UNIVERSIDAD TCNICA DE MACHALA

Calidad, Pertinencia y Calidez

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ESPECTROMETRA DE ABSORCIN
ULTRAVIOLETA-VISIBLE
DOCENTE:
Dr. Wilson Torres Rios
ASIGNATURA:
Bioqumica I
CICLO:

Segundo
Integrantes:

Bryan Velepucha
ngel Lapo
Bismark Morales

MACHALA EL ORO ECUADOR

2016 2017

INDICE DE GRAFICOS
Grficos

Detalle

Pgina

1. Absorcin de radiacin

2. Desviaciones de la ley de Beer.

3. Influencian de la radiacin policromatica sobre la ley de Beer

5
4. Espectros de absorcin de un indicador acido-base
5. Transiciones electrnicas entre niveles de energa molecular

7
10

6. Banda de absorcin originadas por diferentes transiciones electrnicas

7. Grupo cromoforos y transiciones electrnicas

10
12

8. Espectro electromagntico

13

9. Colores del espectro visible

14

10. Espectrofotmetro de doble haz

15

11. Curvas de distribucin espectral de las lmparas de deuterio y volframio

15

12. Filtro de interferencia

17

13. Dispersin de radiacin por un prisma

17

14. Celdas para esprectrotometria

19

15. Clula Fotovoltaica

20

16. Fototubo

20

17. Tuvo fotomultiplicador

21

18. Anlisis de mezcla espectros no supuestas

26

19. Anlisis de mezclas. Superposicin parcial de espectros

26

1 Contenido
1

Contenido............................................................................................................ 3

1.

INTRODUCCIN................................................................................................... 1

2. MARCO TERICO.............................................................................................. 2
2.2.

ANTECEDENTE......................................................................................................................2

2.3.

ESPECTRO ELECTROMAGNTICO.................................................................................3

2.4.

TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA...................................................................4
2.4.1. TRANSMITANCIA (T)................................................................................ 4
2.4.2. LA ABSORBANCIA (A).............................................................................. 4

2.5.

LEY DE LAMBERT-BEER.....................................................................................................5

2.5.1.

LIMITACIONES A LA APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER......................5

2.5.2.

LIMITACIONES PROPIAS DE LA LEY DE BEER.........................................5

2.5.3.

DESVIACIONES DE LA LEY DE BEER........................................................6

2.5.3.1.

Desviaciones Qumicas Aparentes...............................................................6

2.5.3.2.

Desviaciones Instrumentales Aparentes Con Radiacin Policromtica................6

2.6.

TIPOS DE TRANSICIONES ELECTRNICAS..................................................................7

2.6.1. TRANSICIONES >*............................................................................. 7

2.6.2. TRANSICIONES n>*............................................................................. 7
2.6.3. TRANSICIONES n>* y >*................................................................8
2.6.4. BANDAS DE TRANSFERENCIA DE CARGA................................................9
2.6.5.
2.7.

BANDAS DE CAMPO LIGANDO.................................................................9

INSTRUMENTACION..........................................................................................................10

2.7.1.

FUENTES DE RADIACIN......................................................................11

2.7.2.

TIPOS DE ESPECTROFOTMETROS.......................................................11

2.8.

APLICACIONES ESPECTROFOTOMETRCA..............................................................12

2.8.1.

ANLISIS CUALITATIVO........................................................................12

2.8.2. ANLISIS CUANTITATIVO.....................................................................13

2.8.3. ANLISIS DE MEZCLAS DE SUSTANCIAS...............................................13
6.............................................................................................................................. 16

INDICE

1. INTRODUCCIN
Desde hace muchos aos se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias
qumicas; al reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiacin se puede estudiar la
absorcin de sustancias, no solamente en la zona del espectro visible, sino tambin en
ultravioleta e infrarrojo. Se denomina espectrofotometra a la medicin de la cantidad de energa
radiante que absorbe un sistema qumico en funcin de la longitud de onda de la radiacin, y a
las mediciones a una determinada longitud de onda. La teora ondulatoria de la luz propone la
idea de que un haz de luz es un flujo de cuantos de energa llamados fotones; la luz de una cierta
longitud de onda est asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad
definida de energa.
El objetivo es comprender y conocer las caractersticas generales y conceptos relacionados con
la espectrofotometra de absorcin ultravioleta-visible. La temtica que se revisa en el presente
trabajo se basa en los siguientes:

Fundamento
Antecedente
Espectro electromagntico
Transmitancia y absorbancia
Ley de lambert-beer
Tipos de transiciones electrnicas
Instrumentacin
Aplicaciones esprectrofometrica

Al concluir este presente trabajo se conocer los conceptos relacionado con la espectrofometria
de absorcin ultravioleta- visible.

2. MARCO TERICO
2.1.

FUNDAMENTO

La espectroscopia ultravioleta-visible o espectrofotometra ultravioleta-visible (UV/VIS) es una

espectroscopia de emisin de fotones y una espectrofotometra. Utiliza radiacin
electromagntica (luz) de las regiones visible, ultravioleta cercana (UV) e infrarroja cercana
(NIR) del espectro electromagntico, es decir, una longitud de onda entre 380nm y 780nm. La
radiacin absorbida por las molculas desde esta regin del espectro provoca transiciones
electrnicas que pueden ser cuantificadas.
La espectroscopia UV-visible se utiliza para identificar algunos grupos funcionales de
molculas, y adems, para determinar el contenido y fuerza de una sustancia. Se utiliza de
manera general en la determinacin cuantitativa de los componentes de soluciones de iones de
metales de transicin y compuestos orgnicos altamente conjugados.
Se utiliza extensivamente en laboratorios de qumica y bioqumica para determinar pequeas
cantidades de cierta sustancia, como las trazas de metales en aleaciones o la concentracin de
cierto medicamento que puede llegar a ciertas partes del cuerpo.
La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la
concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben las
radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma
lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro, en el
que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y medir la
cantidad de luz absorbida por la misma. En esta prctica se darn a conocer las caractersticas
generales y conceptos relacionados con la espectrofotometra. A continuacin y tras la
explicacin del funcionamiento del espectrofotmetro se harn espectros de absorcin con el fin
de determinar la longitud de onda donde la muestra presenta la mxima absorcin, y tras realizar
las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarn las concentraciones de distintas
biomolecular.
2.2.

ANTECEDENTE

Aunque el descubrimiento de la dispersin de la luz por Newton data de 1704 el desarrollo de

las tcnicas experimentales en este campo fue muy lento. Slo ms de un siglo despus
Fraunhofer cre un sistema ptico, que mediante uso de prismas y rendija (slit), permiti
detectar en el espectro de la luz solar las lneas de absorcin que llevan su nombre. El
2

conocimiento de que cada elemento qumico posee un espectro de emisin de lneas

caracterstica se debe a Bunsen y Kirchhoff (1859), que pueden considerarse los fundadores del
anlisis espectral y los primeros que construyeron un equipo capaz de ser utilizado
prcticamente. (Descubrimiento de los nuevos elementos Rb, Cs, Sr, presencia del He en el sol).
Mientras que la Espectroscopia de Emisin Atmica posea ya a fines del siglo XIX aplicaciones
prcticas, en especial para la determinacin de metales en minerales, la Espectroscopia de
Absorcin Molecular en las regiones Ultravioleta y Visible slo alcanz desarrollo a partir de los
aos 30 del siglo XX. El desarrollo de sistemas de deteccin fotoelctrica permiti en los aos
40 la sustitucin de los equipos de deteccin fotogrfica, poco eficientes, y la generalizacin de
esta tcnica espectroscpica.
2.3.

ESPECTRO ELECTROMAGNTICO

El espectro electromagntico (o simplemente espectro) es el rango de todas las radiaciones

electromagnticas posibles. El espectro de un objeto es la distribucin caracterstica de la
radiacin electromagntica de ese objeto.
El espectro electromagntico se extiende desde las bajas frecuencias usadas para la radio
moderna (extremo de la onda larga) hasta los rayos gamma (extremo de la onda corta), que
cubren longitudes de onda de entre miles de kilmetros y la fraccin del tamao de un tomo.
Grafico 1: Espectro electromagntico

Fuente: (Perez, 2012)

En espectroscopia el trmino luz no slo se aplica a la forma visible de radiacin
electromagntica, sino tambin a las formas UV e IR, que son invisibles. En espectofotometra
de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible
(400-780 nm).
La regin UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una regin de
energa muy alta. Provoca dao al ojo humano as como quemadura comn. Los compuestos
con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptdicos, sistemas aromticos, grupos
carbonilos y otros heterotomos tienen su mxima absorbancia en la regin UV, por lo que sta
3

es muy importante para la determinacin cualitativa y cuantitativa de compuestos orgnicos.

Diversos factores -como pH, concentracin de sal y el disolvente- que alteran la carga de las
molculas, provocan desplazamientos de los espectros UV. La fuente de radiacin ultravioleta es
una lmpara de deuterio.
En la regin visible apreciamos el color visible de una solucin y que corresponde a las
longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite.
Por tanto, para realizar mediciones de absorcin es necesario utilizar la longitud de onda en la
que absorbe luz la solucin coloreada. La fuente de radiacin visible suele ser una lmpara de
tungsteno y no proporciona suficiente energa por debajo de 320 nm.
Grafico 2: Colores del espectro visible

Fuente: (Perez, 2012)

2.4.

TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide

perpendicularmente sobre una disolucin de un compuesto qumico que absorbe luz o
cromforo, el compuesto absorber una parte de la radiacin incidente (Ia) y dejar pasar el
resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It
2.4.1. TRANSMITANCIA (T)

Es la fraccin de radiacin incidente que consigue atravesar la muestra. Vara de 0 a 1. La

transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de luz
transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, I t , y la cantidad de luz
que incidi sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento:

La transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente y transmitida al

pasar por la muestra.
2.4.2. LA ABSORBANCIA (A)
4

Es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz
absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia:

Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e
indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 =
0.
La cantidad de luz absorbida depender de la distancia que atraviesa la luz a travs de la
solucin del cromforo y de la concentracin de ste.
2.5.

LEY DE LAMBERT-BEER

Es fundamental en anlisis cuantitativo al relacionar la absorbancia con la concentracin. Esta

ley expresa la relacin entre absorbancia de luz monocromtica (de longitud de onda fija) y
concentracin de un cromforo en solucin:

La constante recibe el nombre de absortividad molar, cuando la concentracin se expresa en

moles/litro y el camino ptico, b, en centmetros. La absortividad es una propiedad caracterstica
de la sustancia absorbente y depende de la longitud de onda. Por ello, para aplicar la ley de Beer
debe seleccionarse una determinada longitud de onda, y para este propsito se utiliza el espectro
de absorcin.
2.5.1. LIMITACIONES A LA APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER
Se encuentran pocas excepciones a la generalizacin que la absorbancia est relacionada
linealmente a la longitud del camino ptico. En cambio, las desviaciones de la proporcionalidad
directa entre la absorbancia medida y la concentracin, para b constante, son ms frecuentes.
Estas desviaciones son fundamentales y representan limitaciones reales de la ley. Algunas
ocurren como una consecuencia de la manera en que las mediciones de absorbancia se hacen, o
como un resultado de cambios qumicos asociados con cambios en la concentracin. Otras
ocurren a veces como desviaciones instrumentales.
2.5.2. LIMITACIONES PROPIAS DE LA LEY DE BEER
La ley de Beer es exitosa en describir el comportamiento de absorcin de soluciones diluidas
solamente; a concentraciones altas (generalmente mayores que 0,01 M), la distancia promedio
5

entre las especies responsables de la absorcin est disminuida hasta el punto que cada una
afecta la distribucin de cargas de sus vecinas. Esta interaccin, a su vez, puede alterar la
habilidad de las 8 especies para absorber en una longitud de onda de radiacin. Debido a que la
extensin de la interaccin depende de la concentracin, la ocurrencia de este fenmeno provoca
desviaciones de la relacin lineal entre absorbancia y concentracin.
Un efecto similar se encuentra a veces en soluciones que contienen altas concentraciones de
otras especies, particularmente electrolitos. La proximidad de iones a la especie absorbente
altera la absortividad molar de la ltima por atracciones electrostticas, este efecto se disminuye
por dilucin. Se encuentran algunas excepciones entre ciertos iones o molculas orgnicas
grandes, que presentan interacciones significativas a concentraciones debajo de 0,01 M.
Desviaciones de la ley de Beer tambin surgen porque es dependiente del ndice de refraccin
de la solucin; entonces, si cambios de concentracin provocan alteraciones en el ndice de
refraccin de la solucin, se observan desviaciones de la ley.

2.5.3. DESVIACIONES DE LA LEY DE BEER

La proporcionalidad entre la absorbancia y la concentracin nicamente se cumple para
disoluciones muy diluidas, observndose desviaciones ms o menos acusadas al aumentar la
concentracin.
2.5.3.1.

Desviaciones Qumicas Aparentes

Surgen cuando un analito se disocia, se asocia, o reacciona con el solvente para producir un
producto teniendo un espectro de absorcin diferente del analito. Por ejemplo CrO4 2- en
funcin del pH va a absorber diferente.
2.5.3.2.

Desviaciones Instrumentales Aparentes Con Radiacin Policromtica

Se observa una adhesin estricta a la ley de Beer solamente cuando la radiacin es

monocromtica verdadera; esta observacin es otra informacin del carcter limitante de la ley.
El uso de radiacin que est restringida a una longitud de onda simple es raro porque los
elementos que aslan porciones de la salida de una fuente continua producen una banda mas o
menos simtrica de longitudes de onda alrededor de la deseada. La derivacin siguiente muestra
el efecto de la radiacin policromtica de la ley de Beer. Consideremos un haz que consiste de
dos longitudes de onda y . Suponiendo que la ley de Beer se aplica estrictamente para cada
una de estas individuales, se puede escribir para
Se encuentran pocas excepciones a la generalizacin que la absorbancia est relacionada
linealmente a la longitud del camino ptico. En cambio, las desviaciones de la proporcionalidad
6

directa entre la absorbancia medida y la concentracin, para b constante, son ms frecuentes.

Estas desviaciones son fundamentales y representan limitaciones reales de la ley. Algunas
ocurren como una consecuencia de la manera en que las mediciones de absorbancia se hacen, o
como un resultado de cambios qumicos asociados con cambios en la concentracin. Otras
ocurren a veces como desviaciones instrumentales.
2.6.

TIPOS DE TRANSICIONES ELECTRNICAS

Cuando un fotn UV-Visible de energa adecuada incide en una especie absorbente, un electrn
es promovido desde su estado fundamental a un estado electrnico excitado. En absorcin UVVisible, pueden observarse las distintas transiciones electrnicas.
Pueden tener lugar cuatro tipos de transiciones: >*, >*, n>* y n>*. As
mismo, tambin pueden producirse transiciones denominadas de transferencia de carga y de
campo ligando. Seguidamente se comentarn algunas peculiaridades de cada una de las
transiciones mencionadas.
Grafico 3: Banda de absorcion originadas por diferentes transiciones electronicas

Fuente: (Perez, 2012)

2.6.1. TRANSICIONES >*.

Longitud de onda <150 nm . Este tipo de transiciones se dan sobre todo en hidrocarburos que
nicamente poseen enlaces

C-H C-C. La energa requerida para que tenga lugar esta

transicin es relativamente grande, perteneciente a la regin espectral denominada ultravioleta

de vaco.
2.6.2. TRANSICIONES n>*.

Las especies qumicas saturadas que contengan tomos con pares electrnicos en orbitales no
enlazantes pueden dar lugar a que se produzcan transiciones n>*. Esto sucede, por ejemplo,
en compuestos saturados conteniendo heterotomos de oxgeno, azufre y halgenos.

Estas transiciones requieren bastante energa, si bien en menor grado que las >*, por lo
que las bandas correspondientes se presentan fundamentalmente en el ultravioleta lejano. Por
otra parte, la intensidad de las absorciones asociadas con estas bandas suelen ser de pequea
magnitud.
Los mximos de absorcin correspondientes a esta transiciones n>* tienden a desplazarse
hacia longitudes de onda menores al aumentar la electronegatividad del heterotomo. De hecho,
la mayor parte de los compuestos saturados que contienen oxgeno absorben a longitudes de
onda inferiores a 200 nm, lo cual hace posible que compuestos tales como el agua, o los
alcoholes, puedan utilizarse como disolventes en el ultravioleta prximo.
2.6.3. TRANSICIONES n>* y >*.

Longitud de onda entre 200-700 nm. La mayora de las aplicaciones de espectroscopia UVVisible estn basadas en transiciones que ocurren en esta zona. Se requiere que las especies
participantes aporten un sistema de electrones (grupos cromforos: compuestos con
insaturaciones, sistemas aromticos multicclicos, etc.). Las energas de excitacin en las
transiciones >*,son medianamente altas, correspondiendo a la regin UV Lejano y
Prximo, mientras que las n n>*

son considerablemente menores, correspondiendo a la

regin visible del espectro.

Grafico 4: Grupo cromoforos y transiciones electrnicas

Fuente: (Perez, 2012)

Los grupos auxocromos suelen contener grupos funcionales con electrones en orbitales no
enlazantes y que, en consecuencia, pueden absorber nicamente en el ultravioleta lejano, como
consecuencia de transiciones n>*. Sin embargo, si un auxocromo y un cromforo se
8

encuentran en la misma molcula, la absorcin del cromforo se desplaza hacia longitudes de

onda ms largas, a la vez que se produce un incremento en la intensidad de la absorcin. Este
efecto se atribuye normalmente a la posibilidad de que se den transiciones n>*. En relacin
con las modificaciones de las intensidades de absorcin se definen los siguientes trminos:
efecto hipercrmico (aumento de la intensidad de la absorcin) y efecto hipocrmico
(disminucin de la intensidad de la absorcin).
2.6.4. BANDAS DE TRANSFERENCIA DE CARGA.

Estas bandas se originan cuando se produce transferencia de electrones de una parte a otra de un
sistema. Para ello es necesario que uno de sus componentes tenga caractersticas de dador de
electrones y otro de aceptor. Como consecuencia de esta transferencia de electrones se origina
un estado excitado que es el resultado de un proceso de oxidacin-reduccin interna. As, por
ejemplo, la absorcin de un fotn por el complejo Fe(III)SCN da lugar a la transferencia de
un electrn desde el tiocianato hasta uno de los orbitales del hierro, originndose una especie
excitada consistente en Fe(II) y SCN neutro:

Lo mismo que sucede con otros tipos de excitacin electrnica, el electrn que ha
experimentado la transferencia vuelve a su estado original, si bien, ocasionalmente puede tener
lugar la disociacin del estado excitado, teniendo lugar, en este caso, una reaccin fotoqumica.
Algunas molculas orgnicas pueden originar bandas de absorcin por transferencia de carga
intramolecular:

Las bandas de absorcin originadas por estos procesos de transferencia de carga son
particularmente importantes en anlisis qumico, ya que muchos compuestos orgnicos e
inorgnicos las presentan en el ultravioleta (a veces tambin en el visible) y las absortividades
molares suelen ser muy altas (superiores a 10000), por lo cual se obtienen lmites de deteccin
muy bajos para estas especies.
2.6.5. BANDAS DE CAMPO LIGANDO.
El color que presentan muchos iones y compuestos de metales de transicin normalmente se
deben a absorciones denominadas de campo ligando (junto a stas, suelen presentarse las
9

intensas bandas de transferencia de carga anteriormente mencionadas). Estas absorciones suelen

ser de baja intensidad y aparecen en la regin visible, llegando en ocasiones hasta el ultravioleta
prximo y el infrarrojo prximo. El origen de las bandas de campo ligando puede explicarse del
siguiente modo: los cinco orbitales d de un tomo o un in de un elemento de transicin, cuya
representacin se muestra en la figura en ausencia de un campo magntico o elctrico externo
estn degenerados, no siendo necesaria la absorcin de radiacin para promover un electrn de
un orbital a otro.
2.7.
INSTRUMENTACION
La medicin de absorbancia de la luz por las molculas se realiza en unos aparatos llamados
espectrofotmetros. Aunque pueden variar en diseo, en especial con la incorporacin de
ordenadores para el anlisis de datos, todos los espectrofotmetros constan, segn se indica en la
figura, de:
1. Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada longitud de onda:
filtros, prismas, redes de difraccin.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la
muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para medir en UV se deben usar
las de cuarzo o slice fundido, porque el vidrio no transmite la radiacin UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales luminosas en seales
elctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.
4 Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de
onda a la que se va a realizar la medida.
Hay espectrofotmetros de un solo haz (con una sola celdilla para alojar la cubeta con la
muestra) y de doble haz (con dos celdillas para dos cubetas); en nuestro caso se trabajar con los
de un solo haz. Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que
se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente y
transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la absorbancia es cero. A continuacin se pone en
la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de sta.
Grafico 10: Espectrofotmetro de doble haz

10

Fuente: (Perez, 2012)

2.7.1. FUENTES DE RADIACIN
Las fuentes de radiacin utilizadas en espectrofotometra ultravioleta y visible deben ser
continuas en una amplia zona del espectro, de intensidad elevada y ser esencialmente constante
con la longitud de onda.
En la zona ultravioleta y visible, la fuentes ms utilizadas son de dos tipos: fuentes trmicas,
basadas en la emisin de radiacin por efecto de la temperatura, y fuentes cuya radiacin se
debe a descargas elctricas producidas en el seno de gases. Entre las primeras, la ms comn es
la lmpara de filamento de volframio. En condiciones ordinarias de operacin, esta lmpara
resulta til entre unos 350 nm y unos 3000 nm.
Por debajo de 350 nm, la potencia de una lmpara de volframio es inadecuada, debindose
emplear una fuente diferente. La ms comn es una lmpara de descarga de hidrgeno, o de
deuterio. Cuando se produce una descarga elctrica entre dos electrodos en el seno de un gas,
como hidrgeno, las colisiones entre los electrones de la descarga y las molculas gaseosas
provocan la excitacin electrnica, vibracional y rotacional de dichas molculas, con lo que se
obtiene un espectro de lneas que es caracterstico del gas, siempre que la presin sea baja. Al
aumentar la presin, las lneas se ensanchan, llegando a superponerse, hasta que, a presiones
relativamente altas (0.25 mm) se produce un espectro continuo.
Tanto la lmpara de hidrgeno como la de deuterio tienen un intervalo de utilizacin
comprendido entre 175 y 350 nm.Tambin se utilizan con la misma finalidad la lmpara de
descarga de xenon y la de vapor de mercurio. Finalmente, indicar que, puesto que el vidrio
absorbe fuertemente a longitudes de onda inferiores a unos 350 nm, las lmparas de ultravioleta
deben utilizar ventanas de cuarzo.

11

2.7.2. TIPOS DE ESPECTROFOTMETROS

Espectrofotmetro de doble haz: es aquel que cuenta con dos compartimientos para celdas
de muestra que le permite medir simultneamente la cantidad de energa radiante absorbida
por una matriz (blanco) y la energa absorbida por la muestra compuesta por la matriz y la
especie de inters.

Espectrofotmetro de haz simple: cuenta con un nico compartimiento de celda con lo cual
se debe realizar la medida de absorcin del blanco para poder registrar un cero (o
referencia) y luego medir la absorcin de la muestra.

2.8.

APLICACIONES ESPECTROFOTOMETRCA

En principio, cualquier especie qumica que absorba radiacin electromagntica en las regiones
ultravioleta o visible es susceptible de poder ser determinada por tcnicas espectrofotomtricas.
El mayor campo de aplicacin se encuentra en el anlisis cuantitativo, siendo la
espectrofotometra una de las herramientas ms usadas.
2.8.1. ANLISIS CUALITATIVO
Los espectros de absorcin ultravioleta y visible son, en general, menos tiles con fines
cualitativos que los espectros en la regin infrarroja, debido a que en aquellos las bandas son
ms anchas y, por consiguiente, menos caractersticas.
La identificacin de un compuesto puro requiere la comparacin emprica de los detalles del
espectro (mximos, mnimos y puntos de inflexin) de la sustancia problema con los del
compuesto puro. Adems, la intensidad de la absorcin, expresada en trminos de la
absortividad molar, , se usa con frecuencia como criterio adicional para la identificacin, sobre
todo si tiene un valor elevado a determinadas longitudes de onda.
Cuando se trata de identificar sustancias orgnicas, es conveniente operar en fase de vapor y a
presin baja, ya que en estas condiciones, el espectro observado es debido a molculas aisladas
y, generalmente es posible resolver la estructura fina vibracional y rotacional, lo que
proporciona detalles caractersticos para la identificacin. En disolucin y, sobre todo, en
presencia de disolventes polares como el agua, alcoholes, steres y cetonas, las molculas no se
encuentran aisladas, sino solvatadas, como consecuencia de lo cual se limita la rotacin.
Adems, los campos del disolvente pueden modificar de forma irregular los niveles de energa
12

vibracionales y, cuando el nmero de molculas es grande, los niveles de energa son poco
definidos, obteniendose como resultado la aparicin de una banda. Una de las pocas sustancias
orgnicas con espectro de absorcin caracterstico en disolucin es el benceno. Su espectro se
usa frecuentemente en test de especificaciones de pureza, donde el contenido en benceno debe
ser cuidadosamente controlado, por ejemplo, en alcohol absoluto o en ciclohexano.

2.8.2. ANLISIS CUANTITATIVO

Ya se ha comentado que la espectrofotometra de absorcin ultravioleta y visible es una de las

tcnicas ms usadas en anlisis cuantitativo. Se ha estimado que solo en el campo biosanitario,
un 95 % de las determinaciones cuantitativas se llevan a cabo por espectrofotometra*.
En relacin con los mtodos clsicos de anlisis (gravimtricos y volumtricos), los mtodos
espectrofotomtricos son menos exactos, si bien su mayor sensibilidad (104106 M) y rapidez
los hace competir ventajosamente con aquellos en muchas ocasiones. La precisin puede
considerarse aceptable, ya que, normalmente se obtienen incertidumbres relativas entre 1 y 2 %,
aunque con determinadas precauciones pueden reducirse considerablemente.
La base de la aplicacin de los mtodos espectrofotomtricos al anlisis cuantitativo es la ley de
Beer. El procedimiento a seguir para llevar a cabo una determinacin analtica consta de una
serie de etapas encaminadas a establecer las condiciones de trabajo y la preparacin de la curva
de calibrado.
2.8.3. ANLISIS DE MEZCLAS DE SUSTANCIAS

Absorbentes Cuando en una disolucin hay varias sustancias que absorben radiacin, es posible,
en muchos casos, llevar a cabo su determinacin sin necesidad de separar previamente los
distintos componentes. Se va a considerar el caso de que la muestra est constituida por los
componentes M y N.

3. METODOLOGIA
3.1.1. ESPECTRO DE ABSORCIN DE UN
DETERMINACIN DE CONCENTRACIONES
3.1.2. OBJECTIVOS
13

COLORANTE

Obtener el espectro de absorcin del colorante E-124 y determinar, a partir del espectro, a) El
coeficiente de absortividad molar k del colorante y b) la concentracin de una muestra
problema.
3.1.3. MATERIALES

Pipetas
Matraces aforados
La balanza de precisin.
Una disolucin tampn de mes previamente preparada. El mes es una solucin de un
cido orgnico (cido 2-morfolino etanosulfnico) 50 mM neutralizado con NaOH hasta
pH=6,5. El tampn garantiza que el pH se mantiene en torno a 6,5.

3.1.4. PROCEDIMIENTO
1. Preparacin de 4 disoluciones patrn de colorante E-124 a partir de una disolucin
concentrada del colorante (concentracin 0,15 g/l de colorante rojo E-124) que se
proporciona ya preparada.
2. Cadaparejautilizarladisolucinconcentradaparaprepararlassiguientes4
disolucionesmsdiluidasquesernlasquesemidanenelespectrofotmetro:
Disolucin1:diluir1mldeladisolucinconcentradacon5mldetampnyenrasarconaguaen
unmatrazaforadode25ml.
Disolucin 2: idem, 2 ml de disolucin concentrada.
Disolucin 3: idem, 3 ml de disolucin concentrada.
Disolucin4:idem,5mldedisolucinconcentrada.
3. Calcular la molaridad de todas las disoluciones, incluida la concentrada. Usar los
datos que se facilitan en el anexo.
4. Medir el espectro de absorcin del colorante de 325 a 685 nm sobre la disolucin 4:
Tras realizar el blanco, se introduce una cubeta con la disolucin 4 (la ms
concentrada) y se mide la absorbancia en el intervalo de longitudes de onda fijado
tomando valores cada 20 nm. Se repite la operacin de manera ms fina en la
regin donde se haya observado una mayor absorbancia, esta vez tomando valores
cada 10 nm. Establecer, a partir de esta medida, dnde se encuentra el mximo de
absorcin del colorante. Anotar el valor de absorbancia para esa longitud de onda
de la Disolucin 4.
5. Repetir la medida, a la misma longitud de onda (mximo de absorcin del
colorante) para las disoluciones 3, 2, 1 y para una mezcla problema de
concentracin desconocida. Anotar los correspondientes valores de absorbancia
frente a concentracin para hacer una recta de calibrado.
1. Consulte el manual de operacin del espectrofotmetro y ajstelo de acuerdo a lo

establecido en l.
2. Prepare las siguientes soluciones del colorante, utilizando agua:
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Sol. N1.-Concentracin = 1000 ppm; prepare 100 ml.

Sol. N2.- Concentracin=10 ppm; prepare 100 ml (a partir de la solucin

N1)

Sol. N3.- Concentracin = 2ppm; prepare 100 ml (a partir de la solucin

N1)

Sol N4.- Concentracin= 4 ppm; prepare 100 ml (a partir de la solucin

N1)

Sol N5.-Concentracin=6 ppm; prepare 100 ml (a partir de la solucin

N1)

Sol N6.- Concentracin= 8 ppm; prepare 100 ml (a partir de la solucin

N1)

3. ESPECTRO DE ABSORCIN. Utilice la solucin nmero 2 y lea en un rango de

longitud de onda de 380-740 nm, a intervalos de 36 nm. Determine la

absorbancia. Recuerde que el espectrofotmetro se debe ajustar a cero con el
solvente (BLANCO), previo a las determinaciones de la absorbancia. Haga el
grfico de absorbancia contra longitud de onda. Elija la longitud de onda ms
adecuada para la realizacin de la curva estndar.
4. CURVA ESTNDAR. Habiendo fijado la longitud de onda elegida, determine la

absorbancia de las siguientes soluciones, nmero 3, 4, 5, 6 y 2, en este

orden. Utilice agua como BLANCO. Haga el grfico de absorbancia contra
concentracin. Determine la concentracin de la muestra problema que de la
misma sustancia le proporcionar el profesor y reporte este dato.
3.1.5. RESULTADO:

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4. CONCLUSIN:
Se ha llegado a la conclusin de que la espectrofotometra es un mtodo analtico indirecto
porque se basa en la medicin de la absorbancia o transmitancia de las radiaciones; es de gran
utilidad en la actualidad para la identificacin de un analito en una muestra problema.
La espectrofotometra es el mtodo ms usado, debido a que es sencillo, especfico y sensible.

5. BIBLIOGRAFIA
1. APRAEZ. Anlisis de alimentos. Edit. Limuza. Mxico. 1980.

2. E. MERCKZ. Bioqumica. Edit. Prensa Mexicana. Mxico. 1980

3. LAGUNA. PIA. Bioqumica. Edit. Prensa mexicana. Mxico. 1980. 2da.edicn.
4. MATEUS. VAN H. Compendi de Bioqumica. Edit. Pearson Educacion.2003

5.1. Web grafa:

6.
Perez, C. G. (2012). http://ocw.usal.es/ciencias-experimentales/analisis-aplicado-ala-ingenieria-quimica/contenidos/course_files/Tema_3.pdf.
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