UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA
BIOQUMICA Y QCA. BIOLGICA

Cintica
enzimtic
a
Determinacin de la actividad
enzimtica y de la actividad
especfica de la fosfatasa acida del
germen de trigo

Integrantes:

Sofa Ahumada V.
Jos Miguel Len

Fecha de entrega: 28 de Abril de 2016

Introduccin
Las fosfatasas, son parte de un grupo de enzimas llamado esterasas, las
que a su vez son una subcategoria de las hidrolasas. Las hidrolasas, son
aquellas enzimas que catalizan una reaccin de hidrolisis. En tanto, las
fosfatasas al ser parte integrante de ellas, catalizan una reaccin en la
cual se libera un grupo fosfato del sustrato y se deja a este con un grupo
hidroxilo mediante la reaccin general mostrada a continuacin:

Figura 1. Ecuacin representativa de una reaccin catalizada por una fosfatasa

En el siguiente trabajo prctico utilizaremos la fosfatasa cida del

germen de trigo, la cual hidroliza fosfomonosteres liberando ortofosfato
inorgnico. Para esta enzima, dada su baja afinidad por la porcin
orgnica del sustrato se pueden utilizar sustratos artificiales, en este
caso, el p-nitrofenilfostato, el cual al hidrolizarse dar p-nitrofenol. El pnitrofenol en un medio lo suficientemente bsico (pH= > 7.16) , libera
el protn del hidroxilo y queda el ion fenolato, el cual es coloreado y por
tanto absorbe en el visible. Esto ltimo permitir seguir la actividad de la
reaccin a travs de un espectrofotmetro a 405 nm (longitud de onda
caracterstica del p-nitrofenol).
La reaccin que describe lo sealado anteriormente:

Figura 2. Hidrlisis p-nitrofenilfosfato catalizada por fosfatasa. Formacin p-nitrofenol en su

forma coloreada

Finalmente, los objetivos del siguiente trabajo experimental son

determinar el coeficiente de extincin molar del p-nitrofenol a partir de
la curva de calibracin que se realizar con este mismo reactivo.
Adems se calcular la actividad especfica de la solucin de fosfatasa
cida, para esto, definiremos una unidad de actividad enzimtica
considerando tambin los controles a realizar (blanco de sustrato,
control no enzimtico y tiempo cero).

Resultados y anlisis de resultados

En la tabla adjunta, se presenta la informacin acerca de la cantidad de
p-nitrofenol 60 M, adems de la cantidad de NaOH 0,1 M que fue agregada a
cada tubo. Tambin se detalla su concentracin y absorbancia a 405 nm.
Tabla 1. Absorbancias para diferentes concentraciones de p-nitrofenol

#
Tub
o
1
2
3
4
5

Cantidad de pnitrofenol 60
M agregada
[mL]
1
2
3
4
5

Cantidad de
NaOH 0,1 M
agregada
[mL]
5
4
3
2
1

Concentracin
de p-nitrofenol
[nmol/6mL]

Absorbanci
a a 405 nm

60
120
180
240
300

0,139
0,277
0,425
0,575
0,721

Empleando la concentracin de p-nitrofenol y las absorbancias

correspondientes, se procede a elaborar la curva de calibracin. Adems, se
considera el aquel punto en donde la concentracin de p-nitrofenol es 0 que
corresponde a una absorbancia de 0.

Figura 2. Curva de Calibracin para el p-nitrofenol.

La pendiente de la recta corresponde al valor del coeficiente de

extincin () molar, por tanto = 0.00241 [cm nmol/6ml] -1
En segunda actividad del prctico se procede a hacer un ensayo enzimtico, el
cual consiste en confeccionar dos tubo de ensayos que contengan las
condiciones optimas para incubacin de la enzima fosfatasa, con el fin de que
la enzima catalice la reaccin de hidrlisis del p-nitrofenilfosfato. Para ello se
introducen dos tubos de ensayo determinados volmenes de citrato de sodio,
agua, p-nitrofenilfosfato y fosfatasa alcalina de germen de trigo hasta
completar un volumen de solucin de 0,5mL.
La incubacin se llevo a cabo mezclando en primer lugar el volumen de citrato
de sodio, p-nitrofenilfosfato y el agua en un tubo de ensayo A, el cual se
introduce en el bao de agua caliente a 37 por dos minutos. Al transcurrir
los dos minutos se introduce rpidamente la enzima, y se incuba por 5 minutos
a 37 . Al terminar los 5 minutos se agregan 5,5mL de NaOH 0,1M el tubo A
para detener la reaccin. Se repite este procedimiento con el tubo de ensayo
B, pero con la diferencia que se incuba con la enzima por 10 minutos.
Tabla 2. Volumen de cada componente utilizado para la incubacin.
Tubo
Volumen [mL]

Tiempo

Enzima

Citrato de Na

pH 2O
Minutos
nitrofenilfosfat
o
0,20 mg/mL
0,1M pH5
2,5mM
A
0,1
0,2
0,1
0,1
5
B
0,1
0,2
0,1
0,1
10
* Se agrega a cada tubo un volumen de 5,5mL de NaOH al terminar el tiempo
de incubacin fijado para cada tubo.
Se observa una solucin transparente y de color amarillo claro en el tubo A, el
cual fue incubado por 5 minutos en el bao a 37 . En cambio el tubo B
incubado por 10 minutos, presenta un color amarillo un poco ms intenso.
Se procede a realizar 3 tubos controles, para esclarecer si dentro de la solucin
preparada existe un componente diferente a la enzima que pueda llevar a cabo
la reaccin. Los controles realizados consisten en, un control no enzimtico
(tubo C), en el que se utiliza la mezcla de reaccin en la cual la enzima es
reemplazada por solvente. Otro control es el del tiempo cero (tubo E), en el que
la reaccin se detiene en el mismo momento de completarla, agregando el
inhibidor antes de la enzima. Y por ltimo el blanco de sustrato (D), en este
control se reemplaza el sustrato por el solvente.
Los tubos C y D se incuban en el bao caliente a 37 , el tiempo de
incubacin es diferente para cada uno, el tubo C se deja un largo tiempo 14
minutos, y el tubo D se deja en el bao caliente por 5 minutos. El tubo E no se
incuba.

Tabla 3. Volmenes utilizados en la realizacin de controles enzimticos

Tubo
Volumen [mL]
Enzima
Citrato de Na
pH2O
nitrofenilfosfato
0,20 mg/mL
0,1M pH5
2,5mM
C
0,2
0,1
0,2
D
0,1
0,1
0,2
E
0,1
0,2
0,1
0,1
Luego de realizar todos los ensayos enzimticos y los controles respectivo, se
mide la absorbancia de cada una de las soluciones obtenidas a 405nm.
Tabla 4: Absorbancia medida para cada uno de los tubos

Tubo
Absorbancia [nm]
A405

A
0,124

B
0,185

C
0,028

D
0,020

E
0,025

De los valores obtenidos podemos darnos cuenta que no hay actividad enzima,
al eliminar la enzima de la solucin, y tambin al eliminar el sustrato. Esto
quiere decir que no hay componentes en solucin que puedan alterar la
actividad cataltica de la enzima de manera positiva o negativa. Esto lo
comprobamos con el control a tiempo cero, donde en solucin se encuentra el
sustrato y la enzima, pero a diferencia de los tubos utilizados en el ensayo
enzimtico a la mezcla se le agreg previamente NaOH, componente que
cumple con la funcin de detener la reaccin, esto se realiz con la intensin
de detectar alguna interferencia provocada por cualquier componente de la
reaccin, que no sea el sustrato y la enzima, ya que estos estn descartados
por los controles hechos antes. Se concluye que en la solucin no hay
componentes que puedan alterar la actividad cataltica de la enzima fosfatasa.
Es de esperar que la absorbancia medida a los controles C, D y E sea
idealmente cero, pero no ocurre, ya que en el cubo puede estar mal lavado y
por ello contener algn componente, el cual es captado por el espectro de
absorbancia, es por esto que los valores estn un poco ms alto que cero.
En el caso del tubo A y B, al medir la absorbancia del tubo A a los 5 minutos y
luego medir a del tubo B ya transcurrido 10 minutos de reaccin, se cree que la
absorbancia debera dar el doble, ya que transcurrido el doble de tiempo, se
debera formar el doble de producto. Esto no ocurre y damos razn a esto al
error humano que puede existir al momento de empezar a medir el tiempo, o al
agregar la enzima.
A travs de la curva de calibracin creada, se calcula la concentracin de pnitrofenol formado, interpolando la absorbancia medida en para cada tubo.

Tabla 5: Absorbancia y concentracin del control enzimtico.

Tubo
A405 [nm]
Concentracin de pnitrofenol [nmoles/6mL]
A
0,124
52
B
0,185
75
C
0,0
0
D
0,0
0
E
0,0
0