Gua de Trabajos Prcticos

Bioqumica General
CDIGO: DBIO1038
2016

INDICE

Calendarizacin General de los laboratorios

Indicaciones Generales para el Trabajo de Laboratorio

Sesin 1: Bioseguridad en el Laboratorio, Normas APA y

Preparacin de Soluciones

Sesin 2: Construccin de una Curva de Calibracin y

Cuantificacin de Protenas

11

Sesin 3: Determinacin de Actividad Enzimtica

15

Sesin 4: Metabolismo de Glcidos: Determinacin de Glicemia

18

Sesin 5: Metabolismo de lpidos: Determinacin de Colesterol,

Colesterol-HDL yTriglicridos

20

Sesin 6: Metabolismo Nitrogenado: Determinacin de GOT y GGT

26

CALENDARIZACIN GENERAL DE LOS LABORATORIOS (LAS FECHAS SON

PROPIAS DE CADA SECCIN)

Fecha
de
realizacin

N
Sesin

Tema

Tipo

Bioseguridad, Normas APA y Soluciones

Laboratorio

Construccin de Curva de Calibracin y

Determinacin de Protenas

Laboratorio

Determinacin de Actividad Enzimtica

Laboratorio

Metabolismo de Glcidos: determinacin

de Glicemia

Laboratorio

5
6
7

Metabolismo de Lpidos: Determinacin de

Colesterol, Colesterol-HDL y Triglicridos
Metabolismo Nitrogenado: Determinacin
de
aminotransferasa
y
gammaglutamiltransferasa
SEMINARIO CLNICO
Examen

Laboratorio
Laboratorio
Presentacin

INDICACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO

Del trabajo en laboratorio:

Los

Laboratorios se desarrollan en dos mdulos y segn las fechas

calendarizadas para cada seccin.
Se exige un 100% de asistencia a las actividades prcticas, la ausencia a estas
actividades implica no cumplir con los requisitos de aprobacin para la
asignatura (ver Programa de la Asignatura)
Se exige puntualidad, el retraso en el horario de entrada implica el no ingreso al
laboratorio y, por lo tanto, la ausencia a ste y el no cumplimiento de los
requisitos de aprobacin.
Es requisito para el ingreso y permanencia en el laboratorio el uso del delantal
blanco cerrado de mangas largas. El estudiante que no cumpla con esta
condicin no puede ingresar al laboratorio, quedando ausente de la actividad
prctica.
Es requisito para el ingreso y permanencia al laboratorio la tenencia de un
cuaderno de laboratorio personal y los implementos necesarios para el registro
de las anotaciones y resultados correspondientes a cada prctico.
Cada estudiante es responsable del material entregado para que desarrolle cada
prctico. Al finalizar la actividad deber entregar los materiales en buenas
condiciones, as como el lugar de trabajo limpio y ordenado.
Se exige un comportamiento acorde al trabajo en laboratorio, por lo que aquellos
estudiantes que no presenten una conducta responsable y realicen desorden
sern expulsados del laboratorio, quedando ausentes de la actividad.
No se permite durante el desarrollo de las actividades prcticas el uso de celular,
gorros, ingerir cualquier tipo de alimento o bebida, masticar chicle, fumar, el uso
de cualquier implemento ajeno al trabajo de laboratorio que genere distraccin
de los estudiantes. Las mochilas y/o bolsos deben ser dejados ordenadamente
en los estantes dispuestos para ello; no se permite la entrada y salida libre del
estudiante del laboratorio, la salida sin autorizacin implica que el estudiante no
puede volver a ingresar al laboratorio quedando ausente de la actividad.
Las actividades sern realizadas en grupos de cuatro estudiantes o segn las
indicaciones del profesor encargado.
En lo posible traer un notebook, ya que se necesitar buscar informacin o
realizar clculos.
El estudiante debe llegar con la materia relacionada al prctico estudiada, con
dominio y conocimiento de las actividades a desarrollar durante cada laboratorio.
En el aula virtual se encuentran disponibles la Gua de Laboratorios, adems de
los informes y Trabajo Previo para cada Laboratorio (excepto el Laboratorio 1
que no tiene Trabajo Previo).
El Trabajo Previo, tal como lo dice su nombre, debe traerse REALIZADO en forma
individual y su cumplimiento o no, contribuir a la nota de Evaluacin de
Desempeo.
Al comienzo de cada Laboratorio se realizar un test corto de carcter individual
de la materia correspondiente a cada actividad prctica.

 Los estudiantes debern entregar al TRMINO DE LA SESIN, un INFORME

GRUPAL, que incluye el TRABAJO PREVIO (ste deber consolidarse entre los
trabajos previos individuales).
El informe se realizar en una hoja cuadriculada de cuadernillo, de ACUERDO AL
FORMATO y el Trabajo Previo y el Informe sern evaluados en conjunto.
Recuerde revisar que en su trabajo estn escritos los nombres de todos los
integrantes del grupo.
De las Calificaciones:

Las actividades prcticas se calificarn con tres notas que equivalen al Solemne

1, Solemne 2 y Solemne 3 y cada una de ellas contempla las notas de los

controles, Informes (que incluyen los Trabajos Previos) y la nota de Evaluacin
de desempeo, adems de una nota correspondiente a un Seminario.
Estas notas se ponderarn de acuerdo a lo establecido en el programa de la
asignatura.

SESIN N1:
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO, NORMAS APA Y
PREPARACION DE SOLUCIONES
Unidad 1: Conoce los aspectos bsicos relacionados con el laboratorio de
bioqumica y las tcnicas de espectrofotometra, asociado a las mediciones en
investigacin y determinaciones clnicas.
INTRODUCCIN:
La Bibliografa utilizada en cualquier trabajo de investigacin acadmica juega un rol
muy importante. En los Trabajos Previos para preparar los Laboratorios, as como
en los Informes, los alumnos debern consultar y citar las fuentes bibliogrficas
fidedignas.
Estas fuentes bibliogrficas para que se consideren vlidas, deben corresponder a
libros o revistas cientficas, no recomendndose citar textos encontrados en Internet
que no correspondan a publicaciones acadmicas.
Toda informacin obtenida de un trabajo, debe ser citada como perteneciente al o
los autores del artculo, constituyendo un plagio si no se efecta este procedimiento
(La accin de copiar y pegar constituye un plagio). La idea, es recabar informacin,
comprenderla y expresarla con las palabras propias, citando la fuente bibliogrfica
de donde se obtuvo la informacin.
Las citas bibliogrficas tienen un formato definido, el cual puede realizarse de
acuerdo a distintas normas, por ejemplo: estilo AMA, estilo Vancouver, estilo APA,
entre otras.
Una de las ms usadas son las Normas APA de la Asociacin Estadounidense de
Psicologa (American Psychological Association, A.P.A.) y son las que aprenderemos
a usar y sern exigidas en todos los trabajos.
En la actualidad la utilizacin de disoluciones se ha masificado en diversas reas de
la ciencia, de tal forma que su preparacin constituye una prctica rutinaria de la
cual la medicina no queda exenta. Se entiende por disolucin a la dispersin
homognea del soluto en un solvente. Este proceso generalmente requiere de una
fuente de energa para que ocurra, que puede ser calor y/o una fuerza mecnica
como la agitacin.
Las disoluciones ms comnmente utilizadas son aquellas en las que el soluto es un
slido o un lquido y el solvente es un lquido, normalmente agua. La
concentracin de la disolucin nos da informacin acerca de la cantidad de soluto
incorporado en el solvente, expresado en unidades de concentracin. Existen
diversas formas de expresar la concentracin, pero slo se analizarn aquellas

unidades de mayor aceptacin internacional. Las unidades de concentracin ms

utilizadas son p/p, p/v y Molaridad. En muchas ocasiones es fundamental preparar
ciertas disoluciones a concentraciones muy bajas y que sea en forma precisa. Las
disoluciones son ms estables a mayor concentracin, por lo que stas se
almacenan lo ms concentradas posibles. Cuando se trata de un producto de alto
costo, se prepara slo la cantidad necesaria del producto deseado para optimizar
recursos, por lo que es til entender el concepto de dilucin seriada.
Dilucin Seriada: El objetivo de las diluciones seriadas es obtener una disolucin
diluida a partir de otra disolucin concentrada, a travs de diluciones sucesivas de
volumen y concentracin establecidos por el usuario.
La magnitud de las diluciones y el volumen final de las disoluciones son
establecidos por el usuario de acuerdo a la disponibilidad de material para realizarlo,
y a sus objetivos, siendo una de las finalidades de esta tcnica facilitar en la
prctica, la dilucin de una solucin concentrada para su cuantificacin.
El clculo de concentraciones y alcuotas se determina mediante la relacin:
C1xV1=C2xV2, teniendo siempre claro la concentracin de la solucin inicial y la de la
solucin final, y el volumen de la solucin final. La siguiente Figura muestra un
ejemplo de una dilucin de una solucin de albmina.
Si se conoce la concentracin de la solucin original, y se efecta un nmero
determinado de diluciones seriadas, es factible obtener distintas concentraciones de
una solucin final segn lo que se necesite.
200

L
200

L
200

Solucin de
albmina
250 mg/ml

L
200

200 L
H 2O
A

L
200

200 L
H2O
B

L
200

200 L
H2O
C

200 L
H2O
D

Se eliminan

200 L
H 2O
E

Micropipetas: son instrumentos volumtricos bastante precisos, que permiten

medir volmenes pequeos. Poseen un dial que permite variar la cantidad de
volumen a pipetear. Este volumen est medido en micro litros (L). Existen
distintas micropipetas segn su capacidad: de 1-20 L, de 20-100 L, de 100-1000
L

Equivalencia de unidades
Recuerde que:
1 ml = 1000 L
Por lo tanto, para transformar mL a L, debe multiplicar por un factor unitario. Por
ejemplo, si desea tomar 0,45 mL, el clculo de equivalencia es:
0,45

1000
= 450
1

Para el uso correcto de las micropipetas, considere que se trata de material

volumtrico delicado, por lo que deben tratarse con cuidado y no forzarlas. Para
medir adecuadamente un volumen, debe seguir los siguientes pasos:
1)
2)
3)
4)

Marcar en el dial el volumen deseado.

Apretar el mbolo hasta el primer tope. (con el pulgar, segn imagen)
Con la pipeta bien recta, introducir la punta en el material a pipetear.
Aspirar el contenido previamente ajustado, cuidando de no generar
burbuja.
5) Para verter el volumen aspirado, apretar el mbolo, hasta el segundo
tope para vaciar el volumen completamente.
6) Se desecha la punta en el recipiente correspondiente despus de
terminar.

Soluciones de uso en el rea de la Salud.

1.- Suero fisiolgico: El suero fisiolgico es una solucin de agua destilada con
cloruro de sodio en una concentracin determinada que corresponde a 0,9 g de
NaCl (s) puro en 100 ml de solucin (0.9 % p/v), la que se puede expresar
tambin como: 9 g/litro. Es una solucin isotnica, ya que tiene la misma
osmolaridad que la sangre. Por la importancia y frecuencia de utilizacin en Clnica,
Ud. deber recordar la forma de prepararlo.
2.- Sueros glucosados o glucosalinos: Son soluciones de agua y glucosa o
cloruro de sodio y glucosa en distintas concentraciones. Comercialmente los sueros
glucosados se encuentran en concentraciones de 5 % p/v; 10 % p/v y 20 % p/ v. el
suero glucosalino isotnico en una concentracin de glucosa 2.5 % y cloruro de
sodio 0.45 %.
3.-Tintura de Yodo: Es una solucin alcohlica que contiene 6,5 % p/v de yodo
puro; 2,5 % p/v de yoduro de potasio, etanol y agua destilada. Se utiliza como
desinfectante. Si quisiramos preparar 1000 g de Tintura de yodo se requiere:
I2 (s)
=
65 g
KI (s)
=
25 g
C2H5OH (l) =
846 g
H2O (l)
=
64 g
4.- Solucin de Hipoclorito de Sodio: El hipoclorito de sodio se expende en el
comercio bajo distintos nombres (Clorinda, cloro lquido, etc.) y la concentracin del
hipoclorito de sodio nos permite liberar cloro gaseoso segn la siguiente ecuacin
qumica:
2H2O(l) + 2ClO-(ac)

Cl2(g) +

4OH- (ac)

Se ha determinado que esas soluciones comerciales contienen cloro al 4 % p/v

Ud. deber calcular la cantidad en volumen de esa solucin comercial para obtener
distintos volmenes de solucin al 0,5 % p/v.
MATERIALES:
Balanza digital.
Pipetas y micropipetas.
Propipetas.
Probetas
Vasos de precipitados.
Tubos de ensayos.
Matraz aforado.
NaCl(s); C6H12O6(s); I2(s); KI(s); C2H5OH (l), Solucin de hipoclorito de sodio
comercial.
Pisetas con Agua destilada
ESTRATEGIA

Aprendizaje colaborativo, se trabajar en grupos de 3-4 alumnos o segn lo indique

el profesor. El grupo deber organizarse para llevar a cabo todas las actividades.
ACTIVIDADES:
1) Preparacin de soluciones de suero fisiolgico, de suero glucosado o
glucosalino al 5 % y clculo de sus densidades.
a) Preparacin de solucin de suero fisiolgico y clculo de su densidad.
a)
Realice los clculos correspondientes para determinar la cantidad de NaCl (s)
puro necesario para preparar 10,0 ml de suero fisiolgico.
b)
Pese en la balanza esa cantidad de NaCl (s) puro y vace cuidadosamente a
un matraz aforado de 10,0 ml. Vaya agregando agua y agitando. Afore, coloque la
tapa del matraz y mezcle cuidadosamente.
c) Clculo de la densidad del suero fisiolgico: Pese un vaso precipitado limpio y
seco (con capacidad para recibir los 10,0 ml de suero fisiolgico) y anote el valor de
su masa.
d) Trasvasije con mucho cuidado, el suero fisiolgico que Ud. prepar, desde el
matraz aforado al vaso de precipitado recin pesado. Vuelva a pesar y por
diferencia de pesada, determine el peso de los 10,0 ml de suero fisiolgico y
calcule la densidad de la solucin preparada.
b) Preparacin de solucin de suero glucosalino al 5% y calcule la densidad
solucin.
a) Pese sobre papel, la cantidad de NaCl necesaria para preparar una solucin de
10ml al 0,45%.
b) Realice los clculos para determinar la glucosa necesaria para preparar 10 ml de
suero glucosalino.
c) Pese sobre papel, la cantidad de glucosa necesaria para preparar esa cantidad de
suero glucosado.
d) Agregue el NaCl y la glucosa pesada al matraz de aforo de 10 ml, aforar con
agua y agite hasta obtener homogenizacin. La solucin as obtenida corresponde
a suero glucosalino isotnico.
e) Para el clculo de la densidad del suero glucosalino al 5 %: Pese el vaso de
precipitado que contiene el suero glucosado al 5%, posteriormente vacalo y mida
su volumen. Con los datos experimentales obtenidos determine su densidad.
2) Preparacin de solucin alcohlica de yodo o tintura de yodo.
a) Pese el vaso de precipitado limpio y seco. Anote el valor de su masa.
b) Calcule la cantidad de yodo, alcohol etlico, yoduro de potasio y agua necesarios
para preparar 5,0 gramos de tintura de yodo.
c) Pese en forma separada las cantidades calculadas de sustancias slidas.

d) Calcule la cantidad de agua que necesita. Sabiendo que la densidad del agua es
1,00 (g/ml) calcule el volumen que necesita y colquelo en la probeta graduada.
e) Calcule la masa de etanol que necesita. Si conoce su densidad, realice el clculo
correspondiente para obtener el volumen que corresponda.
Si se desconoce la densidad y en reemplazo de lo anterior, pese la probeta
graduada, anote ese valor y desde el tubo de ensayo agregue gradualmente etanol,
hasta obtener la cantidad en gramos que Ud. calcul.
f) Vace al vaso de precipitado limpio y seco el alcohol, agua y las sustancias
slidas, agitando permanentemente. De esta manera, ha obtenido la tintura de
yodo.
3) Preparacin de solucin de hipoclorito de Sodio
a) Calcule el volumen de solucin comercial de Hipoclorito de Sodio, que se
requiere para preparar 10 ml de solucin que contenga 0,5 % p/v de Cl2 (g)
(Cloro activo).
b) Vace aproximadamente unos 5 ml, desde el frasco de reactivo que contiene
solucin de hipoclorito de sodio comercial a un tubo de ensayo con capacidad de 10
mL
c) Utilice pipeta parcial y succione con propipeta la cantidad de solucin comercial
de hipoclorito de sodio, calculada, vacela al matraz aforado y complete con agua
hasta el aforo.
RESULTADOS:
En base a las experiencias efectuadas en este laboratorio, deber contestar las
preguntas del Informe respectivo.

SESIN
N2
CONSTRUCCCION
CUANTIFICACIN DE PROTENAS

DE

CURVA

DE

CALIBRACIN

Resultados de Aprendizajes:
Unidad 1: Conoce los aspectos bsicos relacionados con el laboratorio de
bioqumica y las tcnicas de espectrofotometra, asociado a las mediciones en
investigacin y determinaciones clnicas.
Unidad 2: Describe el valor obtenido en una determinacin de protenas sricas
mediante el mtodo de biuret, y su relacin con posibles patologas, segn
informacin obtenida por el estudiante.
INTRODUCCIN:
Absorcin colorimtrica.
Fundamentos:
Algunos compuestos qumicos y bioqumicos (protenas, carotenos, cidos nucleicos
e hidratos de carbono, por ej.), absorben una cierta intensidad de luz en el rango
visible o UV, del espectro. Los compuestos que presentan esta propiedad se
denominan cromforos.
Dependiendo del tipo de compuesto, ser diferente la longitud de onda a la cual
absorben. La longitud de onda de la luz se expresa generalmente en nanmetros
(nm = 1 x 10-9 m) y nos da cuenta de la regin del espectro que se est utilizando.
Las protenas y los cidos nucleicos, pueden absorber luz en la regin UV y/o
visible. Dependiendo de la concentracin y del tipo de protena o cido nucleico que
se trate, se observar una mayor o menor capacidad de absorcin de la luz
Los grupos funcionales aromticos confieren la propiedad de absorber la luz en el
espectro UV.
La mayora de las biomolculas no absorben luz visible, excepto las que son
coloreadas (ejemplo: hemoglobina y mioglobina).
Algunas biomolculas, al reaccionar con determinados compuestos qumicos forman
productos coloreados que absorben en el espectro visible.
Absorciometra
Si a una energa radiante que tiene una intensidad inicial denominada Io se le hace
atravesar una cubeta que contiene una solucin de una sustancia que absorbe esa
energa radiante, la intensidad de la luz que sale de la solucin (It) luego de
atravesarla ser menor que Io .Ver las figuras.
La sustancia en solucin puede absorber a una cierta longitud de onda del espectro
de luz UV (200-340 nm) o visible (340-750 nm),

La Absorbancia se define como la cantidad de luz que es absorbida por una

solucin a una longitud de onda fija. Esta Absorbancia es directamente proporcional
a la concentracin de la solucin.
La Ley de Lambert-Beer, define la relacin directamente proporcional entre la
absorbancia y la concentracin de una solucin y se precisa segn la siguiente
frmula:

Donde:
A = Absorbancia
= Coeficiente de extincin molar, que es una constante caracterstica para cada
sustancia.
l = Longitud que debe atravesar la luz, es tambin una constante que depende del
equipo y generalmente es igual a 1 cm.
c = Concentracin de la solucin.
Otro trmino asociado es la transmitancia, que se define como el porcentaje de la
luz que atraves la solucin en relacin con la intensidad de luz inicial Io y que tiene
una relacin logartmica con la Absorbancia.

Cuando una solucin de protenas se alcaliniza fuertemente con Hidrxido de sodio

o de Potasio y se agrega una solucin diluida de sulfato de cobre, se produce un
color violeta, cuya intensidad es proporcional a la concentracin de la protena de la
solucin.
Esta reaccin, llamada reaccin de Biuret, es propia de las sustancias que
contienen dos grupos carbamilos (-CONH) unidos directamente o por medio de un

tomo de carbono o de nitrgeno. Las protenas y los pptidos (a partir de los

tripptidos) presentan dicha estructura y por lo tanto, dan positiva esta reaccin.
El reactivo de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino), reacciona con compuestos
que tienen dos o ms enlaces peptdicos dando coloracin caracterstica. El color
desarrollado se debe a la formacin de un complejo de coordinacin entre el Cu++ y
cuatro tomos de nitrgeno que provienen de dos cadenas peptdicas.este color se
puede medir por absorciometra.
Curva de calibracin: Fundamento:
Una curva de calibracin es la representacin grfica de una seal que se mide en
funcin de la concentracin de un analito. En este caso, la seal es el color
desarrollado por la reaccin de Biuret, y el analito corresponde a las protenas que
queremos medir.
El color desarrollado se mide en un espectrofotmetro, a una longitud de onda tal,
que permite medir el color azul violeta (546 nm).
La etapa de calibracin analtica se realiza mediante un modelo de lnea recta, que
consiste en encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de n
puntos experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una variable
x (variable independiente, generalmente concentracin del analito de inters) y
una variable y (variable dependiente, generalmente respuesta instrumental, en
este caso, la Absorbancia).
La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una
pendiente (m), mediante la ecuacin:
y = mx + b.
MATERIALES
Espectrofotmetro ajustado a 546 nm.
Cubetas de plstico de 1,5 ml
Material volumtrico (micropipetas de 100 ul y de 1000 ul, tubos de ensayo)
Muestras de suero normal y patolgico,
Estndar de protenas totales.
Reactivo Biuret
Timer o cronmetro.
Agua destilada
MUESTRAS
Suero N
Suero P
ESTRATEGIA
Aprendizaje colaborativo, se trabajar en grupos de 3-4 alumnos o segn lo indique
el profesor. El grupo deber organizarse para construir una curva de calibracin
para la determinacin de protenas plasmticas por el mtodo de Biuret , luego

hacer una determinacin de protenas en dos muestras desconocidas y discutir sus

resultados para realizar un informe grupal.
ACTIVIDADES
Construccin de la curva de calibracin: En nuestro caso, los puntos
experimentales, son 5 y estn dados por las coordenadas x e y correspondientes a
los tubos 1, 2, 3, 4, y 5, en que X es la concentracin de protenas en g/dL e y es
la Absorbancia a 546 nm.
El tubo 1 corresponde al tubo blanco. La medida de la Absorbancia del blanco
puede realizarse de dos maneras: a) ajustando a cero la absorbancia del blanco o b)
restar la absorbancia del tubo blanco a la absorbancia de los tubos con distintas
concentraciones del analito Absorbancia medida- Absorbancia del tubo blanco.
Cuantificacin de protenas en dos muestras desconocidas:
Para que sea vlido utilizar la curva de calibracin para calcular las concentraciones
de las muestras desconocidas, las muestras deben ser tratadas exactamente igual a
los tubos de la curva y corresponder a los tubos 6 y 7 y se harn en paralelo.
Preparacin tubos Curva de Calibracin
N tubo
Estndar de protenas
8g/dL (mL)
H2O destilada (L)

Preparacin tubos muestras

1
0

2
20

3
30

4
40

5
50

50

30

20

10

0
Muestra
N
(L)
Muestra P(L)

Reactivo de Biuret (L)

Concentracin
Protenas (g/dL)

200
0

200
0

200
0

200
0

200
0

6
0

7
0

0
50

0
0

0
200
0

50
200
0

de

Mezclar por agitacin, incubar 10 minutos a temperatura ambiente y leer la

Absorbancia a 546 nm.
Para poder realizar la curva de calibracin, usted deber calcular previamente, la
concentracin de protenas en cada punto. Realice los clculos y complete la tabla
superior. Considere que el estndar de protenas tiene una concentracin de 8.0
g/dL
RESULTADOS:
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.

SESIN N3: DETERMINACION DE ACTIVIDAD ENZIMTICA

Resultado de Aprendizaje de la unidad 3:
Describe el comportamiento cintico de una enzima en distintas condiciones de
temperatura y pH, dando ejemplos cotidianos (o asociados a salud) en donde se
observa dicho comportamiento cintico
INTRODUCCIN: La catalasa es una enzima que se encuentra en las clulas de los
tejidos animales y vegetales. La funcin de esta enzima en los tejidos es necesaria,
porque durante el metabolismo celular, se forma una molcula txica que es el
perxido de hidrgeno H2O2 (agua oxigenada), que es necesario eliminar. La
catalasa es una protena que se desnaturaliza al someterla a altas temperaturas. Al
desnaturalizarse, perder tambin la funcin y como consecuencia su funcin
cataltica, por lo que no podr descomponer al agua oxigenada. Por otro lado, otra
enzima, la amilasa o ptialina, presente en la saliva, acta sobre el polisacrido
almidn, hidrolizando el enlace O-glicosdico, por lo que el almidn se transformar
en unidades de glucosa. La presencia de almidn puede ser puesta de manifiesto
mediante Lugol (solucin yodo-yodurada), mientras que la glucosa (azcar
reductor), puede ser puesta de manifiesto mediante la reaccin de Fehling.
MATERIALES
Tubos de ensayo.
Mechero
Bao de agua termorregulado
Micropipetas de 1 mL.
Cuentagotas.
Esptula.
Placa calefactora.
Centrifugadora.
Puntas azules
REACTIVOS:
Fehling A: 7 g de sulfato cprico monohidrato en 100 ml de agua destilada.
Fehling B: 35 g de tartrato de sodio y 10 g de hidrxido de sodio en 100 ml de
agua destilada.
Lugol: solucin de I2 al 1% en equilibrio con KI, al 2% en agua destilada
Solucin de almidn al 0,5%
Perxido de hidrgeno 10 volmenes.
MUESTRAS
Hgado de pollo
Saliva
ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajar en grupos de 3-4 alumnos, los que
detectarn la accin de enzimas provenientes de dos diferentes fuentes, utilizando
reacciones apropiadas y discutirn sus resultados para realizar un informe grupal.

ACTIVIDADES
1. -AMILASA
Obtencin:
a) Preparar un tubo de ensayo limpio y colocarle encima un embudo con un filtro de
papel.
b) Humedecer con suero fisiolgico este filtro hasta que aparezca alguna gota de
filtrado en el tubo de ensayo de recogida.
c) Activar en lo posible la secrecin de saliva y depositar sobre el embudo un poco
de saliva escupiendo suavemente.
d) Aadir 12 ml de suero fisiolgico en el embudo, para facilitar la filtracin y
fluidificacin de dicha saliva.
e) Esperar que el volumen de filtrado en el tubo de ensayo, sea de unos 10 mL.
Deteccin
a) Colocar en una gradilla cuatro tubos de ensayo, numerados del 1 al 4.
b) Aadir en cada tubo 5 mL de una solucin diluida de almidn (0,5 %).
c) A los tubos 3 y 4 aadir 1 ml de la solucin de amilasa obtenida de la saliva.
d) En el tubo 1, realizar la Reaccin de Fehling.
e) En el tubo 2, realizar la Reaccin de Lugol.
f) Los tubos 3 y 4 que contienen el almidn, al que le hemos agregado la saliva,
incubar a al bao Mara, a 37 C, durante 15 min.
g) A continuacin, en el tubo nmero 3, realizar la Reaccin de Fehling y en el
tubo nmero 4 realizar la Prueba del Lugol.
h) Anotar los resultados obtenidos

Reaccin de Fehling: A 5 ml de una solucin de azcar agregar 10 gotas de

reactivo de Fehling A y 10 gotas de Fehling B calentar a ebullicin por 1 minuto.
Si se forma un precipitado naranja a rojo, la reaccin es positiva.
Prueba de Lugol: A 5 ml de solucin del glcido a investigar, aadir unas gotas de
Lugol. Si la disolucin del tubo se torna de color azul-violeta, la reaccin es
positiva.
2. CATALASA:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)

Deteccin de catalasa en hgado

Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hgado de pollo.
Aadir 5 mL de agua oxigenada de 10 volmenes recin preparada.
Observar y anotar el resultado
Colocar en otro tubo de ensayo varios trocitos de hgado.
Aadir 5 mL de agua y hervir durante unos 2 minutos.
Despus de este tiempo, retirar el sobrenadante.
Aadir el agua oxigenada (2-3 mL aprox.) al hgado hervido.
Observar y anotar el resultado.

RESULTADOS:
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.

SESIN N4: METABOLISMO DE GLCIDOS: DETERMINACIN DE GLICEMIA

Resultado de Aprendizaje Unidad 4: Analiza el valor obtenido en una
determinacin de glicemia respecto a los valores de referencia, clasificndolo como
normal o patolgico e indicando las hormonas responsables de dicho valor en cada
situacin.
INTRODUCCIN: Los carbohidratos son uno de los principales componentes de la
dieta en los seres humanos. La glucosa es el monosacrido ms importante que se
utiliza para extraer energa. Cualquier alteracin en su metabolismo da origen a
patologas, como la diabetes. El metabolismo de la glucosa incluye, entre otros, los
procesos de gluclisis, glucgenolisis, gluconeognesis, los cuales son regulables
por hormonas tales como la insulina, glucagn y adrenalina.
Las determinaciones de glucosa pueden realizarse en diferentes fluidos biolgicos,
siendo la ms comn la determinacin en sangre (glicemia).
Esta determinacin se realiza en estado de ayuno.
VALORES DE REFERENCIA GLICEMIA EN AYUNAS: 70 a 100 mg/dL
Hipoglicemia: valores por debajo de 70 mg/dL
Hiperglicemia: valores por encima de 100 mg/dL
Mtodo de determinacin:
Fundamento: Se realiza mediante un ensayo enzimtico-colorimtrico que
consiste en dos reacciones enzimticas acopladas.
En la primera reaccin (reaccin especfica), catalizada por la enzima glucosa
oxidasa (GOD), se oxida la glucosa y se genera H2O2. En la segunda reaccin
(reaccin indicadora), la enzima peroxidasa (POD) cataliza la descomposicin del
H2O2 lo que provoca oxidacin de un cromgeno que pasa de su forma reducida (4aminoantipirina, incolora) a su forma oxidada (quinoneimina, coloreada). La
aparicin del cromgeno oxidado (coloreado) se mide mediante un
espectrofotmetro, siendo la coloracin producida directamente proporcional
a la concentracin de glucosa en la muestra. La coloracin se lee a 546nm.
Glucosa

O2

Glucosa-oxidasa

H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol

cido glucnico + H2O2

Peroxidasa

Quinoneimina + HCl + H2O

Se usa una solucin de glucosa de concentracin estndar con cuyo valor de

Absorbancia se hace la comparacin de la Absorbancia de la muestra.

MATERIALES
Tubos de ensayo.
Bao de agua termorregulado
Espectrofotmetro
Micropipetas de 10 L y de 1 mL y sus respectivas puntillas.
Reactivo para determinacin de Glucosa
Estndar de Glucosa 100 mg/dL
MUESTRAS
Suero N
Suero P
ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajar en grupos de 3-4 alumnos los que
cuantificarn la glicemia de dos muestras distintas y discutirn sus resultados para
realizar un informe grupal.
Determinacin de la Glicemia:
a) Prepare una serie de 4 tubos, de acuerdo a la tabla siguiente:
Tubo
(Blanco)
H2O (L)
Estndar
de
Glucosa
(100
mg/dL) (L)
Suero
Normal
(L)
Suero
Patolgico (L)
Reactivo GODPAP
(L)

Tubo
(Estndar)

Tubo
(muestra N)

Tubo
(muestra P)

10

10

10

10

1000

1000

1000

1000

b) Incube los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.

c) Lea la absorbancia en espectrofotmetro a 546nm.
Tubo
(Blanco)
A

Tubo
(Estndar)

Tubo
(muestra N)

Tubo
(Muestra P)

546 nm

d) Obtenga la concentracin de glucosa de ambas muestras desconocidas realizando

una proporcin.

Glicemia (mg/d

Absorbancia de la muestra X 100 (mg/dL)

L) =
Absorbancia del Estndar

Dependiendo de la forma en que se haya ajustado el blanco, habr que hacer la

diferencia de Absorbancia o no.
RESULTADOS:
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.
SESIN
N5:
METABOLISMO
DE
LPIDOS:
COLESTEROL, COLESTEROL-HDL Y TRIGLICERIDOS

DETERMINACIN

DE

Resultado de Aprendizaje Unidad 5:

Analiza los valores de triglicridos y colesterol obtenidos en una determinacin
srica, indicando las lipoprotenas analizadas, el fundamento de los mtodos
utilizados y el tipo de dislipidemia que corresponde a dicho perfil.
INTRODUCCIN: Los lpidos se clasifican generalmente como sustancias orgnicas
insolubles en agua, pero solubles en solventes orgnicos. Los principales lpidos del
plasma humano son colesterol, triglicridos, fosfolpidos y cidos grasos. Estos
lpidos son transportados en el plasma formando las lipoprotenas. Las lipoprotenas
se dividen en varias clases dependiendo de su densidad, lo que determina su
nomenclatura: Quilomicrones, VLDL (lipoprotenas de muy baja densidad), IDL
(lipoprotenas de densidad intermedia), LDL (lipoprotenas de baja densidad) y HDL
(Lipoprotenas de alta densidad).
Los lpidos plasmticos de mximo inters para diagnstico y monitoreo de los
tratamientos de las dislipidemias son el colesterol y los triglicridos. Los mtodos
rutinarios de Laboratorio determinan a estos lpidos como parte de las lipoprotenas.
Dentro de las lipoprotenas, las de mayor inters clnico son las HDL y las LDL,
porque se correlacionan con el riesgo de enfermedades cardiovasculares.
En este laboratorio, determinaremos: Colesterol Total, Triglicridos y
lipoprotenas HDL en dos muestras distintas. Por otra parte, calcularemos las
lipoprotenas LDL, de tal forma de obtener un Perfil Lipdico de ambas muestras.
Mtodos de determinacin.
Fundamentos.
Mtodo para determinar colesterol total:
Es un ensayo enzimtico-colorimtrico que consiste en tres reacciones
enzimticas acopladas.
En la primera reaccin, los steres de colesterol contenidos en las lipoprotenas son
hidrolizados por la enzima colesterol hidrolasa, en la segunda reaccin, el colesterol
oxidasa, oxida el grupo 3-OH del colesterol y se forma perxido de hidrgeno, y en
la tercera reaccin la enzima peroxidasa cataliza la descomposicin del H2O2 lo que

provoca oxidacin de un cromgeno que pasa de su forma reducida (4aminoantipirina, incolora) a su forma oxidada (quinoneimina, coloreada). La
aparicin del cromgeno oxidado (coloreado) se mide mediante un
espectrofotmetro, siendo la absorbancia del producto coloreado ser
directamente proporcional a la concentracin de colesterol en la muestra.
La coloracin se lee a 546nm.
Ester de Colesterol

+ H 2O

Colesterol + O2

Colesterol hidrolasa

Colesterol Oxidasa

H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol

Peroxidasa

Colesterol + c. Graso

Colest-4-en-3-ona

+ H2O2

Quinoneimina + HCl + H2O

VALORES DE REFERENCIA: Colesterol Total Menor que 200 mg/dL

Mtodo para la determinacin de lipoprotenas: Las lipoprotenas plasmticas
son complejos macromoleculares esfricos encargados de transportar los lpidos de
forma soluble (emulsionados) en la sangre. En su ncleo se ubican los lpidos
apolares y en la superficie se encuentran los lpidos anfipticos.
Las distintas lipoprotenas tienen cantidades y tipo de apoprotenas variables, lo cual
es utilizado para determinar diferencialmente, algunas de ellas.
La HDL es la nica lipoprotena que no posee apolipoprotena apo-B en su estructura
y los mtodos de laboratorio utilizan esta propiedad para separarla de las otras
lipoprotenas y cuantificarla en forma separada.
Mtodo de Determinacin de Colesterol-HDL: Se utiliza un reactivo precipitante
que contiene ciertas sales que reaccionan con las apo B precipitando a las
lipoprotenas que la contengan.
Se debe centrifugar para separar las fases, como las HDL no poseen esta
apoprotena, la HDL no precipita y quedan en el sobrenadante. Al determinar el
colesterol que est en el sobrenadante, se estar determinando slo a las HDL.
VALOR DE REFERENCIA:

HDL

mayor a 35 mg/dL

Mtodo de determinacin de Triglicridos:

Es o consiste en un anlisis enzimtico-colorimtrico que consiste en cuatro
reacciones enzimticas acopladas.

En la primera reaccin, los triglicridos son hidrolizados por la enzima lipasa, en la

segunda reaccin, el glicerol es fosforilado con ATP por el glicerol quinasa para
producir glicerol-3-fosfato. En la reaccin siguiente, el glicerol-3-fosfato en
presencia de O2 es oxidado a dihidroxicetona fosfato, con liberacin de H2O2.
Finalmente, el H2O2 formado reacciona con 4-aminoantipirina, en presencia de
peroxidasa, formando quinoneimina, que absorbe a 546 nm, siendo su formacin
directamente proporcional a la cantidad de triglicridos presente en la muestra.

Triglicridos

Glicerol + cidos grasos

Lipasas

Glicerol + ATP

Glicerol- 3-Fosfato + ADP

Gliceroquinasa

Glicerol- 3-Fosfato + O2
Dihidroxiacetonafosfato + H2O2
Glicerol 3 fosfato oxidasa
H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol
+ H2O
VALOR DE REFERENCIA:

Quinoneimina + HCl
Peroxidasa

Trigliceridemia

menor que 150 mg/dL

MATERIALES

Tubos de ensayo.
Bao de agua termorregulado
Espectrofotmetro
Centrfuga
Micropipetas de 10 L, 100 L y de 1 mL y sus respectivas puntillas.
Reactivo para determinacin de Colesterol
Reactivo precipitante
Reactivo para determinacin de Triglicridos
Estndar de colesterol total
Estndar de Colesterol-HDL
Estndar de Trigliceridos

MUESTRAS
Suero N
Suero P
ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajar en grupos de 3-4 alumnos los que
cuantificarn el colesterol total, Colesterol-HDL y Triglicridos de dos muestras
distintas y discutirn sus resultados para realizar un informe grupal.

PROCEDIMIENTOS:
Determinacin de Colesterol: Se cuantificar la cantidad de colesterol total y
colesterol HDL presente en dos muestras sricas. El trabajo se realizar en dos
fases:
Fase 1: Cuantificacin de Colesterol Total:
Preparar cuatro tubos, segn lo indicado a continuacin:
Tubo
(Blanco)
H2O (L)
Estndar
de
Colesterol
(200
mg/dL)
(L)
Suero
Normal
(L)
Suero
Patolgico (L)
Reactivo para
determinacin
de Colesterol
(L)

Tubo
(Estndar)

Tubo
(muestra N)

Tubo
(muestra P)

10

10

10

10

1000

1000

1000

1000

b) Incube los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.

c) Lea la absorbancia en espectrofotmetro a 546 nm y
Tubo
(Blanco)
A

Tubo
(Estndar)

Tubo
(muestra N)

546 nm

d) Obtenga la concentracin de colesterol de ambas muestras.

Absorbancia de la muestra X 200 (mg/dL)
Colesterolemia (mg/dL)=
Absorbancia del Estndar
Fase 2: Cuantificacin de Colesterol-HDL:
Fase A: Separacin de HDL del resto de las lipoprotenas.

Tubo
(Muestra P)

1)
En dos tubos de ensayos colocar 200 ul de suero N y 200 ul de suero P,
respectivamente. Agregar a ambos tubos, 1 ml de reactivo precipitante. El
reactivo precipitante reacciona con apolipoprotenas B, por lo tanto, quedar
sin precipitar la HDL solamente, ya que es la nica que no posee apo B.
2)
Incubar el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente y
posteriormente centrifugar a 5.000 rpm por 5 minutos.
3)
Luego de centrifugar no mueva el tubo para no mezclar y dejarlo hasta
la determinacin.
Preparar cuatro tubos, segn lo indicado a continuacin. Tenga precaucin al aspirar
los sobrenadantes para que no se contaminen con el precipitado.
Fase B: Cuantificacin del colesterol total
Tubo
(Blanco)
H2O

(L)

Estndar
de
HDL Colesterol
(50
mg/dL)
(L)
Sobrenada
nte
muestra N
(L)
Sobrenadante
muestra
P
(L)
Reactivo para
determinacin
de Colesterol
(L)

Tubo
(Estndar)

Tubo3
(sobrenadante
muestra N)

Tubo4
(sobrenadant
e muestra P)

100

100

100

100

1000

1000

1000

1000

b) Incube los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.

c) Lea la absorbancia en espectrofotmetro a 546nm.
Tubo
(Blanco)
A

Tubo
(Estndar)

Tubo
3
(sobrenadante
muestra N)

546 nm

d) Obtenga la concentracin de colesterol-HDL de ambas muestras.

Tubo
4
(sobrenadante
muestra N)

Concentracin de colesterol-HDL (mg/dL)=

Absorbancia de la muestra X 50 (mg/dL)
Absorbancia del Estndar
Cuantificacin de Triglicridos
Preparar cuatro tubos, segn lo indicado a continuacin:
Tubo
(Blanco)
H2O

Tubo
(Estndar)

Tubo
(muestra N)

Tubo
(muestra P)

(L)

10

Estndar
de
Triglicridos
(200
mg/dL)
(L)
Suero
Normal
(L)
Suero
Patolgico (L)
Reactivo para
determinacin
de Triglicridos
(L)

10

10

10

1000

1000

1000

1000

b) Incube los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.

c) Lea la absorbancia en espectrofotmetro a 546nm y complete la siguiente tabla.
Tubo
(Blanco)
A

Tubo
(Estndar)

Tubo
(muestra N)

Tubo
(Muestra P)

546 nm

d) Obtenga la concentracin de Triglicridos de ambas muestras.

Trigliceridemia (mg/dL)=

Absorbancia de la muestra X 200 (mg/dL)

Absorbancia del Estndar

RESULTADOS:
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.

SESIN N6: METABOLISMO NITROGENADO: DETERMINACION

AMINOTRANSFERASAS Y DE GAMMAGLUTAMILTRANSPEPTIDASA

DE

Resultado de Aprendizaje Unidad 6:

Desarrolla una explicacin del rol que tienen las aminotransferasas in vivo, en base
al anlisis del fundamento del mtodo utilizado para la determinacin de su
actividad, en situaciones de dao heptico o muscular.
INTRODUCCIN:
Las AMINOTRANSFERASAS son enzimas ampliamente expresadas en el
organismo, que catalizan la transferencia de un grupo amino de un aminocido a un
cetocido, transformando el aminocido en un cetocido y el cetocido aceptor, en
un aminocido.
Estas reacciones corresponden a en una de las reacciones ms importantes del
metabolismo de los aminocidos.
El inters clnico est centrado especialmente en dos de ellas:
o GPT (transaminasa glutmico pirvica) o ALAT (alaninaaminotransferasa)
TGP
o
GOT
(transaminasa
glutmica
oxalactica)
o
ASAT
(aspartatoaminotransferasa)
Las reacciones reversibles catalizadas por GOT y GPT son las siguientes:
Alanina

ac. -cetoglutarato

Ac. Asprtico + ac. -cetoglutarato

GPT
GOT

ac.Pirvico

ac. Glutmico

ac.Oxalactico + ac.Glutmico

Determinacin de aminotransferasas.
Fundamento: Las determinaciones de estas enzimas se basan en la medicin de
los cetocidos, ya sea del cetocido consumido o del cetocido formado. A medida
que la reaccin transcurre, un cetocido aumenta de concentracin, a medida que el
otro, disminuye.
Para su medicin, se utilizan reacciones enzimticas acopladas, en que los
cetocidos producidos por la respectiva aminotransferasa, son reducidos a
hidroxicidos por las enzimas lactato deshidrogenasa (LDH) o malato
deshidrogenasa (MDH) que utilizan coenzima reducida (NADH) , la que es oxidada a
NAD+.
En razn de que el NADH absorbe a 340 nm, por la accin enzimtica de la
aminotransferasa, se observar una disminucin de la absorbancia a esta longitud
de onda.

Piruvato + NADH + H+
** en la reaccin catalizada por GPT.

Oxalacetato + NADH + H+

LDH

MDH

Lactato + NAD+

Malato + NAD+

**en la reaccin catalizada por GOT.

La desaparicin del NADH por unidad de tiempo puede medirse por la disminucin
de la absorbancia a 340 nm. En estas mediciones el cambio de absorbancia por
minuto (Abs/min) puede relacionarse directamente con los micromoles de NADH
oxidados que sern proporcionales a su vez, con los micromoles de sustrato
transformados por minuto, lo que equivale a la actividad enzimtica de la
transaminasa respectiva.
Determinacin de gammaglutamil transferasa (GGT)
La GGT cataliza la transferencia de una porcin de gamma-glutamil desde el
glutatin a un aceptor (un aminocido, un pptido o una molcula agua). Esta
enzima juega un papel clave en el ciclo de la gamma-glutamil, que permite
transferir aminocidos a travs de la membrana, y ser una va para la sntesis o la
degradacin del tripptido glutatin.
Fundamento del mtodo de determinacin:
La gamma-glutamiltransferasa (-GT) cataliza la transferencia del grupo -glutamilo
de la -glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida (sustrato artificial) a la glicilglicina,
produciendo Glutamilglicilglicina y 3-carboxi-4-nitroanilina.
La actividad de la enzima se determina midiendo la velocidad de formacin de la 3carboxi-4- nitroanilina que es el producto coloreado. Este producto absorbe a 405
nm.
1,2 Glutamil3carboxi4-nitroanilida + Glicilglic ina
glicilglicina + 3carboxi4nitroanilina
MATERIALES

Tubos de ensayo.
Bao de agua termorregulado
Espectrofotmetro
Micropipetas de 100 L y de 1 mL y sus respectivas puntillas.
Reactivo para determinacin de GOT
Reactivo para determinacin de GGT

MUESTRAS
Suero N
Suero P

Glutamil

ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajar en grupos de 3-4 alumnos los que medirn
cinticamente las enzimas GOT y GGT en dos muestras distintas y discutirn sus
resultados para realizar un informe grupal.
PROCEDIMIENTOS
Determinacin de la actividad de GOT
Se determinar la actividad de la enzima en dos muestras de suero y a una
temperatura de 37C, para ello, con cada muestra de suero realice el siguiente
procedimiento:
a) En una cubeta de 1.0 mL agregue 1.0 mL de Reactivo y 100 L de suero.
b) Mezcle, incube y lea la absorbancia a 340 nm despus de un minuto exacto.
Realice lecturas despus de 1, 2 y 3 minutos a contar de de la primera lectura.
Lea frente a blanco de aire.
c) Luego de obtener las lecturas en absorbancia, calcule la diferencia de
absorbancia por minuto (Abs/min).
Absorbancia = Absorbancia 1 absorbancia 2
Absorbancia = Absorbancia 2 absorbancia 3
Absorbancia = Absorbancia 3 absorbancia 4
Obtenga el promedio Abs/min.
Este promedio se multiplica por un factor estandarizado segn la temperatura con la
que se trabaja (F a 37 C =2143).
Actividad enzimtica (U/L) = Absorbancia

340 nm/min

xF

Determinacin de la actividad de gammaglutamiltranferasa

Se determinar la actividad de la enzima en dos muestras de suero y a una
temperatura de 37C, para ello, con cada muestra de suero realice el siguiente
procedimiento:
a) En una cubeta de 1.0 mL agregue 1.0 mL de Reactivo y 100 L de suero
b) Mezcle, incube y lea la absorbancia a 405 nm despus de un minuto exacto.
Realice lecturas despus de 1, 2 y 3 minutos a contar de la primera lectura. Lea
frente a blanco de aire.
c) Luego de obtener las lecturas en absorbancia, calcule el cambio de absorbancia
por minuto (Abs/min).
Absorbancia = Absorbancia 2 absorbancia 1
Absorbancia = Absorbancia 3 absorbancia 2
Absorbancia = Absorbancia 4 absorbancia 3
Obtenga el promedio Abs/min.

Este promedio se multiplica por un factor estandarizado segn la temperatura con la

que se trabaja (F a 37 C =1158).
Actividad enzimtica GGT(U/L) = Absorbancia 405 nm /min x F
RESULTADOS:
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.