CONCEPTOS BSICOS DE FOTOMETRA

INTERACCIN DE LA ENERGA RADIANTE CON LA MATERIA

La energa radiante puede manifestarse como movimiento ondulatorio (radiacin
electromagntica) o como si estuviese integrada por un flujo de partculas discretas o paquetes
ondulatorios energticos denominados fotones, es decir, presentando propiedades
electromagnticas y energticas. Estos dos modelos de comportamiento de la energa radiante
no son excluyentes, sino que son complementarios.
PARAMETROS ONDULATORIOS

AMPLITUD (A): Longitud del vector elctrico/magntico en el mximo de la onda, y esta

relacionada con la intensidad de la radiacin.
LONGITUD DE ONDA (): Es la distancia entre dos puntos de un ciclo completo del
movimiento ondulatorio. Se suele expresarse en nanmetros para las radiaciones visible y
ultravioleta en ngstrom.
PERODO (T): Es el tiempo en segundos que tarda una partcula en realizar una vibracin
completa.
FRECUENCIA (f): Es el nmero de oscilaciones completas que una partcula realiza en
una unidad de tiempo.
VELOCIDAD DE PROPAGACIN (): Es el resultado del producto de la frecuencia y la
longitud de onda.Se mide en metros por ciclo (m/ciclo).Es un parmetro que depende del
medio de propagacin de la radiacin.
NMERO DE ONDA: Es el parmetro descriptivo cuyo valor es la inversa de la longitud
de onda.Se mide en cm-1.
POTENCIA (P): Es la energa de haz de radiacin que llega hasta un rea determinada en
la unidad de tiempo (un segundo).

Parmetros ondulatorios

Existe una relacin entre la energa radiante y la longitud de onda de la radiacin que se
expresa en la ecuacin:

Se denomina espectro electromagntico al conjunto de radiaciones electromagnticas y se ha

dividido en varias regiones, de acuerdo con la longitud de onda.

Rayos X
Ultravioleta
Visible
Infrarrojo
Microondas

(1 100nm).
(100 390 nm).
(390 700 nm).
(700 100 000 nm).
(100 000 1 000 000 nm).

En la regin visible, la luz se descompone en colores, la luz blanca contiene todo el espectro
de longitud de onda. Si interacciona con una molcula puede ser absorbida.

LEYES DE ABSORCIN
Las leyes de absorcin se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad del absorbente
y el grado con el que es absorbida la energa radiante. En trminos generales, puede decirse
que hay 2 variables capaces de afectar al grado de absorcin. La concentracin del absorbente
y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a travs de la solucin.
Existen 2 trminos que se usan ampliamente en la espectrometra por absorcin
A. TRANSMITANCIA (T)
Es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector, una vez que ha
atravesado la muestra, y la cantidad de luz que incidi sobre ella.El valor de la transmitancia de
un objeto se puede determinar segn la siguiente expresin:

I = Es la cantidad de luz transmitida por la muestra.

I0 =Es la cantidad total de luz incidente.
Muchas veces encontramos la transmitancia expresada en porcentaje, segn la formula:

Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el solvente.

Para evitar este error se hace una primera medida con una solucin de referencia o BLANCO,
que contiene todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos
a medir.
Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a esta medida inicial y se
harn en la misma cubeta que se utiliz en la medida del blanco.

B. ABSORBANCIA (A )
La absorbancia es un concepto ms relacionado con la muestra, es la cantidad de intensidad
de luz que se hace incidir en la muestra. Esta definida como:

Donde
I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y
I0 es la intensidad de la luz incidente.
La medida de la absorbancia de una solucin es usada con mucha frecuencia en laboratorio
clnico, para determinar la concentracin de analitos tales como colesterol, glucosa, creatinina y
triglicridos en sangre. Cada uno de estos analitos se hace reaccionar qumicamente con
determinados compuestos, a fin de obtener una solucin coloreada. A mayor intensidad de
color, mayor ser la absorbancia de la solucin en una determinada longitud de onda.
La absorbancia es entonces directamente proporcional a la concentracin del analito.
Para medir esta absorbancia, se hace incidir un haz de luz con determinada intensidad y
longitud de onda, sobre la solucin, y se mide la luz transmitida al otro lado de la cubeta que
contiene dicha solucin. Estas tcnicas estn comprendidas en el rea de la
espectrofotometra.
LEY DE LAMBERT
Expresa la proporcionalidad que existe entre la absorbancia de una solucin coloreada y la
distancia que recorre la luz monocromtica en ella (sin variacin de la concentracin).
LEY DE BEER
Expresa la proporcionalidad que existe entre la absorbancia de una solucin coloreada y la
concentracin de esta en un haz de luz monocromtica (sin variacin de la longitud que recorre
el haz).
Estas dos leyes se combinan en la ley de Lambert y Beer:

Io e I = Intensidad de la luz incidente e Intensidad de la luz transmitida, despus de haber

atravesado la cubeta de la muestra, respectivamente.
A = Absorbancia. Medida de la absorcin de la luz. Tambin se conoce como densidad ptica
o extincin.
Es una magnitud adimensional. Generalmente los espectrofotmetros expresan la
absorbancia hasta las milsimas. Suelen ser magnitudes que oscilan entre 0 y 1, aunque
en determinados anlisis en lo que se mide la variacin de absorbancia con el tiempo se
pueden obtener valores superiores.
b = Trayecto ptico. Su valor esta estandarizado en 1 cm. Es la longitud de la muestra que
atraviesa la radiacin cuando esta se encuentra depositada en una cubeta. Es una medida
estandarizada para todos los espectrofotmetros.
c = Concentracin de la sustancia (analito) en la muestra.suele expresarse en moles/L (con la
absortividad molar) o g/L (si se emplea la absortividad)
= Coeficiente de extincin molar (si c = moles/L), se designa como E =Coeficiente de
extincin (si c =g/l).
La constante Epsilon, se define como la absorcin de una solucin de concentracin 1
mol/l a una determinada longitud de onda y un espesor de cubeta de 1 cm.

LIMITACIONES A LA LEY DE LAMBERT- BEER

La relacin directamente proporcional entre la absorcin de la radiacin por parte del analito y
su concentracin en la muestra no es lineal en cualquier situacin. Existen una serie de
condiciones limitantes o desviaciones de esta ley que dependen de determinadas
caractersticas del analito o que tienen un origen instrumental o qumico, en las que la relacin
no presenta linealidad. Estas desviaciones son:
I.

DEPENDIENTES DE LAS CARACTERISTICAS DEL ANALITO

II.

Cuando la concentracin del analito (tomos, molculas e/o iones) es relativamente

pequea y adems, existen en la muestra concentraciones elevadas de electrolitos que
son capaces de alterar, mediante interacciones electrostticas, la absortividad molar
del analito.Este hecho ocasiona una alteracin en la absorcin de la radiacin que la
desva la linealidad.
Cuando la concentracin del analito es elevada.Se considera que, si supera el valor
0,01 M, la distancia media entre las especies responsables de la absorcin disminuye
tanto como para alterar la distribucin de la carga elctrica y, por tanto su capacidad
de absorcin de la radiacin.
Cuando existen impurezas (sustancias o situaciones distintas al analito) en la muestra
que presentan absorcin o emisin de la radiacin a la longitud de onda del anlisis.

LIMITACIONES QUIMICAS
Cuando por las caractersticas de la tcnica o del analito, se produce una interaccin
qumica (asociacin, disociacin o reaccin) de este con otras sustancias de la muestra o
de los reactivos, resultando un compuesto que presenta un espectro de absorcin distinto
al del analito.

III.

LIMITACIONES INSTRUMENTALES
Cuando por las caractersticas del aparato ptico de medida, se detecta una cantidad de
radiacin diferente a la absorbida por el analito.
El cumplimiento de la ley de Lambert Beer nicamente es estricto cuando la radiacin
incidente es monocromtica, hecho que es muy difcil de conseguir dado que los dispositivos
que discriminan las longitudes de onda no son tan selectivos. Esta desviacin de la ley no es
perceptible cuando el rango de longitudes de onda discriminadas es relativamente estrecho.

ESPECTROFOTOMETRIA
La espectrofotomtrica se refiere a los mtodos cuantitativos, de anlisis qumico que utilizan la
luz para medir la concentracin de las sustancias qumicas .Se conocen como mtodos
espectrofotomtricos y segn sea la radiacin utilizada como espectrofotometra de absorcin
visible (colorimetra), ultravioleta, infrarroja.
Se distinguen dos tipos de aparatos:
COLORIMETRO O FOTOMETROS: Se designa un instrumento para medir la absorcin, el ojo
humano funciona como el detector con ayuda de uno o mas patrones de comparacin de color.
Un fotmetro consta de una fuente un filtro y un transductor fotoelctrico as como un
procesador de seales y una pantalla donde se leen los resultados. Los fotmetros de filtro se
encuentran en el comercio para efectuar mediciones de absorcin en las regiones ultravioletas,
visible e infrarroja, as como emisiones y fluorescencia en las primeras dos regiones de longitud
de onda.
ESPECTROFOTOMETRO: Es un espectrmetro equipado con una o mas rendijas de salida y
transductores fotoelctricos que facilitan la determinacin de la relacin entre la potencia
radiante de dos haces en funcin a la longitud de onda como en la espectroscopia de
absorcin.

Fig.:7 Esquema de espectrofotmetro.

38

COMPONENTES DEL ESPECTROFOTOMETRO

I.

FUENTE DE RADIACION VISIBLE:

Existen dos tipos de fuente de radiacin comnmente empleadas para la obtencin de

radiacin visible, muy ligadas entre si. La primera a tener en cuenta es la lmpara de
Wolframio, la cual se fabrica cuidadosamente con un filamento de wolframio encerrado en una
ampolla de vidrio en cuyo interior se ha hecho el vaco.
Las lmparas de este tipo se regulan bien con estabilizadores de potencia de corriente
alterna.La intensidad de la lmpara es funcin de la temperatura del filamento de wolframio, la
cual a su vez es funcin de la corriente que pasa a travs del filamento .El flujo de corriente se
controla de tal forma para que la intensidad de la lmpara sea constante con el tiempo.La
intensidad de la lmpara, aun a temperatura de filamento constante, es funcin de la longitud
de onda

Lmpara de Wolframio

Hace unos pocos aos se introdujeron las lmparas de halgenos y de cuarzo como fuente de
radiacin .Estas lmparas de halgeno son lmparas de filamento wolframio en las cuales la
ampolla es de cuarzo.
Estas lmparas as mismo tienen iodo a baja presin y operan a temperatura mas altas que las
lmparas ordinarias de wolframio. La cubierta de cuarzo es necesaria para resistir a altas
temperaturas .El iodo se incluye en la lmpara para proteger el filamento de wolframio y
mantenerlo en buen estado.
Una fuente de radiacin visible menos comn es el diodo emisor de luz (LED).Estas fuentes se
fabrican con materiales semiconductores tales como arseniuro de galio, fsforo de galio o
fofoarseniuro de galio.
La energa radiante emitida por una lmpara de diodo emisor de luz (LED) generalmente
abarca un amplio intervalo de longitudes de onda.
II.

SELECTORES DE LONGITUD DE ONDA O ANALIZADORES

La longitud de onda requerida para las medidas puede aislarse por medio de un filtro o de un
monocromador. Los sistemas de seleccin de longitud de onda se catalogan por su amplitud de
banda o paso de banda, que es la anchura en nanmetros de la curva de transmitancia en el
punto medio del pico.

Amplitud de la banda.

Existen dos tipos de analizadores:

a. FILTROS
Los filtros pticos se pueden utilizar cuando se necesita trabajar con un corto intervalo de
longitudes de onda. Cuando se utiliza un filtro para seleccionar las radiaciones, los
instrumentos que llevan tales filtros se llaman fotmetros de filtros.
Los instrumentos empleados para tales aplicaciones se denomina espectrofotmetros o
espectrmetros. Dichos instrumentos tienen un dispositivo llamado monocromador que
selecciona luz monocromtica de la luz policromatica incidente.
Un monocromador permite trabajar a cualquier longitud de onda simplemente cambiando a
voluntad de posicin el selector de la radiacin. Los monocromadores son dispositivos un tanto
caros, de ah el que muchos aparatos utilicen filtros.
Cuando el analista que emplea esta absorciometra sabe que deber llevar a cabo el anlisis
de muchas muestras de un mismo tipo, entonces se aconsejara usar un fotmetro de filtros. En
este caso el fotmetro con el filtro adecuado, se dedicara a un nico tipo de anlisis. Los
fotmetros de filtros son relativamente baratos por lo que la justificacin de su uso es fcil.
Existen dos tipos de filtros de uso ms comn. Los primeros a considerar son los llamados
filtros de vidrio, los cuales se fabrican con dos tipos de vidrio especial. Consta de 2 piezas de
vidrio, la primera de ellas por ejemplo no dejan pasar radiaciones por debajo de 450nm y sin
embargo transmite el 100%de intensidad de las radiaciones de longitud de onda superior a 550
nm.
El segundo vidrio acoplado al anterior transmite el 100% de la intensidad de las radiaciones de
longitud de onda inferiores a 450 nm y no se transmite ninguna radiacin de longitud de onda
superior a 550nm.La combinacin de ambos vidrios da lugar a un filtro que transmite
radiaciones en un intervalo de longitudes de onda 450 nm a 550 nm.Los filtros de
interferenciales se utilizan cuando la monocromaticidad obtenida mediante el uso de filtros de
vidrio no es la suficiente para el anlisis a realizar. Los filtros interferenciales se fabrican con
fluoruro de magnesio (MgF2) plata (Ag).
b. MONOCROMADORES
Un monocromador es un dispositivo ptico que permite, por medio de un mecanismo,
seleccionar y transmitir una estrecha banda de longitudes de onda ya sean electromagnticas o
no a partir de una fuente emisora que produzca una amplia gama de longitudes de onda. El
nombre monocromador se deriva de las races griegas mono- que significa uno, y chroma,
color; el sufijo -ador derivado del latn denota la realizacin de una accin Un monocromador
puede utilizar cualquiera de los fenmenos de refraccin, por ejemplo utilizando un prisma; o de
difraccin, utilizando una red de difraccin; para separar espacialmente los diferentes colores
de la luz.
Usualmente el monocromador cuenta con un mecanismo que permite dirigir el color
seleccionado hacia una ranura de salida, por donde el rayo de luz monocromtico puede
abandonar el dispositivo. Por lo comn la red o el prisma son utilizados en modo reflectivo.
Las REDES DE DIFRACCION se fabrican haciendo una serie de incisiones o surcos
longitudinales con una punta de diamante sobre una placa de vidrio o aluminio.Estos surcos se
hacen con un dispositivo de manera muy cuidadosa de tal forma que los espaciados entre los
surcos y cortes deben tener un perfil especfico.

III.

CUBETAS
Hay dos tipos de cubetas comunes, las cilndricas y las cuadrangulares.
Las cubetas cilndricas son semejantes a tubos de ensayo, pero han de construirse de una
manera aproximadamente cuidadosa a fin de evitar imperfecciones, o variaciones tanto en el
espesor como en el dimetro de las mismas. Los tubos de ensayo regulares ,sin embargo
,nunca debern sustituir a las cubetas cilndricas .
Las cubetas cuadradas tienen la ventaja de que el valor del espesor de cubeta es
perfectamente conocido y tambin puede ser medido, emplendose dicho valor para los
clculos .En cualquier caso el material empleado deber ser siempre transparente a la
radiacin deseada.
Los vidrios borosilicatados constituyen un buen material empleado en la construccin de
cubetas para la regin visible del espectro electromagnetico. Transmiten bien las radiaciones
comprendidas entre 350 nm y 2.000 nm. El cuarzo es tambin un material muy adecuado pues
transmite las relaciones comprendidas entre 200 nm y 3.300 nm. Sin embargo, es algo caro por
lo solo debe emplearse cuando sea necesario .Algunos plsticos transmiten bien en la regin
visible, por lo que tambin se emplean en la citada regin.
Las cubetas deben mantenerse limpias y evitar que se araen en la medida de los posible.
Asimismo se debe evitar coger las cubetas por las caras pticamente transparentes, dejando
as las huellas dactilares. Es aconsejable no utilizar papel filtro, pauelos o felpa para secar la
cubetas, ya que estos contribuyen a rayarlas y deteriorarlas, siendo fuente de error en las
medidas analticas.

IV.

DETECTORES DE LA INTENSIDAD DE RADIACION

Existen varios tipos de detectores:
A) CELULAS FOTOVOLTAICAS
La fotoclula tambin se denomina clula fotovoltaica o clula de capa de barrera.Esta
constituida por una lamina fina de un semiconductor, el selenio, colocada entre dos laminas de
hierro y plata.
La lamina de hierro es lo bastante gruesa como para dotar al dispositivo de la suficiente
fortaleza mecnica, lamina de plata es semitransparente y proporciona el contacto elctrico con
la de selenio; la lamina constituye el otro contacto elctrico.
El conjunto formado por las tres lminas tiene dos conexiones entre conductores de distintas
caractersticas, la unin del hierro y la del selenio y la plata.Las uniones que se producen entre
conductores de distinta naturaleza siempre generan una energa elctrica potencial; por tanto
la clula fotovoltaica es una clula que genera su propio voltaje.No se requiere aportar energa;
la suma de estos dos potenciales de unin proporciona todo el voltaje requerido.
En resumen, las clulas fotovoltaicas son econmicas y dan proporcionalidad lineal entre la
intensidad de radiacin y la respuesta del detector.
B) FOTOTUBOS
El segundo detector de radiaciones visibles que consideraremos a continuacin es el fotodiodo
de vaco mas frecuentemente denominado fototubo. El fototubo se basa en el efecto
fotoelctrico capaz de transformar energa radiante en energa electrica. Un fototubo consta de
un terminal que acta como nodo y una cavidad cncava que es el fotoctodo. El fotoctodo
se construye con un electrodo cncavo de nquel plateado .La lamina de plata se oxida
entonces para producir algo de oxido e plata. Luego el electrodo se cubre con una capa de
cesio y se trata trmicamente resultado es un fotoctodo con una superficie capaz de absorber
los fotones convenientemente.
El fototubo es un buen detector de radiaciones visibles .Presenta una respuesta lineal al
incrementarse la intensidad de radiacin. Desgraciadamente el fototubo no responde a todas
las longitudes de onda por igual.
C) TUBOS FOTOMULTIPLICADORES
Los fotomultiplicadores son detectores rapidos. Los cambios de intensidad de la radiacin
generan cambios de intensidad en la fotocorriente casi de forma instantanea. Los
comercializados cubren un intervalo de longitudes de onda de 180 nm a 1.200 nm. Sin
embargo, al igual que en el caso de los fototubos, un nico fotomultiplicador no cubre un
intervalo completo.

V.

PROCESADORES DE SEALES Y SISTEMAS DE LECTURA

Por lo general, el procesador de seal es un dispositivo electrnico que amplifica la seal
elctrica proveniente del transductor .Adems, puede cambiar la seal .Cambiar la fase de la
seal y filtrarla para eliminar componentes indeseables. Adems, el procesador de seales
ejecuta operaciones matemticas con la seal, como derivacin, integracin o conversin a un
logaritmo.
Se puede encontrar diferentes tipos de dispositivos que despliegan la informacin en los
instrumentos modernos. Entre ellos se incluyen el medidor de DArsonval, medidores digitales,
registradores, tubos de rayos catdicos, paneles de pantallas de cristal liquido y pantallas de
computadora.
INTERFERENCIA EN LAS DETERMINACIONES ESPECTROFOTOMETRICAS
Las interferencias en las medidas espectrometricas son de dos tipos:las estticas y las
cinticas. Las interferencias estticas se producen por sustancias presentes en el espcimen
que no experimentan variacin durante la reaccin analitica.Los ejemplos mas tpicos de este
tipo de interferencias en los laboratorios clnicos son la ictericia, la lipemia y la hemlisis.La
correccin se realiza utilizando un blanco con el espcimen al que no se aade alguna de las
sustancias necesarias para la reaccin.
La interferencia cintica se origina a causa de sustancias presentes en el espcimen que
reaccionan con algn componente de la mezcla de reaccin, de forma que la importancia
relativa de su contribucin depende del tiempo, as como de su concentracin.

VI.

REGISTRO Y PRESENTACION DE DATOS

La seal elctrica producida, es amplificada por el procesador de seal, que la transforma en
dgitos numricos que nos pueden indicar la absorbancia o la transmitancia del analito en la
muestra o su concentracin, dependiendo de cmo se programe el espectrofotmetro en cada
caso ya que debe contar con la capacidad de realizar operaciones matemticas.

CONCEPTO DE CALIBRACION
Se entiende por calibracin al conjunto de operaciones que establece, bajo condiciones
especficas, la relacin entre las seales producidas por un instrumento analtico y los
correspondientes valores de concentracin o masa del juego de patrones de calibrado.
CALIDAD DE UNA CALIBRACION
La calidad de la determinacin de una concentracin no puede ser mejor que la calidad
intrnseca de la calibracin. Los factores que determinan la calidad de una calibracin son:
LA PRECISION DE LAS MEDIDAS: Estimada a travs de la repetitividad y la reproducibilidad
de las medidas. La repetitividad se evala a travs del calculo de la desviacin estndar
relativa de la medida de los patrones calibrado.En la practica puede ocurrir que la repetitividad
para los patrones sea mas pequea que para las muestras, por lo que ser necesario fabricar
patrones similares a las muestras o agregar el analito a las mismas.
EXACTITUD DE LOS PATRONES: El valor de concentracin o masa asignado a cada patrn
trae aparejado un error pequeo si es preparado a partir de reactivos puros.Este error en
general se desprecia, frente al error en las medias de las seales producidas por el
instrumento.
VALIDEZ DE LA CALIBRACION: Generalmente es el factor mas importante. Cuando se
calibra un instrumento se debe tener una razonable certeza de que este responder de igual
manera a los patrones as como a las muestras, aunque estas tengan una matriz relativamente
diferente. Si estas diferencias son muy grandes, pueden llegar a invalidar el proceso de
calibracin. Es necesario estar completamente seguro de que el calibrado es valido antes de
utilizarlo para obtener el valor de concentracin de muestras incgnitas.

ESPECTRO DE ABSORCIN DE UNA SUSTANCIA.

El color es el resultado de la incidencia de la luz blanca sobre un objeto o sustancia, la misma
absorbe algunas longitudes de onda y refleja otras, el resultado es que las longitudes de onda
reflejadas son percibidas por nuestros ojos y nuestro cerebro lo traduce en una tonalidad
dentro de unv rango de color determinado.
Por ejemplo en el caso de la clorofila, esta tiene tres variantes Clorofila a, b y c; estas
absorben luz en los extremos de la escala de luz visible, violeta, azul y rojo; pero muy poco en
verde por ello es que vemos las hojas verdes, la tonalidad del color observado depende de las
longitudes de onda que en definitiva emite cada tipo de hoja; y su intensidad de la cantidad de
fotones reflejados.

Entonces cuando analizamos un objeto debemos establecer que longitudes de onda absorbe y
emite, para ello debemos contruir la curva de absorcin del mismo, para ello tomamos una
solucin coloreada y medimos la absorbancia a diferentes longitudes de onda determinando el
pico de mxima absorcin, que se convierte en caracterstico de la misma y en casos de haber
interferencia se busca el siguiente de mayor absorcin para tomarlo como caracterstico.
Por ejemplo,
En el caso de la clorofila a el pico caracterstico es alrededor de 425 nm, la clorofila b y c
tambin absorben algo a esa longitud de onda pero en menor intensidad.
En el caso de la clorofila b el pico caracterstico es alrededor de 470 nm, la clorofila c tambin
absorbe una cantidad importante a dicha longitud de onda, por ello preferimos tomar como
caracterstico el pico de alrededor de 645 nm.
Para evitar las interferencias realizaremos una evaluacin comparando como absorbe una
muestra pura de concentracin conocida contra las muestras desconocidas.

CURVA DE CALIBRACIN
El mtodo consiste en emplear soluciones de concentracin conocida y crecientes
denominadas estndares o patrones a las ciales se les determinar su absorbancia, se grafican
en un sistema de coordenadas donde en el eje X se grafican las concentraciones y en el eje
Y la absorbancia.
Los puntos resultantes de la interseccin de ambos ejes, se unen trazando una curva entre
ellos, la lnea obtenida se denomina curva de calibracin o curva estndar y sirve para estimar
la concentracin de una muestra cualquiera de la misma sustancia que los patrones
conociendo la absorbancia.
Ejemplo
Considrese los siguientes datos
Solucin

Concentracin del analito

Absorbancia

Estndar 1

1 mg / 100 ml

0.17

Estndar 2

3 mg / 100 ml

0.51

Estndar 3

6 mg / 100 ml

1.03

Blanco

0.00

Muestra 1

0.89

Cul es la concentracin del analito en la muestra 1?

Solucin:
Paso 1
usando papel milimetrado establecer la escala:
eje x = concentracin ( en este caso tenemos como valor mximo 6 mg/100 ml
podemos tomar concentraciones crecientes hasta 7 mg/100 ml)
eje y =Absorbancia (en este caso tenemos como valor mximo 1.03 unidades de
absorbancia podemos tomar hasta 1,2 unidades)

Absorbancia

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

Nota: observe que los intervalos

entre unidades son de la misma
proporcin tanto en el eje x como en
el eje y..
La escala se escoge en funcin del
rango de variacin de los datos y de
la exactitud que queramos asignar a
nuestra grafica

1 2 3 4 5 6 7
mg/100 ml

1.2

Absorbancia

1
La unidad mayor
de divisin del eje
y es 0.2 unidades
de Absorbancia

0.8
0.6
0.4

La unidad menor de
divisin del eje y es
0.04 unidades de
absorbancia

La unidad mayor
de divisin del eje
x es 1 mg/ 100 ml

0.2
0
1

mg/100 ml

La unidad menor de
divisin del eje x es
0.5 mg/ 100 ml

Paso 2:
Ubicamos los puntos segn los datos

Absorbancia

1.2
1

X: 6mg/100 ml
Y: 1.03

0.8
0.6
X: 3mg/100 ml

0.4

Y: 0.51

0.2

X: 1mg/100 ml
Y: 0.17

0
1

7
mg/100 ml

Paso 3
Trazamos la recta entre los puntos, buscando que esta incluya lo mejor posible a todos

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1

En este momento hemos construido la curva estndar

Paso 4
Buscamos la concentracin de la muestra problema (muestra del paciente) Para nuestra caso
la muestra del paciente tiene una absorbancia de 0.89 entonces y trazamos la recta hasta
cortar la curva patrn, luego trazamos la perpendicular hasta cortar el eje x, en ese momento
encontramos la concentracin de la muestra

1.2
1
0.89

0.8
0.6
0.4
0.2
0
1

5.25 mg/100 ml

La respuesta grafica es que la concentracin de la muestra 1 es 5.25 mg/100 ml

FACTOR DE CALIBRACIN

El factor de calibracin es un trmino que relaciona la concentracin de un

estndar o patrn de una sustancia con su absorbancia.
Nos sirve para calcular la concentracin de una muestra desconocida al
multiplicar la absorbancia de la misma con este factor de calibracin
Sabemos que:

A = C b =>

A
C

= b

Entonces podemos aplicar esta relacin para el estndar y para la muestra problema

Astandard
Cstandard

Amuestra

= b

Cmuestra

= b

Astandard
Amuestra
=
Cstandard
Cmuestra
Cstandard
Cmuestra
=
Astandard
Amuestra
Como los datos del standard son conocidos los tomamos como referencia y lo
denominamos Factor de Calibracin (Fc)

Cmuestra
Fc =
Amuestra
Por tanto

Fc Amuestra = Cmuestra

PARTES DEL ESPECTROFOTMETRO

Pantalla digital

Selector de modo de operacin:

Transmitancia

Absorbancia

Factor de calibracin

Concentracin

Ajuste del factor

Incremento / disminucion

Porta muestra
(se usa tubo
spectronic)

Selector de
longitud de onda

Swicht de encendido /
ajuste a 0% transmitancia

ajuste a 100% transmitancia

PARAMETROS ANALITICOS MS EMPLEADOS

SENSIBILIDAD
La sensibilidad de un equipo instrumental, tcnica o mtodo analtico se define como la
capacidad de poder diferenciar dos seales muy parecidas del mismo analito.
Si se presenta en forma grfica la variacin de la seal que se registre con respecto a la
concentracin de un analito en diferentes soluciones patrn, el mtodo, tcnica o equipo
instrumental mas sensible es el que de lugar a una recta de calibrado de mayor pendiente.

Rectas de adicin de soluciones patrn del analito. Clculo de la sensibilidad

LIMITE DE DETECCION (LD)

El lmite de deteccin de una tcnica, mtodo y/o instrumental se define como la minima
cantidad o concentracin del analito que es capaz de detectar para un nivel de confianza dado.
Esta magnitud depende de las fluctuaciones de la seal del blanco.
Para su clculo, se realiza una recta de adicin, (y=a +bx), con soluciones patrn del analito
en una matriz similar a la muestra biolgica (por ejemplo, si se van a analizar sueros, preparar
las soluciones en suero fisiolgico) y se registran al menos 20 medidas del blanco.La menor
concentracin de patrn que se distingue del blanco al menos en tres veces el valor de su
desviacin estndar, se considera como el limite de deteccin.
La formula para hallar el lmite de deteccin es:

LIMITE DE CUANTIFICACION

Su valor es el de la menor concentracin de patrn que se distingue del blanco al menos en

diez veces el valor de su desviacin estndar .El concepto es similar al lmite de deteccin.
La formula para hallar el lmite de cuantificacin es:

LINEALIDAD
La capacidad de un mtodo de anlisis, dentro de un determinado intervalo, de dar una
respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la calidad del analito que se
habr que determinar en la muestra de laboratorio.Los limites de linealidad son los limites
experimentales de concentraciones entre los que pueden aplicarse un modelo de calibracin
lineal con un nivel de confianza conocido.

Linealidad

SELECTIVIDAD
La selectividad indica el grado de ausencia de interferencias, debidas a otras especies
contenidas en al matriz de la muestra.
Cuando mayor es la selectividad de un mtodo y/o tcnica analtica, menos se ve afectado por
las interferencias que daran lugar a una lectura errnea del parmetro que se este analizando.

Esta magnitud suele expresarse en trminos relativos, como coeficientes de selectividad (CS)
de las especies interferentes con respecto al analito (A) y su valor es el que indica la ecuacin.

CSI.A = Coeficiente de selectividad de la especie interferente I con respecto al analito A.

b1 b2 Valores de las respectivas pendientes de las rectas de adicin obtenidas empleando
concentraciones crecientes de la especie interferente que se pretende evaluar y del analito.

PRECISIN
Es el grado de concordancia entre un grupo de resultados obtenidos al aplicar repetitiva e
independientemente el mismo mtodo analtico a alcuotas de la misma muestra.
La precisin se expresa en trminos de coeficiente de variacin cuyo valor porcentual es el de:

La precisin es mayor cuanto menor es el valor del coeficiente de variacin.

Un resultado elevado del coeficiente de variacin suele indicar la presencia de errores
aleatorios. La precisin de un conjunto de resultados se caracteriza por la desviacin estndar.
La precisin se divide en 2 categoras:
A)
REPETIBILIDAD: La ms pequea precisin esperada, da una idea del tipo de
variabilidad que se puede esperar cuando el mtodo es desarrollado en el mismo laboratorio,
por el mismo analista, usando el mismo equipamiento en un intervalo de corto tiempo.
B)
REPRODUCIBILIDAD: La precisin ms grande esperada. Una muestra analizada por
varios laboratorios, distintos analistas, diferentes equipamientos, mayor periodo de tiempo.
La repetibilidad y la reproducibilidad dependen de la concentracin del analito.

EXACTITUD
Es el grado de concordancia entre el valor medido y el valor aceptado o verdadero.
El valor real de la concentracin del analito es conocido en el material de referencia.
Un resultado inexacto al analizar el material de referencia suele indicar la presencia de errores
sistemticos en la medida.
Los errores sistemticos se clasifican en:

Errores Instrumentales: Circuito electrnico, fugas y/o perdidas, alteracin del fluido,
voltaje, prdida del calibrado.
Errores Personales: Fallo en la destreza y forma de trabajo del operador.
Errores del mtodo: Prdida del analito, alteraciones del analito, reacciones qumicas
incompleta o alteradas, inestabilidad de los reactivos.

La exactitud se expresa en trminos de error, error que puede ser absoluto (Ea) o relativo (Er)
se expresa como la diferencia entre el valor obtenido en la analitica, x y el considerado como
real, xr.El error relativo (Er) se expresa como porcentaje del absoluto con respecto al valor real.

PARTE EXPERIMENTAL
Indicaciones generales
La prctica se llevara a cabo en dos sesiones, en la primera se realizar la actividad i y II
En la segunda sesin se realizar la actividad III y IV
Equipos:

Espectrofotometro
Balanza

Materiales

Beaker 50 ml
Fiolas de 100
Pipetas de 5 ml
Propipeta

02
01
02
01

Reactivos

Permanganato de potasio
Agua destilada

I.

Identificacin del espectrofotmetro

Observa la explicacin del profesor de las partes del espectrofotmetro, su uso y
cuidados.
Anote.

II.

Determinacin de la longitud de onda de mxima absorcin.

1. Preparar una solucin de permanganato de potasio de 5 ppm (solucin coloreada)
2. Leer la solucin en el espectrofotmetro a 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560
580, 600, 620 640 640 y 660 nm. Anote la absorbancia en cada caso
3. Grafique la curva de absorcin o curva espectral en un papel milimetrado
colocando en el eje X la longitud de onda y en el eje Y la absorbancia
4. Determinar la longitud de onda de mxima absorcin, eligiendo el punto donde se
obtiene la mayor lectura de absorbancia.

III.

Elaboracin de la curva y factor de calibracin

1. Prepare una batera de tubos de acuerdo a l siguiente esquema:
Tubo
1
2
3
KMnO4
1 ml
2 ml
3 ml
Agua destilada 4 ml
3 ml
2 nml
Calcule la concentracin de cada tubo

4
4 ml
1 ml

2. Realice la lectura del de absorbancia de cada tubo usando la longitud de onda de

trabajo encontrado en el experimento anterior
3. Realice la curva de calibracin en papel milimetrado colocando en el eje X
concentracin, en el eje Y absorbancia
4. Trace la curva caracterstica
5. Encuentre el factor de calibracin para la curva
IV.

Determinacin de la concentracin de una muestra problema.

1. Recibir por parte del profesor una muestra de permanganato de potasio de
concentracin desconocida,

2. Mida la absorbancia de la muestra.

3. Encuentre la concentracin usando la curva de calibracin y el factor de
calibracin.