UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

E.A.P: Ingeniera Agroindustrial

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OBJETIVOS:
Evaluar las condiciones fisicoqumicas en que se presentan las reacciones
enzimticas.

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Evaluar el efecto de la temperatura y cidos en la actividad de la invertasa durante la

hidrolisis de la sacarosa.

FUNDAMENTO TEORICO:
La invertasa (-D-fructofuranosidasa, -D-fructofuransido fructohidrolasa, EC 3.2.1.26),
cataliza la hidrlisis de restos terminales no reductores -D-fructofuranosdicos de
fructofuransidos. Entre los sustratos sobre los que acta el ms significado es, sin duda, la
sacarosa, de ah que el enzima se designe con el nombre de sacarasa. La denominacin
trivial de invertasa, con la que tambin se conoce, hace referencia al hecho de que los
productos de la reaccin son conocidos desde antiguo como azcar invertido ya que
mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa que
resulta de su hidrlisis es levo rotatoria, por lo que en el proceso se origina un cambio de
signo (de positivo a negativo) del valor de rotacin ptica.
Sacarosa ([]D= +66,5) + H2O
D-glucosa ([]D= +52,5) + D-fructosa ([]D= -92)
La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en
microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel importante en el
catabolismo de fructanos y ms especficamente en el de la sacarosa, en especial en
aquellos organismos en los que dichos azcares son utilizados como fuente de carbono y
energa.
El estudio de la actividad invertasa presenta un gran inters tanto desde un punto de vista
acadmico como de investigacin aplicada, siendo uno de los enzimas ms conocidos. A
modo de ejemplo podemos referir que la invertasa fue el primer enzima cuya cintica se
estudi en profundidad (estudios clsicos de Michaelis-Menten) y que fue utilizado
industrialmente.
Para la determinacin de la actividad invertasa se utilizar un ensayo indirecto en el que los
productos de reaccin sern detectados espectrofotomtricamente tras su conversin en
derivados coloreados. En concreto, la extensin de la hidrlisis enzimtica de sacarosa
(azcar no reductor) en glucosa ms fructosa (azcares reductores) se valorar mediante
uno de los diversos mtodos existentes para la estimacin de azcares reductores. Nos
referimos exactamente al mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS), el cual se basa en la
reduccin del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azcar reductor al cido 3-amino5-nitrosaliclico (de color rojo ladrillo) (Chaplin, 1986), cuya presencia puede detectarse por
lectura de la Absorbancia en la zona de 540-570 nm.

En esta prctica vamos a ver la accin de la invertasa y calcularemos entre otras cosas la
velocidad de la reaccin que cataliza. La actividad enzimtica se pone de manifiesto
incubando el sustrato juntamente con la enzima y posteriormente paramos la reaccin y
medimos colorimticamente la reduccin del cido 3,5-dinitrosaliclico que es lo que nos va a

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determinar la velocidad de la reaccin. Se basa en que la sacarosa no contiene tomo de
carbono anomrico libre y por lo tanto no es un azcar reductor.
La enzima invertasa cataliza la hidrlisis de la sacarosa a glucosa y fructosa, frecuentemente
a esta reaccin se denomina inversin. La invertasa se puede conseguir de clulas de
levadura que se rompen por auto lisis, centrifugando y tomando el sobrenadante.
La sacarosa, comnmente conocida como azcar de mesa, es un disacrido compuesto por
a-D-glucosa y b-D-fructosa unidos mediante enlace glicosdico a-1,2. Cuando este enlace es
roto en la reaccin de hidrlisis, se genera una mezcla equimolar de glucosa y fructosa.
La sacarosa puede ser hidrolizada en presencia de una enzima comnmente denominada
invertasa o sacarasa:
Sacarosa + H2O --------------------------- Glucosa + FructosaSacarasa
La denominacin sistemtica de la invertasa es b-fructofuranosidasa, debido a que la
reaccin catalizada por esta enzima es la hidrlisis del residuo terminal b-fructofuransico.
Existe otra enzima, la a-D-glucosidasa, que tambin cataliza esta reaccin, escindiendo la
unidad terminal de la glucosa. La sacarosa tambin puede ser hidrolizada de manera no
enzimtica en medio
cido.

MATERIALES:

Tubos de ensayo
Homogenizador, centrifuga
Bao maria
Extracto de levadura comercial
Solucin de sacarosa
Fehling A, fehling B

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

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PASO 01
Extraer la invertasa a partir de un fermento biolgico, homogenizando 2gr de levadura
(fermento biolgico) en 20ml de agua, dejando en reposo por 15 minutos, luego centrifugando
a 5.000 rpm por 20minutos y finalmente recogiendo el sobrenadante (extracto).

PASO 02
Preparar una disolucin de sacarosa al 2% y repartir en 3 tubos.

PASO 03
Repartir extracto enzimtico en tres tubos de ensayo. El primero se utiliza tal cual (extracto
enzimtico crudo) y el segundo se lleva a ebullicin durante tres minutos, dejndolo enfriar, a
continuacin (extracto enzimtico hervido) y al tercero se le aaden unas gotas de HCl
( extracto enzimtico acido).

PASO 04
En tres tubos de ensayo mezclar 1.0 ml. De fehling A y 1.0 ml. De flehling B.

PASO 05
Preparar un tubo de ensayo con 4 ml. De solucin de sacarosa y 4 ml. Del extracto enzimtico
hervido (tubo B).

PASO 06
Finalmente en otro tubo, poner 4 ml. de sacarosa con 4ml. del extracto enzimtico acido (tubo
C)

PASO 07
Al cabo de 15 minutos adicionar reactivo de felhing a los tubos A, B y C, y luego calentarlos por
unos diez minutos a bao mara y observar los resultados.

RESULTADOS:
TUBOS DESPUES DE LLEVAR A LA CENTRIFUGA:

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LEVADURA
(fermento
biolgico)

observaciones

Toda nuestra levadura se ha

homogenizado
evidentemente, pero al
momento de observar el
resultado, se ha asentado,
solo se obtuvo muestra
sobrenadante, quedando
como precipitado la muestra
solida de la levadura.

ADICION DE LA SACAROSA Y LOS FEHLING EN LOS TUBOS DE ENSAYO,

LLEVANDOLO A LOS DIFERENTES CONDICIONES:
Extracto enzimtico crudo temperatura ambiente
Extracto enzimtico hervido ebullicin por 3 min.
Extracto enzimtico acido) adicin del HCl

TUBOS

OBSERVACIONES

TUBO 01
(extracto enzimtico
crudo)

Este tubo presento mayor coloracin

rojiza en la parte inferior del tubo,
evidentemente se ha hidrolizado la
sacarosa. positivo

TUBO 02
(extracto enzimtico
hervido

TUBO 03
(extracto enzimtico
acido)

La coloracin era rojiza, no hay mucha

evidencia de coloracin rojiza, pero
despus se observa como precipitacin
una pequea cantidad rojiza.
El tubo tiene el color rojizo en la parte
inferior del tubo.(positivo)

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01

02

03

El fundamento de esta reaccin radica en que en un medio alcalino, el ion cprico

(otorgado por el sulfato cprico) es capaz de reducirse por efecto del grupo aldehdo del
azcar (CHO) a su forma de Cu+. Este nuevo ion se observa como un precipitado rojo
ladrillo correspondiente al xido cuproso (Cu2O).

DISCUSION:
Las enzimas catalizan las reacciones disminuyendo la energa libre de activacin necesaria
para que las mismas ocurran. La molcula sobre la cual la enzima acta se denomina
sustrato, esta molcula se transforma obtenindose el producto. La molcula de enzima no
se modifica al trmino de la reaccin y puede continuar catalizando la misma repetidas
veces.
Las enzimas son protenas globulares. Su conformacin espacial presenta un rea,
denominada sitio activo, el cual es fundamental para su actividad cataltica. La naturaleza y
el arreglo espacial de los aminocidos en este sitio activo hacen que ste sea especfico
para un nico tipo de sustrato.
Aun cuando existan distintas molculas que podran ser sustrato, slo aquella cuya forma
sea complementaria con el sitio activo ser capaz de unirse al mismo.
Cuando el sustrato apropiado se une a la enzima, se producen cambios en el sitio activo.
Esta modificacin, denominada ajuste inducido, incrementa la catlisis. La liberacin de los
productos restablece la enzima a su forma original, pudiendo la misma repetir el proceso
sucesivas veces, mientras haya sustrato presente. La conformacin de una enzima es
mantenida por las interacciones que se establecen entre las regiones especficas de los
aminocidos que componen la cadena poli peptdica.

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Debido a ello la misma es susceptible ante cambios en el ambiente en el cual se encuentra,

siendo dos de los factores ms existen algunos tipos de ARN que pueden actuar como
enzimas, catalizando el clivaje y formacin de uniones fosfodister. Estos ARN con actividad
cataltica se denominan ribosimas y son menos comunes que las enzimas proteicas
importantes la temperatura y el pH. Cuando estos varan de forma tal que la conformacin
de la protena es alterada, la enzima pierde su actividad.
La concentracin de H+ afecta la velocidad de reaccin debido a su efecto tanto a nivel de la
ionizacin del sitio activo como de la estructura espacial de la enzima. La catlisis
usualmente requiere que tanto la enzima como el sustrato presenten grupos qumicos
especficos en su forma ionizada o de ionizada para reaccionar. Por ejemplo, la actividad
cataltica puede requerir que un grupo amino de la enzima est en su forma protonada, a pH
alcalino este grupo estar de protonado, por lo cual la tasa de la reaccin decaer.
El anlisis enzimtico o anlisis mediante el empleo de enzimas puede ser utilizado en:
1. La determinacin de los sustratos de la reaccin enzimtica, siendo posible determinar
especficamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad de separar. Para
la cuantificacin de sustratos se pueden utilizar dos mtodos generales:
a. Mtodos de cambio total, de equilibrio o de punto final. En este tipo de mtodos (los ms
utilizados en la prctica) se permite que la reaccin enzimtica se complete o llegue al
equilibrio y se mide la variacin producida en la concentracin de un producto de reaccin o
de un reactivo presente inicialmente en exceso.
b. Mtodos cinticos, en los que se utilizan medidas de la velocidad inicial de la reaccin
enzimtica para deducir la concentracin inicial de sustrato. Los procedimientos de medida
son idnticos a los utilizados para reacciones catalticas en general.
2. Determinacin de los mismos enzimas mediante el empleo de mtodos cinticos en los
que se mide la velocidad de desaparicin del sustrato o de generacin del producto,
relacionada con la concentracin de enzima en disolucin.

CONCLUSIONES:

Los productos de la hidrlisis de la sacarosa -fructosa y glucosa dan resultado

positivo para el test de Fehling, lo cual es indicado por la aparicin de un precipitado
rojo ladrillo.
La sacarosa es un agente reductor y el sulfato de cobre (Cu 2SO4) es un agente
oxidante.
Los tres tubos dieron una coloracin marrn, porque la enzima hidroliza la sacarosa.

CUESTIONARIO:
1. hemos conseguido hidrolizar la sacarosa en los tubos A, B y C? razona porque si o no en
cada uno de ellos.
En los 3 tubos se logro hidrolizar la sacarosa.

Tubo A
La sacarosa se hidroliza a temperatura ambiente por la accin cataltica de la enzima
invertasa pero de una manera lenta. Esto es debido a que la actividad catalitica depende de

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la estructura terciaria de la enzima y esta se conserva en primer lugar a una temperatura
baja (como la T ambiente) hasta luego hidrolizar a la sacarosa. En este caso, en la
sacarosa, el tipo de enlace que subsiste entre sus molculas enlazadas de fructosa y
glucosa (que es para la glucosa y para la fructosa) impide que dicha molcula contenga
terminales reductores (aldehdos o cetnicos). al hidrolizarse, estas molculas quedan libres
recuperando as su poder reductor. De ah que esta de una reaccion positivo.

TUBO B
Bien sabemos que muchas reacciones qumicas transcurren a una velocidad mayor si la
temperatura aumenta, las reacciones catalizadas enzimticamente se comportan
anlogamente hasta cierto punto (punto ptimo). La enzima invertasa, tiene una actividad
cataltica que se debe a una estructura terciaria altamente ordenada y exacta.
Pero al someterla a una temperatura de ebullicin la molcula absorbe demasiada energa,
la estructura terciaria se rompe y la enzima se desnaturaliza, o sea, pierde su actividad
cataltica.
Trabajar con invertasa a temperaturas relativamente elevadas puede ser conveniente debido
a que en los procesos de hidrlisis de sacarosa un requisito indispensable es trabajar a
temperaturas de 60 a 70C para reducir la viscosidad de las soluciones.

TUBO C
Al agregarle el cido clorhdrico al tubo C, hicimos que este se encuentre en un medio acido,
ya que la sacarosa se hidroliza con facilidad en soluciones cidas a velocidades que
aumentan notablemente segn el aumento de la temperatura y la disminucin del pH, con
liberacin de los monosacridos constituyentes, segn la reaccin:

La invertasa en una cso proporcionada por la levadura ; es un catalizador orgnico que

acelera la reaccin de inversin de la sacarosa, desdoblndola por su accin hidroltica, en
otras formas de azcares ms simples.

2. Para hidrolizar qumicamente la sacarosa tuvimos que aadirle a la disolucin HCl y

calentar. Por qu en este caso no hemos tenido que aumentar la temperatura ni alterar el
PH para conseguir la hidrolisis?
Porque la velocidad de reaccion en medio acido es mayor que en la de pH y la temperatura
ya que el medio cido hidroliza el enlace o- glucosdico de la sacarosa y los monosacridos

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resultantes reaccionan con el acido clorhidrico produciendo un color rojo oscuro. Esta
inversion en medio acido logra cambiar el angulo de polarizacion de la sacarosa.

BIBLIOGRAFIA:

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