PRACTICA N 01

PREPARACION DE MATERIAL DE LABORATORIO Y METODOS LA TOMA DE

MUESTRA DE ALIMENTOS

I.

INTRODUCCION

En el anlisis de alimentos se busca verificar si se cumple o no con los

requerimientos establecidos de calidad e inocuidad con la finalidad de proteger a
los consumidores. Por ejemplo la cuenta de bacterias coliformes totales en un
helado de lcuma, la presencia de Escherichia coli en hamburguesas, etc.
Para el resultado del anlisis de una caracterstica de un alimento sea significativo
y confiable, debe provenir de una muestra representativa del lote que haya sido
tomada y manejada de forma adecuada que asegure su integridad.
Las actividades previas a la toma de muestra de alimentos influirn de forma
positiva o negativa en la realizacin de la misma y por consiguiente en la
representatividad de la muestra obtenida. Por ello es de vital importancia que el
laboratorio o el personal que realizara el muestreo cuente con la mayor cantidad
de informacin: tipo de alimento, finalidad del muestreo, lugar de muestreo,
tamao del lote, requerimientos legales y/o especiales, etc., con objeto de que se
elabore un plan de muestreo adecuado.
Aqu se consideran algunos
muestreo.

I.1.

puntos para la elaboracin de los planes de

MATERIAL UTILIZADO

Todo el material e instrumentos que se utilicen para la toma, manejo y transporte

de muestras, que van a estar en contacto directo con el alimento, deben estar
limpios para evitar contaminaciones indeseadas. Es de suma importancia
seleccionar los materiales adecuados para la colecta de muestra, estos debern
estar limpios y ser de materiales inertes a las sustancias que van a muestrearse.
Se recomienda el uso de bolsas de polietileno transparentes, en diferentes
tamaos, frascos de vidrio de diferentes capacidades, recipientes de polipropileno
con sello hermtico, frascos de polipropileno de diferentes medidas; los recipientes
dependern de las caractersticas que se analizaran. En el caso de muestras que

sern sometidas a ensayos microbiolgicos, el material debe ser estril y libre de

sustancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos.
El material deber transportarse preferentemente en hileras de poliestireno o de
otro material aislante limpio; con hielo o refrigerantes en cantidad suficiente para
mantener las muestras a una temperatura adecuada.
Es necesario llevar material accesorio como: papel aluminio, papel de estraza,
etiquetas autoadheribles, maskin tape, algodn, cerillos o encendedor, lmpara de
alcohol, torundas con etanol o isopropanol al 70%, torundas con cloruro de
benzalconio (100 mg/L), frasco con agua clorada (100 mg/L), reactivos para
preservacin qumica. Instrumentos para toma de muestra: muestreadores,
cucharones, esptulas, cuchillos, pinzas, tijeras, etc., (de acero inoxidable o de
cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar los
resultados). Termmetros (de preferencia dos) para la toma de temperatura de
alimentos con alcance de medicin de -40 a 100 C y exactitud de 1C.

I.2.

PERSONAL DE MUESTREO

El personal encargado de realizar el muestreo debe vestir siempre ropa de

proteccin adecuada. Por ejemplo: bata, guantes (estriles donde aplique) lentes
de seguridad, zapatos de seguridad, casco (donde aplique), cofia y cubrebocas,
mascarilla para polvos finos, tapones auditivos, etc.; en la medida de lo posible
tener un conocimiento detallado del material que va a ser muestreado.

I.3.

PLAN DE MUESTREO

En la elaboracin del plan de muestreo se debe considerar: tipo de producto, las

caractersticas a examinar, la finalidad del examen, para as poder definir el
nmero de muestras a colectar, tipo de recipientes, como preservar y transportar
la muestra, etc.
El muestreo consiste en separar una serie de muestras representativas del lote
para someterlas al anlisis microbiolgico o fisicoqumico.

II.

OBJETIVOS

Conocer tcnicas de esterilizacin.

Conocer tcnicas de toma de muestra.
III.

MATERIALES
Frascos de vidrio, plstico, acero inoxidable, etc.
Frascos tapa rosca azul.
Bolsas de polietileno.
Etiquetas.
Sacabocados.
Cuchara
Cucharon
Cuchillo
Desinfectante
Hielo
Mechero
Cooler

rosca azul

Frascos tapa
bolsas de polietileno

Sacabocados

Cucharon

Cooler

Cuchara

Cuchillo

Mechero Bunsen

IV.

PROCEDIMIENTO

Para esterilizar se pueden usar dos mtodos: horno (calor seco) o

autoclave (calor hmedo).
Para muestras liquidas:
Se realiza un batido de la muestra.
Se debe recolectar de 100 ml a 1 L de la muestra, dependiendo de lo
que se requiera.
Utilizar material estril tanto para la toma como para contener la
muestra.
Colocar bolsas de hielo o refrigerante alrededor de los envases con
la muestra.
Rotular adecuadamente la muestra.
Transportar la muestra al laboratorio lo ms antes posible.
Para muestras solidas:
Se deben recolectar de 200 g a 1 K de la muestra, dependiendo de
lo que se requiera.
Realizar cortes o tomar porciones de los alimentos utilizando
cuchillos, cuchara, esptulas, tijeras u otro implemento que se
considere necesario.
Transferir la muestra a una bolsa de polietileno o a un frasco de
vidrio de boca ancha estril.
Colocar bolsas de hielo o refrigerante alrededor de los envases con
la muestra.
Rotular adecuadamente la muestra.
Transportar la muestra al laboratorio lo ms antes posible.

V.

CUESTIONARIO

1. Cules son las normas tcnicas y hoja de registro para la toma de

muestra?
Tcnicas de toma de muestra:
Alimentos envasados: Para colectar productos envasados en presentacin
comercial se deben tomar en forma aleatoria de acuerdo al plan de
muestreo, tomando del mismo lote la cantidad adecuada para los ensayos.
Las muestras se deben enviar al laboratorio en las mismas condiciones en
que se presentan al consumidor. Tratndose de productos envasados en
contenedores grandes, ser necesario abrir stos para poder colectar la
cantidad de muestra necesaria y por lo tanto se debe tener cuidado de no
daar ni contaminar la muestra.
Debe evitarse que el rea donde se realizar la toma de muestra contribuya
a la contaminacin y/o deterioro de las mismas. En el caso de alimentos
que se expenden al aire libre no se requieren precauciones estrictamente
aspticas.
Si se requiere tomar las muestras aspticamente y el rea lo permite, crear
un rea asptica con una torunda empapada en alcohol y pinzas o con una
lmpara de alcohol. Cuando sea necesario medir la temperatura de la
muestra. La muestra utilizada para este fin deber ser diferente de la que
se enva al laboratorio para los ensayos.
Alimentos sin envasar: En los alimentos preparados sin envasar de
consumo inmediato (cocina, comedores, restaurantes, etc.), se recomienda
que la muestra sea colectada con los instrumentos con los que se manipula
normalmente y que sea el personal encargado de la elaboracin y/o
manipulacin de los alimentos, el que realice la actividad siguiendo las
indicaciones del personal de muestreo.
Si se requiere tomar la temperatura, el termmetro debe desinfectarse e
introducirse en una porcin de muestra que no vaya a entrar en la seleccin
de la muestra que va a colectarse.
Si el traslado de las muestras al laboratorio es menor a una hora, para los
alimentos preparados que se muestrean en caliente se permite que sean
transportados al laboratorio a la misma temperatura; en caso de que el
traslado sea ms largo las muestras debern enfriarse a temperatura
ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeracin.

En la toma de muestra utilice los implementos adecuados para que sta

sea lo ms representativa, para ello puede auxiliarse de sacabocados,
cucharas, cuchillos, tijeras, taladros, etc. En el caso de muestras para
ensayos microbiolgicos los instrumentos debern estar estriles o en su
defecto desinfectado con alcohol u otro desinfectante permitido.
Productos a granel: Para los alimentos que se encuentran a granel, si se
encuentran en un contenedor y ste lo permite, tome la muestra en forma
aleatoria, de lo contrario colecte varias muestras de los extremos y centro
del contenedor para obtener una muestra representativa. Si el contenedor
tiene un conducto de salida o una compuerta, antes de obtener la muestra
debe dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha
salida con el flujo y posteriormente colectar la muestra.
Toma de muestra de agua: Las muestras sern recogidas en un recipiente
estril en un punto de muestreo representativo. Este apartado ser
desarrollado en la unidad de trabajo correspondiente.
Identificacin de la muestra: En la toma de muestra es indispensable
identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o despus de
colocar en l la muestra, mediante rtulo o etiqueta (indelebles), con los
siguientes datos:
a. Identificacin nica (Nmero de Acta u Oficio, folio, etc.).
b. Fecha de muestreo.
c. Lugar de muestreo.
d. Hora de muestreo.
e. Descripcin genrica del producto.
f. Nmero de lote.
g. Temperatura de la toma de muestra si es que procede.
h. Parmetros a analizar
i. Nombre y firma del muestreador.
La etiqueta deber colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, la caja, en
el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea
alterada o violada.
Hoja de registro para toma de muestra:

2. Cmo se tomara una muestra de carne, fideos, aceite y leche de

soya?
Muestra de carne:
Cortar porciones de carne o piel de partes diferentes de la carcasa o del
corte de carne o remover una porcin de carcasa. Tome por lo menos, 200
g de muestra en una bolsa de polietileno o en un frasco de vidrio de boca
ancha estril.

PRACTICA N 02
NUMERACION DE MICROORGANISMOS TOTALES EN ALIMENTOS
RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO - METODO DE BREED

I.

INTRODUCCION

El recuento es un procedimiento que permite conocer el nmero de

microorganismos que hay en una muestra. Para este propsito, existen diferentes
mtodos mediante los cuales se pueden contar microorganismos vivos (recuento
de viables), o bien vivos y muertos (recuento de totales). A su vez todos los tipos
de recuento, se pueden clasificar en directos e indirectos. Un recuento directo es
aquel en el que se cuentan las clulas por observacin directa al microscopio, y el
recuento indirecto es aquel en el que se determina el nmero por crecimiento o
alguna propiedad de los microorganismos. La ventaja de los mtodos directos es
que son rpidos.
Se basa en contar m.o. en una cantidad conocida de muestra utilizando frotiscolor
eados, cmaras del tipo de las de contar glbulos, o las especialmente
diseadas para contar hongos en alimentos como la cmara de Howard.
El mtodo de Breed es un mtodo de recuento directo bastante simple, fcil y
eficaz a pesar de ser un mtodo antiguo (1911). Se podr contar el nmero de
microorganismos porque se usa un volumen conocido de muestra en un rea
determinada.
Este mtodo de Conteo Directo al Microscopio es usado mayoritariamente para el
diagnostico microbiolgico de la leche y se considera un mtodo rpido para
estimar el grado de contaminacin bacteriano de la leche pero que no est
diseado para el conteo rutinario de la leche cruda ya que el conteo en placa es
ms preciso, ms prctico y ms barato que un conteo directo ejecutado
adecuadamente. Si el mtodo se contemplara como un mtodo para estimar la
calidad de la leche con propsito de pago, su uso sera limitado para pequeo
nmero demuestras con alto contenido bacteriano (2.3 x 10 6 ufc/mL) debido a la
insensibilidad del mtodo.
Un volumen conocido de la muestra (generalmente 0.01 ml) se extiende sobre un
portaobjeto normal en una superficie conocida. Se examina en un microscopio
calibrado, donde se conoce el dimetro del campo microscpico. Se cuentan las
clulas en diversos campos. Se obtiene el valor medio de clulas por campo y se

multiplica por el nmero de campos microscpicos comprendidos en la

preparacin. El resultado corresponde al nmero de clulas en el volumen
extendido (0.01 ml). Multiplicando este valor por 100 se obtiene el nmero total de
microorganismos por ml o por gramo de muestra.

II.

OBJETIVOS

Conocer el mtodo de Breed para el conteo de microorganismos totales en

alimentos.
Aplicar el mtodo de Breed para contar microorganismos totales en una
muestra de leche cruda fresca.
III.

MATERIALES
Muestra: leche cruda fresca.
Pipeta de Breed o anza en anillo calibrada (3 mm de dimetro interno).
Lamina patrn de Breed.
Laminas portaobjetos.
Azul de metileno.
Colorantes para tincin Gram.
Xilol.

IV.

PROCEDIMIENTO

IV.1.

Estandarizacin del Equipo:

Se coloca la lmina patrn que tiene una tabla macromtrica marcada, que tiene
divisiones de 0.1 a 0.01 m; con el objetivo de inmersin, proceder as:
Medir el campo en mm. hasta el tercer decimal.
Determinar el rea del campo en mm 2; aplicando la formula de superficie
del circulo:
A= r 2
IV.2. Preparacin de la pelcula

Homogenizar la muestra (20 veces).

Tomar 0,01 ml de muestra con el anza.
Distribuir la muestra en el cuadradito.
Secar a 40 45 C por 5 minutos.
Desengrasar con xilol la pelcula seca de la leche.
Teir con azul de metileno y otra con gram.
Observar al microscopio por lo menos 30 campos.

Tincin Tincin
con azulgram
de metileno
# de campo

# de m.o

5
3

6
4

3
V.1.
4

4
6

6
5

0
4

3
6

4
5

10

7
2

11

2
0

12

5
7

13

3
8

14

7
2

15

4
7

16

9
6

V.

34

RESULTADOS
Calculo del promedio de
microorganismos por campo

7
5

17
17

144

18
18

59

19
19

42

20
20

36

21
21

58

22
22

42

23
23

54

24
24

68

30

25
25

105

Promedio de m.o por campo

26
26

63

27
27

54

28
28

78

29
29

210

30
30

47

Promedio de m.o por campo=

Promedio de m.o por campo= 153

30
Promedio de m.o por campo = 5.1

N de m.o por campo = 5

V.2.

Calculo del factor microscpico

A= r 2
A= 3.1416 x (0.145/2)2
A= 0.016513035 mm2
F.M = 100 / 0.01651
F.M = 6056.82 x 100
F.M = 605582.19

V.3.

Clculo del reciproco de la dilucin

Cantidad de muestra = 0.01 ml
Dilucin = 1/100
Reciproco de la dilucin = 100

V.4.

Clculo del numero de microorganismos

N de m.o = N de m.o por campo x factor microscpico x reciproco de la dilucin

N de m.o = 5 x 605582.19 x 100
N de m.o = 302 791 095 m.o/ml

VI.

CUESTIONARIO

1. A parte de la leche qu tipos de jugos se pueden utilizar para este

mtodo?
Se puede realizar para otros productos lcteos derivados y otros productos
alimenticios, siempre y cuando sean lquidos, como por ejemplo leches
fermentadas (leche acidfila), vino, sidra (para contar levaduras).
2. A parte del mtodo de Breed Qu otro
microorganismos totales en alimentos?

mtodo hay para contar

Dentro de los principales mtodos de recuento del nmero bacterias en una

muestra tenemos:
METODOS DIRECTOS
Recuentos en placa: mtodo de placa vertida y diseminacin en placa.
Filtracin
Mtodo del nmero ms probable.
METODOS INDIRECTOS
Turbidimetria
Actividad metablica
Peso seco
3. Si no contara con lmina patrn Por cunto tendra que multiplicar el
nmero de microorganismos?
No se podra determinar con exactitud el nmero total de microorganismos por
este mtodo, pero se podra calcular teniendo un estndar del nmero de
microorganismos promedio en dicha muestra o en todo caso utilizar otros mtodos
de recuento o hacer diluciones y comparar el grado de turbidez con diluciones de
microorganismos ya establecidas.
4. Qu significa en leche determinar el nmero de microorganismos
totales?
Los microorganismos en la leche tienen varias orientaciones. Unos son
beneficiosos por las transformaciones que producen y otros perjudiciales y su
control presenta aspectos sanitarios y comerciales, el primero se refiere al riesgo
que el alimento puede suponer para la salud del consumidor cuando es portador
de microorganismos patgenos o de sus toxinas y el segundo a las caractersticas
de conservacin de la misma que viene determinada por la presencia de un

mayor o menor nmero de flora saprofita, esta en elevadas concentraciones

puede producir defectos y disminucin de las propiedades nutritiva y
organolpticas del producto.

BIBLIOGRAFA

 Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin

(FAO). GUA PARA MUESTREO DE ALIMENTOS. Proyecto TCP/RLA/3013
(a) Desarrollo de un Sistema Integral de Aseguramiento de la Calidad Para
Laboratorios de Anlisis de Alimentos en Amrica del Sur.
Tortora, Funke, Case. Introduccin a la Microbiologa. Novena edicin.
Editorial Mdica Panamericana, S.A. Madrid. Espaa.
DAVILA F., Nuria y J. E., HERNANDEZ G. (2006). Mtodos de ensayos
rpidos de deteccin de microorganismos en la leche. Revista Electrnica
de Veterinaria RE. DVET, Vol. VII, N 07, obtenido el 19 de enero de 2008.