UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

REA DE CONOCIMIENTOS EN CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO ACADMICO DE BIOLOGA MARINA

Tesis de Licenciatura
Efecto in vitro del -caroteno natural obtenido a partir de
Dunaliella salina (Chlorophyta) sobre la lnea celular de cncer
MDA-MB-231

QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL

Ttulo de Bilogo Marino

PRESENTA:
Ilhui Roco Gmez Pacheco

DIRECTOR:
Jorge Olmos Soto

LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, AGOSTO DE 2013

Dedicatoria

Mi mam
Que nunca deja de sorprenderme con lo maravillosa que es.

Abuelita Lupita
Que siempre cuido y am a todos. Te llevo siempre conmigo.

Mi abuela Toa,
El amor de mis amores. Gracias por estar siempre a mi lado.

Javier y Andrs,
El regalo ms bonito que tuve por mis padres. Los adoro.

A mi ta Laura Lilan,
Porque las batallas ms grandes, solo se pueden ganar con amor a la vida.

A mis tas Mara Elena e Ilhui,

Por inspirarme siempre a seguir estudiando.

Mi pap,
Y mis abuelos Sergio y Carlos
Por todo su cario.

Agradecimientos acadmicos

Al Dr. Jorge Olmos Soto por la direccin de esta tesis y por el apoyo brindado;
pero sobre todo, por aceptarme y darme la oportunidad de

aprender cosas

nuevas.

A la M.C. Rosala Contreras Flores tcnico del laboratorio, durante el cultivo de

Dunaliella salina y en toda mi estancia como estudiante del laboratorio. Gracias
nuevamente.
A la M.C. Silvia Viviana Pitones Rubios, por su enorme ayuda tcnica y asesora
durante la fase de cultivo celular, en la elaboracin de los ensayos y por la
bibliografa compartida. Muchas gracias sin tu ayuda no podra haber realizado
esta tesis.

Al M.C. Eduardo Morales Guerrero por toda su asesora y ayuda brindada al

realizar los anlisis por HPLC.

Al M.C. Viktor Ivn Rodrguez Abdal, por su ayuda en el lenguaje de

programacin R.

Al Dr. Jose Luis Ortiz Galindo y al Dr. No Daz Viloria, por la extensa revisin de
la tesis. Mil gracias por todo.

Al comit revisor tesis: Dr. Sergio Flores Ramrez, M.C. Marco Antonio Medina
Lpez, al Dr. No Daz Viloria y al Dr. Carlos Snchez Ortiz.

A Beti y al Dr. Alejandro Gmez por su ayuda en los trmites administrativos. A la

UABCS y al CICESE.

Agradecimientos personales
A mi mam, por todo su amor y todo el tiempo que me ha dedicado desde el da
en que nac. Muchas gracias por estar siempre a mi lado, en las buenas y en las
malas, por regaarme siempre que lo necesit, Por ensearme todo cuanto s.

A Silvia Viviana Pitones, por tu amistad, tu tiempo, tu compaa y gran ayuda no

solo acadmica sino personal. Siempre estar en deuda contigo, eres una persona
muy especial y valiosa. Gracias por todo.

A Jos Luis Ortiz Galindo, muchas gracias to por todo el cario, tiempo y apoyo,
que me has dado siempre, por ser parte de nuestra familia.

A mi ta Mara Elena Gmez Rojo, muchas gracias por todo tu cario, apoyo y
nimos. Te quiero mucho madrina.

A toda mi hermosa familia que siempre me ha apoyado desde lejos.

A las familias Norzagaray-Navarro y Silva-Cruz por ser como mi familia.

A Laura Camacho, muchas gracias por animarme a hacer la tesis en ensenada; y

por tu gran amistad. Te quiero mucho.

A Magaly Gmez, Malissa Fragoso, Angelina Lazcano, Betsab Luna, Diana

Zaleta, Mirelle Dvila, Roco Gonzlez, Casandra Glvez, Marcela Valdovinos,
Christian por su amistad.

A Ivn Rodrguez, muchas gracias por estar a mi lado.

ndice

Lista de figuras

Lista de cuadros

iiI

Lista de anexos

iii

Glosario

iv

Resumen

vi

1. Introduccin

2. Antecedentes

2.1. Los carotenoides

2.2. Dunaliella salina

2.3. Desarrollo del cncer

3. Justificacin

12

4. Hiptesis

12

5. Objetivo general

13

5.1. Objetivos particulares

13

6. Materiales y Mtodos

14

7. Resultados

20

7.1 Cultivo de Dunaliella salina

20

7.2 -Caroteno

21

7.3 Curva de crecimiento

26

7.4 Ensayo de viabilidad celular con -caroteno

26

8. Discusin

30

9. Conclusiones

34

10. Recomendaciones

35

11. Bibliografa

36

12. Anexos

41

Lista de figuras

Figura 1

Molcula de -caroteno.

Figura 2

Dunaliella salina. Contraste de fases con

fluorescencia, objetivo

Figura 3

100X.

Lnea celular MDA-MB-231. Microscopio de

Contraste de fases, objetivo 10X.

Figura 4.

10

Lnea celuar HaCat. Microscopio de Contraste

de fases, objetivo de 10X.

Figura 5.

11

Curva de crecimiento poblacional del cultivo de

Dunaliella

salina

hasta

alcanzar

la

fase

estacionaria.
Figura 6

20

Cromatogramas obtenidos por HPLC a una

longitud de onda de 450 nm.

Figura 7

22

Cromatogramas sobrepuestos del estndar y el

extracto natural de D. salina.

Figura 8

23

Curva de calibracin por HPLC para estimar la

concentracin de -caroteno en el

extracto

natural.
Figura 9

Resultados del ensayo de viabilidad celular

realizado con -caroteno sobre MDA-MB-231.

Figura 10

29

Variacin dentro del tratamiento de 2h con caroteno en la lnea celular MDA-MB-231

Figura 12

29

Resultados del ensayo de viabilidad celular

realizado con -caroteno sobre HaCat.

Figura 11

25

51

Variacin dentro de grupos con el tratamiento

de 2h con -caroteno.

52

Figura 13

Variacin dentro del tratamiento de 24h con caroteno en la lnea celular MDA-MB-231.

Figura 14

54

Variacin dentro del tratamiento de 24h con caroteno en la lnea celular MDA-MB-231:

54

1)Clulas con BS, 2) Clulas con BN.

Figura 15

Variacin dentro del tratamiento de 24h con caroteno en la lnea celular HaCat: 1)Clulas

55

HaCat con BS, 2)Clulas HaCat con BN.

Figura 16

Variacin entre grupos con el tratamiento de

24h con -caroteno. Clulas MDA-MB-231 con
BS, 2) Clulas MDA-MB-231 con BN, 3)Clulas
HaCat con BS, 4) Clulas HaCat con BN.

56

List

a de cuadros

ii

Lista de cuadros

Cuadro I

Incrementos en la concentracin de NaCl

realizados en el cultivo L.

15

Cuadro II

Esquema general del ensayo con -caroteno.

18

Cuadro III

Mediciones de absorbancia obtenidas en el

cromatgrafo HPLC al analizar el estndar
sinttico de trans -caroteno y el extracto
natural de D. salina.

24

Lista de Anexos

Anexo I

Cultivo de D. salina.

41

Anexo II

Soluciones y medios empleados para el cultivo

de las lneas celulares.

46

Anexo III

Ensayo con -caroteno.

48

Anexo IV

Ensayo colorimtrico de MTT.

50

Anexo V

Resultados
programa R.

del

ANOVA

realizado

con

el
51

iii

Glosario

Adenocarcinoma: Cncer que empieza en las clulas glandulares. Las clulas

glandulares se encuentran en el tejido que reviste algunos rganos internos y que
producen y liberan sustancias en el cuerpo. La mayora de los cnceres de mama,
pncreas, pulmn, prstata y colon son adenocarcinomas (INC, 2013).

Antioxidante: Es una molcula capaz de retardar o prevenir la oxidacin (prdida

de electrones) de otra molcula, sin llegar a perder su estabilidad (Holum, 1999).

Pro-oxidante: Es una molcula capaz de reducir a otra molcula (Holum, 1999).

Medio suplementado: Medio que ha sido complementado o enriquecido con suero

fetal bovino; y que por ello cuenta con los nutrientes, cofactores y hormonas de
crecimiento necesarios para el mantenimiento de un cultivo celular (Pitones-Rubio
y Olmos-Soto, 2010).

Confluencia: La cantidad de clulas que crecen sobre la superficie de una caja o

placa de cultivo; esta generalmente se expresa en porcentajes (Langdon, 2004).

Cultivo primario: El cultivo iniciado a partir de clulas, tejidos u rganos tomados

directamente de un organismo (Langdon, 2004).

Pase: Consiste en tomar una fraccin de clulas a partir de un cultivo establecido

para colocarlas en una nueva placa o caja que cuenta con el medio y los
nutrientes necesarios para poder iniciar un nuevo sub-cultivo celular (Langdon,
2004).

iv

Lnea celular continua: Son clulas de un tipo nico (humano, animal o vegetal),
que han sido sub-cultivadas a partir de un cultivo primario del cual derivan. Estas
clulas tienen alteraciones genticas que les dan la capacidad de proliferar
indefinidamente si se les brindan las condiciones ambientales y los nutrientes
esenciales para su mantenimiento (Langdon, 2004).

Resumen

Dunaliella salina es una microalga Cholorophyta produce de forma natural grandes

cantidades de -caroteno. En humanos se ha observado que esta molcula tiene
distintas funciones biolgicas como estabilizador de membrana, antioxidante y
precursor de la vitamina A; adems puede actuar como quimio-protector y
anticancergeno. Por ello el objetivo de este trabajo fue demostrar si el -caroteno
tiene un efecto in vitro sobre la supervivencia de la lnea celular para cncer de
mama MDA-MB-231. Para ello se realiz un ensayo en el que se aplicaron dos
tratamientos de 6 g/l de -caroteno, cada uno con dos condiciones de
incubacin con distintas duraciones de tiempo (2 y 24 horas). Los tratamientos
consistieron en un extracto natural obtenido a partir de D. salina y en trans caroteno sinttico. Ambos tratamientos disminuyeron significativamente la
supervivencia de las clulas de MDA-MB-231; sin embargo el efecto se vio
potenciado cuando se aplic -caroteno de origen natural. El mayor efecto se
observ con un tiempo de incubacin de 2 horas, en el cual la supervivencia de las
clulas de MDA-MB-231 fue de un 27.9 %.

vi

1 Introduccin
En los ocanos del mundo habita una gran diversidad de microorganismos
conformada

por

bacterias,

virus,

hongos,

protozoarios

algas.

Estos

microorganismos producen en conjunto, un reservorio natural de sustancias bioactivas, que son producto de su metabolismo primario y secundario. Estas
sustancias son muy novedosas, ya que tienen amplias aplicaciones en la industria
y en las ciencias de la salud (Ireland et al., 1993; Paniagua-Michel, 2009).

Entre estos microorganismos se encuentra Dunaliella salina, una microalga

Chlorophyta que es uno de los eukariotas ms extremfilos que se conoce y que
bajo condiciones de estrs salino, alta irradianza y falta de nutrientes, produce
grandes cantidades de -caroteno, para proteger la clorofila a y el DNA nuclear
(Ben-Amotz et al., 1987; Borowitzka, 1990; Olmos-Soto et al., 2002; Ben-Amotz et
al., 2009).
El -caroteno es una molcula que presenta una fuerte actividad antioxidante,
capaz de captar y destruir los radicales producidos por la quimioterapia durante el
tratamiento del cncer. Por esta razn, se le atribuye la propiedad de agente
quimio-preventivo y anticancergeno (Bendich y Olson, 1989; Lamson y Brignall,
1999). A este caroteno, tambin se le ha atribuido la capacidad de detener el
proceso de metstasis en algunas clases de cncer, como lo son: el de piel, boca
y pulmn (Venugopal, 2009). Sin embargo, en lo que concierne a la aparicin de
este ltimo tipo de cncer, hay estudios que consideran que el consumo del caroteno junto con el tabaco y el alcohol es un factor de riesgo (Leo y Lieber,
1999).

En Mxico el tipo de cncer ms comn en mujeres mayores de 20 aos es el

carcinoma de mama (CaMa) (INEGI, 2013). Debido a lo anterior, en este trabajo

se busca probar si el -caroteno producido por D. salina, al que ya se le han

atribuido actividades anticancergenas (Borowitska, 1990; Ben-Amotz, 2009;
Venugopal, 2009); presenta un efecto in vitro sobre una lnea celular de cncer de
mama.

2 Antecedentes

2. 1 Los carotenoides
Los carotenoides son una familia de pigmentos de color amarillo- naranja o rojo
que proveen de un intenso color a muchas especies de organismos (Asker et al.,
2012). Estos pigmentos son los ms ampliamente distribuidos en la naturaleza, ya
que se les encuentra en las plantas, las bacterias, las algas, los hongos y los
animales; sin importar si se trata de especies marinas, terrestres o de agua dulce
(Mnguez-Mosquera et al., 2008; Venugopal, 2009). Hasta la fecha se han
descubierto ms de 700 carotenos distintos en la naturaleza (Asker et al., 2012),
entre ellos el -caroteno.

2. 1. 1 Funcin biolgica
En los organismos fotosintticos los carotenoides sirven como pigmentos
accesorios, ayudando a absorber la luz y transfiriendo la energa a la clorofila
(Asker et al., 2012). Otra funcin de los carotenoides en organismos fototrficos y
no-fototrficos, es la de proteger a las clulas contra daos en el ncleo causados
por la produccin de radicales libres, y que puedan originar mutaciones u otras
alteraciones genticas (Bendich y Olson, 1989).

En los miembros del reino animal incluyendo a los humanos, vacas, aves, peces y
algunos crustceos, los carotenoides no pueden ser sintetizados y tienen que ser

adquiridos en la dieta. Algunas de sus principales funciones son: Actuar como un

precursores de la Vitamina A en todas sus formas activas (retinol, retinal y cido
retinoico) (Holum, 1999; Venugocopal, 2009; Asker et al., 2012), como
antioxidantes y pro-oxidantes (Krinsky, 1988; Bendich y Olson, 1989).

Adems, en los seres humanos los carotenoides son constituyentes normales de

la sangre y algunos tejidos. As, en el cuerpo de una persona bien nutrida la
cantidad total de carotenoides vara de 100-150 mg. De ese total el 1% est
presente en el suero sanguneo, el 80-85% en el tejido adiposo, el 8-12% en el
hgado (8-12%) y el 2-3% en los msculos. Los carotenoides que se encuentran
en mayor cantidad en el suero humano son el -caroteno, el -caroteno, la
cryptoxantina, el licopeno y la lutena de los cuales el -caroteno es el ms
abundante (15 al 30%) (Bendich y Olson, 1989).

2. 1. 2 Uso de los carotenoides en la industria y ciencias de la salud

Los carotenoides se emplean en la elaboracin de alimento para aves de corral,
para organismos cultivados por acuacultura y como colorante en la manufactura
de alimentos para humanos (Venugopal, 2009). Tambin se emplean como
complemento nutricional y fuente de provitamina-A, de las cuales el -caroteno
tiene la mayor actividad. Tambin se les emplea como aditivo en cosmticos
(Holum, 1999).

En ciencias de la salud hay estudios que muestran que en humanos, los

carotenoides reducen los niveles de colesterol, homocistena, agregacin
plaquetaria y presin sangunea, teniendo una funcin cardio-protectora debido a
su alta actividad antioxidante. Hay evidencia que indica, que tambin ayudan a
prevenir la aparicin de lceras gstricas, combatir enfermedades neurodegenetarivas, a la activacin de las clulas T del sistema inmune, y que protegen

a las clulas- de la presencia de radicales libres en pacientes con diabetes

mellitus (Holum, 1999; Herchberg, 2005; Mnguez-Mosquera et al., 2008;
Venugopal, 2009).

En relacin al cncer existen estudios epidemiolgicos y oncolgicos, en los que

se muestra que algunos carotenoides como la Aztaxantina, el Lycopeno y el caroteno

tienen

una

actividad

anticancergena,

ya

sea

como

agentes

quimiopreventivos contra el desarrollo del cncer de piel, boca, pulmn y seno,

como inhibidores del proceso de metstasis en casos de cncer de hgado
(Dimitrov et al., 1988; Mnguez-Mosquera et al., 2008; Emeish, 2012).
Adems, se ha observado que la administracin de -caroteno de origen natural
potencia el efecto de la quimioterapia y la radioterapia, e incluso incrementa la
supervivencia en pacientes enfermos de cncer (Lamson y Brignall, 1999).
2. 1.3 -caroteno: Molcula y propiedades generales
El -caroteno (C40H56) tiene un peso molecular de 536.9 umas y es uno de los
carotenoides ms ampliamente distribuido en la naturaleza (Figura 1). Es un
hidrocarburo poli-insaturado compuesto por dos molculas de retinol. Al tratarse
de una molcula lipoflica, es insoluble en soluciones acuosas a menos que
tengan cierto grado de polaridad, como los solventes orgnicos: acetona y
diclorometano (Venugopal, 2009).
La presencia de dobles enlaces conjugados en el -caroteno hace que presente
ismeros geomtricos cis y trans (E/Z), que pueden nter-convertirse cuando se
encuentran en solucin y que presentan sus enlaces dobles en distintas
posiciones. Estos cambios en la geometra afectan el punto de fusin, el color, la
solubilidad, la estabilidad y un poco sus propiedades pticas de absorcin de luz

(Venugopal, 2009). As, aunque presentan un mximo de absorcin a una longitud

de onda de 450 nm, esta es interferida por la presencia de sus anillos y enlaces
dobles (Mnguez-Mosquera et al., 2008). Cuando la molcula del -caroteno se
encuentra en solucin con presencia de luz y oxgeno se oxida, puede polimerizar
y actuar agente quelante, adems de formar ismeros (Venugopal, 2009).

Figura 1. Molcula de -caroteno

2. 2 Dunaliella salina

2. 2. 1 Taxonoma
De acuerdo al ITIS (2003), la clasificacin de la especie es la siguiente:
Divisin

Chlorophyta

Clase

Chlorophyceae

Orden

Volvocales

Family

Dunaliellaceae

Gnero

Dunaliella

Especie

Dunaliella salina (Teodoresco, 1905).

Figura 2. Dunaliella salina. Contraste de fases con fluorescencia, objetivo

100X.

2. 2. 2 Caractersticas generales de la especie

D. salina es una microoalga verde unicelular que tiene una forma ovoide, dos
flagelos apicales y un color que vara de verde-amarillo a rojo profundo (Parra et
al., 1990). Esta microalga pertenece al gnero Dunaliella conformado por 27
especies, las cuales comparten las siguientes caractersticas: Carecen de una
pared celular rgida de polisacridos, estn rodeadas por una delgada membrana
plasmtica cubierta por una capa mucilaginosa, tienen un solo cloroplasto,
pirenoide, un ncleo y nuclolo (Borowitzka, 1990; Wilcox y Graham, 2000; BenAmotz et al., 2009). Sin embargo solo D. salina y Dunaliella bardawil poseen la
capacidad de acumular grandes cantidades de -caroteno y glicerol en su interior,
cuando se encuentra en ambientes extremos hipersalinos y en los que hay una
intensa radiacin solar (Olmos-Soto et al., 2012).

2. 2. 3 Estudios nutricionales con Dunaliella

Entre los antecedentes ms importantes se encuentran los de Ben-Amotz y
colaboradores (1987) y Ben-Amotz y Avron (1992). En estos trabajos se encontr
que D. salina produce una combinacin de ismeros: 15-cis--caroteno (10%), 9-

cis--caroteno (41%), trans -caroteno (42%) y 2 ismeros sin identificar (7%).

Ben-Amotz y Levi (1996) realizaron un estudio in vivo con humanos y observaron

que la mezcla isomrica de -caroteno producida por Dunaliella bardawil fue ms
absorbida, con respecto a otras formas de -caroteno trans de origen sinttico que
fueron administradas. Tambin descubrieron, que tuvo una actividad antioxidante
ms potente.

Diversos investigadores (Borowitska, 1990; Venugopal, 2009), mencionaron a D.

salina como una fuente importante de -caroteno y complemento nutricional para
humanos, por su fuerte actividad pro vitamina A, entre otros beneficios.

2. 2. 4 Estudios previos en el noroeste de Mxico

Se han aislado e identificado bioqumicamente varias cepas locales pertenecientes
al gnero Dunaliella, entre ellas D. salina en lagunas hipersalinas costeras
ubicadas en los estados de Baja California (San Quintin, La Salina) y Baja
California Sur (Salina de Guerrero Negro) (Gutirrez-Milln, 1996; SnchezCastrejn, 1998).

En el 2004, Capa-Robles (2004) estudi la fisiologa de la especie para inducir la

produccin de -caroteno con fines comerciales. Para ello, estudi el efecto de la
salinidad, as como la presencia o ausencia de vitaminas en condiciones no
estresantes de cultivo; adems de que identific la presencia de tres tipos de caroteno: 1)trans--caroteno, 2)-caroteno y 3)de tipo no trans.

Olmos y colaboradores (2002) identificaron molecularmente a la especie por

medio del mtodo de intron-zising finger-printing, demostrando que las especies
de Dunaliella tiene un tamao especfico, de 18S ADNr (Olmos-Soto et al., 2012).

Contreras-Flores (2005) estudi la variabilidad intraespecie y en funcin a ella

evalu la acumulacin de -caroteno bajo distintas condiciones de cultivo.

2. 3 Desarrollo del cncer

Cncer es el nombre general que se da a ms de 100 enfermedades distintas pero

que presentan una caracterstica: Todas se originan a partir de clulas anormales
o neoplsicas que proliferan de forma continua y descontrolada, formando masas
de tejido llamados tumores. Algunas de estas clulas adquieren la habilidad de
invadir nuevos tejidos y rganos causando la enfermedad del cncer (INC, 2013).

La proliferacin celular que da origen al cncer es ocasionada por una alteracin

de los eventos que comprenden el ciclo celular, y que dependen de los niveles
apropiados de la transcripcin y traduccin de ciertos genes, cuyas mutaciones o
fallas han sido estrechamente relacionadas con el desarrollo del cncer. Estos
genes se dividen en dos clases: 1) Los proto-oncogenes, o genes cuyas protenas
estimulan la divisin celular e inhiben la muerte celular programada o apoptosis; y
2) Los genes supresores de tumores, cuyas protenas restringen el crecimiento
celular o conllevan a la apoptosis (Lodish et al., 2002). Las mutaciones en estos
genes son ocasionadas por diversos factores que daan el ADN nuclear (Baba,
2007).

Los factores carcingenos pueden ser de tipo fsico, como la radiacin UV-A y UVB, los rayos X, y rayos Gama; qumico, debido a la presencia de epxidos,
nitrosaminas, hidrocarburos aromticos y minerales (As, Cr, Cd y Ni); biolgico, lo
que incluye a sustancias liberadas por parsitos, plantas, o microorganismos, o
que se encuentran en alimentos y medicinas (Flavonoides, taninos, Ochratoxina A,
caspacianina); y gentico (Baba, 2007). Los factores genticos pueden tener

distintos orgenes como son: mutaciones heredas en ciertos genes (genes BRCA1 y BRCA-2), la accin de algunos tipos de virus (Papilomavirus, herpesvirus y
adenovirus), y la liberacin de especies reactivas de Oxgeno ( 1O2 ) y otros
radicales libres (1OH, -NO) durante el metabolismo celular (Baba, 2007; Musolino
et al., 2007; Fiaschi y Chiaruggi, 2012).

El nombre que se le da a cada tipo de cncer est determinado por el tipo de

tejido y rgano en el cual se origina. As, existe cncer de seno, piel, de hgado,
hueso y pulmn, entre muchos otros (INC, 2013).

2. 3. 1 Cncer de mama
El cncer de mama (CaMa) es causado cuando hay una proliferacin acelerada,
desordenada y no controlada de las clulas de los tejidos de la glndula mamaria,
y es causado por mutaciones que ocurren en los genes que actan normalmente
suprimiendo o estimulando la continuidad del ciclo celular (Rodrguez-Bandala,
2010).

De los tipos de cncer que existen, el CaMa junto con el cncer de prstata, son
de los ms agresivos, ya que hacen metstasis en los huesos y la mayora de los
pacientes mueren cuando esto sucede (Kowalski et al., 2003).

2. 3. 2. Incidencia del Cncer de Mama en Mxico

El cncer es una enfermedad que en muchos casos va asociada a la edad y a la
senectud, por lo que desde el ltimo siglo ha ido incrementndose junto con la
edad de las personas y est en continuo aumento; siendo el cncer de mama uno
de los ms comunes en el mundo (WCR, 2008). En Mxico las cifras son
alarmantes, ya que desde 2010 el CaMa es el tipo de cncer ms comn en
mujeres mayores de 20 aos (24%) y actualmente es la segunda causa de muerte

natural en mujeres de 35 aos y ms (INEGI, 2013).

2. 4 Lneas celulares

MDA-MB-231 (ATCC HTB-26)

Esta lnea celular fue aislada a partir de una paciente femenina de 51 aos, de
origen caucsico, que presentaba un adenocarcinoma grado III de glndula de
mama; por lo que fueron elegidas como modelo para estudiar el efecto en ellas del
-caroteno de origen natural. Estas clulas carecen de la capacidad de
diferenciarse, no forman tejidos, presentan un nmero cromosmico alterado (6469) y su forma es epitelial adherente (Cailleau et al., 1974).

Figura 3. Lnea celular MDA-MB-231. Microscopio de Contraste de fases,

objetivo 10X

10

HaCat
Es una lnea celular inmortal de queratinocitos humanos (QHA), cuyas clulas
conservan la capacidad de diferenciarse y crecer de forma semejante al tejido de
la piel humana (NHEQ) (Lehman, 1997). Debido a sus caractersticas las clulas
de esta lnea fueron empleadas como modelo, para ver el efecto del -caroteno en
clulas normales.

Figura 4. Lnea celuar HaCat. Microscopio de Contraste de fases, objetivo de

10X.

11

3 Justificacin
Muchos de los tratamientos contra el cncer en general y no solo de mama, son
altamente invasivos y poseen muchos efectos secundarios. Por ello encontrar
biomolculas de origen natural como el -caroteno producido por D. salina que
puedan actuar como agentes preventivos, o curativos en el tratamiento, ya sea
que inhiban la proliferacin celular descontrolada o puedan inducir la apoptosis de
las clulas neoplsicas, sin causar efectos tan dainos como la quimio o
radioterapia, an es una panacea en la lucha contra todos los tipos de cncer que
existen.
Por otro lado, hay estudios previos que indican que el -caroteno puede ser un
factor que predisponga a algunos tipos de cncer y otros que indican que tiene
una funcin preventiva. Este estudio puede ayudar a probar in vitro si esta
molcula: 1) Tiene un efecto en la supervivencia de las clulas de cncer de
mama y 2) Si su origen sinttico o natural causa alguna diferencia.

4 Hiptesis

Debido a que en otras especies de Dunaliella (Dunaliella bardawil) se demostr

una mayor absorcin y una actividad antioxidante ms potente con respecto al caroteno de origen sinttico; el -catoteno natural obtenido a partir de Dunaliella
salina puede tener un mayor efecto en la supervivencia de las clulas MDA-MB231 que -caroteno de origen sinttico.

12

5 Objetivo General
Demostrar el efecto que tendr el -caroteno de origen natural presente en un
extracto obtenido a partir de la microoalga D. salina en la supervivencia de la lnea
celular MDA-MB-231.

5. 1 Objetivos particulares

-Estandarizar una fase mvil que permita detectar y cuantificar por medio de
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), el -caroteno sinttico (comercial)
y de origen natural.
-Cuantificar el -caroteno natural presente en el extracto natural de D. salina.
-Evaluar el efecto del -caroteno natural y sinttico en la supervivencia de la lnea
celular MDA-MB-231.
-Evaluar si hay un efecto diferencial entre el -caroteno natural y sinttico en la
lnea celular HaCat.
-Observar si el tiempo de incubacin con ambos tratamientos con -caroteno,
tambin causa un efecto sobre ambas lneas celulares.

13

6 Materiales y Mtodos

6. 1 Dunaliella salina
La cepa de D. salina (UTEX LB2538) empleada para este estudio, proviene de un
lugar conocido como La Salina, localizada 35 km al norte de la ciudad de
Ensenada, B.C. (Contreras-Flores, 2005) y forma parte de la coleccin del
laboratorio de Microbiologa Molecular del Centro de Investigacin Cientfica y de
Educacin Superior de Ensenada, B. C. lugar en donde se realiz este trabajo.

6. 1. 1 Condiciones iniciales de Cultivo

En dos matraces Erlenmeyer de 250 ml se colocaron por separado dos inculos
iniciales de aproximadamente 13,800 clulas de D. salina a los que se les nombr
como cultivos F y L . A cada cultivo se les agreg 50 ml de un medio nutritivo, el
cual fue elaborado con la mezcla de los de medios cultivo para microalgas F2
(Guillard y Ryter, 1962) y Erdschreiber's (1:1) a una concentracin 1.0 M de NaCl.
Los cultivos F y L fueron mantenidos con un fotoperiodo de luz-oscuridad de 12
horas, una temperatura de 25C y un flujo luminoso de 20 quanta m-2 seg-1 hasta
que alcanzaron su fase de crecimiento estacionario. Durante este periodo, cada
cultivo fue agitado manualmente por la maana y por la tarde, para favorecer el
intercambio gaseoso (Ver ANEXO I).

6. 1. 2. Clculo de la densidad poblacional

Cada tres das se realizaron conteos directos a los cultivos F y L al microscopio
ptico con ayuda de una cmara de Neubauer. Para ello, se tom una alcuota de
1 ml a partir de cada cultivo y se le agregaron 70 l de solucin de Lugol cido
para inmovilizar las clulas y contarlas.

14

Para calcular la densidad celular del cultivo se utiliz la siguiente ecuacin:

D= C * 104

En donde:
D= Densidad del cultivo en clulas/ml
C= Nmero de clulas en toda una cuadrcula de 1mm2
104= Factor de dilucin
(Voltolina-Lobina et al., 1989).

6. 1. 3. Induccin
Una vez que se logr la fase estacionaria del cultivo, se eligi al cultivo F como
control, mientras que el cultivo L fue tomado como experimental. Al cultivo
experimental (L) se le realizaron incrementos graduales de salinidad en el medio
nutritivo hasta llegar a una concentracin final de 3.0 M NaCl en el matraz y
adems se increment el flujo luminoso a 26 quanta m-2 seg-1 sin alterar la
temperatura. Al cultivo control F, no se le alteraron las condiciones iniciales. Esta
fase tuvo una duracin de 28 das.
Cuadro I. Incrementos en la concentracin de NaCl realizados en el cultivo L
Da de cultivo

Concentracin Molar NaCl

NaCl adicionado

12

1.5 M

2.61 g

15

2.0 M

1.46 g

18

2.5 M

1.32 g

21

3.0 M

1.61 g

15

6. 2 Betacaroteno
En este estudio se emplearon dos fuentes de -caroteno: Una de origen natural
contenido en un extracto de D. salina obtenido con solventes orgnicos; cuya
elaboracin no se describe ampliamente por motivos de patente. El segundo tipo
fue -caroteno trans de origen sinttico, fabricado por la empresa Sigma.

6. 2. 1 Deteccin y cuantificacin por HPLC

Para cuantificar e identificar el -caroteno natural y sinttico se emple la tcnica
de Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). El anlisis se realiz en un
cromatgrafo Hewlett Packard serie 1100 con inyector manual, un sistema
cuaternario para solventes y un detector mltiple para longitud de onda. Se
emple una columna Zorbax C8 de fase inversa con un tamao de partcula de 5
m, una elucin isocrtica con metanol al 100% a una velocidad de flujo de 0.5
ml/min y 25 minutos de corrida.
Para cuantificar el -caroteno natural presente en el extracto, se realizaron
diluciones con metanol al 100% del estndar sinttico (0.5, 1, 1.5 y 3 g/l) con
las cuales se obtuvo una curva de calibracin con las mediciones obtenidas en el
cromatgrafo.

6.3 Cultivo celular

6. 3. 1 Condiciones de crecimiento
Para su crecimiento, las lneas HaCat y MDA-MB-231 (ATTC HTB-26) fueron
sembradas en cajas de cultivo (Corning) con 7 ml
(GIBCO)

del medio RPMI-1640

suplementado con 10% de SFB (Suero fetal bvino) inactivado

16

(GIBCO) y 1% del antibitico comercial anti-ant (Invitrogen). Las lneas

celulares siempre fueron incubadas en un ambiente estril, a una temperatura de
37C y una atmsfera hmeda con 4% de CO2 (Ver Anexo II).
6. 3. 2 Desprendimiento de lneas celulares
Cuando los cultivos presentaron una confluencia aproximada de un 85%, las
clulas fueron lavadas con 2 ml PBS y se les aplic un tratamiento con una
solucin de tripsina-EDTA y Verseno (1:1) (1 ml) (Ver Anexo II). Enseguida se
tom una porcin de las clulas desprendidas, y se les sembr en una caja nueva
con medio RPMI-1640 suplementado. Para realizar los ensayos posteriores con el
-caroteno, solo se emplearon las clulas obtenidas a partir de un cuarto pase,
siguiendo lo propuesto por Pitones-Rubio y Olmos-Soto, 2010.

6. 3. 3. Curva de crecimiento
Para estimar la cantidad de clulas adecuada para realizar el ensayo con caroteno fue necesario obtener una curva de crecimiento basada en la
confluencia. Para esto se utiliz una placa de cultivo de 96 pozos (Corning), en
donde se colocaron en cada pozo, diferentes cantidades de clulas de MDA-MB231 (1000, 2000, 3000, 4000 y 5000) en 100 l de medio RPMI suplementado, las
cuales fueron incubadas durante 4 horas a una temperatura de 70C y una
atmsfera hmeda de CO2 al 4%. Transcurrido ese tiempo, a las clulas se les
realiz el arresto celular, para lo cual se les cambi el medio a RPMI sin
suplementar. Despus con ayuda de un microscopio invertido Axiovert Zeiss se
observ de forma visual la confluencia celular. De inmediato, las clulas
nuevamente fueron incubadas durante 20 horas bajo las mismas condiciones de
crecimiento. Al cabo de ese tiempo la confluencia fue revisada nuevamente.

17

6. 3. 4. Ensayo con -caroteno

El ensayo estuvo compuesto por dos tratamientos sobre cada uno de los linajes
celulares (MDA-MB-231 y Hacat). El primer tratamiento consisti en una solucin
elaborada con -caroteno de origen natural; mientras que el segundo en una
solucin realizada con -caroteno de origen sinttico. Para cada tratamiento hubo
dos condiciones en el tiempo de incubacin: 2 y 24 horas. Los tratamientos con la
condicin de 2 horas (h) iniciaron 22h despus del arresto celular; mientras que
los tratamientos con la condicin

de 24h se aplicaron sin esperar a que se

cumpliera un tiempo previo al arresto celular (Cuadro II). El ensayo fue realizado
en multi-placas para cultivo celular de 96 pozos (Corning), en los que se
colocaron 5,000 clulas del linaje celular correspondiente, y a las que se les
aplicaron 100 l de cada uno de los dos tratamientos de -caroteno con sus
respectivas condiciones. Como control positivo se utiliz DMSO al 100% y como
control negativo medio RPMI sin suplementar. El ensayo se realiz en condiciones
de oscuridad, por triplicado para cada tratamiento y condicin, a 37C en una
atmsfera hmeda con 4% de CO2. Para medir el efecto del -caroteno de origen
natural y sinttico en la supervivencia celular, fue llevado a cabo el ensayo
colorimtrico de MTT, de acuerdo al mtodo de Pitones-Rubio y Olmos-Soto
(2010) (Ver Anexos III y IV).
Cuadro II. Esquema general del ensayo con -caroteno
Lnea celular
MDA-MB-231

HaCat

Tratamientos con sus condiciones de incubacin

1. -caroteno natural
2h

24 h

2. -caroteno sinttico
2h

24 h

-caroteno natural

-caroteno sinttico

2h

2h

24 h

24 h

18

6.3.5 Anlisis estadsticos

Las absorbancias obtenidos en el ensayo final de MTT fueron analizadas con los
programas Calc de Libre Oppen Office y con R (Ihaka y Gentleman, 1996). En el
primero, se realizaron los estadsticos bsicos y se prob la normalidad y
homocedasticidad de los datos. Con el programa R se realizaron varios anlisis de
variancia (ANDEVA), mediante el uso de matrices, con el fin de establecer si
existi una diferencia entre los tratamientos de -caroteno con base al estadstico
F.

19

7 Resultados

7.1 Cultivo de Dunaliella salina

La fase de cultivo inicial, dur 12 das. Los cultivos llegaron a una fase
estacionaria y alcanzaron un nmero mximo de 410,000 y 421,250 clulas/ml
(Ver Anexo V) al cabo de 9 das de cultivo. Durante esta fase las clulas de D.
salina midieron en promedio: 9-11m de largo, presentaron una coloracin verde y

Densidad poblacional (Cl/ml)

con una forma ligeramente ovalada.

500000
400000
Cultivo F

300000

Cultivo L

200000
100000
0
1

12

Da de Cultivo

Figura 5. Curva de crecimiento poblacional del cultivo de Dunaliella salina

hasta alcanzar la fase estacionaria

El proceso de betacarognesis en el cultivo L de D. salina fue completamente

visible hasta el da 37 de cultivo. En esta fase las clulas incrementaron su
tamao, adquirieron una forma redonda, perdieron sus flagelos y presentaron
grandes glbulos de -caroteno y glicerol. El cultivo experimental L cambi su
coloracin de verde a amarillo, y de este a rojo en el da 40 de cultivo.

20

7.2 -caroteno

En los cromatogramas obtenidos por HPLC el -caroteno present su mayor pico

de absorcin a una longitud de onda de 450 nm. Al analizar el estndar sinttico
se observ un pico mayor correspondiente al trans -caroteno, el cual tuvo un
8.105 min. En el extracto natural, se identific un pico muy semejante, pero con un
tiempo de retencin de 8.432 min. (Figura 6). Sin embargo, al sobreponer los
cromatogramas obtenidos con dos diluciones del estndar y una muestra del
extracto natural, se pudo confirmar la presencia trans -caroteno en D. salina tal y
como se puede ver en la Figura 7.

21

Figura 6. Cromatogramas obtenidos por HPLC a una longitud de onda de

450 nm. A) Estndar de trans -caroteno, B) Extracto natural de D. salina y
C) Blanco de metanol al 100%

22

Figura 7. Cromatogramas sobrepuestos del estndar y el extracto natural

de D. salina. Las lneas punteadas () corresponden al estndar sinttico,
mientras que la lnea continua inferior (__) al extracto natural.

23

En el siguiente cuadro se muestran los datos de absorbancia obtenidos en el

cromatgrafo al analizar el estndar sinttico del trans -caroteno, as como las
concentraciones de -caroteno estimadas en distintas diluciones del extracto
natural de D. salina:

Cuadro III. Mediciones de absorbancia obtenidas en el cromatgrafo HPLC al

analizar el estndar sinttico de trans -caroteno (ES) y el extracto natural de
Dunaliella salina (BN).

Fuente de

Concentracin -caroteno rea (mAU*min)

-caroteno

(g/l)

ES1

0.5

227.682

ES2

0.75

673.028

ES3

1.5

1759.24

ES4

3518

BN1

0.64

513.841

BN2

2.95

3511.8

BN3

4.21

5150.46

24

En la figura 8 se muestra la curva de calibracin obtenida a partir de las

mediciones anteriores con el estndar sinttico y el extracto natural. Esta curva
present una relacin lineal, en cuya ecuacin de la recta se obtuvo una r2 de
0.99796 dando certeza del mtodo de cuantificacin empleado.

rea cromatograma (mAU*min)

6000

y = 1298.6x - 322.26
R = 0.998

5000

Estndar
sinttico

4000

BN1

3000

BN2

2000
BN3

1000
0
0

Concentracin betacaroteno (ug/ul)

Figura 8. Curva de calibracin por HPLC para estimar la concentracin de

-caroteno en el extracto natural

25

7.3 Curva de crecimiento

Al realizar la curva, se determin que la cantidad ptima de clulas para realizar

los ensayos fue de 5,000 clulas debido a las confluencias iniciales y finales
obtenidas, como se puede observar en el siguiente cuadro:

Cuadro IV. Resultados obtenidos para la curva de crecimiento con la lnea

celular MDA-MB-231.

MDA-MB-231

Clulas/ml

Confluencia 4h

Confluencia 20h

1000

10%

20%

2000

15-20%

35%

3000

20-25%

50%

4000

30-35%

65-70%

5000

40-45%

85-90%

7.4 Ensayo de viabilidad celular con -caroteno

Al analizar estadsticamente los resultados obtenidos, los datos presentaron en

todos los casos una distribucin normal, al realizar intervalos de confianza para un
de 0.05.
7.4.1 Tratamiento de -caroteno: 2 horas
En la lnea celular MDA-MB-231 el -caroteno natural tuvo un fuerte efecto, ya que
la supervivencia fue del 27.9%, contra una supervivencia del 64.45% originado por
el trans -caroteno sinttico (Figura 9). Al realizar el ANDEVA se obtuvo una F=

26

1148.3 con un valor de P=4.45e-6 (P <0.05). Esto demostr que la diferencia fue
estadsticamente significativa entre tratamientos (Ver Figura 11 en Anexo 5). Al
comparar contra el control interno de la propia lnea celular MDA-MB-231 (control
negativo) nuevamente existi diferencia significativa. Adems la diferencia ms
grande se present en las clulas tratadas con -caroteno natural.

En la lnea celular HaCat, la supervivencia fue de un 96.04% y de un 89.13% al

ser tratadas con el -caroteno natural y sinttico respectivamente (Figura 10). El
ANDEVA realizado indic que no existi una diferencia significativa entre la
supervivencia de las clulas HaCat tratadas con ambas fuentes de -caroteno
(Figura 12).

Por medio de una cuarta comparacin entre ambas lneas celulares (MDA-MB-231
y HaCat) tratadas con -caroteno (natural y sinttico) durante 24h, se tuvo una
F=55.526 con una P= 1.065e-6 (P<0.05); por lo que nuevamente se encontr una
diferencia estadsticamente significativa. Esto se puede observar con mayor
detenimiento en la Figura 13, en donde se ve una marcada diferencia entre grupos
y en el caso de MDA-MB-231 entre tratamientos.
7. 4. 2 Tratamiento de -caroteno: 24 horas
En las clulas de MDA-MB-231 que fueron sometidas al de -caroteno natural
durante 24h, hubo una supervivencia del 70.98%; mientras que al ser tratadas con
el de origen sinttico fue de un 96.74% (Figura 9). Al realizar el ANDEVA se obtuvo
una F=474.32 con un valor de P=2.63e-6 (P<0.05), por lo que existi una
diferencia entre ambos tratamientos (Ver figura 14 en Anexo V). Al comparar
nuevamente contra el control interno de la lnea celular, nuevamente existi
diferencia significativa, y la diferencia ms grande se present entre las clulas
MDA-MB-231 control interno y las tratadas con -caroteno natural, corroborando el

27

resultado anterior (Ver Figura 17).

En la lnea celular HaCat la supervivencia fue de un 79.71% para el -caroteno
natural y 83.3% para el sinttico durante 24 horas (Figura 10). El ANDEVA indic
que no existi una diferencia significativa entre ambas condiciones (Figura 15).
Sin embrago, al realizar una cuarta prueba considerando a las clulas de control
interno para HaCat, se encontr diferencia significativa con un valor de F=20.878
con una P=0.00019 (P< 0.05). En este caso la mayor variacin se pudo observar
entre las clulas del control negativo y las clulas tratadas con -caroteno
sinttico.
Al comparar los resultados de ambas lneas celulares (MDA-MB-231) tratadas con
ambos tipos de -caroteno por 24 horas, nuevamente se encontr una diferencia
entre los tratamientos. Se obtuvo una F=30.198 con un valor de P=0.001 (P<0.05).
Ver Figura 16, en el Anexo V.
Finalmente, de acuerdo a los resultados obtenidos en ambos tratamientos con caroteno (2 y 24 horas), se acepta la hiptesis planteada en este trabajo.

28

120
% Supervivencia

100
80

etacaroteno Natural

60

Betacaroteno Sinttico

40

Control

20

0
24 horas

2 horas

Tratamiento despus de arresto

Figura 9. Resultados del ensayo de viabilidad celular realizado con -caroteno sobre
MDA-MB-231.

120

Supervivencia (%)

100
80

etacaroteno Natural

60

Betacaroteno Sinttico

40

Control

20
0
24 horas

2 horas

Tratamientos despus de arresto celular

Figura 10.Resultados del ensayo con -caroteno sobre HaCat

29

8 Discusin
Los resultados obtenidos en el ensayo mostraron un claro efecto del -caroteno de
origen natural sobre las clulas de cncer de mama MDA-MB-231, y que adems
fue significativamente mayor con respecto al efecto que caus el trans -caroteno
de origen sinttico. Con base en este resultado podramos platearnos la siguiente
pregunta: De qu forma puede interactuar la molcula de -caroteno con las
clulas cancergenas para causarles una disminucin de su supervivencia? Una
forma podra ser por medio de su actividad antioxidante (Dimitrov et al., 1988;
Bendich y Olson, 1989; Mnguez-Mosquera et al., 2008).

En 1924 se descubri que las clulas cancergenas presentan una alteracin en el

metabolismo celular, llamado efecto Warburg y que las distingue de las clulas
normales. Debido a esta alteracin las clulas de cncer llevan a cabo la gilclisis
anaerbica (convirtiendo la glucosa en lactato) para obtener su energa y realizar
sus actividades vitales (Lehninger, 1995; Dang, 2012). Sin embargo, este proceso
es menos eficiente, de forma que las mitocondrias de las clulas cancergenas
deben trabajar ms y por ende tienen una mayor actividad. Cada vez que las
mitocondrias llevan a cabo sus actividades nuevamente liberan especies reactivas
de oxgeno -1O2 (ROS); por lo que en donde hay clulas cancergenas se forma un
microambiente qumico en el que hay condiciones de hipoxia y una mayor cantidad
de ROS (Dang, 2012).

Las ROS tienen un papel importante durante el desarrollo del cncer, activando o
inhibiendo la actividad de distintos proto-oncogenes y genes supresores de
tumores. Un caso es el del oncogen Myc, que en presencia de ROS es sobreexpresado en las clulas de cncer. Myc es un regulador central del crecimiento

30

celular, de forma que un fallo es un su funcionamiento acelera el metabolismo, y la

proliferacin celular. Otro oncogen, que se ve afectado por la presencia de ROS es
el Factor inducible a la hipoxia (HIF-1); este es un factor trans-cripsional que
induce continuamente la activacin de la gliclisis anaerobia (efecto Warburg) y
tiene una sobre actividad metablica, que las prepara para poder proliferar
continuamente (Dang, 2012). Tambin se sabe que las ROS disminuyen la
expresin de distintos genes supresores de tumores, entre los cuales se encuentra
el gen que codifica la Tensin-fosfatasa homloga (PTEN). La expresin de esta
enzima, detiene la proliferacin celular. Un gen supresor de tumores que tambin
se ve afectado por la presencia de ROS en clulas cancergenas es P53 (Lau et
al., 2011; Fiachi y Chiarugui, 2012).
Como ha sido ampliamente descrito, la molcula de -caroteno posee un largo
esqueleto poli-insaturado, es decir que cuenta con muchos dobles enlaces,
situados en distintos ngulos y posiciones geomtricas, lo que le hace capaz (al
oxidarse) de atrapar y destruir, molculas altamente reactivas, como las especies
reactivas de oxgeno activado (Holum, 1999). Es por eso, que una actividad
antioxidante que atrape ROS por parte del -caroteno pudo disminuir la
supervivencia de las clulas MDA-MB-231 en este trabajo, al daar directamente
su metabolismo, y alterar sealizaciones que les permiten evadir la apoptosis e
inducir la proliferacin celular; ya sea que altere las condiciones de hipoxia y
modifique el ambiente qumico externo en el que se encuentran las clulas o bien
que acte dentro de ellas al ser asimilado.

Por otro lado, Minguez-Mosquera (2008) adems de otros autores, mencionan que
los carotenoides pueden, tener una actividad anticancergena sin actuar como
antioxidantes; interactuando directamente con receptores celulares que se
encuentran embebidos en las membranas celulares (Bendich y Olson, 1989;

31

Lamson y Brignall, 1999; Heber y Lu, 2002. A su vez, esos receptores celulares
podran intervenir en la sealizacin para la progresin del ciclo celular, evitando la
proliferacin caracterstica del cncer (Heber y Lu, 2002). Si esto ocurri en el
ensayo realizado, uno de los receptores involucrados podran ser Cadherina-11 y
E-cadherina.

E-cadherina es una protena de membrana de importancia fundamental para el

mantenimiento y la formacin de tejidos; ya que junto con otras protenas
conforman las uniones intercelulares (uniones GAP). Cadherina-11, es un receptor
celular que se expresa en las clulas de MDA-MB-231 una vez que estas han
sufrido un proceso epigenetico, y jugando un importante papel en el desarrollo de
la metstasis (Onder et. al., 2008; Benton et al., 2009; Lau et al., 2011). Una
diferencia a nivel de receptores como estos tambin podra explicar, porque el caroteno tuvo un efecto sobre las clulas cancergenas de mama y no en las
clulas HaCat. Adems se sabe, que la expresin de Cadherina-11 en clulas de
cncer obedece a un aumento en su proliferacin (Qureshi et al., 2006), pudiendo
explicar porque el efecto del -caroteno fue mayor en el ensayo de 2 horas, ya que
en este caso la confluencia celular era cercana al 100%.

La diferencia que existi en el efecto causado con respecto al origen de la

molcula de -caroteno se debe a que D. salina produce de forma natural, una
mezcla de ismeros: 15-cis--caroteno (10%), 9-cis--caroteno (41%), trans caroteno (42%) y adems de otros ismeros sin identificar (7%). Esta combinacin
de ismeros hace que sean ms fcilmente asimilados y metabolizado por las
clulas humanas que las fuentes sintticas de tipo trans (Ben-Amotz, 1992); Esto
tambin podra explicar porque tuvo un efecto mayor. Adems, aunque
actualmente la produccin comercial de carotenoides es en su mayora llevada a
cabo por sntesis qumica con alto grado de pureza y bajo costo; en ella a menudo

32

quedan algunos precursores de las reacciones o -productos no biolgicos que

pueden tener efectos no deseados (Asker et al., 2012). Por ello, en este trabajo se
consider importante utilizar una fuente sinttica de -caroteno y comparar su
efecto contra uno de origen natural.
Cualquiera que haya sido el mecanismo de accin del -caroteno, la actividad
anticancergena reportada en este trabajo coincide con lo ya expuesto por Bendich
y Olson (1989); Lamson y colaboradores (1989), Venugocopal (2009) y Ben-Amotz
(2009) entre otros en distintos tipos de cncer.

33

9 Conclusiones
-Fue posible inducir la -carotenognesis en D. salina por medio de estrs salino
bajo condiciones de laboratorio.
-El -caroteno obtenido a partir de D. salina tuvo in vitro una actividad negativa en
la supervivencia de las clulas cancergenas MDA-MB-231 en todos los
tratamientos.
-El -caroteno trans

sinttico afect en menor grado la supervivencia de las

clulas cancergenas MDA-MB-231 en todos los tratamientos.

-En clulas normales HaCat el -caroteno sinttico tuvo un mayor efecto negativo
en la supervivencia, con respecto al de origen natural en el tratamiento de 2
horas.
-En clulas normales HaCat tratadas durante 24 horas con el -caroteno natural la
diferencia fue mnima.
-El -caroteno de origen natural obtenido a partir de D. salina puede ser un buen
candidato para la prevencin y el tratamiento del cncer de mama.

34

10 Recomendaciones
-Optimizar las condiciones de cultivo y de estrs para D. salina.
-Obtener cultivos masivos de D. salina para lograr una mayor produccin de caroteno en menos tiempo.
-Confirmar el efecto del -caroteno producido naturalmente por D. salina en otras
lneas celulares de cncer.
-Estudiar los mecanismos mediante los cuales el -caroteno de origen natural
puede interactuar con las clulas de cncer..
-Estudiar las rutas metablicas que inducen la -carotenognesis en D. salina
desde un punto de vista gentico, con el fin de generar cepas superproductoras del pigmento.

35

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40

ANEXO I
Cultivo de D. salina

a) Medio nutritivo

Este medio consisti en una combinacin de los medios Erdschreibers y F/2 en

una proporcin 1:1 y a una concentracin de 1.0 M de NaCl. Para preparar 1L total
es necesario:
1. Combinar los componentes.
2. Guardar a temperatura ambiente.
Cuadro V. Componentes del medio de cultivo nutritivo
Componente

Cantidad

Medio Ersdschravers 1.0 M NaCl

500 ml

Medio F/2 1.0 M NaCl

500 ml

b) Medio Erdschreibers modificado 1.0 m NaCl.

Para preparar 1 l de medio se debe:
1. Agregar a 3 l de agua de mar (30-35 ppt) pasteurizada, cada uno de los
componentes en el orden especificado con exceptuando las vitaminas.
2. Agitar vigorosamente y vaciar en un recipiente con tapa.
3. Esterilizar en autoclave durante 30 minutos.
4. Cuando el medio est temperado agregar la solucin de vitamina B12.
5. Guardar a 4C.

41

Cuadro VI. Componentes del medio Erdschreibers empleado

Componente

Cantidad

Concentracin final

Solucin de Metales Traza P-IV

12 ml

NaNO3

0.1955 g/l

2.3 mM

Na2HPO47H2O

0.9511 g/l

6.7 mM

NaCl

23 g/l

1M

Solucin de Vitamina B12

1 ml

*El medio original puede ser consultado en la pgina de internet perteneciente a la

Coleccin de Algas de la Universidad de Texas, UTEX (2013).

c) Medio F/2 modificado 1.0 m NaCl

Para preparar 1 l de medio fue necesario:
6. Agregar a 950 ml de agua de mar (30-35 ppt) pasteurizada, cada uno de los
componentes en el orden especificado (a excepcin de las vitaminas)
mientras se agita constantemente.
7. Llevar el volumen total a 1 l con agua de mar pasteurizada.
8. Cubrir y esterilizar en autoclave durante 30 minutos.
9. Cuando el medio est a temperatura ambiente agregar las soluciones de
vitaminas.

42

Cuadro VII. Componentes del medio F/2 empleado

Componente

Cantidad

Concentracin

Concentracin

Solucin Stock

final

NaNO3

1 ml

7.5 g/100 ml H2O

880 M

NaH2PO4H2O

1 ml

0.5 g/ 100 ml H2O

36 M

Solucin de metales traza

1 ml

para F/2
NaCl

23 g/l

Solucin de Vitaminas

1 ml

1M

para F/2

*Para preparar el medio original consultar a Guillard y Ryter (1962).

d) Solucin de metales traza para medio Erdschreibers

Para preparar 1 l se debe:
1. Agregar a 950 ml de agua destilada todos los nutrientes en el orden
enlistado mientras se agita vigorosamente.
2. Llevar a un volumen total de 1 l con agua destilada.
3. Guardar a 4 C.

43

Cuadro VIII. Solucin de metales traza para preparar el medio Erdschreibers

Componente

Cantidad Concentracin final

Na2EDTA2H2O

0.75 g/l

2 mM

FeCl36H2O

0.097 g/l

0.36 mM

MnCl24H2O

0.041 g/l

0.21 mM

ZnCl2

0.005 g/l

0.037 mM

CoCl2

0.002 g/l

0.0084 mM

Na2MoO42 H 2O

0.004 gl

0.018 mM

e) Solucin de Vitamina B12 para medio Erdschreibers

Para preparar 200 ml es necesario:
1. Prepara 200 ml del amortiguador HEPES (50mM)
2. Ajustar el ph a 7.8.
3. Agregar la Vitamina B12 (0.1 mN) y esperar a que se disuelva por completo.
4. Esterilizarla solucin por medio de un filtro Millipore de 0.45 m.
5. Guardar es oscuridad a 4C.

Cuadro IX. Vitaminas adicionadas en el medio Erdschreibers

Componente

Cantidad

Amortiguador HEPES pH 7.8

2.4 g/200 ml H20

Vitamina B12

0.027 g/200 ml H20

f) Solucin de metales traza para medio F/2

Para preparar 500 ml se debe:
1. Colocar en un vaso de precipitado 450 ml de agua destilada.
2. Calentar el agua en hasta casi alcanzar el hervor y en agitacin constante

44

agregar los componentes.

3.

Llevar a un volumen total de 500 ml con agua destilada

Cuadro X. Solucin de metales traza para preparar el medio F/2
Componente

Cantidad

Concentracin final

ZnSO47H2O

23 mg/500 ml

0.08 M

MnSO4H2O

152 mg/500 ml

0.9 M

Na2MoO42H 2O

7.3 mg/500 ml

0.03 M

CoSO47H2O

14 mg/500 ml

0.05 M

CuCl22H 2O

6.8 mg/500 ml

0.04 M

Fe(NH4)2(SO4)26H2O

4.6 mg/500 ml

11.7 M

Na2EDTA2H2O

4.4 mg/500 ml

11.6 M

g) Solucin de Vitaminas para medio F/2

Para preparar 200 ml es necesario:
1. Prepara 200 ml del amortiguador HEPES (50mM)
2. Ajustar el ph a 7.8.
3. Agregar los componentes y esperar a que se disuelvan por completo.
4. Esterilizarla por medio de un filtro Millipore de 0.45 m.
5. Guardar es oscuridad a 4C.
6.
Cuadro XI. Solucin de Vitaminas adicionadas en el medio F/2
Componente

Cantidad

Amortiguador HEPES pH 7.8

2.4 g/ 200 ml H20

Vitamina B12

0.027 g/ 200 ml H20

Biotina

0.005 g/ 200 ml H20

Tiamina

0.22 g/ 200 ml H20

45

ANEXO II
Soluciones y medios empleados para el cultivo de las lneas celulares

a) Solucin PBS
Para preparar una solucin de PBS 10X se deben mezclar en 950 ml de agua
destilada, los componentes mostrados a continuacin:
Cuadro XII. Componentes del buffer PBS
Reactivo
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4

Cantidad
8g
2g
17 mg
1.63 g

Posteriormente, se debe titular hasta llegar a pH 7.4 con HCl NaOH, llevar a 1L
con agua destilada y esterilizar a 15 lb de presin durante 30 minutos en
autoclave.

b) Verseno
Para preparar 60 ml, se debe pesar el EDTA y disolverlo en PBS estril en
constante agitacin.:

Cuadro XIII. Reactivos para preparar EDTA/PBS [1 mM].

Reactivo
EDTA
PBS

Cantidad
0.0228 g
60 ml

Una vez preparada la solucin, esta debe ser esterilizada por medio de un filtro
Millipore de 0.2 m.

46

c) Suero fetal bovino

Antes de aadir el SFB (GIBCO) al medio RPMI-1640, este fue inactivado. Para
ello es necesario colocarlo en un bao mara y calentarlo a 55C durante 20
minutos.
d) Medio RPMI-1640 (Invitrogen )
Para preparar 50 ml de medio suplementado es necesario:
1. Tomar 45 ml de medio RPMI y agregar cada uno de los componentes.
2. Filtrar el medio por medio de un filtro Millipore de 0.2 m con ayuda de una
bomba de vaco.
3. Cerrar y guardarlo a 4C.
Cuadro XIV. Medio RPMI suplementado.
Componente
RPMI-1640
SFB inactivado
Ant-Ant

Cantidad
45 ml
5 ml
500 l

47

Anexo III
Ensayo con -caroteno
a) Solucin -caroteno natural
Para preparar las soluciones de -caroteno natural:
1. Se mezclaron en un tubo falcon de 15 ml los componentes enumerados en la
siguiente tabla:

Cuadro XV. Solucin A elaborada a partir del extracto de D. salina.

Reactivos
CH3Cl2
DMSO
Extracto
EtOH
Medio RPMI sin
suplementar
Volumen final

Cantidades
100 l
40 l
12 l
248 l
2.6 ml
3 ml

2. En otro tubo falcon de 15 ml se colocaron 9 ml de medio RPMI con o sin

suplementar segn el caso necesario.
3. Calent en bao mara a 37 C durante 3 minutos y agregar 1 ml de la mezcla
4. Agregar 1 ml de la solucin A preparada.
5. Mantener en bao de hielo y oscuridad, ya que la solucin es fotolbil.
b) -caroteno sinttico
Para preparar las soluciones de -caroteno sinttico:
6. Se mezclaron en un tubo falcon de 15 ml los componentes enumerados en la
siguiente tabla.

48

Cuadro XVI. Solucin B de -caroteno trans sinttico.

Reactivos
CH3Cl2
DMSO
-caroteno trans
EtOH
Medio RPMI-1640
Sin suplementar
Volumen final

Cantidades
50 l
20 l
18 mg
112 l
2800
3 ml

7. En otro tubo falcon de 15 ml se colocaron 9 ml de medio RPMI con o sin

suplementar segn el caso necesario.
8. Calent en bao mara a 37 C durante 3 minutos y agregar 1 ml de la mezcla
9. Agregar 1 ml de la solucin B preparada.
10. Mantener en bao de hielo y oscuridad, ya que la solucin es fotolbil.

* La concentracin final de todas las soluciones empleadas en los tratamientos fue

de 6 g/l de -caroteno.

49

Anexo IV
Ensayo colorimtrico de MTT

Para realizar el ensayo se debe:

1.

Preparar el reactivo de MTT (Sal de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2, 5

difeniltetrazolio) con una concentracin de 5mg/ml. Para ello se mezclan en

completa oscuridad los siguientes componentes:

Cuadro XVII. Componentes del Reactivo de MTT.

Componente Cantidad
Sal de MTT

25 mg

PBS estril

5 ml

2 Con ayuda de una micro-peta agregar 50 ul de de medio RPMI sin suplementar

en cada pozo de la placa en la que se llev a cabo el ensayo (muestras, blancos y
controles).
3 Enseguida adicionar 50 ul reactivo de la sal de MTT en cada pozo. Este paso
debe hacerse sin presencia de luz blanca.
4 Agitar suavemente la placa para mezclar la sal de MTT con el medio de cultivo.
5 Introducir en la incubadora durante 2 horas y media, a una temperatura de 37C
y a un 5% CO2.
6 Sacar la placa de la incubadora y con cuidado extraer el sobrenadante de cada
de pozo. Este paso debe de hacerse con sumo cuidado, ya que se debe evitar
quitar los cristales formados en el fondo de cada pozo.
7 Adicionar 100 ul de isopropanol a cada pozo e incubar tres minutos.
8 Agitar suavemente la placa durante 10 minutos, hasta observar que haya una

50

coloracin (azul-roja) que sea homognea.

9 Leer en un micro-lector de placas a una absorbancia de 490 nm.

ANEXO V
Resultados del ANOVA realizado con el programa R

1.
Comandos empleados en R, y resultados obtenidos en el tratamiento de 2
Horas con -caroteno para cada lnea celular
a) MDA
>y1=c(.249, .258, .264)
y>2=c(.107, .108, .109)
>y=c(y1,y2) >n=rep(3,2)
>group=rep(1:2,n)
>data=data.frame(y=y,group=factor(group))
>fit=lm(y ~ group,data)
>anova(fit)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
1 0.033302 0.033302 1148.3 4.524e-06 ***
Residuals 4 0.000116 0.000029
Signif. codes: 0 *** 0.001 ** 0.01 * 0.05 . 0.1 1

Figura 11. Variacin dentro del tratamiento de 2h con -caroteno en la lnea

51

celular MDA-MB-231. 1)Clulas con -caroteno trans sinttico (BS),

2)Clulas con -caroteno natural (BN).

b ) MDA vs control negativo

>y1=c(.249, .258, .264) >y2=c(.107, .108, .109) >y3=c(.401, .414, .302)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
2 0.105375 0.052687 41.483 0.0003068 ***
Residuals 6 0.007621 0.001270
c) Hacat
>y1=c(.288, .260, .246) >y2=c(.276, .227, .237) >y=c(y1,y2) >n=rep(3,2)
>group=rep(1:2,n)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
1 0.0004860 0.00048600 0.862 0.4057
Residuals 4 0.0022553 0.00056383

Figura 12. Variacin dentro del tratamiento de 2h con -caroteno en la lnea

celular HaCat 1)Clulas con BN, 2)Clulas con BS

52

d) HaCat con control interno

>y1=c(.276, .227, .236) >y2=c(.288, .260, .246) >y3=c(.296, .271, .275)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
2 0.0017709 0.00088544 .0154 0.214
Residuals 6 0.0026360 0.00043933
e) MDA-MB-231 Vs HaCat Beta Natural
>y1=c(.107, .108, .109) >y2=c(.276, .227, .236) >y3=c(y1,y2)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
1 0.0287042 0.0287042 84.259 0.0007822 ***
Residuals 4 0.0013627 0.0003407

f) MDA-MB-231 Vs HaCat (Todos los tratamientos)

>y1=c(.249, .258, .264)
>y2=c(.107, .108, .109)
>y3=c(.276, .227, .236)
>y4=c(.288, .260, .246)
>y=c(y1,y2,y3,y4)
>n=rep(3,4)
>group=rep(1:4,n)
>data=data.frame(y=y,group=factor(group))
>fit=lm(y ~ group,data)
>anova(fit)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
3 0.049793 0.0165976 55.526 1.065e-05 ***
Residuals 8 0.002391 0.0002989

53

Figura 13. Variacin dentro de grupos con el tratamiento de 2h con caroteno: 1)MDA-MB-231 con BS 2)MDA-MB-231 con BN, 3)HaCat con BS,
4)HaCat con BN.

2.

Tratamiento: 24 Horas con -caroteno

a) MDA

>y1=c(.388, .387, .381) >y2=c(.278, .279, .291)

Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
1 0.0158107 0.0158107 474.32 2.63e-05 ***
Residuals 4 0.0001333 0.0000333

Figura 14. Variacin dentro del tratamiento de 24h con -caroteno en la

lnea celular MDA-MB-231: 1) Clulas con BS, 2) Clulas con BN.

54

b) MDA con control interno

>y1=c(.388, .387, .381) >y2=c(.278, .279, .291) >y3=c(.401, .414, .382)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
2 0.0242607 0.0121303 111.74 1.787e-05 ***
Residuals 6 0.0006513 0.0001086

c) Hacat
>y1=c(.246, .216, .228) >y2=c(.228, .216, .217)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
1 0.00014017 0.00014017 1.0294 0.3677
Residuals 4 0.00054467 0.00013617

Figura 15. Variacin dentro del tratamiento de 24h con -caroteno en la

lnea celular HaCat: 1)Clulas HaCat con BS, 2)Clulas HaCat con BN.

55

d) Hacat con control interno

>y1=c(.246, .216, .228) >y2=c(.228, .216, .217) >y3=c(.296, .271, .275)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
2 0.0063007 0.00315033 20.878 0.001983 **
Residuals 6 0.0009053 0.00015089

e) MDA vs HaCat (Todos los tratamientos)

>y1=c(.388, .387, .381) >y2=c(.278, .279, .291) >y3=c(.246, .216, .228)
>y4=c(.288, .216, .217)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
3 0.045275 0.0150916 30.198 0.0001031 ***
Residuals 8 0.003998 0.0004997

Figura 16. Variacin entre grupos con el tratamiento de 24h con caroteno. Clulas MDA-MB-231 con BS, 2) Clulas MDA-MB-231 con
BN, 3)Clulas HaCat con BS, 4) Clulas HaCat con BN

56