Escuela de Tecnologa medica

Tecnologa medica

INFORME DE LABORATORIO N 6
MTODOS DE DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE PROTENAS

Asignatura:
Bioquimica Clinica I

Autores:
Maria Aguilar
Ignacio Candia
Felipe Castillo
Marcela Castro
Docente:
Nilo Carvajal

Introduccin
La curva de calibrado es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la concentracin de
una sustancia en una muestra por comparacin con una muestra de concentracin conocida. Se
basa en una relacin en principio lineal entre un carcter medible (por ejemplo la absorbancia en
los enfoques de espectrofotometra) y la variable a determinar, en este caso la concentracin.
Para ello, se efectan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura
y el consiguiente establecimiento de una funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee
el mismo carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable independiente
de esa funcin, se obtiene la concentracin de sta.
La curva de calibracin se construye con las medidas obtenidas de sustancia de concentracin
conocida (diluciones) que utilizarn para determinar la cantidad de sustancia (protenas) presente
en una muestra incgnita. As, la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la
curva de calibracin, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la
concentracin del analito.
Por ltimo, la relacin entre intensidad de color y concentracin de la sustancia, es proporcional y
as, si se grafica el valor de intensidad de color medido con un aparato adecuado
(espectrofotmetro o colormetro) en funcin de las concentraciones crecientes de la sustancia se
obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de protena, mayor cantidad de producto de reaccin
y, por lo tanto, mayor intensidad de color
A continuacin, se utilizar la curva de calibracin para determinar la concentracin de una muestra
proteica (problema) a partir de diluciones estndar de albumina de bovino, y reactivo de Biuret para
coloracin.
Procedimiento
1. Se preparan las diluciones de albumina con el volumen necesario para cada tubo, obtenido
mediante el clculo terico para luego completar con suero fisiolgico. (tabla en resultados)
2. Posteriormente se agrega el reactivo de Biuret (2 ml) misma cantidad para todos los tubos.
3. Se emulsionan los tubos durante 10 a 30 segundos y se dejan incubar a temperatura
ambiente durante 15 minutos.
4. Se procede con la medida de la absorbancia de cada tubo, para ello, se utiliza una muestra
de suero fisiolgico con reactivo Biuret como solucin blanco para calibrar el
espectrofotmetro.
5. Una vez medida la absorbancia se anota el dato arrojado por el equipo, se calibra con la
solucin blanco y se procede finalmente con el tubo siguiente. Esto sucesivamente con las
muestras restantes.
Por ltimo, a partir de los datos registrados se procede con la construccin de la curva de
calibracin.

Resultados
Preparar 6 diluciones de 500 uL, cada una con distinta concentracin de
BSA, a partir de una solucin madre 10 mg/mL. A los que posteriormente se les
agregara 2 ml de
reactivo Biuret.

Tubo 1
= 0.025 mL

10 mg/mL x = 500 uL 0.5 mg/mL

x= 25 uL

Tubo 2
= 0.05 mL

10 mg/mL x = 500 uL 1.0 mg/mL

x= 50 uL

Tubo 3
uL = 0.125 mL

10 mg/mL x = 500 uL 2.5 mg/mL

x= 125

Tubo 4
uL = 0.250 mL

10 mg/mL x = 500 uL 5.0 mg/mL

x= 250

Tubo 5
uL = 0.375 mL

10 mg/mL x = 500 uL 7.5 mg/mL

x= 375

Tubo 6
uL = 0.5 mL

10 mg/mL x = 500 uL 10.0 mg/mL

x= 500

Luego tabular cuantos uL de suero son necesarios para lograr los 500 uL de
cada tubo.
Tubos
0
1
2
3
4
5
6

uL BSA 10 mg/mL
0
25
50
125
250
375
500

uL suero
500
475
450
375
250
125
0

mL Biuret
2
2
2
2
2
2
2

A las muestras problemas se les har la siguiente relacin:

Muestra Problemas
Suero (tubo 7)
Leche (tubo 8)

uL
20
20

mL Biuret
2
2

Tabla 1. Despus de dejar reposar el reactivo Biuret se midi la absorbancia

de cada tubo:
Tubos
0
1
2
3
4
5
6
7
8

Concentracin (mg/mL)
0
0.5
1.0
2.5
5.0
7.5
10.0
x
x

Graficar los datos obtenidos:

Absorbancia (546 nM)

0
0.0262
0.0553
0.1395
0.2701
0.4067
0.5468
0.2356
0.1325

Mtodo 1: De acuerdo a la ecuacin de la recta del grfico en Excel,

calculamos la concentracin de las muestras problemas.
Suero
y = Valor de la absorbancia de la solucin. = 0.2356
x =Concentracin de la solucin en mg/ml
Suero
0.2356 = 0.0934 X - 0.1674
mg/mL = concentracin.

4.3147

Leche
y = Valor de la absorbancia de la solucin. = 0.1325
x =Concentracin de la solucin en mg/ml
Leche
0.1325 = 0.0934 X - 0.1674
concentracin.

3.2109 mg/mL =

Mtodo 2: De acuerdo al clculo de la pendiente con dos puntos de la

recta A (0.5, 0.0262) y B (10, 0.5468), calcular las concentraciones.

m= 0.5468 0.0262
10.0 0.5

m= 0.0548

Suero
y = Valor de la absorbancia de la solucin. = 0.2356
x =Concentracin de la solucin en mg/ml
Suero
concentracin.

0.2356 = 0.0548 X

4.2992 mg/mL =

Leche
y = Valor de la absorbancia de la solucin. = 0.1325
x =Concentracin de la solucin en mg/ml
Leche
0.1325 = 0.0548 X
concentracin.

2.4178 mg/mL =

Discusin
A travs de la extrapolacin realizada utilizando la ecuacin de la recta,
podemos obtener distintos resultados de concentracin segn el mtodo
utilizado. El mtodo N1 (Utilizando el programa Excel) genera una funcin afn
no lineal que toma como punto de interseccin aproximadamente Y= -0.016.
En cambio el mtodo utilizado en la gua entregada en clases por el Profesor,
aplica una funcin lineal, es decir, el valor de b en la expresin y= mx + b se
considera cero. Este pequeo detalle provoca variaciones en los resultados de
0.47 unidades. El mtodo ms seguro en este caso es el nmero uno, ya que
toma en cuenta el valor de b en la ecuacin de la recta otorgando un dato
ms fidedigno.
Respecto a los resultados, eran los esperados. Ya que in situ pudimos estimar la
concentracin posible para cada muestra problema, primeramente, por la
intensidad de la coloracin.
Luego guiados por la absorbancia. La muestra de Suero arroj una absorbancia
de 0.2356 por lo que tomando en cuenta los valores de la Tabla 1 en los
resultados, su concentracin debera encontrase entre el intervalo de los tubos
3 y 4 (2.5-5.0 mg/ml). Esto fue comprobado al calcular su concentracin en la
extrapolacin con un valor igual a 4.3147 mg/mL, el cual se halla en el rango
de los tubos 3 y 4 (ms cercana al tubo 4).
En tanto, para la muestra de Leche semidescremada, segn su absorbancia
podra encontrarse entre los tubos 2, 3 y 4 (1.0-5.0 mg/ml). Al extrapolar con el
Mtodo 1 usando Excel, obtenemos una concentracin de 3.2109 mg/mL
mientras que al utilizar el Mtodo 2 una concentracin de 2.4178 mg/mL,
existiendo un delta de 0.7931 unidades entre ambos. Sin embargo, como se
acot anteriormente el mtodo de Excel es ms confiable y por lo tanto se
considera como concentracin de protena de 3.2109 mg/ml en la leche
semidescremada, ubicndola entre los tubos 3 y 4 (ms cercano al tubo 3).
Por ello podemos concluir que en el suero existe una mayor concentracin de
protena que en la leche semidescremada.

Conclusin
En este laboratorio se observ sobre la curva de calibracin de protenas, en
donde se entendi que la curva de referencia se construye por cantidades
conocidas de una sustancia, eso quiere decir que la muestra que utilizamos
como la albumina determina la cantidad de protenas en una sustancia o
muestra incgnita, en donde la determinacin en una relacin proporcional
depender entre la magnitud o intensidad del color que da una reaccin y la
cantidad de reactivo que lo provoca, dando un entorno de color azul mediante
la solucin sea con ms cantidad de protenas, el cual fue por el reactivo de
biuret, en donde se prepar la solucin de albumina con suero fisiolgico(ver
anexo 1), luego se utiliz 9 tubos(ver anexo 2) en donde siete tubos fueron
para la gradiente en nivelacin de la albumina en donde el primero fue con de
menor cantidad hasta ir incrementando la cantidad de albumina, donde la
solucin fue a base de suero fisiolgico y ms tarde la incorporacin del biuret,
luego en los dos tubos restantes se utiliz como muestra problema en donde el
n7 fue de suero(ver anexo 3) y el n8 fue de la leche, donde las muestras
fueron solo se aadi el biuret, donde se pudo lograr observar la comparacin
de la intensidad de color en cada muestra, y despus se midi la absorbancia,
para calcular la cantidad del color en cada tubo. A base de esto se observ que
los rangos de absorbancia de las muestras con albumina y las de muestra
problema, arrojaron un nivel de absorbancia acorde con la intensidad de color
que se obtuvo, y as dio como resultado la cantidad de protenas equivalente
entre una muestra con albumina y otra con una muestra problema, el cual en
el grafico se form la curva de calibracin formado con las cantidades de
protenas en las muestras, mostrado por una recta de calibracin.

Anexo

3)

1)

Muestra de albumina con

suero fisiolgico 50ml

Muestra problema tubo

n7
Suero

2)

Tubo n0 n7 suero fisiolgico + albumina + reactivo de biuret

Tubo problema n7 suero + biuret
Tubo problema n8 leche + biuret
BIBLIOGRAFIA
Wolff, Klaus. (2009). Captulo 88: Fundamentos de fotobiologa y de
fotoinmunologa cutneas. En Dermatologa en medicina general (803-804).
Buenos Aires: Medica Panamericana.
Daz, N. A., Ruiz, J. A. B., Reyes, E. F., Cejudo, A. G., Novo, J. J., Peinado, J. P.,... & Fiana, I. T.
(2005). 8. Espectrofometra: Espectros de absorcin y cuantificacin colorimtrica de
biomolculas. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular. Facultad de Medicina. Crdoba.

Fundamentos de Espectrofotometra. (s.f.). Recuperado de

https://drive.google.com/file/d/0BzWR4xFQPJVKdDFZXzA0azdHM3c/view?
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