Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco sub Sede Canchis

Carrera Profesional de Medicina veterinaria

BIOTECNOLOGA DE LA REPRODUCCIN
Coleccin maduracin de ovocitos de diferentes especies animales en
vitro
Andr Leonard Farfan Suarez
INTRODUCCIN

La practica se realizo el da 22 de julio en el CICAS las RAYA Cusco a

horas 7.00 am de la maana. Se las tcnicas de coleccin de ovocitos y al da
siguiente maduracin de ovocitos de diferentes especies animales.
La mejora gentica en la biotecnologia animal, consiste principalmente en el
cruce selectivo de ejemplares con caractersticas fenotipicas altamente
deseables como, mejores tasas de produccin de leche, carne, mejor clidas
de leche, un desarrollo mas rpido de musculatura, etc. Para poder llevar a
cabo estas mejores, se utiliza tcnicas como clonacion, inseminacin in vitro y
transferencia de embriones. El xito de estas tcnicas consiste en la calidad de
los gametos masculinos y femeninos; el semen y vulos u ovocitos. El control
de la calidad del semen de un macho, es una tarea sencilla y en muchos casos
rutinaria, la cual consiste en una evaluacin de la motilidad, viabilidad y
morfologa de los espermatozoides utilizando un microscopio, en cambio la
recuperacin, clasificacin y conservacin de ovocitos viables y adecuada es
una tarea mas complicada. Ademas los ovocitos son mas difciles de conseguir
y son mas escasos, normalmente las vacas maduras solo produce 1 ovocito
por ciclo estral. Para vencer este obstculo, se puede realizar una sper
ovulacion inducida por hormonas. Luego se procede con la obtencin o
recuperacin de ovocitos, esta etapa se puede hacer por dos diferentes
estrategias; la primera estrategia consiste en una recuperacin in vivo, en
donde de realiza un lavado de las trompas y ovarios utilizando un medio clular
especial que asegure la supervivencia del ovocito; y la segunda estrategia
consiste en el recuperacin de los ovocitos in vitro de los ovarios de una vaca o
animal sacrificada. El ultimo paso es la clasificaron del ovocito recuperado, esta
se realiza mediante la observacin d e las caractersticas morfolgicas del
ovocito usando un estereoscopio o un microscopio y se evala siguiendo una
serie de criterios como la integridad de la zona pelucida, apariencia del
citoplasma, membrana plasmatica, etc.
MARCO TERICO
La aplicacin de los procedimientos de fertilizacin in vitro (FTV) en la
reproduccin animal se ha incrementado en los ltimos aos y en un futuro
puede llegar a ser utilizada en programas de gran escala en la produccin
comercial de embriones in vitro. Dentro de este concepto, la recoleccin de
ovocitos es un paso necesario para poder llegar a establecer estos programas
de FIV. Los ovarios contienen un elevado nmero de folculos que se
encuentran en diferentes estados de desarrollo (primordiales, en crecimiento,
atrsicos), de los cuales solamente una pequea proporcin va a ser utilizada
durante la vida reproductiva del animal. La recoleccin de ovocitos permite
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recuperar y aprovechar folculos no ovulatorios, que bajo condiciones

fisiolgicas se tornaran en folculos atrsicos. La obtencin de ovarios
provenientes de vacas sacrificadas en el matadero suministra una fuente
abundante de ovocitos obtenidos a bajo costo, provenientes de animales en
diferentes estados del ciclo estral, que pueden ser madurados, fertilizados y
cultivados in vitro hasta estados avanzados del desarrollo embrionario.
Origen de los ovocitos.
a) Hembras vivas: estat cnica de recuperacin de ovocitos se aplica
cuando la vaca posee un alto valor gentico, teniendo caractersticas muy
buenas. Se escoge ademas animales que son frtiles, evitando hembras
prepberes, gestantes, infertiles y aquellas hembras que no responden al
tratamiento de sper ovulacion. Las tcnicas mas usadas son: - OPU: Ovum
Pick Up: la cual es una aspiracin transvaginal guiada por ultrasonido. Esta
tecnica permite la recuperacin de ovocitos mediante aspiracin al vaco,
generalmente se usa animales con pretratamiento hormona.
OPU no requiere que el animal tenga un ciclo reproductivo normal, cuando se
usa conjuntamente con tcnicas de fecundacin in vitro, se acorta el intervalo
generacional y aumenta la mejora gentica maternal produciendo mas progenie
que por mtodos convencionales.
b) Hembras ovariectomizadas: utilizando esta tcnica se obtiene pocos
ovocitos a un elevado precio, ademas es necesario tratar a las hembras con
hormonas (FSH), y es necesario conocer la situacin fisiolgica/ patolgica de
las hembras como raza, edad, estado de lactacin, nutricin, estado
reproductivo, etc.
c) Hembras de matadero: esta consiste la fuente principal de ovocitos,
es una tcnica de bajo costo, recogiendo un elevado numero de ovocitos en
funcin a las hembras sacrificadas, una de las desventajas principales es el
desconocimiento total o parcial de la situacin fisiolgica/ patolgica de la
hembra donante.
Los principales factores tcnicos que afectan la eficiencia de la aspiracin
transvaginal guiada por ultrasonido son el procedimiento de obtencin, el
dimetro de la aguja usada y la presin de aspiracin. Los factores biolgicos
son; el momento del ciclo estral en el cual se realiza la aspiracin, las
condiciones corporales del animal, la raza, la edad y el tipo de estimulacin del
crecimiento folicular.
Tcnicas de recogida de los ovocitos.
a) Diseccin: Consiste en aislar cada folculo ovrico del resto de tejido
con ayuda de pinzas y tijeras, liberando posteriormente los ovocitos tras la
ruptura controlada del folculo intacto. En esta tcnica, el dimetro y atresia del
folculo son conocidos, el rendimiento es elevado; se obtiene 90 a 100 ovocitos
por 100 folculos seleccionados, la mayor proporcin de los ovocitos son de

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buena calidad (60%), una de las limitaciones consiste en el tiempo pues

solamente se puede experimentar con pocos ovocitos.
b) Aspiracin: Consiste en la puncin y extraccin del contenido de los
folculos mediante una aguja conectada a una jeringa u otro mtodo de
succin. Este es el metido mas usado cuando se trabaja con ovocitos de
bovino. Se obtiene un menor rendimiento; de 30 a 60 ovocitos por cada 100
folculos aspirados, menor calidad del cumulus ( disgregacin de las clulas),
menor proporcin de ovocitos de buena calidad (45%), se tiene una mayor
rapidez de recogida y es necesario una seleccin mas estricta.
c) Slicing: Consiste en realizar cortes longitudinales y transversales con
una hoja de bistur en la superficie de los ovarios para liberar los ovocitos. Esta
tcnica presenta mayor porcentaje de ovocitos recuperados por ovario, pero
con una menor proporcin de ovocitos de buena calidad ( 30 a 45%), los
ovocitos recuperados presentan menor integridad del cumulus. Una de sus
principales ventajas es la mayor rapidez de recogida de ovocitos.
d) Otros mtodos: Digestin del tejido ovrico con tripsina durante 1
hora y posterior filtracin y separacin de ovocitos/ ovario. Digestin de tejido
ovrico con colagenasa (ovocitos preantrales) 2.3 Seleccin de los ovocitos.
Parmetros visuales: 3 o ms capas de clulas del cumulus (Mayor %
blastocistos: >5 capas) Intercambio de metabolitos y seales entre ovocito y
clulas del cumulus maduracin citoplasmtica Desechar ovocitos
denudados o con cumulus incompleto Geshi et al. (1999): terneros a partir de
ovocitos madurados sin cumulus en un medio de maduracin suplementado
con piruvato sdico y sin suero.
Cmulus compacto vs cumulus expandido Blondin and Sirard (1992): cumulus
ligeramente expandido vs cumulus compacto o expandido Wurth and Kriup
(1992): cumulus ligeramente expandido y clulas ms oscuras vs cumulus
compacto y clulas brillantes. Apariencia homognea del citoplasma vs
heterognea Nagano et al. (1999): citoplasma heterogneo > potencial de
desarrollo embrionario: presentan una mejor distribucin de los grnulos
corticales (ME) disminucin de la poliespermia
Sistemas de maduracion in vitro.Medios de maduracin.- Se puede utilizar diferentes medios, de
soluciones salinas a medios mas complejos como por ejemplo: TCM 199:
sales, piruvato sdico, lactato sdico, aminocidos, vitaminas, purinas,..+/tampones: Hepes, bicarbonato sdico pH: 7.2-7.4 Osmolaridad: 285-320
mOsm/kg.
Suplementos.- Estos son los encargados de proporcionar condiciones
mas especificas, varian de acuerdo a cada especie animal. Sueros: fuente de
protenas, cidos grasos, VV, hormonas, factores de crecimiento, .. Suero fetal
bovino, suero de vaca en celo, suero de buey Hormonas: FSH, LH, estrgenos:
Epidermal Growth Factor Cisteina, cisteamina, -mercaptoetanol: precursores
del glutation Glutatin: su concentracin intracitoplasmtica aumenta durante la
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maduracin Protege al ovocito de reacciones oxidativas Favorece la

descondensacin de la cromatina formacin del PN masculino
Condiciones de cultivo.- Temperatura: la temperatura mas adecuada
para el cultivo de ovocitos es de 38.5 grados Centgrados. Si < 25 C: se
producirn anormalidades del huso cromosmico Si > 40 C: causara
poliespermia. Atmsfera: es estrictamente necesario utilizar una incubadora
con 5% CO2, sobretodo si el medio de MIV contiene bicarbonato. Si es posible
el cultivo se debe realizar en una incubadora de CO2 humidificada. Tiempo: el
tiempo de maduracion y 24 h (vaca), 26 h (oveja), 27 h (cabra), 40-44h (cerda)
Sistemas de maduracin.- Se puede utilizar , diferentes sistemas;
Microgotas 50 o 100 l recubiertas por aceite mineral. Placas de 4 pocillos: 500
l Placas de petri : 2 ml Co-cultivo: clulas de la granulosa clulas Vero: clulas
de rin de Green monkey. Esttico sin clulas / no esttico + clulas
granulosa.
Factores que afectan el ovocito.Dimetro del folculo. Cuando se obtiene ovocitos procedentes de
folculos pequeos (1-2 mm) estos tienen maduracin nuclear pero son
inmaduros citoplasmticamente. Ovocitos procedentes de folculos medianos
(2-5 mm) o grandes (5-8mm): poseen un porcentaje de maduracin nuclear
mayor.
Dimetro del ovocito. Existe una relacin entre el tamao del folculo y
el desarrollo del ovocito, y tambin existe una relacin entre el crecimiento del
ovocito y su capacidad del desarrollo in vitro. Competencia meitica aparece
cuando el ovocito alcanza el 80-90% de su tamao pero hasta que no alcanzan
su tamao mximo, no puede completar la maduracin citoplasmtica (Thibault
et al).
Morfologa del ovario Gandolfi et al. (1997) seala: A) Presencia de un
folculo > 10 mm dimetro B) Presencia de ms de 10 folculos de 2 a 5 mm de
dimetro y ninguno de >10 mm C) Presencia de menos de 10 folculos de 2 a 5
mm de dimetro y ninguno de > 10 mm
Edad Se recomienda evitar trabajar con animales prepberes o muy
adultos. Un factor muy importante es el estado hormonal Ciclo estral. Para
mejorar estos factores se recomienda tratamientos hormonales (FSH o PMSG)
MATERIALES Y MTODOS
Materiales

Ovarios de Ovino recolectados post morten.

Jeringa de 5 ml.
Colectores
Pinzas.
Bistur.
Tijera.

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Guantes.
Microscopio.
Incubadora

PROCEDIMIENTO.
Se recolecto ovarios de un ovino cual haba sido sacrificada. Se los
almaceno a bajas temperaturas para evitar la muerte de los ovocitos. Luego se
corto el tejido muscular que se encontraba cerca del ovario.
Mtodo de aspirado folicular.
Despus de lavar el ovario, se lo coloc sobre una placa petri, se
seleccion un folculo de 3 mm de dimetro, se sujet el ovario y se aspir el
contenido del folculo utilizando una jeringa de 5 ml, luego se vaci el contenido
del folculo sobre una lamina porta-objetos. Se observ en un microscopio o y
finalmente se evalu la calidad de los ovocitos.
Se pone lo colectado en posillos y se pone en solucin con fenol,
despus se le pone en la incubadora y se espera hasta el dia siguiente
RESULTADOS.
Despus de realizara el metodo, se pudo localizar ovocitos de manera
exitosa.
Ademas de localizarlos se los evalo de acuerdo a sus principales
caractersticas morfolgicas. Se pudo observar ovocitos a diferentes estadios
de maduracin, as como diferentes calidades de estos.
Se encontr un ovocito con fenol
CONCLUSIONES.
Se pudo concluir: Primero, el metido de puncin folicular, tuvo mejores
resultados que el mtodo de corte.
Segundo, la localizacion del los ovocitos usando un microscopio optimo
es mas fcil y rpida que usando el estereoscopio.
Tercero, la recuperacin de ovocitos es una tcnica compleja que
requiere mucha experiencia y conocimiento del operador para poder ser llevada
a cabo con xito y en poco tiempo.
DISCUSIN.
Los resultados encontrados coinciden con lo reportado por Takagi et. al.
que menciona mayores valores de ovocitos para el mtodo de aspiracin, que
para el mtodo de corte seriado. Esto podra deberse a que cuando se realizan
los cortes, parte del liquido folicular escapa.
La recuperacin de ovocitos en biotecnologa puede ser usada en casos
de que se tenga una vaca con excelentes caractersticas y esta no puede
quedar preada cuando se le practica una inseminacin artificial, a pesar de
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tener una calidad buena. En estos casos se puede recuperar los ovocitos de la
vaca, a la cual ha sido sper ovulara usando hormonas, la recuperacin se
realiza in vivo usando la tcnica de aspiracin transvaginal guiada por
ultrasonido. Se utiliza un medio de recuperacin de ovocitos rico en
aminocidos y a los ovocitos recuperados se los clasifica de acuerdo a su
estadio de maduracin. A los ovocitos que han sido clasificados como aptos, se
los puede inseminar in vitro. Luego se los cultivo en medios celular especfico,
por ejemplos Dulbeccos o RPMI, luego cuando el embrin a llegado a un
estado de estabilidad. el embrin se implanta en una vaca de comprobada
fertilidad, la cual por lo menos ha salido preada una ves
ANEXOS

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