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Disinfettanti chimici ed antisettici prova quantitativa per superfici non porose per la valutazione dellattivit

batterica e/o fungicida di disinfettanti chimici utilizzati in campo alimentare, industriale, domestico e istituzionale
Metodo di prova e requisiti senza azione meccanica (fase 2, stadio 2)
Questo Standard Europeo stato approvato dal CEN il 20 gennaio 2015.
I membri del CEN sono tenuti a rispettare le Normative Internazionali CEN/CENELEC che stabiliscono le condizioni per
dare a questo Standard Europeo la validit di standard nazionale senza alcuna modifica. Liste aggiornate e riferimenti
bibliografici riguardanti questi standard nazionali possono essere ottenuti con una richiesta al Centro Gestionale CENCENELEC o a qualsiasi membro CEN.
Questo Standard Europeo esiste in tre versioni ufficiali (Inglese, Francese, Tedesco). Una versione in altre lingue
tradotta sotto la responsabilit di un membro CEN nella sua lingua e notificato al Centro Gestionale CEN-CENELEC ha
la stessa validit delle versioni ufficiali.
I membri del CEN sono gli organismi di normazione nazionali di Austria, Belgio, Bulgaria, Croazia, Cipro, Repubblica
Ceca, Danimarca, Estonia, Finlandia, Repubblica di Macedonia, Francia, Germania, Grecia, Ungheria, Islanda, Irlanda,
Italia, Lettonia, Lituania, Lussemburgo, Malta, Olanda, Norvegia, Polonia, Portogallo, Romania, Slovacchia, Slovenia,
Spagna, Svezia, Svizzera, Turchia e Regno Unito.

Prefazione
Questo documento (EN 13697:2015) stato preparato dalla Commissione Tecnica CEN/TC 216 disinfettanti chimici e
antisettici, la cui segreteria tenuta da AFNOR.
A questo Standard Europeo sar data la validit di standard nazionale, o per la pubblicazione negli stessi termini o per
approvazione, al pi tardi di Ottobre 2015 e le norme nazionali conflittuali saranno ritirate al pi tardi di Ottobre 2015.
Lattenzione richiamata sulla possibilit che alcuni degli elementi di questo documento possano essere soggetti a
diritti di brevetto. CEN (e/o CENELEC) non saranno ritenuti responsabili per lidentificazione di alcuni o tutti i diritti di
brevetto.
Questo documento sostituisce EN 13697:2001.

I cambiamenti tra questa edizione e EN 13697:2001 sono i seguenti:


-le sostanze interferenti sono cambiate dallo 0,03% di albumina bovina allo 0,85% nel latte scremato (vedere la
Clausola 4, Tabella 1) per la Pseudomonas aeruginosa solo in condizioni di pulizia;
-La preparazione della spora dellaspergillus brasiliensis (ex aspergillus niger) stata aggiornata in modo da
armonizzare questo passaggio con lemendamento sul metodo di valutazione fungicida QST rilasciato nel 2012 (vedere
5.4.1.3 b);
-Calcoli della media ponderata e dei risultati sono stati modificati in modo da essere armonizzati con le nuove norme
CEN TC 216 (vedere 5.4.1.5, 5.5.2, 5.5.3 e 5.6);
-Altri paragrafi sono stati armonizzati con le nuove norme CEN TC 216 (per esempio la preparazione dellacqua dura,
5.2.2.7)
I risultati ottenuti dalle norme precedenti per laspergillus niger necessitano di essere ripetuti per tenere in
considerazione i nuovi requisiti morfologici delle spore e i cambiamenti nelle sostanze interferenti.

Secondo le Normative Internazionali del CEN-CENELEC, le organizzazioni nazionali di normazione dei seguenti paesi
sono destinati a implementare questi Standard Europei: Austria, Belgio, Bulgaria, Croazia, Cipro, Repubblica Ceca,
Danimarca, Estonia, Finlandia, Repubblica di Macedonia, Francia, Germania, Grecia, Ungheria, Islanda, Irlanda, Italia,
Lettonia, Lituania, Lussemburgo, Malta, Olanda, Norvegia, Polonia, Portogallo, Romania, Slovacchia, Slovenia, Spagna,
Svezia, Svizzera, Turchia e Regno Unito.

Introduzione
Questa Norma Europea descrive un metodo di valutazione per stabilire se un prodotto presentato come un
disinfettante nei campi descritti nel Clausola 1 ha o non ha attivit battericida e/o fungicida o fermentativa sulle
superfici non porose.
Questa Norma Europea stata rivista in modo da modificare le sostanze interferenti in condizioni di pulizia utilizzate
per la Pseudomonas aeruginosa; in modo di modificare il calcolo di N, NC, NT, Nc, Na e di conseguenza i risultati finali
e di armonizzare la norma con le altre norme recenti CEN TC 216.
Il test di laboratorio simula minuziosamente le condizioni pratiche di utilizzo. Le condizioni scelte (tempo di contatto,
temperatura, organismi in superficie) riflettono i parametri che si trovano in situazioni pratiche incluse le condizioni
che potrebbero influenzare lazione dei disinfettanti. Ogni concentrazione duso rilevata da questo test corrisponde a
definite condizioni sperimentali.
Le condizioni sono destinate a ricoprire scopi generici e a permettere riferimenti tra laboratori e tipi di prodotto.
Comunque, per alcuni utilizzi le raccomandazioni duso di un prodotto possono differire e quindi sono necessarie
ulteriori condizioni di valutazione.

1 Portata
Questa Norma Europea specifica un metodo di prova (fase 2/passo 2) e i requisiti minimi per attivit battericida e/o
fungicida o fermentativa dei disinfettanti chimici che formano un preparato omogeneo fisicamente stabile nellacqua
dura o nel caso di prodotti pronti alluso con acqua nel campo alimentare, industriale, domestico e istituzionale,
esclusi i campi e le situazioni dove la disinfezione in presenza di indicazione medica ed esclusi i prodotti usati su
tessuti viventi.
La portata di questa Norma Europea si applica almeno ai seguenti:
a) Lavorazione, distribuzione e rivendita di:
1) Cibo di origine animale:
i) latte e latticini;
ii) carne e prodotti di carne;
iii) pesce, frutti di mare e prodotti;
iv) uova e ovoprodotti;
v) cibo per animali;
vi) ecc.

2) Cibo di origine vegetale:


i) bevande;
ii) frutta, verdure e derivati (inclusa distilleria di zucchero);
iii) farina, macinati e prodotti da forno;
iv) cibo per animali;
v) ecc.
b) Campi domestici e istituzionali:
1) esercizi di ristorazione;
2) aree pubbliche;
3) trasporti pubblici;
4) scuole;
5) vivai;
6) negozi;
7) sale fitness;
8) contenitori per rifiuti (cestini);
9) alberghi;
10) abitazioni;
11) aree di ospedali clinicamente non sensibili;
12) uffici;
13) ecc.
c) Altri campi industriali:
1) materiali di imballaggio;
2) biotecnologia (lievito, proteine, enzimi);
3) farmaceutici;
4) cosmetici e articoli da bagno;
5) tessili;
6) industria spaziale, industria informatica;
7) ecc.
Usando questa Norma Europea, possibile determinare lattivit battericida o fungicida o fermentativa di un prodotto
non diluito. Una volta testate tre concentrazioni, nellintervallo attivo e non attivo, richiesta la diluizione del
prodotto e, quindi, il prodotto forma un composto stabile omogeneo nellacqua dura.

LEN 14885 specifica in dettaglio la relazione dei vari test luno con laltro e di usare precauzioni.
NOTA 1 Il metodo descritto destinato a determinare lattivit di formulazioni commerciali di sostanze attive sui
batteri e/o funghi nelle condizioni in cui sono usate.
NOTA 2 Questo metodo non pu essere usato per valutare lattivit di prodotti contro i micobatteri.

2 Riferimenti normativi
I seguenti documenti, interamente o in parte, sono normativamente riferiti in questo documento e sono indispensabili
per il suo utilizzo. Per i riferimenti datati si utilizza solo ledizione citata. Per i riferimenti non datati si utilizza lultima
edizione del documento riferito (inclusi gli emendamenti).
EN 12353, Disinfettanti chimici e antisettici preservazione di organismi di prova utilizzati per determinare lattivit
battericida (inclusa la Legionella), micobattericida, sporicida, fungicida e virucida (inclusi i batteriofagi)
EN 14885, Disinfettanti chimici e antisettici Applicazione della Norma Europea per i disinfettanti chimici e antisettici
ISO 4793 Filtri di laboratorio sinterizzati Graduazione di porosit, classificazione e nominazione

3 Termini e definizioni
Per i fini di questo documento si applicano i termini e le definizioni date in EN 14885.

4 Requisiti
Il prodotto deve dimostrare una riduzione di almeno 4 logaritmi decimali (lg) per i batteri e una riduzione di almeno 3
logaritmi decimali (lg) per i funghi, quando testati in accordo con la Tabella 1 e 5.5.1.

Tabella 1 Condizioni obbligatorie e aggiuntive

Condizioni del test


Organismo di prova
(vedere 5.2.1)
obbligatorio

Attivit batterica su
superfici non porose senza
azione meccanica
Enterococcus hirae
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus

Esempio

Salmonella typhimurium
Lactobacillus brevis
Enterobacter cloacae

Temperature del test


obbligatoria
aggiuntiva

Tra 18C 1C e
25C 1C
4C 1C; 10C 1C;

Attivit fermentativa su
superfici non porose senza
azione meccanica
Candida albicans

Saccharomyces cerevisiae
(per le birrerie)
Saccharomyces cerevisiae
var. diastaticus (per le
birrerie)
Tra 18C 1C e
25C 1C
4C 1C; 10C 1C;

Attivit fungicidaf su
superfici non porose senza
azione meccanica
Candida albicans
Aspergillus Brasiliensis
(ex A. niger)

qualsiasi organismo di
prova rilevante

Tra 18C 1C e
25C 1C
4C 1C; 10C 1C;

Tempo di contatto
obbligatorio
aggiuntivo

Sostanze interferenti
Obbligatorio
condizioni di pulizia

condizioni di sporco

aggiuntivo
Riduzione logaritmica
da un controllo
dellacqua (logaritmo
decimale)

40C 1C
5min 10s

40C 1C
15min 10s

40C 1C
15min 10s

1min 5s; 15min 10s;


30min 10s; 60min 10s
0,3g/l di Albumina Bovina
per Staphylococcus aureus,
Enterococcus hirae e
Escherichia coli;
8,5g/l di latte scremato per
Pseudomonas aeruginosa
3,0g/l di Albumina Bovina
per Staphylococcus aureus,
Enterococcus hirae,
Pseudomonas aeruginosa e
Escherichia coli;

1min 5s; 15min 10s;


30min 10s; 60min 10s

1min 5s; 15min 10s;


30min 10s; 60min 10s

0,3g/l Albumina Bovina per


C. albicans

3,0g/l Albumina Bovina per


C. albicans

0,3g/l Albumina Bovina per


C. albicans e A. brasiliensis

3,0g/l Albumina Bovina per


C. albicans e A. brasiliensis

qualsiasi sostanza rilevante

qualsiasi sostanza rilevante

qualsiasi sostanza rilevante

4Log

3Log

3Log

Il tempo di contatto obbligatorio per i disinfettanti per superfici dichiarato nella Tabella 1 stato scelto per abilitare la
comparazione di condizioni standard. Le condizioni del test riferite non sono assolutamente intese come un requisito
per luso di un prodotto, n come un requisito per la valutazione e accettazione di prodotti da parte delle autorit
regolanti.
Il tempo di contatto raccomandato per luso del prodotto tra le responsabilit del fabbricante.
Quando appropriato (per scopi specifici), unaggiuntiva attivit battericida/fermentativa/fungicida dovr essere
determinata sotto altre condizioni di tempo, temperatura, ceppi aggiuntivi e sostanze interferenti in modo da tenere
in considerazione le specifiche condizioni duso previste.
NOTA Per le condizioni aggiuntive, la concentrazione definita da un risultato pu essere inferiore di quella ottenuta
sotto le condizioni dei test obbligatori.

5 Metodi di prova

5.1 Principio
Un test di sospensione di batteri o funghi in una soluzione di sostanze interferenti inoculato in una superficie di
prova di acciaio inossidabile e asciutto. Un preparato campione del prodotto sotto valutazione applicato in modo
che copra la pellicola asciutta. La superficie mantenuta a una specifica temperatura per un periodo di tempo
definito. La superficie trasferita a un mezzo di neutralizzazione precedentemente convalidato in modo che lazione
del disinfettante sia immediatamente neutralizzata. Il numero di organismi sopravvissuti che pu essere recuperato
dalla superficie determinato quantitativamente.
anche determinato il numero di batteri o funghi in una superficie trattata con acqua dura al posto del disinfettante e
la riduzione della carica batterica attribuita al prodotto calcolata per differenza.

5.2 Materiali e reagenti

5.2.1 Organismi di prova


Lattivit battericida dovr essere valutata usando i seguenti quattro ceppi:
-Pseudomonas aeruginosa

ATCC 15 442
(ATCC 15 442, ATCC 6 538, ATCC 10 541, ATCC 10 536, ATCC 10 231, ATCC 16 404
e ATCC 13311 sono la raccolta di numeri di ceppi forniti dallAmerican Type
Culture Collections. Questa informazione fornita per comodit dellutilizzatore
di questa norma e non costituisce un appoggio del CEN al prodotto nominato.
Prodotti equivalenti possono essere usati se pu essere dimostrato che portano
agli stessi risultati.);

-Staphylococcus aureus

ATCC 6 538;

-Enterococcus hirae

ATCC 10 541;

-Escherichia coli

ATCC 10 536.

Lattivit fungicida o fermentativa dovr essere valutata usando i seguenti due ceppi:
-Candida albicans

ATCC 10 231;

-Aspergillus brasiliensis (ex A. niger)

ATCC 16 404.

Se richiesto per unapplicazione specifica, si pu scegliere da ceppi aggiuntivi, per esempio:


-Salmonella typhimurium

ATCC 13 311;

-Lactobacillus brevis

DSM 6 235;

-Enterobacter cloacae

DSM 6 234;

-Saccharomyces cervisiae (per birrerie) o

ATCC 9 763 o DSM 1 333;

- Saccharomyces cervisiae var. diastaticus (per

DSM 70 487.

birrerie)
NOTA Vedere lAnnesso A per il corrispondente numero di ceppo in alcune altre raccolte di colture.
Se ceppi aggiuntivi sono utilizzati, dovranno essere incubati attraverso condizioni di crescita ottimali (temperatura,
tempo, atmosfera) e annotati nel rapporto di valutazione.
Se i ceppi aggiuntivi selezionati non corrispondono ai ceppi specificati dovr essere verificata la loro idoneit a fornire
inoculi di concentrazione sufficiente. Se i ceppi aggiuntivi testati non sono classificati in un centro di riferimento, le
loro caratteristiche di identificazione dovranno essere stabilite. In aggiunta, dovranno essere tenute dal laboratorio di
verifica o di coltura nazionale di riferimento per 5 anni.

5.2.2 Mezzi di coltura e reagenti

5.2.2.1 Generale
I reagenti dovranno essere di grado analitico e/o appropriati agli scopi microbiologici.

5.2.2.2 Acqua
Lacqua dovr essere libera di sostanze che sono tossiche o inibenti a batteri o funghi. Dovr essere acqua appen
distillata in vetro e non demineralizzata.
Sterilizzare nellautoclave (vedere 5.3.2.1).
NOTA 1 Se lacqua sterilizzata durante la sterilizzazione dei reagenti, questo non necessario.
NOTA 2 Se acqua distillata di qualit adeguata non disponibile, pu essere usata acqua per preparato iniettabile
(vedere European Pharmacopoeia).

5.2.2.3 Triptone Soia Agar (TSA)


Per il mantenimento dei ceppi batterici e del rendimento della conta batterica.
Triptone, digestione pancreatica della caseina

15,0g

Peptone di soia, digestione in papaina della farina di soia

5,0g

NaCl

5,0g

Agar

15,0g

Acqua (vedere 5.2.2.2)

1000,0ml

Sterilizzare nellautoclave (vedere 5.3.2.1). Dopo la sterilizzazione, il pH del mezzo di coltura dovr essere equivalente
a 7,2 0,2 quando misurato a 20C.

5.2.2.4 Estratto di malto agar (MEA)


Per il mantenimento dei ceppi fungosi, sporulazione e rendimento della conta batterica.
Estratto di malto (commestibile, per esempio la polvere Cristomalt di Difal)

30,0g

Agar

15,0g

Acqua (vedere 5.2.2.2)

1000,0ml

Lestratto di malto dovr essere commestibile (per esempio la polvere Cristomalt di Difal) o lequivalente che non sia
altamente purificato e basato non solo sul maltosio (per esempio Estratto di malto di OXIOID). Tuttavia, se ci sono
problemi producendo almeno il 75% di spore spinose vedere 5.4.1.4.2.
Sterilizzare nellautoclave (5.3.2.1a). Dopo la sterilizzazione, il pH del mezzo di coltura dovr essere equivalente a 5,6
0,2 quando misurato a (20 1)C.

In caso si incontrino problemi con la neutralizzazione (5.5.2.3 e 5.5.2.4), pu essere necessario aggiungere
neutralizzatore al MEA. Lannesso B fornisce una guida su quali neutralizzanti possono essere usati.

5.2.2.5 Diluente
Soluzione di triptone e cloruro di sodio:
Triptone, digestione pancreatica della caseina

1,0g

NaCl

8,5g

Acqua (vedere 5.2.2.2)

1000,0ml

Sterilizzare nellautoclave (vedere 5.3.2.1). Dopo la sterilizzazione, il pH del mezzo di coltura dovr essere equivalente
a 7,0 0,2 quando misurato a 20C.

5.2.2.6 Neutralizzatore
Il neutralizzatore dovr essere convalidato per il prodotto con un test in accordo a 5.5.2.3 e 5.5.2.4. Il neutralizzatore
dov essere sterile.
NOTA Linformazione sui neutralizzatori che sono risultati adatti per alcune categorie di prodotti data nellAnnesso
B.

5.2.2.7 Acqua dura per la diluizione dei prodotti


Lacqua dura per la diluizione dei prodotti dov essere preparata come segue:
-soluzione A: dissolvere 19,84g di anidro di MgCl2 e 46,24g di anidro di CaCl2 in acqua (vedere 5.2.2.2) e diluire in
1000ml. Sterilizzare con filtrazione a membrana (5.3.2.19) o nellautoclave (5.3.2.1a). Lautoclave, se usata, pu
causare una perdita di liquido. In questo caso, riportare fino a 1000ml con acqua (5.2.2.2) in condizioni asettiche.
Depositare la soluzione nel frigorifero (5.3.2.15) per non pi di una settimana.
-soluzione B: dissolvere 35,02g di NaHCO3 in acqua (5.2.2.2) e diluire in 1000ml. Sterilizzare con filtrazione a
membrana (5.3.2.19). Depositare la soluzione nel frigorifero (5.3.2.15) per non pi di una settimana.
Aggiungere almeno 600ml di acqua (vedere 5.2.2.2) a 6,0ml di soluzione A in un pallone tarato da 1000ml, quindi
aggiungere 8,0ml di soluzione B. Mescolare e diluire in 1000ml di acqua (vedere 5.2.2.2).
Sterilizzare passando attraverso un filtro con una dimensione massima dei pori di 0,45m.
Il pH dellacqua dura dovr essere di 7,0 0,2, quando misurato a (20 1)C (5.3.2.6). Se necessario, aggiustare il pH
usando una soluzione di approssimativamente 40g/l (circa 1mol/l) di idrossido di sodio (NaOH) o
approssimativamente 36,5g/l (circa 1mol/l)di acido cloridrico (HCl).
Lacqua dura dovr essere appena preparata in condizioni asettiche e usata entro 12h.
NOTA Quando si preparano le soluzioni per il prodotto di prova (5.4.2), laggiunta del prodotto allacqua dura produce
in ogni provetta una durezza finale dellacqua differente espressa in carbonato di calcio (CaCO 3). In ogni caso, la
durezza finale inferiore a 375mg/l di carbonato di calcio.

5.2.2.8 Sostanze interferenti

5.2.2.8.1 Generale
Le sostanze interferenti dovranno essere scelte secondo le condizioni duso definite per il prodotto.
Le sostanze interferenti dovranno essere sterili e preparate per il test al doppio della loro concentrazione finale.
Per le sostanze interferenti aggiuntive, la composizione ionica (per esempio durezza di pH, calcio e/o magnesio) e la
composizione chimica (per esempio sostanze minerali, proteine, carboidrati, lipidi, detergenti) dovranno essere
totalmente definite.
NOTA Il termine sostanza interferente usato anche se contiene pi di una sostanza.
Il metodo di preparazione e sterilizzazione insieme alla composizione dovranno essere annotati nel rapporto di
valutazione (vedere 5.7).

5.2.2.8.2 Albumina bovina e soluzioni scremate


La soluzione di albumina bovina per le condizioni di valutazione dovr essere preparata come segue:
-Preparazione per condizioni di pulizia:
-dissolvere 0,6g di albumina bovina (frazione Cohn V per il mezzo di coltura Dubos) in 100ml di acqua (vedere
5.2.2.2);
-sterilizzare con filtrazione a membrana da 0,45m (vedere 5.2.2.19), tenere in frigorifero e usare entro un mese.
La concentrazione finale di albumina bovina nella procedura di valutazione (vedere 5.5.2) 0,3g/l.
La soluzione di latte scremato per le condizioni di valutazione dovr essere preparata come segue:
-Latte scremato (condizioni di pulizia solo per la Pseudomonas aeruginosa), con garanzia di assenza di antibiotici o
additivi, dovr essere ricostituito a un tasso di 100g di polvere per litro di acqua (5.2.2.2). La soluzione di lavoro dovr
essere preparata come segue:
-preparare una soluzione di 1,70% (V/V) in acqua (vedere 5.2.2.2) aggiungendo 17 parti del 10% di soluzione madre
(100g di latte scremato in 1l di acqua) a 83 parti di acqua;
-sterilizzare per 30min a 105C 3C (o 5min a 121C 3C).
La concentrazione finale di latte nella procedura di valutazione (vedere 5.5.2) di 8,5g/l di latte ricostituito.
-Preparazione per condizioni di sporco;
-dissolvere 0,60g di albumina bovina (frazione Cohn V per il mezzo di coltura Dubos) in 100ml di acqua (vedere
5.2.2.2);
-sterilizzare con filtrazione a membrana da 0,45 m (vedere 5.3.2.19), tenere in frigorifero ed usare entro un mese.
La concentrazione finale di albumina bovina nella procedura di valutazione (vedere 5.5.2) di 3,0g/l.

In aggiunta, altre sostanze interferenti per disinfettanti chimici con propriet detergenti (perci simulanti condizioni di
sporco aggiuntive per usi specifici) possono essere scelti da:

5.2.2.8.3 Latte (caseifici)


Il latte scremato, con garanzia di assenza di antibiotici o additivi, dovr essere ricostituito a un tasso di 100g di polvere
per litro dacqua (vedere 5.2.2.2). La soluzione di lavoro dovr essere preparata come segue:
-preparare una soluzione di 2,0% (V/V) in acqua (vedere 5.2.2.2) aggiungendo 2 parti di latte ricostituito a 98 parti di
acqua;
-sterilizzare per 30 minuti a 105C 3C (o 5 min a 121C 3).
La concentrazione finale di latte nella procedura di valutazione (vedere 5.5.2) dovr essere 1,0% (V/V) di latte
ricostituito.

5.2.2.8.4 Estratto di lievito (fabbriche di birra)


Lestratto di lievito disidratato per la batteriologia, dovr essere preparato come segue:
-preparare una soluzione da 20g/l in acqua (vedere 5.2.2.2), aggiustare il pH fino a 7,0 0,02 con lidrossido di sodio;
-sterilizzare nellautoclave (vedere 5.3.1).
La concentrazione finale di estratto di lievito nella procedura di valutazione (vedere 5.5.2) dovr essere di 10g/l.

5.2.2.8.5 Saccarosio (bevande, industrie delle bibite analcoliche)


Preparare una soluzione di 20g/l in acqua (vedere 5.2.2.2), sterilizzare con filtrazione a membrana.
La concentrazione finale di saccarosio nella procedura di valutazione (vedere 5.5.2) di 10g/l.

5.2.2.8.6 Soluzioni tampone di pH 5,0 e pH 9,0 (clean-in-place)


La soluzione tampone dovr essere descritta nel rapporto di valutazione e il valore di pH dovr essere registrato. Il pH
finale nella valutazione dovr essere uguale a 5,0 0,2 o 9,0 0,2.

5.2.2.9 Laurilsolfato di sodio (cosmetici o industria della cosmetica)


Preparare una soluzione di 10g/l di laurilsolfato di sodio in acqua (vedere 5.2.2.2). Sterilizzare nellautoclave (vedere
5.3.1).
La concentrazione finale di laurilsolfato di sodio nella procedura di valutazione (vedere 5.5.2) di 5g/l.

5.2.3 Superficie di prova

Dischi di acciaio inossidabile (dischi da 2cm di diametro) 304 con finitura 2b su entrambi i lati. La superficie dovrebbe
essere piatta.
Le superfici dovrebbero essere usate una volta sola.
Prima dellutilizzo le superfici dovrebbero essere piazzate in un becher (dimensione minima: 50ml) contenente non
meno di 20ml di 5% (V/V) Decon per 60min. Risciacquare immediatamente i dischi con acqua fresca corrente
distillata per 10s.
La superficie non dovr potersi seccare in alcun caso. I dischi dovranno essere maneggiati solo con forcipi.
Risciacquare i dischi con acqua (vedere 5.2.2.2) per ulteriori 10 secondi in modo da assicurare la completa rimozione
del tensioattivo.
Per fornire un sufficiente flusso dacqua, un serbatoio sterilizzato per erogazione di liquidi con adeguate manichette e
connettori o altri adeguati metodi possono essere usati e regolati per fornire approssimativamente 2000ml al minuto.
Per sterilizzare, collocare il disco pulito in una vasca contenente il 70% (V/V) di iso-propanolo per 15min. Rimuovere il
disco e asciugare per evaporazione sotto un flusso daria laminare.

5.3 Apparecchiatura e vetreria

5.3.1 Generale
Sterilizzare tutta la vetreria e le parti di apparecchiatura che verranno in contatto con i mezzi di coltura e i reagenti o il
campione, eccetto quelle che sono fornite sterili, da uno dei seguenti metodi:
3

a) nellautoclave (vedere 5.3.2.1) mantenendolo a 121 0 C per un tempo di attesa minimo di 15 minuti;
b) nello sterilizzatore a calore secco (vedere 5.3.2.1) mantenendolo a 180C per un tempo di attesa minimo di 30
minuti, a 170C per un tempo di attesa minimo di 1h o a 160C per un tempo di attesa minimo di 2h.

5.3.2 Equipaggiamento tipico per laboratorio microbiologico


in particolare, i seguenti:

(lattrezzatura usa e getta accettabile in alternativa alla vetreria riusabile)

5.3.2.1 Apparecchiatura per la sterilizzazione:


3

a) per la sterilizzazione a calore umido, unautoclave capace di essere mantenuta a 121 0 C per 15min;
b) per il trattamento termico a secco, un forno ad aria calda capace di mantenere i 180C per un tempo di attesa
minimo di 30min, a 170C per un tempo di attesa minimo di 1h o a 160C per un tempo di attesa minimo di 2h.

5.3.2.2 Cabine a temperatura controllata.

5.3.2.3 Vasche dacqua in grado di essere regolate a 20C 1C, a 45C 1C e a temperature di valutazione
aggiuntive di 0 1C (vedere 5.5.1).
5.3.2.4 Incubatrice (per attivit battericida), in grado di essere regolata o a 36C 1C o 37C 1C. Unincubatrice a
37C 1C pu essere usata se unincubatrice a 36C 1C non disponibile.
5.3.2.5 Incubatrice (per attivit fungicida o fermentativa), in grado di essere regolata a 30C 1C.
5.3.2.6 pH-metro, con una taratura di precisione di 0,1 unit pH a 20C 1C.
5.3.2.7 Cronometro.
5.3.2.8 Mixer a vortice (agitatore meccanico o agitatore elettromeccanico, per esempio Vortex mixer).
5.3.2.9 Recipienti: provette, flaconi o matracci di capacit adeguata.
5.3.2.10 Pipette graduate di capacit nominale di 10ml, 1ml, 0,1ml e 0,05ml, o pipette automatiche tarate.
5.3.2.11 Capsule di Petri di dimensione da 90mm a 100m.
5.3.2.12 Microsfere di vetro (Diametro: 5mm).
5.3.2.13 Matracci tarati.
5.3.2.14 Agitatore meccanico.
5.3.2.15 Frigorifero in grado di essere regolato da 2C a 8C.
5.3.2.16 Forcipi.
5.3.2.17 Cabina a flusso laminare daria filtrata microbiologica.
5.3.2.18 Filtro sinterizzato: Porosit da 40m a 100m (vedere ISO 4793).
5.3.2.19 Apparecchiatura di filtrazione a membrana, costruito con un materiale compatibile con le sostanze da
filtrare.
Lapparecchiatura dovr avere un supporto del filtro di almeno 50ml di volume. Dovr essere adatto allutilizzo di filtri
di diametro da 47mm a 50mm e dimensione dei pori di 0,45m per la sterilizzazione dellacqua dura (5.2.2.7).

5.4 Preparazione delle sospensioni dellorganismo di prova e soluzioni del prodotto esaminato

5.4.1 Sospensioni dellorganismo di prova

5.4.1.1 Colture primarie degli organismi di prova


Le colture primarie dovranno essere tenute in accordo ai requisiti di EN 12353.

5.4.1.2 Coltura di lavoro degli organismi di prova

a) Batteri:
In modo da preparare la coltura di lavoro dellorganismo di prova, la sub-coltura dalla coltura primaria (vedere 5.4.1.1)
by streaking on TSA slopes (vedere 5.2.23) e incubare (vedere 5.3.2.5). Dopo 18h fino a 24h, preparare una seconda
sub-coltura dalla prima sub-coltura nello stesso modo e incubare per 18h fino a 24h. Da questa seconda sub-coltura,
una terza sub-coltura pu essere prodotta nello stesso modo.
NOTA 1 La seconda e terza sub-coltura sono coltura(e) di lavoro.
Se non possibile preparare la secondo sub-coltura in un particolare giorno, una sub-coltura da 48h pu essere usata
per le seguenti sub-colture, purch la sub-coltura sia stata tenuta nellincubatrice durante il periodo di 48h. In queste
circostanze, preparare una ulteriore sub-coltura da 24h dopo aver proceduto. Non prendere una quarta sub-coltura.
Per ceppi ulteriori (vedere 5.2.1), qualsiasi scostamento da questo metodo di coltura dei batteri o preparazione delle
sospensioni dov essere annotato, precisandone i motivi nel rapporto di valutazione.
b) funghi:
In modo da preparare la coltura di lavoro della Candida albicans, la sub-coltura dalla coltura primaria (vedere 5.4.1.1)
by streaking onto MEA slopes (vedere 5.2.23) e incubare (vedere 5.3.2.5). Dopo 42h fino a 48h, preparare una seconda
sub-coltura dalla prima sub-coltura nello stesso modo e incubare per 42h fino a 48h. Da questa seconda sub-coltura,
una terza sub-coltura pu essere prodotta nello stesso modo.
NOTA 2 La seconda e/o terza sub-coltura sono coltura(e) di lavoro.
Per lAspergillus brasiliensis (precedentemente A. niger) (5.2.1), usare solo la prima sub-coltura cresciuta sul MEA
(5.2.2.4) nelle capsule di Petri o nei matracci con tappi ventilati (5.3.2.17) e incubare a 30C 1C per 7 fino a 9 giorni.
Nessuna ulteriore sub-coltura richiesta. Non impilare le capsule di Petri durante lincubazione per migliorare
lomogeneizzazione della temperatura.
Alla fine dellincubazione, tutte le colture dovranno mostrare una superficie marrone scuro o nera. Colture con
presenza di piccole e sporadiche aree bianche o grigie potrebbero essere tenute.

5.4.1.3 Sospensioni esaminate


a) sospensione batterica esaminata:
Prendere 10ml di diluente (vedere 5.2.2.5) e piazzarlo in un matraccio da 100ml con 5g di microsfere di vetro (vedere
5.3.2.12). Prendere la coltura di lavoro (vedere 5.4.1.2.) e trasferire anse delle cellule nel diluente. Le cellule
dovrebbero essere sospese nel diluente immergendo lanello nel diluente e sfregandolo contro il lato del matraccio
per distaccare le cellule. Agitare il matraccio per 3min usando un agitatore meccanico (5.3.2.14). Aspirare la
sospensione dalle microsfere di vetro e trasferirlo ad un altro matraccio. Aggiustare il numero di cellule nella
7
7
sospensione a 1,5x10 cfu/ml fino a 5,0x10 cfu/ml usando il diluente, stimando il numero di unit mediante uno
spettrofotometro o altre tecniche adatte. Mantenere questa sospensione in una vasca dacqua a 20C 1C e usarlo
entro 2h.
b) sospensione fungina esaminata:
1) Candida albicans:
Prendere 10ml di diluente (vedere 5.2.2.5) e piazzarlo in un matraccio da 100ml con 5g di microsfere di vetro.
Prendere la coltura di lavoro (vedere 5.4.1.2.) e trasferire anse delle cellule nel diluente. Le cellule dovrebbero essere
sospese nel diluente immergendo lanello nel diluente e sfregandolo contro il lato del matraccio per distaccare le

cellule. Agitare il matraccio per 3min usando un agitatore meccanico (5.3.2.14). Aspirare la sospensione dalle
microsfere di vetro e trasferirlo ad un altro matraccio. Aggiustare il numero di cellule nella sospensione a
8
8
1,5x10 cfu/ml fino a 5,0x10 cfu/ml usando il diluente, stimando il numero di unit mediante uno spettrofotometro o
altre tecniche adatte. Mantenere questa sospensione in una vasca dacqua a 20C 1C e usarlo entro 2h.
2) Aspergillus brasiliensis (ex A. niger):
Prendere la coltura di lavoro (vedere 5.4.1.2) e sospendere le cellule in 10ml di soluzione sterile 0,05% w/v di
polisorbato 80 (qualit analitica, non idrolizzato in accordo con European Pharmacopoeia, Volume 1. TWEEN 80 un esempio di un prodotto adatto disponibile
in commercio. Questa informazione fornita per comodit dellutilizzatore di questa norma e non costituisce un appoggio del CEN al prodotto nominato.) in acqua
(vedere 5.2.2.2). Usando una bacchetta o una spatola distaccare le conidiospore dalla superficie della coltura.
Trasferire la sospensione in un matraccio e gentilmente agitare a mano per un minuto insieme alle microsfere di vetro
(5.3.2.12). La sospensione filtrata attraverso un filtro sinterizzato (vedere 5.3.2.18).
Eseguire un esame microscopico con ingrandimento a x400 subito dopo lo la preparazione per mostrare:
-la presenza di unalta concentrazione (almeno il 75% di spore spinose) di caratteristiche spore mature, per esempio
spore spinose (contro le spore lisce);
-lassenza di germinazione delle spore (controllare almeno 10 campi visivi);
-lassenza di frammenti di miceli (controllare almeno 10 campi visivi).
Se sono presenti spore germinate, scartare la sospensione.
Se sono presenti miceli, procedere a una seconda filtrazione sinterizzata.
Se sono ancora presenti miceli, scartare la sospensione.
Se il 75% delle spore spinose non ottenuto pu essere a causa della coltura dellAspergillus brasiliensis (ex A. niger) o
dei mezzi di colture usati per produrre queste spore. In questa situazione, sar necessario ottenere la coltura da
unaltra raccolta di colture e/o usare un MEA di un diverso fornitore.
7

Aggiustare il numero di spore nella sospensione tra 1,5x10 cfu/ml fino a 5,0x10 cfu/ml usando il diluente (5.2.2.5),
stimando il numero di cfu in qualsiasi modo adatto. Usare la sospensione entro 4h in una vasca dacqua controllata a
20C 1C (5.3.2.3). In ogni caso, aggiustare la temperature secondo la 5.5.1 solo immediatamente prima linizio della
valutazione (5.5.2).
Luso di uno strumento per la conta cellulare per aggiustare il numero di cellule altamente raccomandato. Quando si
usa unadeguata camera di conteggio, seguire le istruzioni espressamente.
-5

-6

Per il conteggio, preparare 10 e 10 diluizioni della sospensione usando diluente (5.2.2.5). Mescolare (5.3.2.8).
Prendere un campione di 1,0ml di ciascuna diluizione in doppione e inoculare usando il metodo delle diluizioni
successive o il metodo di diffusione su piastra.
a) Quando si usa il metodo delle diluizioni successive, trasferire circa met di ogni campione da 1,0ml in distinte
capsule di Petri (per esempio in doppione = quattro piastre) e aggiungere da 15ml a 20ml di MEA sciolto (5.2.2.4)
raffreddato a (451)C.
b) Quando si usa il metodo di diffusione su piastra, spargere circa un quarto di ogni campione da 1,0ml su un adeguato
numero (almeno quattro) di piastre con superficie asciutta contenente MEA (5.2.2.4) (per esempio in doppione
almeno otto piastre).
Questa sospensione esaminata non dov essere depositata per pi di 2 giorni tra i 2C e gli 8 C.

La sospensione esaminata dovr essere mescolata (vedere 5.3.2.8) immediatamente prima di usarla per risospendere
le spore.

5.4.1.4 Conteggio delle sospensioni batteriche e fungine esaminate


-6

-7

Diluire la sospensione batterica aggiustata (vedere 5.4.1.3) a 10 (diluizione in serie) e a 10 e la sospensione fungina
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(vedere 5.4.1.3) a 10 e a 10 usando diluente (vedere (5.2.2.5). Mescolare la sospensione (vedere 5.3.2.8).
Prendere un campione di 1,0ml di ogni diluizione in doppione e inoculare per diluizioni successive. Pipettare ogni
campione da 1,0ml in distinte capsule di Petri (vedere 5.3.2.11) e aggiungere tra i 15ml e i 20ml di TSA sciolto (5.2.2.2)
per i batteri e tra i 15ml e i 20ml di MEA sciolto (5.2.2.3) per i funghi, raffreddato a (451)C.
a) Conteggio delle sospensioni batteriche esaminate
1) Per i ceppi batterici, incubare le piastre a 36C 1C o a 37C 1C per 24h. Scartare ogni piastra che non
conteggiabile per qualsiasi motivo. Incubare le piastre per ulteriori 24h. Non ricontare le piastre che non mostrano pi
colonie conteggiabili. Ricontare le piastre rimanenti.
b) Conteggio delle sospensioni fungine esaminate
1) Per i ceppi fungini, incubare le piastre a 30C 1C per 24h (Candida albicans), per 42h fino a 48h (Aspergillus
brasiliensis (ex A. niger)). Scartare qualsiasi piastra che non sia conteggiabile per qualsiasi motivo. Conteggiare le
piastre e determinare il numero di unit che formano le colonie. Incubare le piastre per ulteriori 24h. Non ricontare le
piastre che non mostrano pi colonie ben distinte. Ricontare le piastre rimanenti. Per lAspergillus brasiliensis (ex A.
niger), continuare lincubazione per ulteriori 20h fino a 24h e se necessario un ulteriore 20h fino a 24h, posto che il
numero di colonie conteggiabili (colonie discrete) stia aumentando.
Determinare il pi alto numero di colonie per ogni campione da 1ml.
Per lincubazione e il conteggio, vedere 5.4.1.5.

5.4.1.5 Conteggio del valore medio ponderato delle sospensioni esaminate


a) Scartare qualsiasi piastra che non sia contabile per qualsiasi motivo. Contare le piastre e determinare il numero
totale di cfu. Non ricontare le piastre che non mostrano pi colonie ben distinte. Ricontare le piastre rimanenti. Se il
numero aumentato, usare solo il numero pi alto per valutazioni ulteriori.
b) Solo le piastre che mostrano un numero di colonie compreso in una fascia di 15-300 per i batteri e i lieviti e 15-150
per le muffe vanno usate per effettuare il calcolo del risultato. Una deviazione del 10% accettata, cos come i limiti
sono 14 e 330 per i batteri e lieviti e 14-165 per le muffe.
N = Log 0,025xc
(n1 + 0,1n2) x d
dove
c la somma dei valori Vc presi in considerazione;
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n1 il numero di valori Vc presi in considerazione nella diluizione minore, per esempio 10 ;


-7

n2 il numero di valori Vc presi in considerazione nella diluizione maggiore, per esempio 10 ;

-6

d il fattore di diluizione corrispondente alla diluizione minore (10 ).

5.4.2 Soluzioni dei prodotti esaminate


Dovrebbero essere registrati i dettagli dei campioni del prodotto come ricevuto.
Le soluzioni dei prodotti esaminate dovrebbero essere preparate in acqua dura (vedere 5.2.2.7) a un minimo di tre
concentrazioni includendo una concentrazione nella fascia attiva e una concentrazione nella fascia non attiva.
Per i prodotti solidi, dissolvere il prodotte come ricevuto tramite pesatura di almeno 1g 10mg del prodotto in un
matraccio tarato e diluire con acqua pesante (vedere 5.2.2.7). Successive diluizioni dovranno essere preparate in
matracci tarati (vedere 5.3.2.13) su una base di volume/volume in acqua dura (vedere 5.2.2.7).
Per i prodotti liquidi, diluizioni del prodotto dovranno essere preparate in acqua dura (5.2.2.7) su una base di
volume/volume usando matracci tarati (vedere 5.3.2.13).
Il prodotto come ricevuto pu essere usato come una delle soluzioni dei prodotti esaminate. Per i prodotti forniti
pronti alluso, lacqua (vedere 5.2.2.2) dovr essere usata per preparare le diluizioni.
Quando il prodotto diluito in acqua pesante, dovr dare un preparato stabile fisicamente omogeneo.
La soluzione del prodotto esaminata e le sue diluizioni dovranno essere appena preparate e usate entro 2h.
La concentrazione del prodotto indicata nel rapporto di valutazione dovr essere la concentrazione esaminata.
Registrare la concentrazione esaminata in termini di volume per volume o peso per volume.

5.5 Procedura

5.5.1 Scelta di condizioni sperimentali


La selezione della temperatura di contatto, tempo di contatto e sostanze interferenti dovranno essere effettuate
secondo luso pratico previsto dal prodotto (vedere Clausola 4 Tabella 1) come segue:
a) temperatura esaminata; (C):
1) la temperatura di prova dovr essere a temperatura ambiente nel fascia tra (18 1)C e (25 1)C;
2) temperature aggiuntive possono essere scelte tra 4C 1C o 10C 1C o 40C 1C. Una camera a temperatura
controllata dovr essere usata per temperature diverse da quella ambiente.
b) tempo di contatto; t (min):
1) il tempo di contatto da testare di 5min 10s per i batteri e 15min 10s per i funghi;
2) tempo agguntivo pu essere scelto tra 1min 10s, 5min 10s, 15min 10s, 30min 10s e 60min 10s.
c) ceppi:
1) i ceppi dovranno essere come dato nel 5.2.1.
d) in caso di sostanze interferenti:

1) la sostanza interferente obbligatoria da esaminare 0,3g/l di albumina bovina (5.2.2.8.2) o 0,85% di latte scremato
in caso di Pseudomonas aeruginosa per condizioni di pulizia (5.2.2.8.2) o 3,0g/l di albumina bovina (5.2.2.8.2) per
condizioni di sporco secondo la Clausola 4, Tabella 1 e applicazioni pratiche;
2) nel caso di requisiti aggiuntivi altre sostanze interferenti (vedere 5.2.2.8.3 fino a 5.2.2.8.6) possono essere scelte
secondo il campo operativo del prodotto.
Il prodotto non dovr causare la formazione di qualsiasi osservabile accelerazione nelle condizioni sperimentali usate.

5.5.2 Procedure di valutazione

5.5.2.1 Valutazione Nd determinazione di concentrazioni microbicide


La procedura per determinare le concentrazioni microbicide la seguente:
a) Per preparare la valutazione della sospensione microbica pipettare 1,0ml di sostanza interferente (5.2.2.8) in una
provetta. Aggiungere 1,0ml di sospensione esaminata (5.4.1.3). Far partire il cronometro immediatamente, mescolare
e piazzare la provetta in una vasca dacqua o in una cabina a temperatura controllata (5.3.2.2) alla temperatura di
valutazione scelta C 1C per 2 min 10s.
Immediatamente prima di aggiungerla, la sospensione esaminata dovr essere ben mescolata per risospendere gli
organismi.
b) Piazzare le superfici di prova (5.2.3) in una capsula di Petri sterile e assicurarsi che la piastra sia in posizione
orizzontale. Preparare le superfici di prova inoculando 0,05ml della sospensione microbica esaminata (5.5.2.1a) su
ogni superficie di prova. Asciugare le superfici e 37C finch non sono visibilmente asciutte. chiaro che lasciugatura
delle superfici esaminate avverr a ritmi diversi a causa delle condizioni ambientali del laboratorio e del modello
dellincubatrice (per esempio con o senza un ventilatore). Per questo motivo non data una durata in tempo e il
tempo minimo richiesto dalle superfici per diventare visibilmente asciutte dovrebbe essere stabilito per ogni
laboratorio. Il tempo di asciugatura non dovrebbe eccedere i 60min e se lo fa, dovranno essere usate condizioni
dasciugatura alternative. Permettere alle superfici di prova di stabilizzarsi alla temperatura di valutazione scelta C
1C.
c) Pipettare 0,1ml di ogni soluzione di prodotto esaminata (5.4.2) per essere esaminata su una distinta superficie
asciutta assicurandosi che linoculo asciutto sia completamente ricoperto dal prodotto esaminato. Piazzare le superfici
nella cabina e temperatura controllata (5.3.2.2) alla temperatura di valutazione scelta C 1C e tempo di contatto t.
d) Al termine di t, trasferire ciascuna superficie (Nd) a un distinto recipiente contenente 10ml di neutralizzatore
(5.2.2.6) insieme a sufficienti microsfere di vetro (per esempio 5g) per supportare la superficie. Le superfici dovranno
essere posizionate con la superficie inoculata verso il basso a contatto con le microsfere. Agitare i recipienti per
minimo 1 min. Lagitamento dovrebbe essere sufficientemente vigoroso da assicurarsi che la superficie di prova si
muova costantemente sulle microsfere. Dopo un tempo di neutralizzazione di 5min 10s preparare una serie di
-1
-2
diluizioni decimali fa 10 a 10 della miscela neutralizzata nel diluente (5.2.2.5). Prendere un campione di 1,0ml della
miscela neutralizzata e di ogni diluizione in doppione e inoculare usando il metodo delle diluizioni successive o il
metodo di diffusione su piastra.
1) Quando si usa il metodo delle diluizioni successive, pipettare ogni campione da 1,0ml in distinte capsule di Petri e
aggiungere tra i 15ml e i 20ml di TSA sciolto (5.2.2.3) per i batteri e di MEA per i funghi, raffreddato a 45C 1C.

2) Quando si usa il metodo di diffusione su piastra , spargere ogni campione da 1,0ml diviso in porzioni di
approssimativamente la stessa dimensione su di un appropriato numero (almeno due) di piastre con superficie
asciutta contenenti TSA (5.2.2.3).
Per lincubazione ed il conteggio, vedere 5.5.3.
e) Recuperare la superficie esaminata (Nts), lasciar scorrere via il neutralizzatore e risciacquare con 10ml di acqua
(5.2.2.2). Trasferire in una capsula di Petri contenente 10ml di TSA solidificato (5.2.2.3) per i batteri e in una capsula di
Petri contenente 10ml di MEA solidificato (5.2.2.3) per i funghi e posizionare sopra lagar, il lato esaminato verso
laltro. Aggiungere 10ml di TSA (5.2.2.3) e/o di MEA (5.2.2.4) sciolti e raffreddati a 45C.
f) Attuare le procedure dalla a) alla e) usando le altre soluzioni di prodotto esaminate contemporaneamente.
g) Attuare le procedure dalla a) alla f) applicando le altre condizioni obbligatorie e se opportuno altre condizioni
sperimentali aggiuntive (5.5.1).

5.5.2.2 Controllo dellacqua Nc


La procedura per determinare il controllo dellacqua la seguente:
a) Posizionare una superficie di prova (5.2.3) in una capsula di Petri sterile e assicurarsi che sia in posizione orizzontale.
Inoculare 0,05ml di sospensione microbica di prova (5.5.2.1a) sulla superficie di prova. Asciugare la superficie a 37C
finch non visibilmente asciutta (5.5.2.1b).
b) Per il controllo dellacqua (Nc), pipettare sulla superficie di valutazione 0,1ml di acqua dura (5.2.2.7) o di acqua
(5.2.2.2) in caso di prodotti pronti alluso assicurandosi che linoculo asciutto sia completamente ricoperto dacqua.
Posizionare la superfice in una cabina a temperatura controllata (5.3.2.2) alla temperatura di valutazione scelta di
1C.
c) Alla fine di t, trasferire la superficie Nc in un recipiente contenente 10ml di neutralizzatore (5.2.2.6) insieme a
sufficienti microsfere di vetro (per esempio 5g) per supportare la superficie. Le superfici dovrebbero essere
posizionate con la superficie inoculata verso il basso a contatto con le microsfere. Agitare i recipienti per minimo
1min. Lagitamento dovr essere sufficientemente vigorosa da assicurare che la superficie esaminata si muova
costantemente sulle microsfere. Dopo un tempo di neutralizzazione di 5min 10s preparare una serie di diluizioni
-3
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-5
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decimali della miscela neutralizzata nel diluente (5.2.2.5), preparare diluizioni a 10 , 10 , 10 e 10 per i ceppi
-2
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-5
batterici e diluizioni a 10 , 10 , 10 e 10 per i ceppi fungini. Prendere un campione di 1,0ml di queste diluizioni in
doppione e inoculare usando il metodo delle diluizioni successive o il metodo di diffusione su piastra.
d) Recuperare la superficie di prova (Nts), lasciar scorrere via il neutralizzatore e risciacquare con 10ml di acqua
(5.2.2.2). Trasferire in una capsula di Petri contenente 10ml di TSA solidificato (5.2.2.3) per i batteri e una capsula di
Petri contenente 10ml di MEA solidificato (5.2.2.4) per i funghi e posizionare sopra lagar, il lato esaminato verso lalto.
Aggiungere 10ml di TSA (5.2.2.3) e/o MEA (5.2.2.4) sciolti e raffreddati a 45C. Per incubazione e conteggio vedere
5.5.3.

5.5.2.3 Controllo del neutralizzatore NC verifica dellassenza di tossicit del neutralizzatore


Per verificare lassenza di tossicit del neutralizzatore, la procedura la seguente:
a) Preparare una superficie di prova inoculata (5.5.2.1 a) e b)).

b) Pipettare 10ml di neutralizzatore (5.2.2.6) in un recipiente con sufficienti microsfere di vetro (per esempio 5g) per
supportare la superficie. Quindi aggiungere 0,1ml di acqua dura (5.2.2.7) o acqua (5.2.2.2) in caso di prodotti pronti
alluso. Mescolare e lasciare in contatto per 5min 10s a 20C 1C.
c) Alla fine del tempo di neutralizzazione trasferire la superficie di prova inoculata e asciutta nel recipiente e
posizionare la superficie inoculata own wards a contatto con le microsfere (per esempio 5g). Agitare i recipienti per
minimo 1min. Lagitamento dovrebbe essere sufficientemente vigoroso da assicurarsi che la superficie di prova si
muova costantemente sulle microsfere.
d) Dopo un tempo di neutralizzazione di 5min 10s preparare una serie di diluizioni decimali della miscela
-3
-5
neutralizzata NC nel diluente (5.2.2.5) per produrre diluizioni da 10 a 10 . Prendere un campione da 1,0ml di ogni
diluizione in doppione e inoculare usando il metodo delle diluizioni successive o il metodo di diffusione su piastra
(5.5.2.2. d)). Per incubazione e conteggio vedere 5.5.3.

5.5.2.4 Metodo di convalida NT convalida di diluizione-neutralizzazione


Per convalidare il metodo di neutralizzazione della diluizione, la procedura la seguente:
a) Preparare una superficie di prova (5.5.2.1. a) e b)).
b) Pipettare 10ml di neutralizzante (5.2.2.7) in un recipiente con sufficienti microsfere di vetro a supportare la
superficie. Quindi aggiungere 0,1ml della pi alta concentrazione di prodotto usata nella valutazione (5.5.2.2)
Mescolare e lasciare in contatto per 5min 10s a 20C 1C.
c) Alla fine del tempo di neutralizzazione trasferire la superficie di prova nel recipiente e posizionare la superficie
inoculata verso il basso a contatto con le microsfere (per esempio 5g). Agitare i recipienti per minimo 1min.
Lagitamento dovrebbe essere sufficientemente vigoroso da assicurarsi che la superficie prova si muova
costantemente sulle microsfere.
d) Dopo 5min 10s preparare una serie di diluizioni decimali della miscela neutralizzata NT nel diluente (5.2.2.4) per
-3
-5
produrre diluizioni da 10 a 10 . Prendere campioni da 1,0ml di ogni diluizione in doppione e inoculare usando il
metodo delle diluizioni successive o il metodo di diffusione su piastra.

5.5.3 Conteggio delle miscele di prova


Per i ceppi batterici, incubare le piastre a 36C 1C o a 37C 1C per 24h.
Per i ceppi fungini, incubare le piastre a 30C 1C per 24h (Candida albicans), per 42h fino a 48h (Aspergillus
brasiliensis (ex A. niger)). Scartare qualsiasi piastra che non sia conteggiabile per qualsiasi motivo. Conteggiare le
piastre e determinare il numero di unit che formano le colonie. Incubare le piastre per ulteriori 24h. Non ricontare le
piastre che non mostrano pi colonie ben distinte. Ricontare le piastre rimanenti. Per lAspergillus brasiliensis (ex A.
niger), continuare lincubazione per ulteriori 20h fino a 24h e se necessario ulteriori 20h fino a 24h, posto che il
numero di colonie conteggiabili (colonie discrete) stia aumentando.
Registrare il numero di unit che formano le colonie (Nts) che rimangono sulla superficie esaminata.
Scartare qualsiasi piastra che non sia conteggiabile per qualsiasi motivo. Conteggiare le piastre per determinare il
numero totale di cfu. Non ricontare le piastre che non mostrano pi colonie ben distinte. Ricontare le piastre
rimanenti. Se il numero aumentato, usare solo il numero pi alto per ulteriori valutazioni.

Solo le piastre che mostrano un numero di colonie compreso in una fascia di 15-300 per i batteri e i lieviti e 15-150 per
le muffe vanno usate per effettuare il calcolo del risultato. Una deviazione del 10% accettata, cos come i limiti sono
14 e 330 per i batteri e lieviti e 14-165 per le muffe.
Nel test, laddove il numero di cfu su ogni piastra conteggiata sia 14, il numero di cfu/ml dovrebbe essere registrato
2
come 1,4x10 ( 2,15 Log). Laddove il numero di cfu su ogni piastra conteggiata sia 330 o 165, il numero di cfu/ml
5
5
dovrebbe essere registrato come 3,3x10 ( 5,52 Log) o 1,6x10 ( 5,22 Log).
Calcolare Nc e Nd il numero di cfu recuperati dalla superficie di valutazione usando la seguente equazione:
Nd (o Nc) = log (c x 10/n x d)
Dove
c la somma dei valori Vc presi in considerazione;
n il numero di valori Vc presi in considerazione;
d la diluizione presa in considerazione.
Se uno o entrambi i valori Vc dei doppioni sono o sotto il limite inferiore o sopra quello superiore, esprimere i risultati
come meno di o pi di. In particolare, nel test, laddove il numero di cfu su ogni piastra conteggiata sia 14, il
2
numero di cfu/ml dovrebbe essere registrata come 1,4x10 ( 2,15 Log). Laddove il numero di cfu su ogni piastra
5
5
conteggiata sia 330 o 165, il numero di cfu/ml dovrebbe essere registrato come 3,3x10 ( 5,52 Log) o 1,6x10 (
5,22 Log).
Se entrambi i valori Vc dei doppioni sono zero, si assume che il conteggio (in ufc) meno di 5/ml nel mezzo di
neutralizzazione e un valore Na 0,10 dovrebbe essere usato.
Calcolare NC e NT il numero di cfu recuperati dalla superficie di valutazione usando la seguente equazione:
NC, NT = log (c x 10/n xd)
Dove
c la somma dei valori Vc presi in considerazione;
n il numero di valori Vc presi in considerazione;
d la diluizione presa in considerazione.

5.6 Calcolo ed espressione dei risultati

5.6.1 Elaborazione dei dati: conteggio di valori di media ponderata


Larrotondamento dei risultati dovr essere effettuato arrotondando i valori esponenziali a due cifre significative.
Quando si arrotondano le cifre: se lultima cifra maggiore o uguale a 5 la cifra precedente aumentata di ununit;
se lultima cifra minor di 5 la cifra precedente rimane invariata; procedere in questo modo fino a raggiungere due
cifre significative.
I valori log sono arrotondati a due cifre decimali significative come mostrato nellAnnesso B e Annesso C, Tabella C.1.

Se i conteggi osservati da due diluizioni consecutive falliscono entro lintervallo 14-330 o 14-165, allora un valore di
media ponderata calcolato come segue:
(m+m+n+n)/2.2xVxd
dove
m, m sono le due riproduzioni alla diluizione minore espresse in cfu;
n, n sono le due riproduzioni alla diluizione maggiore espresse in cfu;
V il volume dellinoculato nella piastra espresso in ml;
d il fattore di diluizione minore.
In caso non tutte le riproduzioni ad ogni diluizione ricadano entro lintervallo di 14-300 o 14-165, la media ponderata
prender in considerazione i seguenti:
Caso 1: solo m e n ricadono nellintervallo di 14-330 o 14-165, la formula cambia come segue:
(m+n)/1.1xVxd

(5)

Caso 2: solo m, m e n ricadono nellintervallo di 14-330 o 14-165, la formula cambia come segue:
(m+m+n)/2.1xVxd

(6)

Caso 3: solo m, n e n ricadono nellintervallo di 14-330 o 14-165, la formula cambia come segue:
(m+n+n)/1.2xVxd

(7)

Caso 4: solo m ricade nellintervallo di 14-330 o 14-165, la formula cambia come segue:
m/Vxd

(8)

5.6.2 Verifica della metodologia


Per ogni valutazione, controllare che:
a) la conta media dalla piastra doppione usata per il calcolo di N, Nc, Nd, NC, NT siano tra 14 e 330 per ceppi di batteri
e lieviti e tra 14 e 165 per ceppi di muffe;
b) 6,57 N 7,10 Log per i batteri;
c) 5,57 N 6,10 Log per i finghi;
d) Nc 6,27 Log per i batteri;
e) Nc 5,27 Log per i funghi;
f) NC 0,5 Nc;
g) NC 0,5 Nc non maggiore di 0,3;
h) Nts meno di 100 cfu/ml per le concentrazioni attive. Altrimenti, il recupero dei microrganismi non stato
sufficiente. Per concentrazioni inattive, Nts pu non essere numerabile;

i) controllo dei conteggi della media ponderata: il quoziente non inferiore a 5 e non superiore a 15. Si applica solo
al calcolo di N.

5.6.3 Espressione dei risultati

5.6.3.1 Riduzione
La riduzione (R) espressa in logaritmo.
Per ogni organismo esaminato registrare il numero di cfu/ml nella procedura di valutazione dellattivit microbicida
del prodotto (5.5.2.2) e nella procedura di controllo (5.5.2.3). Per ogni concentrazione di prodotto ed ogni condizione
sperimentale, calcolare la riduzione del logaritmo decimale (lg) a parte usando lequazione:
R = Nc Nd

5.6.4 Conclusioni

5.6.4.1 Attivit su superfici non porose per scopi generici


Lattivit battericida sulle superfici per scopi generici caratterizzata dalla concentrazione del prodotto testato per cui
i criteri 5.6.1 e 5.6.2 sono rispettati e per cui una riduzione di 4 log o pi in vitalit dimostrata nelle condizioni di
valutazione richieste: 5min 10s, 18C e 25C e condizioni di pulizia o di sporco (vedere Clausola 4), quando gli
organismi esaminati sono Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus hirae e Escherichia coli.
Lattivit fungicida sulle superfici per scopi generici caratterizzata dalla concentrazione del prodotto testato per cui i
criteri 5.6.1 e 5.6.2 sono rispettati e per cui una riduzione di 3 log o pi in vitalit dimostrata nelle condizioni di
valutazione richieste: 15min 10s, 20C 1C e condizioni di pulizia o di sporco (vedere Clausola 4), quando gli
organismi esaminati sono Candida albicans e Aspergillus brasiliensis (ex A.niger).
Lattivit fermentativa sulle superfici per scopi generici caratterizzata dalla concentrazione del prodotto testato per
cui i criteri 5.6.1 e 5.6.2 sono rispettati e per cui una riduzione di 3 log o pi in vitalit dimostrata nelle condizioni di
valutazione richieste: 15min 10s, 20C 1C e condizioni di pulizia o di sporco (vedere Clausola 4), quando gli
organismi esaminati sono Candida albicans.
Lattivit battericida, fungicida e fermentativa sulle superfici per scopi generici caratterizzata dalla concentrazione
del prodotto testato per cui i criteri 5.6.1 e 5.6.2 sono rispettati e:
-per cui una riduzione di 4 log o pi in vitalit dimostrata nelle condizioni di valutazione richieste: 5min 10s, 20C
1C e condizioni di pulizia o di sporco (vedere Clausola 4), quando gli organismi esaminati sono Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus hirae e Escherichia coli.
- per cui una riduzione di 3 log o pi in vitalit dimostrata nelle condizioni di valutazione richieste: 15min 10s, 20C
1C e condizioni di pulizia o di sporco (vedere Clausola 4), quando gli organismi esaminati sono Candida albicans e
Aspergillus brasiliensis (ex A.niger).
- per cui una riduzione di 3 log o pi in vitalit dimostrata nelle condizioni di valutazione richieste: 15min 10s, 20C
1C e condizioni di pulizia o di sporco (vedere Clausola 4), quando gli organismi esaminati sono Candida albicans.

5.6.4.2 Attivit su superfici non porose per scopi specifici


Lattivit battericida e/o fungicida o fermentativa sulle superfici per scopi specifici caratterizzato dalla
concentrazione del prodotto esaminato per cui i criteri 5.6.1 e 5.6.2 sono rispettati e per cui:
- una riduzione di 4 log o pi in vitalit dimostrata, quando gli organismi esaminati sono Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Enterococcus hirae e Escherichia coli e se necessario ulteriori organismi esaminati;
e/o per cui:
- una riduzione di 3 log o pi in vitalit dimostrata, quando gli organismi esaminati sono Candida albicans e
Aspergillus brasiliensis (ex A.niger), e se necessario ulteriori organismi esaminati;
- una riduzione di 3 log o pi in vitalit dimostrata, quando gli organismi esaminati sono Candida, e se necessario
ulteriori organismi esaminati;
sottoposti a condizioni aggiuntive: t in minuti, in gradi C, condizioni di pulito o di sporco e sostanze interferenti
aggiuntive (vedere 5.5.1).

Rapporto di valutazione
Il rapporto di valutazione dovr riferirsi a questo Standard Europeo.
Il rapporto di valutazione dovr stabilire, almeno, le seguenti informazioni:
a) identificazione del laboratorio;
b) identificazione del campione:
1) nome del prodotto;
2) numero di lotto;
3) fabbricante;
4) data di consegna;
5) condizioni di conservazione;
6) sostanza(e) attiva e la sua(loro) concentrazione(i) (opzionale);
c) condizioni sperimentali:
1) periodo di analisi;
2) diluente del prodotto usato durante la valutazione;
3) concentrazioni del prodotto esaminato;
4) aspetto delle diluizioni del prodotto;
5) tempo(i) di contatto;
6) temperatura(e) di valutazione;

7) sostanze interferenti;
8) reazioni tra linoculo in presenza di sostanze interferenti e il prodotto;
9) temperatura dincubazione;
10) neutralizzatore dei ceppi batterici o fungini usati;
11) identificazione dei ceppi batterici e/o fungini usati;
12) identificazione della superfice esaminata;
d) procedura operativa:
1) dettagli completi per lesame di convalida del mezzo di neutralizzazione dovranno essere forniti;
e) risultati della valutazione:
1) prove di convalida;
2) valutazione dellattivit battericida e/o fungicida e/o fermentativa;
f) esito;
g) localit, data e firma(e) riconoscibile(i).
NOTA Un esempio di un rapporto di valutazione tipico dato nella Tabella C.1.

Annesso A
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Annesso B
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Annesso C
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Annesso D
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Annesso E
La formula usata per il calcolo della precisione dei risultati del test possono essere trovati in EN 1040:2005, Annesso E.
Il numero di ripetizioni che danno una precisione del fattore di riduzione deve essere stabilito da adeguati studi

collaborativi. Una guida allinterpretazione dei risultati del test riguardo la loro precisione e il numero di ripetizioni del
test dato nellEN 14885.

Bibliografia
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