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DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES
U.N.S.
NDICE
DESARROLLO DEL INCULO U CULTIVO CELULAR POR LOTES...........................1

1.
2.
OBJETIVOS................................................................................................... 1
1.1.
OBJETIVOS GENERALES:........................................................................1
1.2.
OBJETIVOS ESPECFICOS:.......................................................................1
METODOLOGA EXPERIMENTAL.....................................................................2
2.1.
DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO:............................................................2
2.1.1.
Medio slido de mantencin..................................................................3
2.1.2.
Medio de activacin............................................................................. 3
2.1.3.
Medio de Fermentacin........................................................................3
2.1.4.
Solucin de sales................................................................................ 4
2.2.
PREPARACIN DE MEDIOS:.....................................................................4
2.2.1.
Condiciones de Asepsia:......................................................................4
2.2.2.
Preparacin del medio de mantencin:...................................................5
2.2.3.
Preparacin del medio de activacin:.....................................................6
2.2.4.
Preparacin del medio de fermentacin:.................................................7
2.3.
CULTIVO DEL M.O., ETC.:.........................................................................7
2.3.1.
Resiembra celular:............................................................................... 7
2.3.2.
Activacin celular y desarrollo del inculo:..............................................8
2.3.3.
Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa
(ESPECTOFOTOMETRO):............................................................................... 8
2.3.4.
Determinacin de azcares reductores: mtodo del DNS (cido
dinitrosaliclico):............................................................................................... 9
2.3.5.
3.
Determinacin de la concentracin celular por D.O.:...............................10
MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS..............................................12

3.1.
PREPARACIN DE MEDIO SLIDO DE MANTENCIN:.............................12
3.1.1.
Materiales y equipos:.........................................................................12
3.1.2.
Reactivos:........................................................................................ 12
3.2.
PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN:............................................13
3.2.1.
3.2.2.
Reactivos:........................................................................................ 13
3.3.
U.N.S.
PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN:......................................13
3.3.1.
3.3.2.
Reactivos:........................................................................................ 14
3.4.
RESIEMBRA CELULAR:..........................................................................14
3.4.1.
3.5.
ACTIVACIN CELULAR Y DESARROLLO DEL INCULO:...........................14
3.5.1.
3.6.
DETERMINACIN DE LA CINTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA:....15
3.6.1.
3.7.
DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES:....................................15
3.7.1.
3.7.2.
Reactivos:........................................................................................ 15
4.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS.............................................16
5.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.................................................................18
6.
ANEXOS...................................................................................................... 19
1
U.N.S.
DESARROLLO DEL INCULO U CULTIVO CELULAR POR

LOTES
1. OBJETIVOS
1.1. OBJETIVOS GENERALES:
Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces,
empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124, evalundose el
efecto de la fuente de carbono y la velocidad de agitacin en la cintica de
crecimiento y la produccin de etanol.
1.2. OBJETIVOS ESPECFICOS:
Disear y preparar el medio lquido de cultivo.

Activacin celular y desarrollo del inculo.
Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa.
Determinacin de la cintica de consumo de la fuente de carbono.
Determinar la cintica de generacin de etanol.
Determinacin del M, qS y los rendimientos del nutriente limitante en
clulas y en etanol, adems de las respectivas productividades en clulas
y etanol.
Evaluar el valor del pH al inicio y al final de la cintica.
Influencia de la aireacin.
2
U.N.S.
2. METODOLOGA EXPERIMENTAL
2.1. DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO:
Para la formulacin del diseo de cultivo se tiene en cuenta los siguientes
requerimientos nutricionales para el cultivo Pichia stipitis NRRL Y-7124.
Para el Diseo del medio de cultivo:
Macronutrientes:
N, S, K, P y Mg
Micronutrientes:
Ca, Cl, Zn, Fe, Cu, Co y B
Estado:
Medio lquido
pH:
4,5
Requerimi
entos nutricionales:
Para ello utilizamos un medio de cultivo mnimo.
Fuente de carbono y energa:
Glucosa
Fuente de N:
Sulfato de amonio
Sulfato de magnesio
Fuente de Mg y S:
heptahidratado
Fuente de K:
Fsforo dicido de Potasio
Fuente de P:
Fsforo dicido de Potasio

Condiciones de cultivo:
Velocidad de agitacin
(shaker):
180 rpm
Concentracin celular final:
2 g/l
Temperatura:
30 C
2.1.1.
Medio slido de mantencin

NUTRIENTES
CONCENTRACIN (g/l)
PESO (g)
Extracto de levadura
0,15
Peptona
0,25
Extracto de malta
0.15
Agar
20
3
2.1.2.
2.1.3.
Medio de activacin
NUTRIENTES
CONCENTRACIN (g/l)
PESO (g)
Glucosa
10
0,3
Xilosa
10
0,3
0,09
Extracto de malta
0,15
Solucin de sales
5 ml/l
0.15 ml
NUTRIENTES
CONCENTRACIN (g/l)
PESO (g)
Glucosa
14,0
(NH4)2SO4
KH2PO4
MgSO4.7H2O
1,1
Solucin de sales
5 ml/l
Medio de Fermentacin
Tampn citrado
pH 4,5
2.1.4.
U.N.S.
Solucin de sales
NUTRIENTES
CONCENTRACIN (g/l)
CaCl2.2H2O
2,9
ZnO
0.40
FeSO4.7H2O
6,42
MgSO4.7H2O
2,20
CuSO4.5H2O
0,25
CoCl2.6H2O
0,24
H3BO3
0,06
ml
4
U.N.S.
2.2. PREPARACIN DE MEDIOS:

2.2.1.
Condiciones de Asepsia:
rotular
Mechero bunsen
Los Matraces
encender
sostener
flamear
Matraz
-Nombre de cepa.
-Fecha.
Nombre del grupo.
Previamente desinfectado el rea
de trabajo con alcohol de 96
Si los matraces tienen un tapn de
algodn, aflojar un poco de
manera que no est muy apretado
La boca de ambos matraces para
matar cualquier microorganismo
presente en el aire y que pueda
contaminar
enel
la meique
prctica.
Tapar con
retirar
flamear
mantener
Inculo
La Boca de ambos matraces
Posicin inclinada (riesgo de

contaminacin
sea mnimo)
Matraz estril
sembrar
flamear
Boca de los matraces

taparlos de nuevo
mezclar
Matraces en el caldo
sembrado
Inculo
flamear
Los tapones antes que los

coloques en los matraces.
5
U.N.S.
2.2.2. Preparacin del medio de mantencin:
Agua destilada
medir
pesar
Agua destilada
medir
En un matraz de 250 ml
Cantidad de cada compuesto
Hasta llegar a los 50 ml

que se requiere.
calentar
En un Mechero Bunsen (lograr

una coloracin celeste),
agitar
Constantemente con un varilla por

un minuto (aparicin de la primera
burbuja).
5 tubos de ensayo
con tapa.
preparar
agregar
6-7 ml de la mezcla en caliente a

cada tubo de ensayo, con pipeta
de 10 ml.
enfriar
Una vez tapados los tubos de

ensayos, por 1 hora.
colocar
En un vaso precipitado, y llevarlos

a la olla a presin (auto clave).
121 C
/ 20 min
calentar
colocar
A posicin inclinada a T. Amb.
2.2.3. Preparacin del medio de activacin:

Componentes para el
medio
pesar
Por separado.
- Extracto de levadura en una
matraz.
- Glucosa en un matraz de 125 ml.
- Las sales en un tubo de ensayo.
6
U.N.S.
esterilizar
Por separado los componentes.
disolver
Sales minerales
alistar
El volumen de las sales minerales.
agregar
Al matraz que contiene el

extracto de levadura, con la
ayuda de la micro pipeta.
ajustar
EL pH a 7 de la solucin que
contiene glucosa y xilosa.
121C 15 min.
esterilizar
mezclar
2.2.4. Preparacin del medio de fermentacin:

Componentes para el
medio
pesar
Cada compuesto en agua destilada:

-
disolver
esterilizar
enfriar
Glucosa en un matraz de 1 L con

agua destilada.
(NH4)2SO4 en un matraz con
agua destilada
Solucin de sales, KH2 PO4,
(MgSO4).7H2O en un matraz con
agua destilada.
Las disoluciones por separado.
7
U.N.S.
2.3. CULTIVO DEL M.O., ETC.:

2.3.1.
Resiembra celular:
esterilizar
Materiales a utilizar, garantizar

asepsia
colocar
Abajo el Mechero para mantener

un ambiente estril
someter
El Asa Bacteriolgica al fuego del

mechero hasta el rojo vivo.
Por unos segundos
enfriar
extraer
resembrar
Una azada del Tubo de Ensayo

que
contena
las
clulas
desarrolladas en medio slido
En tubos de ensayo preparados
con medio slido (Agar)
realizar
Azada desde dentro hacia

fuera en el tubo
llevar
A la Incubadora a 30C durante

24 a 48 horas.
llevar
El tubo de Ensayo para cerrarlo
8
2.3.2.
U.N.S.
Activacin celular y desarrollo del inculo:

tomar
inocular
Una azada de la cepa incubada

en medio slido Pichia stipitis
NRRL Y-7124
En el Matraz con los 30ml del
medio de activacin
tapar
El Matraz con un tapn de

gasa y algodn.
llevar
Al Shaker a 120rpm, T = 35 C
y un t = 24
2.3.3.
Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa
(ESPECTOFOTOMETRO):
inocular
A partir de este paso se
determinar la cintica de
crecimiento de la biomasa.
30ml de caldo (medio rico +

biomasa) a un matraz de 1L
contenido 270ml de medio
definido.
Una muestra de 5ml del caldo.
extraer
X0 y S0 con D.O
medir
Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido
del mechero.
La toma de muestras se inicia desde la dilucin del medio de activacin
en el medio de fermentacin.
Estas se realizaran cada hora y media para la primera muestra y
posteriormente cada hora de la siguiente manera:
extraer
separar
medir
verter
completar
centrifuga
guardar
5ml del medio de cultivo
3ml
para
el
tubo
de
espectrofotmetro y el resto se le
agreg al tubo de centrifugado.
Absorbancia a 640nm y pH
9
U.N.S.
5ml en el tubo de centrifugado,

se devuelve.
A la mxima velocidad por 20
minutos
El sobrenadante en viales y
ponerlos en refrigerador
2.3.4.
Determinacin de azcares reductores: mtodo del DNS (cido
dinitrosaliclico):
aadir
mantener mezcla
Volumen del reactivo DNS a

un volumen de muestra a
analizar
bao: agua
tiempo: 5>
ebullicin
enfriar
Agua destilada
aadir
10 volmenes
leer
2.3.5.
Absorbancia a 540 nm
blanco: agua destilada
Determinacin de la concentracin celular por D.O.:

tomar muestra
centrifugar
re suspender
eliminar
centrifugar
eliminar
Volumen conocido
5000 rpm
Tiempo: 20
Sobrenadante
Centrifugado
destilada
con
agua
10
U.N.S.
5000 rpm
; Tiempo: 20
a fin de eliminar restos

de sustrato que pudieran
alterar la determinacin.
Sobrenadante
re disolver
secar
Precipitado
Estufa: 80 C hasta peso

constante
CINTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

Plan de Muestreos y Registro de Datos
Grupo: C
Da de la experiencia: ..
Micro-organismo: Fuente Carbono:..
pH0
HORA
TC ..
TIEMPO
(horas)
N rpm
Absorbancia
(640 nm)
Nombre del
alumno
Observaciones
11
U.N.S.
3. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

3.1. PREPARACIN DE MEDIO SLIDO DE MANTENCIN:
3.1.1.
Materiales y equipos:
Balanza analtica
Olla a presin
Mechero Bunsen
Pipetas de 10 ml.
6 tubos de ensayo con tapas
Varilla de vidrio
Matraz Erlenmeyer
Guantes
Esptula
Probeta graduada
Capachos de papel
Vaso de precipitados 250m
12
3.1.2.
Reactivos:
Sustrato: Glucosa.
Muestra: Pichia stipitis.
Agua destilada.
Extracto de levadura.
Peptona.
Extracto de malta.
Agar.
3.2. PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN:

3.2.1.
Matraz de 125 ml.
2 tubos de ensayo con tapa
Algodn
Gasa
Varilla de vidrio
Balanza analtica
Esptula
Agua destilada
Guantes
Shaker
Mechero Bunsen, trpode y rejilla.
Olla a presin
Pipetas
Capachos de papel
pHmetro
3.2.2.
Reactivos:
Componentes segn Tabla N 2
U.N.S.
13
U.N.S.
Alcohol
3.3. PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN:

3.3.1.
Matraz de 1 L
Matraces de 125 ml
Micropipeta
Espectrofotmetro
Varilla de vidrio
Capachos de papel
Balanza analtica
pHmetro
Gasa y algodn
Incubadora
Microscopio
Laminillas porta y cubre objeto
3.3.2.
Reactivos:
Segn la tabla N 3
Agua destilada
Alcohol
3.4. RESIEMBRA CELULAR:

3.4.1.
Asa bacteriolgica
Tubo de ensayo con medio slido donde se encuentra el M.O.
14
U.N.S.
3.5. ACTIVACIN CELULAR Y DESARROLLO DEL INCULO:

3.5.1.
Matraz de 125 ml.
Algodn
Gasa
Agua destilada
Shaker
3.6. DETERMINACIN DE LA CINTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA:

3.6.1.
Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentacin
Espectrofotmetro
pHmetro
Gasa y algodn
Centrifuga
Tubos de ensayo
Capachos de papel aluminio
3.7. DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES:

3.7.1.
Barra magntica
Vaso de precipitado 250ml
Matraz de aforo de 100ml.
Papel aluminio
15
U.N.S.
Balanza de platos
Balanza analtica
Frasco de vidrio
Agitador magntico
Mechero bunsen
3.7.2.
Reactivos:
1g de cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS)
1.6g de NaOH 2N.
30g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado.
4. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS
FECHA
ACTIVIDADES
Seleccin
prelacin
de
reaccin
materiales.
ABRIL
2
26
7
2 3 4 5 6 9
MAYO
1
1
11
0
2
17
18
16
Esterilizacin
de medios.
Preparacin
del medio de
cultivo.
Inoculacin
del medio de
cultivo.
Preparacin
de la solucin
tampn.
Evaluacin
supervisin
del medio.
Evaluacin
supervisin
del medio.
Evaluacin
supervisin
del medio.
Evaluacin
supervisin
del medio.
Evaluacin
supervisin
del medio.
Determinaci
n
de
cinticas
las
de
crecimiento,
consumo.
Presentacin
del
informe
final.
Sustentacin.
U.N.S.
17
U.N.S.
5. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Principios de la Ingeniera de los Bioprocesos PAULINE M. DORAN
18
U.N.S.
QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniera Bioqumica.
http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKits-C.pdf.
http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.shtml
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?
Mostrar=quimicos
https://books.google.com.pe/books?
id=oYqWMXyyLxYC&pg=PT1062&dq=QUE+ES+pichia+stipitis+nrrl+y+712
4&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiO0NPuzJjMAhXFlx4KHR_WCX4Q6AEIGjA
A#v=onepage&q=QUE%20ES%20pichia%20stipitis%20nrrl%20y
%207124&f=false
19
6. ANEXOS
U.N.S.

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DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES

DESARROLLO DEL INCULO U CULTIVO CELULAR POR LOTES...........................1

DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO:............................................................2

Medio slido de mantencin..................................................................3

Preparacin del medio de mantencin:...................................................5

Preparacin del medio de activacin:.....................................................6

Preparacin del medio de fermentacin:.................................................7

CULTIVO DEL M.O., ETC.:.........................................................................7

Activacin celular y desarrollo del inculo:..............................................8

Determinacin de la concentracin celular por D.O.:...............................10

MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS..............................................12

PREPARACIN DE MEDIO SLIDO DE MANTENCIN:.............................12

PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN:............................................13

DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES

PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN:......................................13

ACTIVACIN CELULAR Y DESARROLLO DEL INCULO:...........................14

DETERMINACIN DE LA CINTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA:....15

DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES:....................................15

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS.............................................16

DESARROLLO DEL INCULO U CULTIVO CELULAR POR

1.2. OBJETIVOS ESPECFICOS:

Disear y preparar el medio lquido de cultivo.

Ca, Cl, Zn, Fe, Cu, Co y B

Fsforo dicido de Potasio

Fsforo dicido de Potasio

Concentracin celular final:

Medio slido de mantencin

2.2. PREPARACIN DE MEDIOS:

La Boca de ambos matraces

Posicin inclinada (riesgo de

Boca de los matraces

Los tapones antes que los

2.2.2. Preparacin del medio de mantencin:

Hasta llegar a los 50 ml

En un Mechero Bunsen (lograr

Constantemente con un varilla por

6-7 ml de la mezcla en caliente a

Una vez tapados los tubos de

En un vaso precipitado, y llevarlos

A posicin inclinada a T. Amb.

2.2.3. Preparacin del medio de activacin:

Por separado los componentes.

El volumen de las sales minerales.

Al matraz que contiene el

2.2.4. Preparacin del medio de fermentacin:

Cada compuesto en agua destilada:

Glucosa en un matraz de 1 L con

2.3. CULTIVO DEL M.O., ETC.:

Materiales a utilizar, garantizar

Abajo el Mechero para mantener

El Asa Bacteriolgica al fuego del

Una azada del Tubo de Ensayo

Azada desde dentro hacia

A la Incubadora a 30C durante

El tubo de Ensayo para cerrarlo

Activacin celular y desarrollo del inculo:

Una azada de la cepa incubada

El Matraz con un tapn de

30ml de caldo (medio rico +

Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido

5ml del medio de cultivo

5ml en el tubo de centrifugado,

Volumen del reactivo DNS a