Determinacin cido srbico por hplc

Objeto:
Determinacin de cido srbico en productos lcteos por hplc con detector espectrofotomtrico ultravioleta.
Equipos:
Balanza analtica, clase i.
Agitador magntico.
Equipo de hplc con detector espectrofotometrico ultravioleta (uv).
Equipo para filtracin de solventes
Sonicador.
Centrfuga.
Agitador vortex
Ph-metro
Materiales:
Matraz aforado de 100, 50, 25, y 10 ml.
Pipeta aforada de 2, 5 y 10 ml.
Pipetas automticas de 20-200 y 100-1000 ml.
Tubos de centrfuga de 50 ml.
Viales de vidrio con tapa y septa de tefln para hplc x 1.5-2ml.
Filtros de membrana descartables de 0.45 y/o 0.22 m de tamao de poro y dimetro adecuado de material
inerte al extracto a filtrar.
Membranas de 0.45 m de tamao de poro y dimetro adecuado para filtracin de solventes.
Columna c18 (es conveniente su uso con guardacolumna c18).
Probetas de 100, 250, 500, y 1000 ml.
Vaso de precipitados de 250 ml.
Embudos.
Filtro de papel tipo whatman 91 de filtracin rpida.
Drogas y/o reactivos:
Acetato de amonio p.a.
cido actico glacial p.a.
Acetonitrilo, grado hplc.
Agua de alta pureza, tipo i (segn astm d1193-6)
Ferrocianuro de potasio trihidratado p.a.
Acetato de zinc dihidratado p.a.
Patrones:
cido srbico, pureza certificada.

Soluciones:
Buffer ph 4.6: pesar 15 g de acetato de amonio en un vaso de precipitados de 1000 ml, agregar
aproximadamente 900 ml de agua de alta pureza y agitar hasta disolucin. Agregar cido actico glacial hasta
ajustar el ph en 4.6 (aproximadamente 12 ml). Trasvasar cuantitativamente a probeta de 1000 ml y llevar a
volumen con agua de alta pureza. El ph final debe ser 4.6 0.2
Fase mvil: buffer ph 4.6: acetonitrilo, (80:20)
Antes de usar, filtrar en equipo para filtracin de solventes con membrana de 0.45 m.
Solucin carrez i: disolver 15 g de ferrocianuro de potasio trihidratado con agua de alta pureza y llevar a 100
ml.
Solucin carrez ii: disolver 30 g de acetato de cinc dihidratado con agua de alta pureza y llevar a 100 ml.
Solucin madre de cido srbico: pesar al dcimo de mg, aproximadamente 0.050 g de cido srbico en matraz
aforado de 100 ml y llevar a volumen con solucin buffer de acetato. Concentracin aproximada de 0.5 mg/ml.
Solucin intermedia de cido srbico: tomar 10.0 ml de solucin madre de cido srbico en matraz aforado de
50 ml y llevar a volumen con solucin buffer de acetato.
Solucin de trabajo de cido srbico: tomar 2.0 ml de solucin intermedia de cido srbico en matraz aforado
de 25 ml y llevar a volumen con solucin buffer de acetato. Concentracin aproximada de 0.008 mg/ml.
Curva de calibracin:
En sendos matraces de 10 ml preparar las siguientes soluciones, llevando a volumen final con buffer acetato
Concentracin final del st

l de solucin

Volumen final

Concentracin

(g/ml)
de trabajo
(ml)
equivalente en matriz (g/g)
0.04
50
10
2
0.08
100
10
4
0.2
250
10
10
0.4
500
10
20
0.8
1000
10
40
Construir un grfico de respuesta (rea) en funcin de concentracin (g/ml en la solucin final).
Ensayo:
Pesar al dcimo de mg, aproximadamente 1 g de muestra en tubo de centrfuga de 50 ml.
Agregar 30 ml de solucin buffer de acetato
Sonicar 30 minutos.
Mezclar y llevar a 50 ml con solucin buffer de acetato
Agitar con vortex durante 10 segundos.
Centrifugar a 1700 x g (4000 rpm aproximadamente), durante 15 minutos.
Filtrar sucesivamente a travs de filtros de membrana de 0.45 m y 0.22 m de tamao de poro y colocar
en viales para hplc de 1.5-2 ml.
Inyectar los extractos en el cromatgrafo.
Nota para la matriz queso:

Rallar la matriz antes de pesar.

Luego de sonicar y antes de llevar a volumen, agregar 1 ml de solucin carrez i y 1 ml de solucin carrez ii.
Dejar reposar 15 minutos.
Luego de centrifugar (4.8.5.), filtrar primero a travs de papel de filtro y seguir con 4.8.6.
Fortificacin para dulce de leche y queso: a un gramo de matriz blanco previamente analizada, agregar 100
l de solucin intermedia de cido srbico
Condiciones cromatogrficas:
Detector de ultravioleta: = 250 nm.
Flujo: 1.0 ml/min.
Volumen de inyeccin: 20 l.
Resultados:
Interpolar los valores obtenidos de reas de las muestras y el fortificado en la curva de calibracin y
determinar la concentracin. Clculo:
cido srbico mg / kg = ((am b) / a) x 50 / m
Donde:
Am = reas de muestra
b = ordenada al origen de la curva de calibracin
a = pendiente de la curva de calibracin
m = masa de la muestra (g).
Con los valores obtenidos para los fortificados determinar la recuperacin media del ensayo.
Corregir con los valores de recuperacin, las concentraciones obtenidas.