U5 - ACTIVIDAD No 5

CINTICA ENZIMTICA I:
ACCIN CATALTICA-ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN

ACTIVIDADES TERICO-PRCTICAS
El alumno deber conocer los temas de Cintica Enzimtica desarrollados en Qumica
Biolgica General.
Objetivos

Estudiar los efectos de un catalizador sobre el equilibrio y velocidad de una reaccin qumica.
Estudiar la ecuacin de Michaelis-Menten: concepto de velocidad inicial y estado estacionario.
Interpretacin fsica de la ecuacin de Michaelis-Menten y de los parmetros cinticos.
Determinacin prctica de la actividad enzimtica

1-Introduccin
Las enzimas son protenas que catalizan reacciones qumicas especficas. El mecanismo
propuesto para este tipo de catlisis es que la enzima E se asocia con la molcula sobre la que
acta (llamada sustrato S) formando un complejo enzima-sustrato (ES) a partir del cual se forma el
producto P y se libera nuevamente la enzima sin modificaciones:

E+S

ES

E+P

Debido a la naturaleza proteica de estos catalizadores, todos aquellos factores que

afecten la estructura primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de la enzima modificarn su
actividad. Es fundamental entonces mantener constantes la composicin del medio (pH, fuerza
inica, etc), temperatura y definir precisamente las condiciones en la que se realiza el ensayo
enzimtico.
Generalmente, la presencia de una determinada enzima en una preparacin biolgica
compleja, puede detectarse analizando la aparicin de producto o la desaparicin de sustrato de la
reaccin que la enzima cataliza. Bajo ciertas condiciones la velocidad inicial V0 (velocidad de la
reaccin medida a tiempos cortos y cuando la cantidad de producto aparecido es despreciable) es
proporcional a la concentracin de enzima y puede ser utilizada para cuantificar la enzima
presente.
Midiendo la variacin de velocidad inicial de la reaccin en funcin de la concentracin de
sustrato podemos obtener los parmetros cinticos KM (constante de Michaelis) y Vmax (velocidad
mxima), cuyo significado fsico se discutir en el transcurso de este terico prctico.
Los siguientes problemas han sido seleccionados para conceptualizar todo el marco
terico de catlisis y cintica enzimtica clsica. Le sugerimos que repase los conceptos ya
aprendidos sobre cintica qumica (visto en Qumica General), enzimas y cintica enzimtica
(Qumica Biolgica) y consulte la bibliografa recomendada.

2-Catlisis
Problema 1
k1
La reaccin S

P tiene un G < 0 y sigue una cintica de primer orden

k -1
en ambas direcciones.

48

Las velocidades de ida y de vuelta pueden escribirse como:

Vida k1 S

Vvuelta k 1 P

a) Cmo son estas dos velocidades en el equilibrio? Encuentre la relacin existente entre las
constantes cinticas y la Keq.
b) Grafique cualitativamente cmo vara la [S] y la [P] en el tiempo.
c) Cmo obtiene la velocidad de la reaccin a cualquier tiempo a partir de este grfico?
Si esta reaccin ocurre en presencia de un catalizador:
d) Qu pasar con el G y la Keq?
e) Qu ocurrir con la energa del estado de transicin?
f) Como se modificarn las velocidades de la reaccin de ida y de vuelta?
g) Cmo se ver modificado el grfico de variacin de [S] y [P] en el tiempo?
h) Si el catalizador fuese una enzima, sus respuestas anteriores seguiran siendo vlidas?
i) Nombre algunas caractersticas de la catlisis enzimtica dada la naturaleza proteica de la
enzima.

3-Ecuacin de Michaelis-Menten
Problema 2
La reaccin qumica de S que da P, catalizada por E se puede describir como:
k1

E+S

k2

E+P

ES
k-2

k-1

A fin de obtener la ecuacin de velocidad de esta reaccin, Michaelis y Menten

hicieron dos suposiciones:
Primera suposicin: la velocidad de reconversin de P + E a ES es despreciable
k1

E+S

K2

E+P

ES
k-1

a) En qu condiciones experimentales esta suposicin es vlida?

b) Cmo se llama la velocidad calculada bajo esta aproximacin y cmo la determinara
experimentalmente?
Notar que las curvas de variacin de [S] y [P] en el tiempo pueden modelizarse a tiempos
cortos como rectas, es decir que la velocidad de la reaccin sera constante en ese intervalo
de tiempo.
c) En su grfico de [S] y [P] vs. t marque la tangente a la curva a t=0. Seleccione en su grfico el
intervalo de tiempo en que se cumplen las condiciones de velocidad inicial.
Con esta primera aproximacin, podemos plantear la velocidad de la reaccin como:

Vo

d P
k 2 ES
dt

Es decir que la velocidad se mantendr constante mientras no vare la [ES].

Segunda suposicin: es la llamada hiptesis del estado estacionario que indica que,
durante la mayor parte de la reaccin, la concentracin de intermediario es constante, es decir:

d ES dt 0

d) Ud. piensa que esta aproximacin es vlida en condiciones de velocidad inicial?

e) Grafique como varan las [E]t, [E] y [ES] en el tiempo.
f) Segn esta aproximacin, cmo sern las velocidades de formacin y desaparicin del
complejo ES?
g) Segn las suposiciones anteriores y sabiendo que:

49

Velocidad de formacin de ES:

Velocidad de desaparicin de ES:
Concentracin de enzima libre

d ES dt k1 E S
d ES dt k 1 ES k 2 ES
E E t ES

Encuentre una relacin para [ES] con [E]t y [S].

h) Teniendo en cuenta la definicin de Vo, encuentre la ecuacin que relaciona Vo con [E]t y [S].

Cuando hay un exceso de S disponible, podemos aproximar que toda la enzima est
formando el complejo ES, es decir: E t ES . En estas condiciones, la velocidad de la
reaccin enzimtica se aproxima a la velocidad mxima (Vmax). Podemos decir entonces que:

Vo k 2 ES

Condiciones saturantes de S

V max k 2 E t

i) Utilizando la definicin de Vmax y llamando K M k 1 k 2 k1 (esta es una relacin de

constantes y por lo tanto una constante en s misma), Ud. habr encontrado la ecuacin de
Michaelis- Menten.

Problema 3
El siguiente grfico representa la variacin de concentracin de producto en el tiempo para
una reaccin del tipo S
P

[P] mM

a
tiempo

Contestar Verdadero Falso:

a)
b)
c)
d)

A t se ha consumido todo el sustrato.

La velocidad a t=0 es igual a la velocidad en el punto a.
En el punto a, la velocidad es la mxima alcanzada en la reaccin.
A t, la velocidad de la reaccin es nula.

4-Interpretacin de KM , Vmax y kcat

Problema 4
a) En condiciones de [S]=KM, qu valor toma Vo? Cul es la interpretacin prctica de KM?
Experimentalmente se observa que en general, en una reaccin catalizada por una enzima, la
unin de E + S se produce rpidamente en comparacin con la segunda etapa de conversin y
liberacin de P, es decir que k2 << k1. Por lo tanto esta ltima etapa se considera la etapa limitante
de la velocidad de la reaccin.

50

b) Segn esta consideracin y recordando que K M k 1 k 2 k1 , qu representa KM? Por

qu se dice que KM es una medida aproximada de la afinidad del sustrato por el sitio activo de la
enzima?
c) Por qu en condiciones saturantes de S la velocidad de la reaccin no aumenta
proporcionalmente con la concentracin de S?
d) Segn la definicin de Vmax, ( V max k 2 E t ), qu representa k2 (tambin llamada kcat)?. Por

qu llamarn a esta constante, nmero de recambio (o turnover)?

e) Si la catalasa tiene una k2= 40x106 s-1, y la lisosima una k2= 0.5 s-1, a igual concentracin de
enzima y condiciones saturantes de sustrato cunto tiempo necesitar la lisosima para producir
la misma cantidad de producto que la catalasa produce en 1s?

5-Ejercicios de aplicacin

Problema 5
Ud. esta poniendo a punto una tcnica para estimar la concentracin de una determinada
enzima en una muestra biolgica compleja.
a) Qu medira para detectar su actividad biolgica?
b) Supongamos que Ud. conoce las condiciones de temperatura, pH, iones y cofactores que la
enzima necesita para su funcionamiento; cmo determinara las condiciones de velocidad
inicial? Grafique [P] vs. tiempo para dos experimentos con distinta cantidad de Et, ([E]t1 =
2[E]t2).
c) Segn la ecuacin de Michaelis-Menten, cul es la dependencia de Vo con [E]t? Grafique Vo
vs. [E]t para una concentracin de S constante.
d) A altas [E]t, se seguirn cumpliendo las predicciones de la ecuacin de Michaelis-Menten?
e) Conociendo el grfico anterior Ud. ya puede estimar la [E]t de una muestra desconocida
midiendo Vo?

Problema 6
Ud. esta investigando las diferencias de afinidad por el sustrato de dos enzimas de distinto
origen biolgico (bovina y humana) que catalizan la misma reaccin. Suponga que ya conoce las
condiciones ptimas para el funcionamiento de ambas enzimas, incluso las condiciones de Vo.
a) Qu mediciones hara para realizar dicha comparacin?
b) Sus resultados fueron KM(h) = 0.03 M, y KM(b) = 0.5 M. Grafique ambas curvas Vo vs [S] y
explique cul enzima tiene mayor afinidad por S. Suponga que ambas enzimas llegan a igual
Vmax.
c) Qu pasara si hubiera elegido poner el doble de [E]t en el sistema de reaccin?. Los
resultados de KM hubieran sido los mismos? Grafique ambas situaciones.
d) Grafique [P] vs tiempo para distintos experimentos con [E]t(h)= cte. y [S] = KM, KM, 10KM y
20KM. Qu sucede con las ltimas dos curvas? Estas condiciones se llaman saturantes de
S o condiciones de orden cero. Qu sucede con las primeras dos curvas? Ellas estn en
condiciones de primer orden para S.

Problema 7
Segn el siguiente grfico diga V/F respecto de la concentracin de sustrato:

Vo

A
B
[S]

51

a) A y B son las curvas de sustrato de dos concentraciones distintas de la misma enzima.

b) A y B podran ser las curvas de [S] de la misma enzima pero A se realiz a pH=7 y B a pH=
5.
c) La curva A es la curva de [S] de una enzima que tiene mayor afinidad por su sustrato que la
de la curva B.
d) Si ambas curvas se realizaron con igual concentracin de dos enzimas distintas, como ambas
llegan a la misma Vmax, entonces sus kcat tambin son iguales.

Problema 8
Segn el siguiente grfico diga V/F:
a

[P]

tiempo
a) Ambos experimentos se realizaron con la misma [S] pero con distinta [E] t.
b) Ambos experimentos se realizaron con la misma [E] t y en condiciones de primer orden para el
S, siendo [S]a=2[S]b.
c) Ambos experimentos se realizaron en condiciones saturantes de S e igual [E] t.
d) El experimento a alcanza mayor [P] debido a que se realiz con mayor [S] que el experimento
b.
Problema 9 (ATENCION: el siguiente problema deber llevarse realizado al Terico-practico
de Cinetica Enzimatica I ya que ser discutido en clase. Para resolverlo, tome el valor de
absortividad molar del producto de reaccin que figura en la parte prctica.
Se desarroll la reaccin de defosforilacin del sustrato p-nitrofenilfosfato catalizada por la
enzima fosfatasa alcalina de cerebro de rata. Para ello se incubaron a 37C en sendos tubos 50 l
de una solucin 25 mM del sustrato, iniciando la reaccin con el agregado de 150 l de un
homogeneizado de cerebro de rata conteniendo la enzima, en presencia de magnesio (cofactores)
y el buffer adecuado. La reaccin se dej evolucionar y se detuvo por agregado de 1 ml de NaOH
0.2 M segn el esquema siguiente:
Tubo
N
1
2
3
4
Bco.*

(l)

(l)

Sustrato
25 mM
(l)

50
50
50
50
50

200
200
200
200
200

50
50
50
50
50

Cofactores

Buffer

MgCl2 y ZnSO4

Abs.
(410 nm)

(l)

Tiempo de
incubacin
(minutos)

150
150
150
150
150*

10
20
30
40
10

0.051
0.098
0.144
0.172
0

Enzima

Producto
formado
(M)

* La enzima para el blanco se agrega despus del NaOH

Al respecto responda las siguientes preguntas:

52

a) Qu efecto tiene el agregado de NaOH sobre la reaccin?

b) Cmo debe ser preparado el tubo Blanco?
c) Cul es el volumen de reaccin antes del agregado de NaOH? Y el volumen final de
reaccin al que se le mide absorbancia?
d) Cul es la concentracin del sustrato al comienzo de la reaccin (en M)?
e) Segn las medidas de absorbancia obtenidas (ver Tabla), cul es la concentracin de
producto a cada tiempo?
f) Cul es el porcentaje de sustrato hidrolizado a cada tiempo?
g) Grafique concentracin de producto vs. tiempo y determine el rango de linealidad.
h) Determine la velocidad inicial de la reaccin (Vo).
i) Luego del tiempo mximo de linealidad, es valido el modelo de Michaelis-Menten?

Problema 10
A fin de analizar la dependencia de la actividad Glucosa oxidasa con la [E]t se desarroll el
siguiente experimento. Se incub a 37 C, 1 mL de solucin 1 mM de glucosa con diferentes
cantidades de enzima, deteniendo la reaccin a distintos tiempos y midiendo la aparicin de un
producto coloreado (= 3140 M-1cm-1).
Tiempo
(min)
1
2
3
4
5

0.5 g enzima
A
[P]
0.044
0.091
0.134
0.178
0.227

1 g enzima
A
[P]
0.090
0.179
0.271
0.310
0.363

2 g enzima
A
[P]
0.180
0.374
0.547
0.600
0.684

5 g enzima
A
[P]
0.395
0.788
1.030
1.250
1.321

a) Grafique cada experimento y determine Vo.

b) Grafique Vo vs [E]t. La dependencia de Vo con [E]t es lineal para todo el rango de [E]t? Con
este experimento puede averiguar KM y Vmax?
6- Bibliografa recomendada

Fundamentos de Bioqumica: La vida a nivel molecular, Voet, Voet y Pratt.

Qumica Biolgica, Antonio Blanco. Captulo 7; enzimas.
Bioqumica, Lehninger. Captulo 8; Enzimas: cintica e inhibicin.
Bioqumica, Rawn. Vol 1, Captulo 7; Parte II: Cintica enzimtica.
Fisico-Qumica, Peter Atkins. Captulo 25.7; Reacciones elementales consecutivas.

53

Actividades Prcticas
En este y en el prximo trabajo prctico se realizarn estudios cinticos acerca de la enzima
de Escherichia coli.
El prctico estar dividido en dos etapas:

FOSFATASA ALCALINA

Primera semana: Se observar como se modifican las curvas de tiempo de la reaccin

cuando se cambian las concentraciones de enzima y sustrato utilizado. Se establecern
condiciones de velocidad inicial (Vo). Se discutir la dependencia de la Vo con la concentracin de
enzima.
Segunda semana: Se medirn las velocidades iniciales en funcin de la concentracin de
sustrato para determinar los valores de KM y Vmax.
Una de las reacciones que cataliza esta enzima es la siguiente:
O
O2N

Fosfatasa alcalina
-

O P O- + O2N

O P O
Op-nitrofenilfosfato

O-

MgCl2, pH=10,
H2O

Ofosfato

p-nitrofenxido

El sustrato p-nitrofenilfosfato disdico es una sustancia orgnica que no se encuentra en

organismos vivos, y se utiliza aqu para detectar y cuantificar la actividad de fosfatasa alcalina que
es capaz de hidrolizarlo en p-nitrofenol y fosfato inorgnico.
La cantidad de producto (p-nitrofenol) resultante se puede medir espectrofotomtricamente.
Debido a que el p-nitrofenol tiene un pKa=7,14 a pH=10 se encuentra como p-nitrofenxido, el
cual presenta un mximo de absorcin a 410 nm con una absortividad molar de 17.500 M-1 cm-1.
El p-nitrofenilfosfato es un ster del cido fosfrico que al igual que los steres de cidos
carboxlicos se hidroliza en medio alcalino originando como productos de reaccin al pnitrofenxido y fosfato inorgnico. Cmo afecta la presencia de esta reaccin a la determinacin
experimental de la actividad de fosfatasa alcalina?
Descripcin del ensayo enzimtico
1] Preparacin enzimtica:
La enzima fosfatasa alcalina se obtiene a partir de un cultivo de bacterias de Escherichia
coli transformadas con el plsmido que contiene la secuencia de la protena. Esta enzima en su
forma activa se encuentra en el periplasma de la clula. Mediante hidrlisis de la membrana
externa se obtiene el contenido periplsmico el cual contiene la enzima fosfatasa alcalina, entre
otras protenas. Al contenido periplsmico se lo denomina enzima.
2] Sistema de incubacin:
Es la composicin de la solucin donde ocurre la reaccin. En este caso ser:
p-nitrofenilfosfato disdico 3 mM
(Sustrato)
(Cofactor)
MgCl2 1mM
ZnSO4 0,1 mM
(Cofactor)
Tris HCl pH=8
(Buffer)
Fosfatasa Alcalina
(Enzima)

54

La mezcla se incuba a 37 oC en un bao termostatizado durante el tiempo fijado para cada

caso (curva de enzima, curva de tiempo, curva de sustrato). La reaccin comienza en el
momento de agregar enzima al sistema de incubacin y se detiene, al cabo del tiempo elegido,
agregando 1 ml de NaOH 0.1 M. El NaOH agregado inactiva a la enzima y alcaliniza el medio
de manera que el producto (p-nitrofenol) aumenta su coeficiente de absorcin a 410 nm.
Las lecturas de Absorbancia deben efectuarse antes de transcurridas 2 horas desde la
inactivacin.
3] Blanco de enzima:
En cada una de las determinaciones, adems de los tubos problema, deber prepararse
simultneamente un tubo adicional denominado blanco de la reaccin enzimtica. Contendr
todos los elementos del sistema de incubacin menos la preparacin enzimtica. Este tubo se
procesar de manera anloga a los restantes, es decir, se incubar a 37 oC durante el mismo
tiempo y finalmente se le agregarn los 2 ml de NaOH. La preparacin enzimtica se agregar
recin despus del NaOH. El valor de absorbancia que pudiera tener este tubo es
independiente de la accin de la enzima y deber descontarse de la lectura en los restantes
tubos.

Primera semana
1]

Curvas de Tiempo:

Para estudiar cmo cambian las curvas de formacin de producto en funcin del tiempo de la
reaccin cuando se cambian las condiciones de [E] y [S], realizaremos tres curvas de tiempo
siguiendo el siguiente esquema.

Tabla1:Curvadetiempo1
Tubo N Cofactores

Buffer

Enzima

(L)

Sustrato
3 mM
(L)

(L)

Tiempo de
incubacin
(minutos)

MgCl2 10 mM

Tris 10 mM pH 8

ZnSO4 1 mM

Abs.
Producto
(410 nm) formado
(M)

(L)
1

65

540

25

30

65

540

25

30

10

65

540

25

30

15

65

540

25

30

20

Bco.*

65

540

25

30* (alfinal)

55

Cofactores
MgCl2 10 mM
ZnSO4 1 mM
(L)

Buffer
Tris 10
mM pH 8
(L)

Sustrato
3 mM
(L)

Enzima
(L)

Tiempo de
incubacin
(minutos)

65

465

100

30

65

465

100

30

10

65

465

100

30

15

65

465

100

30

20

Bco.*

65

465

100

30* (al
final)

Tubo
N

Abs.
Product
(410 nm) o
formad
o
(M)

Tabla 2: Curva de tiempo 2 con Aumento de Sustrato

Tabla3:Curvadetiempo3conDisminucin deEnzima
Tubo N Cofactores

Buffer

Enzima

(L)

Sustrato
3 mM
(L)

(L)

Tiempo de
incubacin
(minutos)

MgCl2 10 mM

Tris 10 mM pH 8

ZnSO4 1 mM

Abs.
Producto
(410 nm) formado
(M)

(L)
1

65

558

25

12

65

558

25

12

10

65

558

25

12

15

65

558

25

12

20

Bco.*

65

558

25

12 (alfinal)

Al cabo del perodo de incubacin agregar a cada tubo 1 ml de NaOH 0,1 M

* La enzima para el blanco se agregar despus del NaOH.
A partir de las lecturas de A410 de cada tubo, calcular la concentracin de producto formado en
el volumen de reaccin (M). Grafique en dos grficos por separado las curvas 1 y 2, y las curvas
1 y 3, y obtenga los valores de Vo para cada curva. Discuta en clase como vara Vo en cada
condicin y como se correlaciona ello con el modelo de Michaelis-Menten.
Segn sus resultados elija un tiempo de reaccin en el cual en todas las condiciones
experimentales la reaccin permanezca en condiciones de Vo. Este tiempo de reaccin ser
utilizado en la segunda semana para realizar la curva de Vo vs. sustrato.
2]

Curva de Enzima: condiciones de linealidad de la Vo con [E].

Para asegurarnos de que en las condiciones de trabajo elegidas nuestro sistema se comporta
segn el modelo de Michaelis-Menten, necesitamos cerciorarnos de trabajar en un rango de [E]
en el cual la dependencia de Vo con [E] sea lineal. Para ello graficamos los resultados de las
velocidades de reaccin (Vo) obtenidas de las curvas 1 y 3 (adems del punto 0,0) en funcin
de la cantidad de enzima agregada y discutimos su dependencia.

56

Segunda semana
Velocidad de reaccin en funcin de la concentracin de sustrato. Determinacin de KM y Vmax

3]

En los experimentos anteriores usted observ que a tiempos cortos la [P] es lineal con el
tiempo y eligi detener la reaccin en un determinado tiempo en el cual la reaccin se encuentra
en condiciones de velocidad inicial. Adems Ud. se asegur que la velocidad de la reaccin
depende linealmente de la concentracin de enzima en el intervalo de tiempo usado. En este
Trabajo Practico realizaremos una Curva de Sustrato para poder obtener los parmetros
cinticos KM y Vmax de la Fosfatasa Alcalina.
Realizaremos el siguiente protocolo:

Cofactores Sustrato
MgCl 10 mM
3 mM
Tubo ZnSO2 1 mM
4
N
(l)
(l)

Buffer
Tris 10 mM
pH 8

Enzima

(l)

(l)

65

560

30

65

10

555

30

65

15

550

30

65

25

540

30

65

100

465

30

65

300

265

30

65

550

15

30

Bco*

65

25

540

30*(alfinal)

Abs.
(410 nm)

Sustrato
(M)

Producto
formado
(M)

Vo
(M/min)

Incubar todos los tubos a 37 oC durante el tiempo elegido en el prctico anterior como condiciones
de Vo. Para detener la reaccin agregar a cada tubo 1 ml de NaOH 0,1 M.
* La enzima para el blanco se agrega despus del NaOH.
Calcule la concentracin de sustrato (M) en el volumen de reaccin y las velocidades de
reaccin (en M/min) a partir de los datos de absorbancia. Grafique Vo vs. [S] utilizando el
programa de anlisis grafico Origin o similar y obtenga los datos de KM y Vmax mediante un ajuste
no-lineal con la frmula de Michaelis-Menten. Adems, utilice un mtodo de linealizacion de la
ecuacion de Michaelis-Menten a su eleccin (Lineaweaver-Burk o Eadie-Hofstee) y realice una
regresin lineal de sus datos utilizando Origin o Excel. A partir de los valores de la pendiente y
ordenada al origen, calcule KM y Vmax. Obtiene los mismos valores con los dos mtodos? Cual
de ellos le da errores menores?

57

U6 - ACTIVIDAD N 6
Cintica Enzimtica II
Determinacin de parmetros cinticos - Inhibidores Enzimticos

Objetivos:
Determinacin grfica y analtica de KM y Vmax de una reaccin catalizada enzimticamente.
Linearizacin de la ecuacin de Michaelis-Menten: transformaciones de Lineweaver-Burk y de
Eadie-Hofstee.
Identificacin de distintos tipos de inhibidores y sus efectos en los parmetros cinticos.
1- Introduccin
Cuando se disea y ejecuta un experimento, el anlisis se realiza generalmente ajustando
un modelo terico a los datos obtenidos. Para ello, necesitamos conocer las ecuaciones que
describen el comportamiento del sistema y el significado fsico de cada uno de sus parmetros.
En nuestro caso, el modelo es el de Michaelis-Menten de una reaccin enzimtica.
En el terico-prctico anterior, discutimos el marco terico de este modelo. Por lo tanto,
para una buena comprensin de este terico-prctico, es fundamental que tenga presente los
conceptos aprendidos en Cintica I.
(Tambin sugerimos repasar los conceptos ya conocidos de equilibrio qumico y
funciones lineales.)
2-Determinacin de KM y Vmax.
El modelo de MichaelisMenten para una reaccin catalizada por una enzima nos dice que
la variacin de la velocidad inicial (Vo) de la reaccin con la concentracin de sustrato ([S])
responde a la siguiente ecuacin:

Vo

Vmax S
K M S

(1)

Si graficamos nuestros datos de Vo en funcin de [S] y los mismos se ajustan al modelo,

deberamos obtener una hiprbola rectangular. A travs de una regresin no lineal o bien
grficamente podramos determinar los valores de KM y Vmax.
Veamos un ejemplo. En la figura 1 se representan los resultados experimentales de una
reaccin enzimtica. Tambin se muestran los valores obtenidos de KM y Vmax a partir de un ajuste
con la ecuacin (1), la desviacin estndar asociada a cada uno de ellos (Std) y el chi^2.

58

10
9
8
7

Vo
(mg/min)

6
5
4
Model: Hyperbl
Chi^2 = 0.04976
Valor
Vmax 9.90757
3.50931
KM

3
2
1

Std
0.36235
0.31899

0
0

10

[S] (mM)

Figura 1
2.1) Es posible obtener grficamente los valores de KM y Vmax a partir de los datos de la
figura 1?
Por lo general no es posible obtener grficamente los datos de KM y Vmax ya que el rango
de [S] trabajado normalmente es a concentraciones bajas y el error en la determinacin grfica es
muy alto. El mejor mtodo para obtener KM y Vmax es el ajuste mediante una regresin no lineal de
los datos experimentales con la ecuacin de Michaelis-Menten. En este Terico-Practico, as como
en el Trabajo Prctico correspondiente, obtendremos los valores de KM y Vmax utilizando el
programa de anlisis de datos Origin, el cual nos permite ajustar los datos de los problemas de
aplicacin.
En el caso de que no se disponga de un programa capaz de realizar una regresin no
lineal, la transformacin lineal de la ecuacin de Michaelis-Menten nos facilita la tarea de hacer el
clculo a mano o en un programa que sea capaz de hacer slo regresiones lineales, como el
Excel. Los dos mtodos de linealizacin ms empleados son los de dobles inversas o de
Lineaweaver-Burk y de Eadie-Hofstee, los cuales se muestran en la figura 2. La linealidad en estos
grficos asegura el cumplimento de la ecuacin de Michaelis-Menten (y por tanto los supuestos
que esta implica).

59

Ecuacin de
Michaelis-Menten

Vo

Vmax S
K M S

Vo
Vmax

KM

[S]

Ecuacin de
Lineweaver-Burk

1 KM 1
1

Vo Vmax S Vmax

Ecuacin de
Eadie-Hofstee

Vo K M

(2)

1/Vo

Vo
V
S max

(3)

Vo
Vmax

1/Vmax

Pendiente: -KM
Pendiente: KM/Vmax

-1/KM

1/[S]

Vmax/KM

Vo/[S]

Figura 2
Cuando un conjunto de datos no tiene error experimental, los mtodos de linealizacin son
adecuados para determinar los parmetros cinticos. Sin embargo, para un conjunto de datos
reales (que presentan error) estos mtodos pueden inducir a una incorrecta determinacin. Por
ejemplo, la linealizacin por Lineweaver-Burk a bajas concentraciones de sustrato amplifica los
errores, generando una dispersin de datos que dificulta realizar un buen ajuste. El mtodo de
Eadie-Hofstee tambin produce una amplificacin de los errores, pero este no es tan severo y esta
tcnica se considera ms adecuada. Un problema adicional con Eadie-Hofstee es que la variable
independiente no es realmente independiente y por lo tanto los errores experimentales estn
presentes en ambos ejes.
El siguiente ejemplo ilustra lo anterior. En el grfico de Michaelis-Menten (1) se muestran en
crculos llenos los datos sin error, mientras que en smbolos vacos se representan dos conjuntos

60

Vo

1/Vo

de datos con error experimental. En los grficos de Lineweaver-Burk (2) y de Eadie Hofstee (3) se
representan los mismos datos y sus respectivos ajustes lineales.

1/[S]

[S]

Vo

Vo/S
3- Inhibicin
Los inhibidores son compuestos que perturban la cintica de la reaccin, haciendo variar
KM, Vmax o ambos en forma APARENTE.

Vo

Vmax S
K M S

Vo

Vmax, ap S

K M , ap S

(3)

La expresin matemtica para KM,ap y Vmax,ap depender del tipo de inhibicin.

3.1- Inhibicin competitiva
Las reacciones que ocurren en presencia del Inhibidor (I) pueden escribirse como:

E + S
+
I
KI
EI

ES

P + E

KI: constante de DISOCIACIN

del complejo EI

61

En esta ecuacin, Vmax y KM son los parmetros correspondientes al sustrato sin inhibidor.

3.1.1) Observando los equilibrios qumicos planteados, cmo ser la Vo en presencia de

inhibidor a bajas concentraciones de sustrato respecto a la reaccin en ausencia de inhibidor?
Cmo se ver afectada la velocidad de reaccin en exceso de sustrato? Cambiar Kcat?,Como
aparentara ser afectado el equilibrio E + S
ES?Cmo ser la KM, ap respecto a KM?
Las expresiones matemticas para Vmax,ap y KM,ap para este tipo de inhibicin son:

Vmax, ap Vmax

I
K M , ap K M 1
K I

(4,5)

3.1.2) Verifique si las ecuaciones 4 y 5 coinciden con lo esperado segn el punto anterior.
3.1.3) Encuentre las races de la transformacin de Eadie Hofstee y Lineweaver-Burk.
Las representaciones grficas de la ecuacin linealizada a medida que aumenta la [I] son:

[I]1
1/Vo

[I]2

Vo

SIN I

[I]2>[I]1

Vmax
[I]2>[I]1

1/Vmax

Pendiente: -KM(1+[I]/KI)
[I]1

Pendiente: (1+[I]/KI)KM/Vmax
[I]2
-(1/(KM(1+[I]/KI ))

1/[S]

Vmax/KM (1+[I]/KI)

SIN I
Vo/[S]

Figura 3
3.1.4) Dibuje el grfico de Michaelis-Menten para las situaciones con y sin inhibidor.
3.2- Inhibicin no competitiva

En este caso, el inhibidor se une tanto a la E libre como al complejo ES.

3.2.1) Plantee los equilibrios, siendo KI la constante de disociacin del complejo EI y KI la
correspondiente constante de disociacin del complejo ESI.
Si aproximamos que KI KI, cmo ser (><=) Vmax,ap y KM,ap respecto a los parmetros obtenidos
en ausencia de inhibidor?
Si aumentamos la concentracin de sustrato, la Vmax,ap llegar al valor de Vmax?Cmo variar la
relacin Km/Vmax?
Las ecuaciones para este modelo son:

Vmax, ap

Vmax
1 [ I ]

K I

K M ,ap K M

(6,7)

62

La representacin grfica de las ecuaciones linealizadas a medida que aumenta la [I] son:

[I]1
1/Vo

[I]2>[I]1

[I]2

Vo

SIN I

Pendiente: -KM

Vmax/(1+[I]/KI)

(1+[I]/KI)/Vmax

[I]1
Pendiente: (1+[I]/KI)KM/Vmax
-(1/KM )

SIN I

[I]2

1/[S]

Vmax/KM (1+[I]/KI)

Vo/[S]

Figura 4
3.2.2) Dibuje el grfico de Michaelis-Menten para las situaciones con y sin inhibidor.

3.3- Inhibicin acompetitiva

En este tipo de inhibicin, el inhibidor se une al complejo ES con una constante de

disociacin KI.
3.3.1) Plantee los equilibrios. Qu ocurrir en este caso con Vmax,ap y KM, ap?
Las ecuaciones que describe este modelo son:

Vmax, ap

Vmax
1 [ I ]

K I

K M ,ap

KM
1 [ I ]

K I

(8,9)

Las representaciones grficas de la ecuacin linealizada a medida que aumenta la [I] son:

[I]1
1/Vo

[I]2

SIN I

Vo
[I]2>[I]1
Vmax/(1+[I]/KI)

(1+[I]/KI)/Vmax

Pendiente: -KM/(1+[I]/KI)
[I]2>[I]1
[I]1
Pendiente: KM/Vmax

-((1+[I]/KI)/KM )

SIN I
[I]2

1/[S]

Vmax/KM

Vo/[S]

Figura 5
3.3.2) Dibuje el grfico de Michaelis-Menten para las situaciones con y sin inhibidor.
Como podemos ver en estos ejemplos, debemos realizar los experimentos en ausencia y
presencia de inhibidor para identificar el tipo de inhibicin.

63

4-Problemas de aplicacin
1) Se midi la variacin de la velocidad inicial en funcin de la concentracin de sustrato para una
reaccin catalizada enzimticamente. Se realizaron dos experimentos y slo en uno de ellos la
concentracin de enzima era conocida. Los valores obtenidos se muestran en la tabla.
[S] (M)
0.1
0.2
0.5
0.8
1.0
2.0

[E]1=1x10-6 M
Vo (mmol /mL min)
3.33
5.00
7.14
8.00
8.33
9.09

[E]1
Vo/[S]

[E]2=?
Vo (mmol /mL min)
7.67
11.50
16.43
18.40
19.17
20.91

[E]2
Vo/[S]

a) Calcule Vo/[S] para ambos experimentos y realice un grafico de Eadie Hofstee para ambas
curvas.
b) Obtenga la ecuacin lineal que mejor describe los datos de cada experimento y obtenga los
valores para KM y Vmax para ambos casos.
c) Calcule el valor de la kcat.
d) Qu concentracin de enzima se utiliz en el segundo experimento?
2) Suponga que los datos que se muestran en la tabla fueron obtenidos de una reaccin
enzimtica en presencia y ausencia de un inhibidor.
[S] (mM)
0.2
0.4
0.8
1.0
2.0
4.0
a)
b)
c)
d)

Vo (mmol/ mL min)
Sin I
Con I
5.0
3.0
7.5
5.0
10.0
7.5
10.7
8.3
12.5
10.7
13.6
12.5

Utilizando un grfico de Lineweaver-Burk (doble reciprocas) determine el tipo de inhibicin.

Calcule Vmax y KM de la reaccin.
Asumiendo que la [I] en la mezcla de reaccin fue 0.2 mM, determine KI, Vmax app y KM app.
Dibuje el grfico de Michaelis-Menten para esta situacin.

3) El salicilato inhibe la accin cataltica de la glutamato-deshidrogenasa.

a) Determine el tipo de inhibicin mediante el anlisis grfico de los datos mostrados en la tabla
(utilice ambas transformaciones y compare).
b) Suponga que la concentracin de salicilato se mantiene constante y es de 40 mM. Calcule
tambin la KM para el sustrato y la KI, constante de disociacin para el complejo enzimainhibidor.
Sustrato [mM]
1.5
2.0
3.0
4.0
8.0
16.0

Velocidad (mg/min)
sin salicilato
con salicilato
0.21
0.08
0.25
0.10
0.28
0.12
0.33
0.13
0.44
0.16
0.40
0.18

64

EJERCICIOS ADICIONALES DE CINTICA ENZIMTICA

Problema 1: Completar:
Dado que se asume que la velocidad de la reaccin enzimtica esta dada por la ecuacin
de M.M., necesariamente debemos tener en cuenta lo asumido en el modelo de M.M. Por lo que el
KM obtenido representa la constante de disociacin de............, y representa una medida de la
....................de E por S.
A pesar de que esto no ha sido demostrado fehacientemente hasta hoy, meramente definimos KM
como una constante que representa la concentracin de sustrato a la cual se
produce..........................................................
Problema 2
Suponga que la glucosa puede convertirse en otra sustancia por la accin de una cierta
enzima. La tabla siguiente muestra para este caso hipottico las diferentes velocidades a diversas
concentraciones de glucosa:
[glucosa](M)
Vo (M min-1 )
1/ [S].
1/ Vo
Vo/[S]
1x10-5
150
2x10-5
256
1x10-4
600
3x10-4
770
5x10-4
818
a) Graficar Vo vs. [S].
b) Calcular las inversas de concentracin y velocidad y graficar 1/Vo vs. 1/[S].
c) I-El primer propsito del grfico de Lineweaver-Burk, es estudiando la linealidad, chequear cuan
bien la reaccin responde a la ecuacin. Esta correspondencia indica que el complejo enzimasustrato:
( ) permanece a una concentracin relativamente constante durante el perodo de las
observaciones.
( ) es formado apreciablemente a partir de la unin de la enzima con el sustrato y tambin del
producto son el sustrato.
II-El segundo propsito del grfico L-B, una vez que estamos satisfechos con la linealidad, es
evaluar Vmax y KM.
La interseccin de la recta en el eje y corresponde al valor algebraico de..................que en
este caso es de ............. Cuando 1/[S] = 0, la velocidad es (infinita - mxima - mnima). Si
extrapolamos la recta hasta cortar el eje x, donde 1/Vo = 0, el valor de la interseccin con el eje de
las abscisa es igual a -1/KM que en este caso es de.................
d) Analizando el mismo grfico, existe otro modo que nos permita calcular el valor de KM?
e) Otro modo de analizar la cintica de una reaccin enzimtica esta representado por los grficos
de Hofstee, el cual grfica............................................
Calcular con los datos anteriores Vo/[S] y grafique. Determinar Vmax y KM
Problema 3
En un experimento de Vo en funcin de [S], se obtuvo como resultado KM y Vmax para una
dada enzima con su sustrato, expresado en una grfica de Vo vs [S] y 1/Vo vs 1/[S] (Fig 1.
Experimento 1).
Luego se realizaron otros dos experimentos, cada uno con una "pequea" variante pero
manteniendo constante temperatura, pH y tiempo de reaccin, obteniendo los siguientes
resultados comparados con el experimento 1.

65

Indique que tipo de inhibicin hay en los experimentos 2 y 3.

Problema 4
El conocimiento de las reacciones catalizadas por accin enzimtica ha sido de gran ayuda
en lo que se refiere a estudios bioqumicos relacionados con el rea de la salud. Dichos estudios
pueden orientar a un diagnstico clnico determinado, ya sea utilizando enzimas para determinar
concentraciones de sustratos (como glucosa o urea) o utilizando sustratos para determinar la
actividad de ciertas enzimas del paciente (como Fosfatasas Ac).
Los niveles normales de Fosfatasas Ac en plasma humano estn en el orden de los 1,5 a 8,62
UI/L (UI=1 mol/minuto de producto generado o sustrato consumido).
En un laboratorio clnico se tomaron 200 L de plasma de dos pacientes y se procedi de la
siguiente manera.

66

MgCl2

Tubo

Sustrato

Buffer

0,026 M

Suero de paciente
(Enzima)

Paciente1

25 L

100 L

300 L

200 L

Paciente 2

25 L

100 L

300 L

200 L

Blanco

25 L

100 L

300 L

200 L*

*Despus de agregar el NaOH.

La reaccin es :
p-nitrofenilfosfato + H2O

p-nitrofenol + PO44-

Enzima

Luego de incubar durante 15 minutos a 37 C, se agrego a las muestras 2 mL de NaOH 0,1 M.

Las lecturas de absorbancias a 410 nm del p-nitrofenol fueron:
A(paciente1)= 0,420

A(paciente 2)=0,154

A(blanco)=0,021

Calcule la actividad Fosfatasa Ac en UI/L para ambos pacientes.

A= d [P]
=17500 M-1cm-1
d=1 cm UI= 1 mol/minuto.
Problema 5
Enumere todos los factores que considere pueden afectar la capacidad de una
enzima de catalizar una determinada reaccin qumica.
Problema 6
Si consideramos la siguiente ecuacin para una reaccin enzimtica:
V1

E+S

V3

ES

E+P

V4
V2
a) En que condiciones se considera la velocidad igual a la velocidad inicial:
I) V1 V2

II) V1=V2

III) V3 V4

IV) V3=V4

V) Ninguno es correcto.

b) Justifique la opcin correcta.

c) Dibuje en grfico de Vo vs [S] y 1/Vo vs 1/[S] los resultados de una reaccin enzimtica tpica
que ha sido afectada por los tres tipos de inhibidores conocidos e indique en que parte del
equilibrio de reaccin actan cada uno.

Problema 7
Un estudiante decide comparar dos sustratos (A y B), con una enzima (E) que es especfica
para ambos. Los productos de reaccin de ambos sustratos son diferentes pero pueden ser
detectados espectroscpicamente a 450 nm (PA) y 550 nm (PB).
Se realiz un experimento de Vo vs [S] para A y para B. En todos los casos se mantuvo
constante la temperatura, pH, [E] y tiempo de reaccin (los cuales fueron determinados con
anterioridad). Las reacciones se mantuvieron a 37 C durante 20 minutos (condiciones de Vo
preestablecidas) y siendo el volumen final igual a 5 mL, se obtuvieron los siguientes resultados
para ambos sustratos.

67

[Sustrato]
mM

A (PA)

A (PB)

0.082

0.039

5
10
20
30
50

0.301
0.460
0.640
0.740
0.820

0.167
0.271
0.416
0.498
0.593

Si
E+A

[EA]

PA + E

E+B

[EB]

PB + E

A(PA)= PA d [PA]

EPA = 5000 M-1cm-1

d=1 cm.

(a 450 nm).

A(PB)= PB d [PB]

EPB = 2600 M-1cm-1

d=1 cm.

(a 550 nm).

1. Calcule la KM y Vmax de la enzima para ambos sustratos.

2. El sustrato A tiene mayor o menor afinidad por la enzima que el sustrato B? JSR.

68