Espectro de absorci

on de las clorofilas y
Ra
ul Puente
Laboratorio de Fsica Contempor
anea II, Facultad de Ciencias,
Universidad Nacional Aut
onoma de Mexico
email: raulpuente@ciencias.unam.mx
(Dated: 25 de julio de 2015)
En esta pr
actica se obtuvieron muestras de clorofila y embebidas en eter de petr
oleo y etlico, respectivamente, y de
sangre, para obtener los espectros de absorci
on de cada uno de ellos iluminando en el espectro visible. Para la clorofila
se obtuvieron picos de absorci
on en 420 nm 10 nm y 660 nm 10 nm, mientras que para la clorofila se obtuvieron
en 430 nm 10 nm y 660 nm 10 nm. Asimismo, se midi
o el espectro de absorci
on de la sangre en 420 nm 10 nm,
540 nm 10 nm y 580 nm 10 nm.

1.

INTRODUCCION

Espectros de absorci
on

El espectro de absorci
on de un material es la porcion de la
radiaci
on incidente absorbida por el mismo en un rango de
longitudes de onda. Dicho espectro est
a determinado por la
composici
on at
omica y/o molecular del material.
Pese a que la radiaci
on es tpicamente absorbida en frecuencias que, multiplicadas por la constante de Planck, igualen las diferencias de energa entre niveles at
omicos (i.e.
las transiciones modifican directamente al n
umero cuantico principal), tambien es posible que se den transiciones que
modifiquen el estado de momento angular total o vibracio
nal de las moleculas del compuesto. Este
es precisamente el
mecanismo que permite que os objetos tengan color. El color
que observamos en los objetos opacos (i.e. que no emiten luz
por s mismos) depende de la luz con la que se iluminen. As,
si utilizamos luz visible para iluminar un objeto blanco, este
no absorber
a ninguna longitud de onda, reflejando todas,
por lo que nuestro ojo percibir
a una superposici
on de todas
las longitudes de onda en el visible, mostr
andolo blanco.
Inversamente, un objeto negro absorbe todas las longitudes
de onda, por lo que nuestro ojo no percibe luz alguna y lo
vemos de ese color. Por tanto, un objeto de un cierto color
en especfico (e.g. verde) lo vemos de ese color ya que solo
refleja ese color, absorbiendo todos los dem
as [1].

lienos deslocalizados tienen bandas de absorci

on muy fuertes
en las regiones visibles del espectro (ver figura 2), permitiendo que la planta pueda, con la energa de la luz solar realizar
sus procesos de fotosntesis. Es particularmente importante,
para los fines de este trabajo, se
nalar que ambas clorofilas
son solubles en solventes organicos, tales como el eter de
petroleo o el eter etlico.
H
O

N
N

- Mg++
N

N
O

- Mg++
N

O
O

Clorofila

La clorofila es un compuesto qumico que se encarga, entre

otras cosas, del mecanismo de fotorrecepci
on. Se encuentra
en los cloroplastos de las plantas verdes, que a simple vista se
manifiesta como la coloraci
on verde. La estructura basica de
la molecula de clorofila es un anillo de porfirina, ligada a un
atomo central. La estructura es muy similar a la estructura

del grupo hemo en la hemoglobina, excepto que en el atomo

central de hemo es el hierro, mientras que en la clorofila es
magnesio[2].
Existen 2 tipos principales de clorofila nombrados y .
Su ligera diferencia yace en la composici
on de una cadena
lateral (en es CH3 , en es CHO, c.f. figura 1). Ambas
clorofilas son fotorreceptoras muy eficaces, ya que contienen
una red alterna de enlaces simples y dobles, y los orbitales
pueden deslocalizar la estabilidad de la estructura. Tales po-

(a) Clorofila .

(b) Clorofila .

Figura 1: Estructura qumica de los dos tipos de clorofila

estudiados en esta pr
actica.

Las diferentes cadenas laterales en las 2 clorofilas sintonizan el espectro de absorcion a diferentes longitudes de onda,
de modo que la luz que no es absorbida significativamente
por la clorofila , en 460 nm, en lugar sera capturado por
la clorofila , la cual absorbe fuertemente a esa longitud de

l Puente
Rau

Chlorophyll b

Absorbance

Chlorophyll a

400

500

600

utilizando el embudo. En este punto se reconoci

o que en la
solucion de eter de petroleo se encontraba la clorofila y
carotenos, mientras que en la solucion de alcohol metlico se
encontraba la clorofila y xantofila.
Luego, a la solucion de alcohol metlico se agreg
o 50 ml de
eter etlico y, utilizando peque
nas porciones de agua destilada, se separo el alcohol del eter, en donde en este u
ltimo se
encontraba la clorofila . Finalmente, utilizando una pastilla
de Potasa (hidroxido de potasio) en 9 ml de alcohol metlico
y 30 ml de agua destilada, se separaron los carotenos y la
xantofila de las soluciones que contenan las clorofilas y ,
respectivamente.
Entonces, de esta manera se obtuvo una soluci
on de eter
de petroleo con clorofila y una de eter etlico con clorofila
(ver figura 4).

700

Wavelength [nm]

400

500

600

700

Figura 2: Espectros de absorci

on para longitudes de onda en
el espectro visible de las clorofilas y en azul y en rojo,
respectivamente.

onda. As, estos dos tipos de clorofila se complementan entre

s en la absorci
on de la luz solar. Las plantas pueden suplir
sus necesidades energeticas de las partes azul y rojo del espectro, sin embargo, existe hay una regi
on espectral grande,
entre 500 600 nm, donde se absorbe muy poca luz. Esta
luz est
a en la regi
on verde del espectro y, como se explico
en la secci
on anterior, al reflejarse se le da a las plantas la
apariencia verde. La clorofila absorbe con tanta fuerza que
puede enmascarar otros colores menos intensos. Algunos de
estos colores m
as delicados (de moleculas como los carotenos, xantofila y quercetina) se revelan cuando la molecula de
clorofila se descompone. La clorofila tambien puede da
narse
con tratamiento termico, ya que el
atomo de Mg central se
sustituye por iones de hidr
ogeno. Esto afecta a los niveles de
energa dentro de la molecula, alterando los resultados en un
espectro de absorci
on [3].

2.

Figura 3: Embudo de separaci

on con dos fases.

DESARROLLO

Primeramente se prepar
o la muestra de 2.5 g de espinaca
molida (sin nervaduras) utilizando 40 ml de acetona al 80 %
en un mortero con pistilo, de la cual se extraeran las clorofilas. As, se mezcl
o la acetona con 50 ml de eter de petroleo
en un embudo de separaci
on, junto con 70 ml de agua destilada para limpiar la soluci
on. Luego, despues de que el eter
y la mezcla de agua con acetona se separaron (ver figura
3), se conserv
o s
olo el eter de petr
oleo, el cual contena las
clorofilas.
Despues se agreg
o a la soluci
on de eter (despues de lavarla
repetidas veces con agua destilada) 46 ml de alcohol metlico
con 4 ml de agua destilada, y se separaron ambas soluciones

Figura 4: Muestras finales de las clorofilas y disueltos en

eter de petr
oleo y etlico, respectivamente.

Finalmente, utilizando un espectrometro Milton Roy Spectronic 21D, se midio la absorcion para un intervalo de longitudes de onda de 380 a 750 nm con pasos de 10 nm de
las muestras de clorofilas y y para la sangre, teniendo
cuidado de obtener los espectros para las mismas longitudes
de onda para los blancos, i.e. para los eteres de petr
oleo y
etlico y para el agua destilada (para la sangre), para poder
restar ambos espectros y obtener solo los correspondientes a
las clorofilas y . El funcionamiento a grandes rasgos del
espectrometro se puede ver en el apendice A.

 n de las clorofilas y
Espectro de absorcio
3.

RESULTADOS

El procedimiento detallado en la secci

on 2 se realizo dos veces. As, los resultados de los espectros de absorcion para las
clorofilas y del primer intento se muestras en la figura 5.
Luego, como punto extra, se midi
o el espectro de absorcion
de una muestra de sangre, el cual se puede ver en la figura 6.
Finalmente, con el prop
osito de verificar los datos obtenidos
en el primer intento, se midieron los espectros de absorcion
de ambas clorofilas, los cuales se muestran en la figura 7.

muestra de sangre, se encontro un comportamiento bastante parecido al reportado por otras fuentes (ver figura 6 c.f.
ref. [4]), notando particularmente que no hubo absorci
on en
las longitudes superiores a 600 nm, que corresponde al color
rojizo obscuro caracterstico de la sangre.
En la tabla I se observa una comparacion entre los valores
obtenidos experimentalmente con los valores reportados en
las ref. [4, 5].
Compuesto
Clorofila

4.

ANALISIS
DE RESULTADOS

En la figura 5 se observa un comportamiento de los espectros

de absorci
on de las clorofilas y bastante similar al mostrado en la figura 2, particularmente en los picos de absorcion
de ambas clorofilas cercanos entre los 400 y 500 nm.
Sin embargo, es peculiar que los m
aximos de absorcion
entre los 600 y 700 nm en nuestra medici
on se traslaparon.

Esto
se puede deber a varias cosas. Una de ellas es que la
resoluci
on de la medici
on fue bastante mala (de 10 nm cada
paso), por lo que la incertidumbre no especificada en el dispositivo de medici
on, por cierto puede ser tomada al menos
de 5 nm. Otra posibilidad, sin embargo, es el hecho de que
probablemente no se logr
o separar totalmente las clorofilas
en los eteres de petr
oleo y etlico, lo que podra influir en la
medici
on de los picos de absorci
on. Pese a lo anterior, debido a que los picos entre los 400 y 500 nm son diferentes, es
difcil pensar que ambas soluciones de eter contenan un fuerte contenido de ambas clorofilas, ya que entonces deberan de
haberse traslapado todos los picos de absorci
on. Una tercera
causa posible es que existan todava residuos de compuestos extra en las soluciones, como carotenos o xantofila, lo
que evidentemente modificara el espectro de absorcion de
las muestras.
Vemos en particular, y pese a las dificultades presentadas
en la diferenciaci
on de los resultados de ambas clorofilas,
que los espectros de absorci
on de ambos compuestos son casi nulos en longitudes de onda correspondientes a los tonos
verduscos (i.e. alrededor de 550 nm), lo que coincide con
lo explicado en la secci
on 1 sobre la coloraci
on verde de los
compuestos.
Entonces, con el prop
osito de corroborar los datos, se
realiz
o la segunda medici
on, tratando de prestar especial
atenci
on en los picos de absorci
on de ambas clorofilas entre los 600 y 700 nm. Sin embargo, como se observa en la
figura 7, esto no se logr
o, ya que a pesar de que el espectro de
absorci
on de la clorofila fue casi identico que el obtenido
en la primera medici
on, el espectro de la clorofila en el eter
de petr
oleo se comport
o de una manera muy extra
na, dando picos muy poco confiables (en cuanto a localizacion),
adem
as de nunca alcanzar el cero en cuanto a absorcion, lo
que indica que probablemente la soluci
on estaba contaminada. Por estas razones, esta segunda medici
on no ayudo a
obtener mejores resultados. Como nota a este punto, puede
ser que el comportamiento de este espectro fuera causado
por una soluci
on demasiado diluida de la clorofila , lo que
ocasionara que el tama
no de los picos de absorci
on (despues
de efectuar la resta con el blanco) disminuyeran en tama
no.
Luego, sobre el espectro de absorci
on obtenido para la

Clorofila

Sangre

Valor medido [nm]

Valor de referencia [nm]

420
660
430
660
420
540
580

430
662
453
642
414
542
576

Tabla I: Comparaci
on de los m
aximos de absorci
on medidos con
valores de referencia.

Vemos que, pese a lo mencionado anteriormente sobre la

incertidumbre de las mediciones, si el error se tomara como
de 10 nm, las mediciones para los picos de absorci
on de la
clorofila y para la sangre de referencia caen dentro de los
datos obtenidos experimentalmente. Sin embargo, vemos que
esto no es as para la clorofila , ya que hay una diferencia
de alrededor de 20 nm entre nuestros resultados y los valores
de referencia.
Particularmente notamos que, comparando los resultados
obtenidos con los valores de referencia para los picos de absorcion de la sangre son bastante parecidos, con un error de
alrededor de 5 nm. Es probable que esta diferencia sea tan
peque
na (en comparacion con las diferencias presentadas en
las clorofilas) debido a que la sangre no se someti
o a ning
un
proceso de separacion, sino que se analizo inmediatamente
despues de extraerla, lo que evito problemas como los presentados en la separacion de las clorofilas en cuanto a la
incertidumbre de la ausencia de compuestos espurios (como
los carotenos y la xantofila).
5.

CONCLUSIONES

Utilizando metodos espectroscopicos se lograron determinar

los espectros de absorcion de las clorofilas y y de la
sangre, con un error aceptable en los valores de los picos de
dichos espectros. Pese a lo anterior, probablemente podran
mejorarse los resultados (en cuanto a la comparaci
on con
los valores de referencia de tales picos y en cuanto al comportamiento en general de los espectros) si se realizara el
experimento con una resolucion mayor alrededor de los m
aximos, permitiendo que la incertidumbre asociada a la medicion fuera mas cercana a la incertidumbre del dispositivo (de
alrededor de 0.5 nm, seg
un la mitad de la mnima escala).
Otra cosa a mejorar podra ser la limpieza de los materiales,
ya que, a pesar de que el embudo de separaci
on fue limpiado varias veces con acetona, este pareca tener manchas y
partculas (especialmente dentro de la valvula de drenado)
que podran haber causado divergencias en las mediciones.
Pese a todo lo anterior, finalmente se obtuvieron espectros
que, al menos cualitativamente (y tambien cuantitativamen-

l Puente
Rau

te en los casos de la clorofila y la sangre), reproducan

los valores de referencia de los espectros de absorcion de las
clorofilas y de la sangre.

Ap
endice A: Funcionamiento del espectr
ometro

Del manual del usuario [6] vemos que la l

ampara para iluminar las muestras est
a hecha de Tungsteno, que emite luz
blanca (con un m
aximo de emisi
on alrededor de 300 nm),
como se puede ver en la ref. [7]. La fuente de luz se filtra con
un dispositivo similar a un monocromador (dispositivo como
el utilizado el la pr
actica anterior, a partir de una rejilla de
difracci
on por reflexi
on), y luego se hace pasar a traves de
la muestra, para finalmente hacer incidir la luz en un fotodetector. El esquema del espectr
ometro se puede ver en la
figura 8.

[1] A. Sommerfeld, Optics: Lectures on Theoretical Physics, Vol.

IV (Academic Press, 1964).
[2] M. J. Motilva, Chlorophylls - from functionality in food to
health relevance (5th Pigments in Food Congress, 2008).
[3] S. W. Jeffrey and K. Shibata, Biological Bulletin (Marine Biological Laboratory) 136 (1969).
[4] B. L. Horecker, J. Biol. Chem. 148, 173 (1943).

Figura 8: Diagrama esquem

atico del espectr
ometro utilizado en
la pr
actica.

[5] C. L. Comar and F. P. Zscheile, Plant Physiology 17, 198

(1942).
[6] Manual de usuario: Espectrometro Milton Roy Spectronic
21D.
[7] R. Larrabee, The Spectral Emissivity and Optical Properties of
Tungsten, Tech. Rep. p. 43 (Massachusetts Institute of Technology, 1957).

 n de las clorofilas y
Espectro de absorcio

Espectro de absorcin de las clorofilas (primera medicin)

1.4
X: 430
Y: 1.284

Clorofila
Clorofila

1.2

Absorbencia

0.8

X: 420
Y: 0.612

0.6
X: 660
Y: 0.432

X: 660
Y: 0.417

0.4

0.2

0
400

450

500

550

600

650

700

750

nm

Figura 5: Espectros de absorci

on obtenidos para las clorofilas (en azul) y (en rojo) en la primera medici
on.

Espectro de absorcin de la sangre

X: 420
Y: 1.207

1.2

Absorbencia

0.8

0.6

0.4
X: 580
Y: 0.304

0.2

0
400

450

500

550

600

650

nm

Figura 6: Espectro de absorci

on obtenido para la sangre.

700

750

l Puente
Rau

Espectro de absorcin de las clorofilas (segunda medicin)

Clorofila
Clorofila
0.9

X: 430
Y: 0.838

0.8

0.7

Absorbencia

0.6

0.5

0.4

X: 410
Y: 0.352

X: 660
Y: 0.258

0.3

0.2
X: 640
Y: 0.117

0.1

0
400

450

500

550

600

650

700

nm

Figura 7: Espectros de absorci

on obtenidos para las clorofilas (en azul) y (en rojo) en la segunda medici
on.

750