UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Instituto de Qumica
Departamento de Qumica Analtica (DQA)

Experimento 1: Cromatografia em Coluna e CCD: Separao dos

pigmentos do espinafre.
Experimento 2: Cromatografia Gasosa: Estudo do efeito da temperatura da
coluna na separao de misturas e construo de curva analtica.
Experimento 3: Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC): Efeito
da composio da fase mvel na eluio de misturas.
Mdulo Cromatografia

Prof. Prof. Dra. Ana Valria Colnaghi Simionato

Grupo
Felipe Monferdine Aggio

159697

Joo Vitor Lage

148661

Marcia Kaori Kasahara

156541

Campinas, 17 de junho de 2015

1. INTRODUO
1.1. Cromatografia em Coluna convencional

A cromatografia em Coluna convencional realizada a partir de uma coluna constituda por um

tubo de vidro, em posio vertical, recheada com um slido que funcionar como adsorvente, que
a fase estacionria, e uma fase mvel lquida, que consiste em uma srie de eluentes que deve
dessorver do adsorvente as substncias fixadas no mesmo (adsorvato), de forma que a eluio se
processar por ao da gravidade, arrastando consigo os componentes da amostra segundo a sua
polaridade, separando os componentes de uma mistura devido s diferenas nas foras de adsoro
entre eles e o adsorvente. A extremidade superior do tubo aberta e a inferior afilada termina em
uma torneira, permitindo o controle da vazo da fase mvel. A fase que fica no interior da coluna
(adsorvente) suportada, na parte inferior, por um chumao de l de vidro, ou por uma placa
porosa de vidro ou teflon.
1.2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
A cromatografia em camada delgada consiste na separao dos componentes de uma mistura
pelo fenmeno da adsoro atravs da migrao diferencial sobre uma camada delgada uniforme de
adsorvente, retido sobre uma superfcie plana, a placa cromatogrfica. As amostras so aplicadas
nas placas na forma de solues utilizando micropipetas, microsseringas ou at mesmo capilares, e
solventes bastante volteis, facilmente eliminados aps a aplicao. Na cromatografia ascendente,
forma de desenvolvimento de um cromatograma mais utilizado, as placas so colocadas
verticalmente nas cubas cromatogrficas, que devem ter junto s paredes um pedao de papel de
filtro que permita que a fase mvel suba por ele e sature bem rapidamente o interior das mesmas. A
fase mvel deve cobrir todo o fundo da cuba, mas no deve chegar s manchas nas placas. Assim
que a fase mvel atinja a parte superior da placa, ento a placa retirada, marca-se a distncia
percorrida pela fase mvel. Aps o desenvolvimento do cromatograma, as placas so secas e
reveladas.
1.3. Cromatografia Gasosa (CG)
A separao baseia-se na diferena de distribuio das substncias da amostra entre uma fase
estacionria, que pode ser slida ou lquida, e uma fase mvel, o gs de arraste. A amostra, atravs
de um sistema de injeo, introduzida em uma coluna contendo a fase estacionria. Por eluio,
uma corrente de gs passa continuamente pela coluna e quando a amostra vaporizada introduzida
nesta corrente, ela arrastada atravs da coluna. O uso de temperaturas convenientes no local de
injeo e na coluna possibilita a vaporizao destas substncias que dependendo da natureza das
mesmas e as da fase estacionria, so retidas e chegam sada da coluna em tempos diferentes. As
substncias presentes na amostra, depois de separadas, chegam ao detector, que gera um sinal para
o registrador. O uso de um detector apropriado na sada da coluna possibilita a deteco e
quantificao das substncias.
1.4. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia possui vrios mecanismos de separao, que varia
conforme as caractersticas da fase estacionria, sendo a fase mvel sempre lquida. Na tcnica de
HPLC emprega-se uma coluna fechada e reaproveitvel, sistemas de bomba de alta presso que
fazem a fase mvel migrem a uma velocidade razovel pela coluna. A injeo da amostra feita a
partir de uma microsseringa ou uma vlvula de injeo. A vazo da fase mvel controlada
facilmente, resultando em operaes reprodutveis e as anlises realizadas pelo HPLC mais
precisas. Vrios tipos de detectores, que podem ser colocados na sada da coluna, proporcionam um
registro contnuo da composio do efluente, utilizado para identificar e quantificar os
componentes da amostra.
2. OBJETIVOS
2.1. Experimento 1: Cromatografia em Coluna e CCD

Neste experimento visa-se Avaliar a separao em fase normal de pigmento de espinafre por
cromatografia em coluna. Avaliar uma tcnica de separao preparativa. Usar a cromatografia em
camada delgada para conferir a eficincia da separao analisada.
2.2. Experimento 2: Cromatografia Gasosa (GC)
Com esse experimento visa-se avaliar o efeito da temperatura na separao de duas misturas
empregando dois tipos de fase estacionria, e empregar a tcnica de cromatografia gasosa como
mtodo quantitativo a partir da construo de curvas analticas.
2.3. Experimento 3: Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
Neste experimento visa-se observar o efeito na fora da fase mvel na separao dos
componentes de duas misturas, alm da familiarizao do equipamento.
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Experimento 1: Cromatografia em Coluna e CCD
3.1.1. Materiais e Reagentes
1 papel de filtro cortado ao meio
3.1.2. Procedimento
Procedimento para cromatografia em camada delgada (CCD)
As seguintes modificaes forma feitas:
Recortou-se um papel de filtro no meio e colocou s paredes do bquer junto com a placa
cromatogrfica mergulhada na fase mvel.
3.2. Experimento 2: Cromatografia Gasosa (CG)
3.2.1. Materiais e Reagentes
Coluna capilar (FE: polidimetilssiloxano com 5% de difenilssiloxano, Cpsil 8 CB; dimenses:
30 m x 0,25 mm x 0,25 m).
Coluna empacotada (FE: Supelcovax 10; L = 1,8 m)
3.2.2. Procedimento
No houve modificaes no procedimento do experimento.
3.3. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
No houve nenhuma modificao no roteiro do experimento.
4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1.

Experimento 1: Cromatografia em coluna e Cromatografia em Camada Delgada:

As bandas cromatogrficas coletadas na cromatografia em coluna foram:
1 frao: mistura de carotenos (amarela)

 2 frao: mistura de clorofilas (verde)

3 frao: mistura de xantofilas (amarela)
Esse resultado pode ser explicado atravs da anlise da estrutura geral dos trs grupos de
compostos, pois suas estruturas esto diretamente ligadas com suas interaes com fase mvel e
estacionria.

Figura 1 - Estrutura qumica do -caroteno.

Os carotenos so um grupo de substncias que, junto com as xantofilas, fazem parte da
famlia dos carotenoides. Os carotenos so corantes orgnicos sintetizados por plantas, fungos e
algas, e so todos hidrocarbonetos de quarenta tomos de carbono. Analisando o exemplo da
estrutura do betacaroteno acima, percebemos que os carotenos no apresentam tomos muito
eletronegativos e tambm no apresentam momento dipolar relevante, sendo, portanto,
molculas apolares. Desta forma, os carotenos do extrato de espinafre tm pouqussima
interao com a fase estacionria de slica (que bastante polar). Esta observao explica o
menor tempo de reteno obtido na separao dos analitos da amostra.

Figura 2 - Estrutura qumica da clorofila b.

As clorofilas so um grupo de compostos fotossintticos, produzidos por plantas e
outros organismos. Como vemos no exemplo acima da clorofila b, diferentemente dos
carotenos, as clorofilas possuem heterotomos bastante eletronegativos que criam certo
momento dipolar, fazendo com que as clorofilas passem a interagir de maneira mais efetiva com
a fase estacionria.

Figura 3 - Estrutura qumica da zeaxantina.

As xantofilas so pigmentos orgnicos que se diferem dos carotenos, principalmente
pelo fato de obterem heterotomos muito eletronegativos e hidroxilas, que permitem que se
forme ligaes de hidrognio, que so interaes intermoleculares mais fortes do que os dipolos
de Van der Waals, caractersticos de muitas clorofilas. Desta forma, as xantofilas presentes no
extrato de espinafre permanecem por mais tempo retidas na FE, e, por isso, eluem mais
lentamente.

Figura 4 - Estrutura qumica da slica (FE).

Na representao acima, pode-se notar que, na superfcie da slica (SiO 2) slido amorfo
utilizado como fase estacionria existem stios ativos de hidroxilas (silanois), que so
responsveis pela alta polaridade e fora das ligaes de hidrognio, que afetam a reteno dos
analitos polares.
As fraes coletadas foram analisadas por espectroscopia molecular nos comprimentos de
onda de mxima absorbncia para os trs analitos (carotenos, clorofila e xantofilas), e foram
obtidos espectros eletromagnticos na regio do UV-Vis; a fim de verificar, comparando os
espectros com os da literatura, a eficincia da separao clssica empregada.

Figura 5 - Espectro de absoro UV-Vis da 1 banda coletada (carotenos).

Figura 6 - Espectro de absoro UV-Vis de uma mistura de carotenoides encontrados

em algumas espcies de algas. Eixo x: (nm). Eixo y: absorbncia.
Comparando os dois espectros (experimental e o de referncia), observa-se que ambos
so bastante semelhantes, apresentando picos em regies parecidas do espectro eletromagntico.

Figura 7 - Espectro de absoro UV-Vis da 2 banda coletada (clorofilas).

Figura 8 - Espectros de absoro UV-Vis de clorofilas encontradas em quatro

diferentes espcies de plantas com condies diferentes de crescimento.
A Figura 8 traz 16 diferentes espectros de absoro de clorofilas em quatro plantas
distintas, porm, nota-se que todos esses espectros se assemelham com o encontrado no
experimento.

Figura 9 - Espectro de absoro da 3 banda coletada (xantofilas).

As xantofilas so carotenoides, e, mesmo apresentando estruturas diferentes das dos
carotenos, seus espectros so parecidos. Por isso, o espectro encontrado nessa banda exibe
similaridade com o da literatura, apresentado na Figura 6, que mostra o espectro caracterstico
dos carotenoides.
Desta forma, constata-se que todas as bandas coletadas a partir do extrato de espinafre
foram bem separadas.
Para avaliar a separao analtica, utilizou-se a CCD. Atravs da distncia percorrida na
placa por cada mancha, pode-se fazer um comparativo entre o fator de retardamento das
manchas do extrato de espinafre com as manchas das trs bandas coletadas. O fator de
retardamento (ou fator de reteno), relaciona a afinidade do analito pela FM e pela FE. Em
CCD, ele definido como:

Sendo que:dm = distncia percorrida pela mancha

ds = distncia percorrida pelo solvente
Se a dm for prxima da ds, ento, conclui-se que o analito referente mancha tem maior
afinidade pela FM e fator de retardamento alto. Quando a d m for bastante diferente da ds, o
analito tem maior afinidade pela FE e fator de retardamento baixo. Neste experimento, d s = 5,40
cm.
Tabela 1 - Distncias percorridas por cada mancha do extrato de espinafre e seus
respectivos fatores de reteno.
Extrato
Manchas

dm (cm)

Fr

1,9

0,35

2,2

0,41

2,4

0,44

3,1

0,57

5,4

1,00

No se pde calcular com exatido o fator de reteno para as manchas da 2 banda,

pois acredita-se que esta possua traos contaminantes das demais substncias da matriz. O
esquema que exemplifica a placa cromatogrfica obtida mostrado a seguir:

Figura 10 - Esquema da placa cromatogrfica obtida na CCD.

Desconsiderando a 2 banda, pode-se calcular o fator de reteno para a primeira e terceira.
Tabela 2 - Distncia percorrida pela mancha da 1 banda e seu respectivo fator de
reteno.
1 banda
Mancha

dm (cm)

Fr

5,4

Tabela 3 - Distncia percorrida pela mancha da 3 banda e seu respectivo fator de

reteno.
3 banda
Mancha

dm (cm)

Fr

1,8

0,33

Assim, observa-se que a mancha da primeira banda se relaciona com a quinta mancha
do extrato, pois seus fatores de reteno so iguais; e a mancha da terceira banda se relaciona
com a primeira mancha do extrato, pois seus valores so bem prximos.

Como mencionado acima, altos fatores de retardamento indicam que os analitos tm

maior afinidade pela FM, ou seja, sero eluidos mais facilmente e percorrero distncias
maiores. Assim, pode-se concluir que a 1 banda referente substncia que tem maior
interao com o solvente, que, como verificou-se atravs da anlise da estrutura qumica, a
mistura de carotenos. Foi definido tambm as xantofilas como o grupo que mais interage com a
fase estacionria, ento, atribui-se a elas o Fr = 0,33 (3 banda).
Nem sempre tcnicas cromatogrficas mais sofisticadas, com alta instrumentao so
adequadas quando se precisa fazer anlises preliminares de uma matriz qualquer;
principalmente se esta matriz for muito complexa, como matrizes biolgicas ou ambientais.
Mtodos preparativos, como a cromatografia em coluna clssica e a cromatografia em camada
delgada so muito usados at os dias de hoje, por suas vrias vantagens, como a facilidade,
versatilidade e rapidez. Porm, embora essas tcnicas serem de grande valia para um qumico,
elas tambm possuem desvantagens que podem ser significantes. Uma delas a
reprodutibilidade e eficincia. As FEs devem ser completamente uniformes, sem rachaduras,
bolhas ou filmes com espessura variada, para que a FM e os analitos no possuam caminhos
preferenciais para percorrerem durante a eluio (termo A da Equao de Van Deemter).
Possivelmente, essa foi a maior fonte de erros durante o experimento, devido s condies da
coluna empacotada.
Esses erros propiciaram em certa coeluio de misturas indesejveis na 2 banda
coletada, porm, esse desvio na separao esperada no foi muito significativo, uma vez que se
comprovou uma separao dos analitos aceitvel, atravs dos espectros de absoro dos
mesmos; que eram desiguais entre si, e semelhantes em relao aos da literatura.
4.2. Experimento 2: Cromatografia Gasosa (CG)
Tabela 4: Valores de tempo de reteno e largura para compostos da mistura A
Tempo de
reteno a
80 C
Composto
(min)
3,712
n-heptanol
6,731
n-octano
6,863
n-nonano
11,339
decano
gs de isqueiro
-

Tempo de
Largura reteno a
w a 80C 160C
(min)
(min)
0,0247
3,428
0,0283
3,954
0,0416
4,97
0,0741
6,435
-

Largura w
a 160C
(min)
0,0141
0,0273
0,028
0,0412
-

Tempo de
reteno na
rampa de
aquecimento
(min)
3,918
5,197
6,974
8,999
2,916

Largura w na
rampa de
aquecimento
(min)
0,0299
0,0317
0,0332
0,0346
0,0246

A parir de tais valores, podemos perceber que o primeiro pico referente ao n-heptano, o
segundo, o terceiro e o ltimo, ao n-octano, n-nonano e ao decano, respectivamente. Isto pode
ser explicado primeiramente pelo fato de que nesta ordem que a massa molecular aumenta, e
consequentemente, a volatilidade diminui, e, quanto mais voltil, mais rpido o composto
volatilizado, arrastado pela coluna, chegando at o detector. A polaridade da coluna no afeta
significativamente na separao, devido aos compostos da mistura apresentar polaridades
parecidas.

Tabela 5 : Propriedades e estruturas dos compostos da mistura A

Mistura A

Frmula
Molecular

n-Heptano

Frmula estrutural

Ponto de
Ebulio (C)

Massa
Molecular
(g/mol)

98,42

100,21

C7H16

n-Octano

C8H18

125

114,23

n-Nonano

C9H20

151

128,2

Decano

C10H22

174,1

142,29

Tabela 6: Valores dos parmetros cromatogrficos para compostos da mistura A na

temperatura de 80C

Composto
n-heptano
n-octano
n-nonano
decano

Parmetros cromatogrficos para a temperatura de 80C

Tempo de
reteno
Fator de
ajustado
reten
Altura do
Fator de
(min)
o
Eficincia prato terico separao
Resoluo
pico 1 /pico 2: pico 1 /pico 2:
0,796
0,273 361361,61
4,98116 10-6
4,793
113,9
pico 2/pico 3 pico 2 /pico 3:
3,815
1,308 905120,27 1,98869 10-6
1,035
3,8
pico 3/pico 4:
pico 3/pico 4:
3,947
1,354 435473,09 4,13344 10-6
2,134
77,4
-6
8,423
2,889 374656,33 4,80440 10

Tabela 7: Valores dos parmetros cromatogrficos para compostos da mistura A na

temperatura de 100C
Parmetros cromatogrficos para a temperatura de 100C
Tempo de
reteno
Fator de
ajustado
reten
Altura do
Fator de
Composto (min)
o
Eficincia prato terico separao
Resoluo
pico 1/pico 2:
pico 1/pico 2:
-6
n-heptano
0,512
0,176 945721,76 1,90331 10
2,027
25,4
pico 2/pico 3:
pico 2/pico 3:
n-octano
1,038
0,356 335635,60 5,36296 10-6
1,979
36,7
pico 3/pico 4:
pico 3/pico 4:
n-nonano
2,054
0,704 504100,00 3,57072 10-6
1,713
42,3
-6
decano
3,519
1,207 390321,66 4,61158 10
Tabela 8: Valores dos parmetros cromatogrficos para compostos da mistura A na rampa
de aquecimento.

Parmetros cromatogrficos para a temperatura na rampa de aquecimento

Tempo de
reteno
Fator de
ajustado
reten
Altura do
Fator de
Composto (min)
o
Eficincia prato terico separao
Resoluo
pico 1/pico 2:
pico 1/pico 2:
-6
n-heptano
1,002
0,344 274730,24
6,5519 10
2,276
41,526
pico 2/pico 3:
pico 2/pico 3:
n-octano
2,281
0,782 430038,06
4,1857 10-6
1,779
54,761
pico 3/pico 4:
pico 3/pico 4:
n-nonano
4,058
1,392 706004,88
2,5496 10-6
1,499
59,735
decano
6,083
2,086 1082321,51
1,6631 10-6
Observando os valores dos parmetros cromatogrficos percebemos que em alguns
aspectos a anlise usando a rampa de aquecimento apresentou fatores de separao e resoluo
menores que os de 80C para os compostos n-heptano e n-octano e fator de separao menor
que os de 100C para os pares de compostos n-octano e n-nonano e n-nonano e decano, apesar
da resoluo neste caso ser maior para a rampa de aquecimento. J a eficincia apresentou
valores maiores na rampa de aquecimento para n-nonano e decano, mas menores para n-heptano
e n-octano em relao a 80C.
Para melhorar ainda mais os valores da eficincia, pode se otimizar as condies de anlise
de acordo com a equao de van Deemter:

Onde H a altura do prato terico, o fator de empacotamento, d p o dimetro da partcula de

FE, o fator de obstruo, DM o coeficiente de difuso no analito na fase mvel, u a vazo
do gs de arraste, df a espessura do filme lquido de fase estacionria, D s o coeficiente de
difuso no analito na fase estacionria, Dm o coeficiente de difuso no analito na fase mvel e
r o dimetro da coluna.
Para melhorar a eficincia, deve minimizar ao mximo H, j que a eficincia
inversamente proporcional altura do prato terico. Neste caso, o primeiro termo da equao
no relevante, pois em colunas capilares, que foi utilizada para analisar a mistura A, o
primeiro termo se anula, sendo mais importante o segundo termo, que dividido por u, e o
terceiro, que multiplicado. Pode-se minimizar H diminuindo a espessura do filme lquido de
FE, df.

Curva de calibrao do n-octano

rea do pico (contagens/s)

200000

150000

100000

Equation

y = a + b*x

Weight

No Weighting
1,54372E7

Residual Sum
of Squares

50000

0,9997

Pearson's r

0,99921

Adj. R-Square

Value

Standard Error

rea do pico

Intercept

-8625,04595

1937,77984

rea do pico

Slope

20997,44392

294,82381

10

concentrao (mg/mL)

Figura 11: Curva de calibrao do n-octano.

Equao da reta: y = 20997x -8625
Valor de R2: 0,9992
Para o clculo da concentrao de n-octano na amostra, substituiu o valor do sinal para
a amostra, que 3059450,0 contagens/s, no lugar de y na equao da reta, e encontrando assim
o x, que o valor da concentrao em mg/mL.
A concentrao obtida de 146,12 mg/mL, que um valor muito alto, provavelmente
proveniente de erros como a forma da injeo, no preparo das solues padres de n-octano, e
tambm devido ao modo de operao split, que no adequado para anlises quantitativas.
Tabela 9: Valores de tempo de reteno e largura para compostos da mistura B

Composto
3- pentanol
1- hexanol
1- heptanol
1- octanol
gs de
isqueiro

Tempo de
reteno a
Largura w Tempo de
largura w
140 C
a 140C
reteno a
a 160C
(min)
(min)
160C (min) (min)
4,157
0,0295
4,038
0,0279
5,604
0,0363
4,854
0,0328
6,873
0,0434
5,522
0,0365
8,881
0,0558
6,532
0,0418
-

Tempo de
reteno na
rampa de
aquecimento
(min)
4,402
6,558
7,781
9,160

Largura w na
rampa de
aquecimento
(min)
0,0277
0,0312
0,0331
0,0375

3,753

0,117

Como se pode observar, o 3-pentanol, o 1-hexanol, o 1-heptanol e o 1-octanol so

referentes ao primeiro, segundo, terceiro e ltimo pico, respectivamente. Isto se deve ao fato
que, apesar da fase estacionria ser polar, a polaridade no o fator determinante, j que as
estruturas so parecidas, mas sim a volatilidade, e nesta ordem que os valores de ponto de
ebulio aumentam e consequentemente, a volatilidade diminui, sendo assim o 3-pentanol

quem se volatiliza primeiro e assim por diante, sendo tambm arrastado pelo gs inerte (fase
mvel) primeiramente.
Tabela 10: Propriedades e estruturas dos compostos da mistura B
Ponto de
Ebulio
(C)

Massa
Molecular
(g/mol)

Mistura B

Frmula
Molecular

3-Pentanol

C5H12O

115,3

88,14

1-Hexanol

C6H14O

158

102,17

1-Heptanol

C7H16O

175,8

116,2

1-Octanol

C8H18O

195

130,23

frmula estrutural

Tabela 11: Valores dos parmetros cromatogrficos para compostos da mistura B na

temperatura de 140C

Composto
3- pentanol
1- hexanol
1- heptanol
1- octanol

Parmetros cromatogrficos para a temperatura de 140C

Tempo de
reteno
ajustado
Fator de
Altura do
Fator de
(min)
reteno Eficincia prato terico separao
Resoluo
pico 1/pico 2:
pico 1/pico 2:
0,404
0,108 317713,74 5,66548 10-6
4,582
44,0
pico 2/pico 3:
pico 2/pico 3:
1,851
0,493 381331,77 4,72030 10-6
1,686
31,8
pico 3/pico 4:
pico 3/pico 4:
3,120
0,831 401266,78 4,48579 10-6
1,644
40,5
-6
5,128
1,366 405298,81 4,44117 10

Tabela 12: Valores dos parmetros cromatogrficos para compostos da mistura B na

temperatura de 160C

Composto
3- pentanol
1- hexanol
1- heptanol
1- octanol

Parmetros cromatogrficos para a temperatura de 160C

Tempo de
reteno
Fator de
ajustado
reten
Altura do
Fator de
(min)
o
Eficincia prato terico separao
Resoluo
pico 1/pico 2:
pico 1/pico 2:
0,285
0,076 335153,84 5,37067 10-6
3,863
26,9
pico 2/pico 3:
pico 2/pico 3:
1,101
0,293 350406,25 5,13689 10-6
1,607
19,3
1,769
2,779

0,471 366207,35
0,740 390714,72

4,91525 10-6
4,60694 10-6

pico 3/pico 4:
1,571

pico 3/pico 4:
25,8

Tabela 13: Valores dos parmetros cromatogrficos para compostos da mistura B na

rampa de aquecimento (120C at 4,5 min e 20C/min at 180C)
Parmetros cromatogrficos para a temperatura na rampa de aquecimento (120C at 4,5 min e
20C/min at 180C)
Tempo de
reteno
ajustado
(min)

Composto

Fator de
reteno

3- pentanol

0,649

0,173

1- hexanol

2,805

0,747

1- heptanol
1- octanol

4,028
5,407

1,073
1,441

Altura do
Eficincia prato terico Fator de separao
pico 1/pico 2:
404073,64 4,45463 10-6 4,322
pico 2/pico 3:
706892,90 2,54635 10-6 1,436
pico 3/ pico 4:
884168,07 2,03581 10-6 1,342
954659,27 1,88549 10-6

Resoluo
pico 1/pico 2:
73,2
pico 2/pico 3:
38,0
pico 3/pico 4:
39,1

A partir dos valores dos parmetros calculados, pode-se observar que a eficincia na rampa
de aquecimento foi maior do que em 140C e 160C, e os valores do fator de separao e
resoluo na rampa de aquecimento foram parecidos com os valores de tais parmetros
cromatogrficos em 140C, logo a rampa de aquecimento obteve resultados satisfatrios.
Os resultados podem ser melhorados alterando a natureza, presso e fluxo da fase mvel, a
rampa de aquecimento da anlise, ou at mesmo otimizando as condies do experimento
atravs da equao de van Deemter. Neste caso, pode-se minimizar o dimetro das partculas de
fase estacionria, pois esta slida. Os outros termos da equao de van Deemter no so
relevantes neste caso.

Curva de calibrao do hexanol considerando o valor para 10 mg/mL

140000

rea do pico (contagens/s)

120000
100000
80000
60000

Equation

y = a + b*x

Weight

No Weighting

Residual Sum
of Squares

40000

8,35324E8
0,95412

Pearson's r

0,91034

Adj. R-Square

20000

Value

Standard Error

rea do pico

Intercept

-6137,63938

12313,28768

rea do pico

Slope

11807,83018

1852,7922

0
0

10

concentrao (mg/mL)

Figura 12 : Curva de calibrao do hexanol considerando o ponto referente

concentrao de 10 mg/L
Equao da reta: y = 11807 x -6137
Valor de R2: 0,91034

Curva analtica de hexanol desconsiderando o valor de 10 mg/mL

90000
80000

rea do pico (contagens/s)

70000
60000
50000
40000

Equation

y = a + b*x

Weight

No Weighting

Residual Sum
of Squares

4,36793E7

30000

Pearson's r

0,99362

Adj. R-Square

0,98728

20000

rea do pico

Intercept

2713,97908

3465,80596

rea do pico

Slope

9204,41299

603,31938

Value

Standard Erro

10000
0
0

10

concentrao (mg/mL)

Figura 13: Curva de calibrao do hexanol desconsiderando o ponto referente

concentrao de 10 mg/L
Equao da reta: y = 9204 x + 2713
Valor de R2: 0,9873
Como o valor de R2 maior para a curva de calibrao desconsiderando o ltimo ponto, foi
utilizada a equao da reta referente a essa curva de calibrao para determinar a concentrao
de hexanol na amostra. Substituindo o valor da rea do pico da amostra, que de 98160,0
contagens/s, em y, podemos encontrar x, que o valor da concentrao de hexanol em mg/mL.
A concentrao obtida de 10,37017 mg/mL.
Equaes utilizadas:

Tempo de reteno ajustado (tr):

Onde tr o tempo de reteno do pico em questo e tm o tempo de reteno do pico morto.

Fator de reteno (k):

Eficincia (N)
[pratos tericos]

Onde w a largura do pico em questo .

Altura do prato terico (H):

[m/pratos tericos]

Onde L o comprimento da coluna (m)

Fator de separao ()

Onde ka o fator de reteno maior e kb o menor. medida sempre para dois picos
consecutivos.

Resoluo (R)

Onde tra o tempo de reteno maior e wa a largura do seu respectivo pico, trb o tempo de
reteno menor e wb a largura do seu respectivo pico. calculada para dois picos adjacentes.

4.3. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

Tabela 14 : Valores de tempo de reteno, largura, tempo de reteno ajustado, fator de
reteno, resoluo, eficincia, altura do prato terico e fator de separao para os
compostos da mistura A em diferentes composies da fase mvel
metanol/gua
ANALITOS
(v/v)
tR (min)

50/50

60/40

70/30

Uracil
Fenol
Benzonitrila
Nitrobenzeno
Uracil
Fenol
Benzonitrila
Nitrobenzeno
Uracil
Fenol
Benzonitrila
Nitrobenzeno

2,069
4,278
5,244
7,497
2,124
3,352
3,775
4,980
2,109
2,739
2,934
3,551

Wb
(min)
0,52
0,61
0,56*
0,70
0,46*
0,42*
0,59*
0,67
0,19**
0,08**
0,08**
0,09**

Uracil

------- #

-------

Fenol

------- #

-------

Benzonitrila ------- #

-------

Nitrobenzeno

0,08*

80/20
2,895

Resultados para a Mistura A

tR'
k
Rs
N
H (cm)
(min)
0
0
3,91
253,3
0,0987
1,068 2,209
1,65
786,9
0,0318
1,535 3,175
3,58
1403,0 0,0178
2,623 5,428 ------- 1835,3 0,0136
0
0
2,79
341,1
0,0733
0,578 1,228
0,84
1019,1 0,0245
0,777 1,651
1,91
655,0
0,0382
1,345 2,856 ------884,0
0,0283
0
0
2,74
682,6
0,0366
0,299 0,630
1,43
6494,0 0,0038
0,391 0,825
4,26
7451,6 0,0034
0,684 1,442 ------- 8624,3 0,0029
------------ ------------------------------ ------------------------------ ------------------------------ ------- 7254,8 0,000034
-

Tabela 1: Resultados obtidos pela anlise por HPLC da mistura A em diferentes fases mveis.
* valor de largura da base obtido manualmente.
** valor de largura obtido meia altura do pico, obtido manualmente.
# picos que coeluiram na anlise.

------1,44
1,71
------------1,34
1,73
------------1,31
1,75
-------------------------------

Durante a anlise com a fase mvel 80/20 (metanol/gua) observamos apenas trs picos,
onde o primeiro e o segundo estavam muito prximos e o ultimo estava bem distante, assim no
conseguimos distinguir e analisar os analitos Uracil, Fenol e Benzonitrila neste caso, salvando
apenas o Nitrobenzeno.
Os analitos da mistura A so uracil, fenol, benzonitrila e nitrobenzeno, suas respectivas
estruturas moleculares so:

Nitrobenzeno

Benzonitrila

Fenol

Uracil

Como podemos observar, o Uracil tem dois tomos de oxignio e dois tomos de
nitrognio dispostos de forma com que este composto seja o mais polar entre os quatro citados,
o fenol seria o segundo composto mais polar porque tem uma hidroxila ligada diretamente ao
anel, enquanto os outros dois tm tomos menos eletronegativos que o oxignio ligados
diretamente ao anel. Entre a benzonitrila e o nitrobenzeno, o grupo nitro no oferece tanta
polaridade molcula porque os oxignios esto alinhados de forma a no contriburem tanto
para o momento polar alm deles no estarem ligados diretamente ao anel aromtico, desta
forma concluiu-se que a ordem de polaridade dos analitos da mistura A :
Uracil > Fenol > Benzonitrila > Nitrobenzeno
J que o Uracil o composto mais polar ele foi o primeiro a ser eludo na coluna
cromatogrfica porque esta uma coluna empacotada de fase estacionria C 18, um material
bastante apolar, assim os analitos mais polares vo interagir menos com a fase estacionria da
coluna, portanto estes sero eludos mais rapidamente, explicando os resultados obtidos na
tabela 1 em que o tempo de reteno do Uracil o menor, seguido pelo Fenol, depois a
Benzonitrila e por ultimo o Nitrobenzeno.
Tabela 15: Valores de tempo de reteno, largura, tempo de reteno ajustado, fator de
reteno, resoluo, eficincia, altura do prato terico e fator de separao para os
compostos da mistura A em diferentes composies da fase mvel.
metanol
/gua
(v/v)

Analitos

50/50

Uracil
Anilina
lcool
Benzlico
Acetofenona
Uracil
Anilina
lcool
Benzlico
Acetofenona

60/40

Resultados para a mistura B

tR (min)
2,073
3,678
4,211

Wb
(min)
0,47
0,52
0,67

6,007
2,104
3,087
3,299
4,134

Rs

H (cm)

0
0,774
1,031

tR'
(min)
0
1,605
2,138

3,24
0,90
2,97

311,3
800,5
632,0

0,0803
0,0312
0,0396

------1,33
1,84

0,54*
0,09**
0,10**
0,12**

1,898
0
0,467
0,568

3,934
0
0,983
1,195

------6,08
1,13
3,92

1979,9
3027,7
5279,4
4187,1

0,0126
0,0083
0,0047
0,0060

------------1,22
1,70

0,13**

0,965

2,030

-------

5602,3

0,0045

-------

70/30

80/20

Uracil
Anilina
lcool
Benzlico
Acetofenona
Uracil
Anilina
lcool
Benzlico
Acetofenona

2,102
2,709 #
2,709 #

0,40*
0,48*
0,48*

0
0,289
0,289

0
0,607
0,607

1,38
0
0,90

441,8
509,6
509,6

0,0566
0,0491
0,0491

------1,00
1,70

3,135
2,400 #
2,400 #
2,400 #

0,47
0,14**
0,14**
0,14**

0,491
0
0
0

1,033
0
0
0

------0
0
1,51

711,9
1628,1
1628,1
1628,1

0,0351
0,0154
0,0154
0,0154

-------------------------

2,696

0,09**

0,123

0,296

-------

4971,2

0,000050

-------

* valor de largura da base obtido manualmente.

** valor de largura obtido meia altura do pico, obtido manualmente.
# picos que coeluiram na anlise.

Nas anlises com fase mvel 70/30 e 80/20 (metanol/gua) os analitos Anilina e lcool
Benzlico, no caso 70/30, e os analitos Uracil, Anilina e lcool Benzlico, no caso 80/20, todos
foram detectados como um nico pico, porem este pico pode ser analisado manualmente
gerando os dados da tabela 2.
Os analitos que compem a mistura B so Uracil, Anilina, lcool Benzlico e Acetofenona,
suas respectivas estuturas moleculares so:

Uracil

Anilina

lcool Benzilico

Acetofenona

Do mesmo modo feito para a mistura A, podemos analisar a polaridade destes compostos e
pelo mesmo motivo de antes o Uracil ser o mais polar, j a Anilina ser o segundo mais polar
porque tem um nitrognio ligado diretamente ao anel aromtico enquanto os outros dois
compostos tm um carbono ligado ao anel, entre o lcool Benzilico e a Acetofenona o lcool
ser mais polar devido ao anel estar ligado a um grupo lcool, enquanto na Acetofenona este
anel est ligado a um carbono que se liga a um oxignio e a uma metila, assim esta metila
adicional faz com que a polaridade da Acetofenona seja ligeiramente menor que do lcool,
assim a ordem de polaridade dos analitos da mistura B :
Uracil > Anilina > lcool Benzlico > Acetofenona
Pelo mesmo motivo citado para os analitos da mistura A, como a coluna cromatogrfica e as
fases mveis envolvidas na anlise so as mesmas para as duas misturas, os compostos mais
polares sero eludos mais rapidamente e, portanto, tero um tempo de reteno menor, como
obtido nos resultados da tabela 2.
Sobre a fora da fase mvel podemos concluir que como a nossa fase estacionria
bastante apolar, quanto mais apolar for a fase mvel utilizada, mais forte esta fase mvel e,
portanto, menor a reteno dos analitos. Assim podemos concluir que quando se tem

polaridades das fases mvel e estacionaria prximas uma da outra, espera-se uma velocidade de
eluio maior e consequentemente uma menor resoluo entre os picos.
Ambas as misturas A e B se comportaram da mesma maneira sobre a mudana de fases
mveis, porque conforme aumentamos a relao metanol/gua aumentamos o carter apolar da
fase mvel, assim a polaridade desta fase mvel cada vez mais prxima da polaridade dos
analitos e da fase estacionria utilizada nas anlises das duas misturas, o efeito observado foi
que com o aumento da concentrao de metanol na fase mvel houve um aumento na
velocidade de eluio dos analitos e uma resoluo menor entre os picos, como esperado, por
conta disso observamos coeluio de analitos em concentraes muito altas de metanol na fase
mvel.
Frmulas utilizadas na obteno dos resultados:
Fator de reteno (k):
Tempo de reteno ajustado (tR):
Fator de separao ():

Eficincia (N):

Eficincia meia altura:

Altura do prato terico (H):

Resoluo (Rs):

Resoluo meia altura:

Onde tR o tempo de reteno, t M o tempo morto, W a largura dos picos na base e L o
comprimento da coluna cromatogrfica.

5. CONCLUSO
Nem sempre tcnicas cromatogrficas mais sofisticadas, com alta instrumentao so
adequadas quando se precisa fazer anlises preliminares de uma matriz qualquer;
principalmente se esta matriz for muito complexa, como matrizes biolgicas ou ambientais.
Mtodos preparativos, como a cromatografia em coluna clssica e a cromatografia em camada
delgada so muito usados at os dias de hoje, por suas vrias vantagens, como a facilidade,
versatilidade e rapidez. Porm, embora essas tcnicas serem de grande valia para um qumico,
elas tambm possuem desvantagens que podem ser significantes. Uma dela a reprodutibilidade
e eficincia. As FEs devem ser completamente uniformes, sem rachaduras, bolhas ou filmes

com espessura variada, para que a FM e os analitos no possuam caminhos preferenciais para
percorrerem durante a eluio (termo A da Equao de Van Deemter). Possivelmente, essa foi a
maior fonte de erros durante o experimento, devido s condies da coluna empacotada.
Esses erros propiciaram em certa coeluio de misturas indesejveis na 2 banda coletada,
porm, esse desvio na separao esperada no foi muito significativo, uma vez que se
comprovou uma separao dos analitos aceitvel, atravs dos espectros de absoro dos
mesmos; que eram desiguais entre si, e semelhantes em relao aos da literatura.
Desta forma, conclui-se que tais mtodos clssicos atendem muito bem o seu papel, em
serem preparativos adequados.
Porm, a otimizao de certos parmetros tanto determinados experimentalmente quanto
pela equao de van Deemter, como a temperatura para Cromatografia Gasosa e a fora da fase
mvel para Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC), ambos analisados no
experimento, contribuem para um resultado melhor e mais preciso. A instrumentao da tcnica
pode torna l reprodutvel, alm de mais prtico para as anlises. No entanto, as possveis fontes
de erro para o segundo experimento foram as injees da amostra e o preparo das solues.

6. ANEXOS

Aqui se encontram os cromatogramas dos experimentos

Experimento 3: Cromatografia Lquida de alta eficincia

Figura 14: Cromatograma da mistura A com fase mvel metanol:gua 50:50

Figura 15: Cromatograma da mistura A com fase mvel metanol:gua 60:40

Figura 16: Cromatograma da mistura A com fase mvel metanol:gua 70:30

Figura 17: Cromatograma da mistura A com fase mvel metanol:gua 80:20

Figura 18: Cromatograma da mistura B com fase mvel metanol:gua 50:50

Figura 19: Cromatograma da mistura B com fase mvel metanol:gua 60:40

Figura 20: Cromatograma da mistura B com fase mvel metanol:gua 70:30

Figura 21: Cromatograma da mistura B com fase mvel metanol:gua 80:20

Experimento 2: Cromatografia Gasosa

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ENGEL, V. L.; POGGIANI, F. Estudo da Concentrao de Clorofila nas Folhas e seu Espectro
de Absoro de Luz em Funo do Sombreamento em Mudas de Quatro Espcies Florestais
Nativas. Brazilian Journal of Plant Physiology, vol. 3, 1991.
HARRIS, D. C. Anlise Qumica Quantitativa. LTC Editora, 5 edio, Rio de Janeiro, 2001.
MELO, M. G. G.; ROCHA, O. Associao Simbitica de Metania spinata (Porifera,
Metaniidae) com uma Chlorophyceae. Brazilian Journal of Ecology, vol. 2, 1997.
COLLINS, C.H.; BRAGA, G. I.; BONATO, P. S.; Fundamentos de Cromatografia, Editora da
Unicamp, Campinas, Sp, 1997. Pginas: 21, 22, 23, 24, 47,52,53,54,55,61, 62, 143,144,145,
185,187,189.
http://www.analiticaweb.com.br/produtos_detalhe.php?
tit=&Bid=p3d24b0dc8aa68&an=ca0a098e0885a9ecebf3cdef93538072
McNAIR, H.M., MILLER, M..J., Basic Gas Chromatography, John Wiley & Sons, Inc . New
York, 1998. Pginas: 40,41,42.