UNIVERSIDAD POLITECNICA DE PUEBLA

INGENIERA GENTICA

Protocolo de clonacin de clulas Procariotas a Procariotas.

Insercin del NisB para la produccin de Nisina en la bacteria de
E. coli

Profesora: Mtra. Vernica Miroslava Martnez Ortiz

Fecha de entrega: 27/07/16

6 Cuatrimestre

Grupo: BA

Equipo
Brenda Rojas Huerta
Nayeli Carrillo Jimnez

INTRODUCCIN

La gran complejidad de los procesos biolgicos en los seres vivos ha sido por aos la
razn por la que los investigadores han centrado su atencin en descifrar los mecanismos
que se esconden detrs de esos procesos. Desde las primeras observaciones de
Gregorio Mendel hasta la actualidad, se tiene la nocin de que parte de la explicacin de
los diferentes fenmenos biolgicos se encuentra escondida en el genoma celular y que
una de las claves para entender dichos fenmenos es el estudio de los genes. (Tamay,
2013).
Es as como han ido apareciendo diferentes tecnologas cuyos protocolos estn dirigidos
al estudio del ADN para su posterior manipulacin se han propuesto diferentes pasos
para la obtencin del fragmento especifico, los pasos a seguir son: la obtencin del
fragmento de ADN que contiene el gen que se va a clonar, la insercin de dicho gen en
una molcula de ADN apropiada que sirve como vehculo o vector de clonacin,
introduccin del vector de clonacin en una clula de otro organismo (clula
hospedadora), deteccin del gen clonado para comprobar que se encuentra y se expresa
en la clula hospedadora, multiplicacin de la clula hospedadora para obtener un
nmero elevado de copias del gen. (Montenegro, 2013)
Ejemplos de las manipulaciones anteriormente mencionadas es la mutagenesis dirigida,
pues en estas tcnicas se centran en inducir mutaciones en ubicaciones especificas
(Pierce, 2009); probablemente, uno de los procesos ms conocidos de este tipo es la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingls
Las diferentes finalidades que pueden llegar a tener la ingeniera gentica son bastas
pues puede llegar a usarse en diferentes campos de la industria, agricultura, medicina etc.
Ahora bien la transferencia implica introducir un fragmento de ADN en un vector. Los
vectores de clonacin deben permitir la insercin de un fragmento de ADN extrao y ser
capaces de replicarse normalmente dentro de la bacteria, en este trabajo se introdujo.
Las bacteriocinas producidas por diferentes bacterias probiticas pueden servir como
barreras antimicrobianas y ayudar a reducir los niveles de microorganismos patgenos
(Fernandez, 2005). Existen numerosas bacteriocinas y cada una tiene espectros de
inhibicin particulares, esta caracterstica es aprovechada para la manipulacin de
poblaciones bacterianas a nivel de tracto digestivo con el fin de excluir patgenos.
La nisina es el antibitico usado a nivel comercial en diversos productos alimenticios la
cual es producida por Lactococcus lactis ssp. Debido a que no se han reportado
mecanismos de resistencia por las bacterias sensibles, se utiliza ampliamente como
conservador a nivel mundial. En la industria alimentaria la nisina se usa principalmente
en la elaboracin de quesos, pero en un estudio reciente (D. Ercolini et al 2010) se ha
demostrado la eficacia de esta sustancia para el almacenamiento de carne de ternera en
envases activos.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las infecciones de tipo gastrointestinal en especial las originadas por Enterobacterias son
un gran problema que enfrentan los servicios de salud tanto la poblacin adulta como
infantil que en los ltimos tiempos

JUSTIFICACIN

Este antibitico natural es el primer conservante natural del que se sabe que mata
bacterias Gram-negativas, las cuales suelen ser nocivas. El antibitico puede ser til para
proteger a los alimentos de una amplia gama de patgenos que causan enfermedades.
El antibitico podra ser usado para evitar la presencia de bacterias perniciosas en carnes,
quesos procesados, productos lcteos y de huevo, alimentos enlatados, mariscos,
condimentos, bebidas fermentadas y muchos otros alimentos. Adems de sus beneficios
para la seguridad alimentaria, los antibiticos son fciles de digerir, no resultan txicos
para los humanos, no provocan alergias y es difcil que las bacterias peligrosas
desarrollen resistencia a ellos.

OBJETIVO GENERAL

Identificar el gen de produccin de nisina (antibitico) es producida por Lactococcus lactis

ssp para ser introducida a Escherichia coli.

OBJETIVO ESPECFICOS

Obtener el gen NisB

Disear un primers.
Insertar un gen en el vector de clonacin estableciendo la enzima NisB.
Clonar el gen en una clula hospedera.
Demostrar la funcionalidad.
Realizar el corrimiento electrofortico para determinar
Corroborar que el gen se insert por PCR

APLICACIONES

La Nisina es un polipptido producido por la fermentacin de varias cepas de Lactococcus

lactis; presenta actividad como un conservador natural para los alimentos con una alta
eficiencia y no es txico. La Nisina es eficaz contra una amplia gama de bacterias Gram
positivas, particularmente contra las que producen esporas resistentes al calor. Inhibe
ciertas cepas de patgenos en los alimentos, tales como Clostridium spp., Clostridium
botilinum, Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus, Listeria monocytogenes,
Bacillus stearotermophilus y otrosaunque no presenta ningn efecto contra bacterias
Gram negativas, levaduras ni mohos.
La Nisina es utilizada en gran variedad de productos alimenticios, ya sea solo o en
combinacin de otros conservadores (ejemplo cido benzico o cido srbico).

ANTECEDENTES

La nisina es el antibitico usado a nivel comercial en diversos productos alimenticios la

cual es producida por Lactococcus lactis ssp. Debido a que no se han reportado
mecanismos de resistencia por las bacterias sensibles, se utiliza ampliamente como
conservador a nivel mundial. La biosntesis de la nisina est controlada por un conjunto de
11 genes que codifican el precursor as como las enzimas necesarias para modificarla y

secretarla, entre otras funciones. NisB es la primera enzima que acta sobre el precursor
deshidratando aminocidos clave.

METODOLOGA

Bsqueda del gen en NCBI

NCBI
CLONACIN Y EXPRESIN DE LA ENZIMA RECOMBINANTE NisB EXPRESADA
La nisina es el lantibitico mas estudiado y usado a nivel comercial en diversos productos
alimenticios la cual es producida por Lactococcus lactis ssp. lactis [1]. Debido a que no se
han reportado mecanismos de resistencia por las bacterias sensibles, se utiliza
ampliamente como conservador a nivel mundial [2]. La biosntesis de la nisina est
controlada por un conjunto de 11 genes que codifican el precursor as como las enzimas
necesarias para modificarla y secretarla, entre otras funciones. NisB es la primera enzima
que acta sobre el precursor deshidratando aminocidos clave [3]
Lantibiotico
Se ha descubierto un lantibitico (un pptido producido por una bacteria que es inofensivo
para los humanos) que podra ser aadido a los alimentos para matar bacterias dainas
como la Salmonela, la E. coli y la Listeria.
Este lantibitico natural es el primer conservante natural del que se sabe que mata
bacterias Gram-negativas, las cuales suelen ser nocivas. El lantibitico recin descubierto
puede ser til para proteger a los alimentos de una amplia gama de patgenos que
causan enfermedades.
El lantibitico podra ser usado para evitar la presencia de bacterias perniciosas en
carnes, quesos procesados, productos lcteos y de huevo, alimentos enlatados, mariscos,
condimentos, bebidas fermentadas y muchos otros alimentos. Adems de sus beneficios
para la seguridad alimentaria, los lantibiticos son fciles de digerir, no resultan txicos
para los humanos, no provocan alergias y es difcil que las bacterias peligrosas
desarrollen resistencia a ellos.

Lactococcus lactis nisin A (nisA) and nisB, nisC, nisT, and nisI genes,
complete cds

481
541
601
661
721
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L16226.1

Se ubic en Nebcutter y se indic los sitios de corte

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Las enzimas de restriccin que se usaron en un fragmento del gen NisB

Cepas y condiciones de crecimiento bacteriano. Escherichia coli K12 (para la
clonacin de genes) y cepas de se propagaron en caldo de Luria-Bertani (LB) con
agitacin o en agar LB a 37 C. El medio LB aplicado contiene 4 g / litro de NaCl, a
menos que se indique lo contrario. El ADN cromosmico de una cepa productora de
nisina de L. lactis y se utiliza como la fuente gentica de los genes de inmunidad
nisina. Se utilizaran antibiticos a las siguientes concentraciones: ampicilina, 100 mg
/ ml; eritromicina, 5 mg / ml; y kanamicina, 5 mg / ml. La induccin de genes se
lograra mediante la adicin de 1 mM IPTG (isopropil-- D -thiogalactopyranoside).
La clonacin de genes. Los procedimientos para la purificacin de ADN, restriccin,
ligadura, electroforesis en gel de agarosa, y la transformacin de
competente E. coli clulas se llevaran a cabo como se describe por Sambrook et
al. E. coli se transformara. El PCR se llevara a cabo. Las secuencias de nucletidos
de los cebadores utilizados para la PCR se enumeran en la Tabla, y los plsmidos
utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla
Construccin de E. coli SPL aguas arriba de los genes de la inmunidad
nisina. El marco de lectura abierto de nisB fue amplificado en PCR L. lactis ADN
cromosmico y ligaron entre s. El gen indicador lacZ de E.coli se fusionara al
extremo de la nisB construccin gnica con el fin de realizar ensayos de galactosidasa para determinar la fuerza de la SPL, que se clon delante de los
genes de produccin de nisina. El fragmento de SPL se insertara en frente de
la nisB-lacZ construccin gnica mediante el uso de un cebador inverso degenerado
amplificar un fragmento de 500 pb de ADN no codificante de E. coli, esta se
transform con el SPL- nisB-lacZ mezcla de ligacin, y se agruparan los
transformantes resultantes

Los transformantes se seleccionaran en base primera en su coloracin azul en

placas de agar LB que contenan los antibiticos apropiados y X-Gal (5-bromo-4cloro-3-indolil-- D -galactopyranoside) y se examinaran a partir de entonces para la
produccin de la nisina y la -galactosidasa actividad.

-galactosidasa experimentos.
Con el fin de determinar los puntos fuertes de los diferentes promotores sintticos,
un ensayo de -galactosidasa se realizara usando un protocolo de Miller
modificado. La E. coli cultivo se hizo crecer en medio LB a 37 C hasta que la
DO 600 alcanza 0,5. A continuacin, se recoger una alcuota de 2 ml de las clulas
y se resuspendera en 2 ml de tampn Z (6 mM Na 2 HPO 4 , NaH 40 mM 2 PO 4 ,
mM KCl 10, 1 mM MgSO 4 , pH 7,0), y el OD 600 se registr. Una muestra de 100 a
800 l de la suspensin de clulas se lisara durante 5 min a 30 C con 200 l de la
poblacin de lisozima (Z-tampn con 2,5 mg / ml de lisozima), y se aadira Z-buffer
para obtener un volumen total de 1 ml. La muestra lisada se mezclara con 8 l de
10% de Triton X-100 y 100 l de 4 mg / ml de ONPG ( o -nitrofenil-- D galactopyranoside) y se incubara a 30 C hasta que la mezcla de reaccin se vuelva
amarilla. La reaccin se detendra mediante la adicin de 1 ml de 0,5 M Na 2 CO 3 , y
se observara el tiempo. La OD 420 y OD 550 se registraran, y la actividad especfica
-galactosidasa se calculara como sigue: 1000 [OD 420 - 1,75 (OD 550 )] / [tiempo
(en minutos) OD 600 volumen de la muestra (en mililitros)]. (Mette, 2009)

Experimento de produccin de nisina. Produccin de nisina bajo el rgimen de

lote repetido Se llevara a cabo la activacin de E. coli en medio MRS y
posteriormente en suero de leche suplementado. Las condiciones de fermentacin
en el biorreactor sern 200 rpm, 10 mL/ min de aire, 30C, pH 6.0 y 30C. Luego de
24 h se detendra la agitacin y se esperara a que las clulas sedimentaran, se
retirara la mayor parte del medio fermentado mediante una bomba peristltica y se
administrara 1 L de medio fresco estril a base de suero lcteo suplementado. Se
continuara la fermentacin bajo las mismas condiciones, despus de 24 h se
extraera el medio y se administrara nuevamente 1 L de medio fresco suplementado y
estril para continuar con la fermentacin hasta que se cumplieran 72 h en total. La
nisina usada como inductor se administrara despus de 2 h de fermentacin en cada
caso en que se agrege nuevo medio de cultivo. Se tomaran muestras de 10 mL cada
2 h. (Pia, 2007)

Bibliografa

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Biotecnologa. Departamento de Investigacin y Posgrado en Alimentos (DIPA),
PROPAC, Facultad de Qumica, Universidad Autnoma de Quertaro. Obtenido de

http://www.uaq.mx/investigacion/revista_ciencia@uaq/ArchivosPDF/v4-n2/t6.pdf