50 ARTCULO PRODUCTO DE LA INVESTIGACIN NOVA - PUBLICACIN

CIENTFICA - ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 6 JUNIO - DICIEMBRE DE 2006:1-114

Aislamiento e identificacin de diez cepas bacterianas desnitrificantes a partir d
e un suelo agrcola contaminado con abonos nitrogenados proveniente de una finca p
roductora de cebolla en la Laguna de Tota, Boyac, Colombia
Joaqun L. Benavides Lpez de Mesa1, Gladys M. Quintero1, Olga Luca Ostos Ortiz2
1
Universidad de La Salle, 2Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca Corresponden
cia: jbenavides@lasalle.edu.co Recibido: 13-10-06 / Aceptado: 17-11-06
Resumen
Este articulo presenta los resultados de la versatilidad adaptativa y tolerancia
de una consorcio bacteriano constituido por 10 cepas bacterianas endmicas de un
suelo agrcola contaminado, proveniente de una finca productora de cebolla ubicada
en la laguna de Tota en Aquitania, Boyac, Colombia, expuesto al uso incontrolado
de fertilizantes nitrogenados. La consorcio bacteriano aislado del suelo est con
formado por: Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Pseudomonas stutzeri,
Acinetobacter sp, Propionibacterium sp, Peptoestreptococcus sp, Sthaphylococcus
coagulasa negativa, Corynebacterium sp, Clostridium sp y Actinomyces sp. Se demo
str que los microorganismos aislados tienen capacidad desnitrificante in vitro, t
ransformando el nitrato a nitrgeno molecular. La consorcio bacteriano aislado se
constituye en una alternativa de biorremediacin para recuperar suelo agrcola conta
minado con exceso de fertilizantes nitrogenados. Palabras Claves: agentes fertil
izantes, amonio, biorremediacin, desnitrificacin, nitratos, urea.
Abstract
This article presents the results of the adaptative versatility and tolerance of
a bacterial consortium made up of 10 bacterial stocks endemic to a contaminated
soil coming from an onion farm located near Laguna de Tota, Aquitania, Boyac, Co
lombia. This soil has been exposed to the uncontrolled use of nitrogen rich fert
ilizers. The bacterial consortium from the soil is made up of Bacillus megateriu
m, Bacillus licheniformis, Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp, Propionibacte
rium sp, Peptoestreptococcus sp, coagulasa negative sthaphylococci, Corynebacter
ium sp, Clostridium sp, and Actinomyces sp. It was demonstrated that the isolate
d microorganisms have in vitro denitrifying capabilities, thus transforming nitr
ates to molecular nitrogen. The isolated bacterial association constitutes a bio
remediation alternative to recover the soil that has been contaminated by the ex
cess of nitrogen rich fertilizers. Key words: ammonium, biodegradation, denitrif
ication, fertility agents, nitrates, urea.

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Introduccin
La salinizacin de suelos es un problema universal y complejo que ocasiona un impa
cto ambiental negativo, el cual se ha incrementado con el pasar de los aos como c
onsecuencia del uso indiscriminado de abonos, convirtindose en una amenaza para l
a agricultura, la flora y fauna autctona (1). Las tcnicas de biorremediacin, consti
tuyen una importante alternativa de solucin a la salinizacin de suelos, ya que per
miten eliminar o inmovilizar contaminantes, transformndolos o degradndolos a susta
ncias menos peligrosas o inocuas. Dichas tcnicas utilizan microorganismos con cap
acidad para utilizar los contaminantes como fuente de energa o como aceptores y d
onadores de electrones dentro de la cadena respiratoria, mejorando as, la calidad
y condiciones fsico-qumicas del suelo, contribuyendo en el crecimiento, rendimien
to y calidad de las cosechas (2). De esta forma, la biorremediacin de suelos cont
aminados por fertilizantes nitrogenados (gallinaza, urea), puede realizarse medi
ante la aplicacin y/o bioaumentacin de microorganismos desnitrificantes autctonos,
que utilizan formas de nitrgeno inorgnico o amonio previamente reducido convirtindo
lo en sustancias gaseosas como N2O, NO y N2 , los cuales son emitidos a la atmsfe
ra (3). Las bacterias desnitrificantes son filogenticamente diversas y estn distri
buidas ampliamente en ecosistemas acuticos y terrestres. El proceso de desnitrifi
cacin ocurre en muchas especies de Eubacterias y en unas pocas Arqueobacterias. L
as Proteobacterias, las Enterobacterias, son anaerobios facultativos, debido a q
ue cambian el aceptor de electrones como el oxigeno por xidos de nitrgeno bajo con
diciones anxicas. Otros estudios han demostrado que las bacterias desnitrificante
s y fijadoras de nitrgeno se encuentran en la capa superficial del suelo a una pr
ofundidad de 5 cm (4). El aislamiento de estos microorganismos se realiz en un me
dio de cultivo al que se le aadi nitrato potsico como aceptor de electrones, una fu
ente de carbono no fermentable como donador de electrones y sales
minerales a fin de no seleccionar organismos fermentativos. El objetivo del estu
dio, fue aislar e identificar mediante el uso de medios selectivos y pruebas bio
qumicas convencionales, consorcios bacterianos desnitrificantes a partir de un su
elo proveniente de una finca productora de cebolla cerca a la laguna de Tota (Bo
yac) contaminado por exceso de fertilizantes (nitratos y amonio).
Materiales y mtodos
Toma de muestra de suelo La muestra de suelo fue trada de la finca Siempre Viva l
a cual se encuentra ubicada en el municipio de Aquitania (Boyac). Para la recolec
cin del suelo se delimit un rea aproximada de 1500 m2 dentro de la cual se tomaron
muestras compuestas utilizando un muestreo aleatorio en zig-zag. Se removi la cap
a superficial presente y se excav hasta una profundidad de 20 cm. Las muestras fu
eron empacadas en 14 sacos (40 kilos). La seleccin de la muestra se bas en anlisis
fsico-qumicos previos confirmando altas concentraciones de nitratos. Montaje ex si
tu La muestra fue trasladada a un invernadero construido en la Sede La Floresta
de la Universidad de La Salle, donde se utiliz un rea total de terreno de 14m2, de
los cuales 6m2 se emplearon para la disposicin del suelo. Se realiz el montaje de
3 surcos problema (unidades experimentales) y un control, cada surco de 52 cm d
e ancho, por 1,30 cm de largo, por 20 cm de profundidad; cada unidad experimenta
l posea tres rplicas, el montaje cont con un sistema de impermeabilizacin para la re
coleccin y manejo de lixiviados con el fin de evitar la contaminacin del suelo pro
blema, suelos aledaos y acuferos. Homogenizado de suelo De cada muestra de suelo s
ecado y tamizado se pesaron 25 g. y se homogenizaron en 225 ml agua peptonada (0
,85%), con cicloheximida (50 mg/ml) para inhibir el

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crecimiento fngico; se mantuvieron en agitacin a 120 rpm, por 30 minutos a tempera
tura ambiente (20 C). Conteo preliminar de clulas viables A partir del homogenizad
o se determin la concentracin inicial de bacterias viables hetertrofas y desnitrifi
cantes de cada uno de los surcos mediante la tcnica de recuento por vertido en pl
aca, previa preparacin de la muestra de suelo por homogenizacin y secado, segn prot
ocolo. Recuento de desnitrificantes A partir del homogenizado se prepararon dilu
ciones seriadas en base 10 en medio lquido mineral; (100 a 10-7); de cada dilucin
se inocul, por triplicado, 0,1 ml a placas de petri. Luego se agregaron 20 ml de
medio agar mineral mnimo fundido y mantenido a 450 C. Una vez solidificados los m
edios se llevaron a incubar a 370 C durante 48-96 horas, para obtener crecimient
o de colonias. Para cuantificar las colonias se seleccionaron las diluciones que
presentaron crecimiento entre 30 y 300 UFC, se realiz el clculo teniendo en cuent
a el ttulo de la dilucin y la cantidad de inculo utilizado. Los resultados se expre
san en UFC/g de suelo. Aislamiento e identificacin de consorcios denitrificantes
bacterianos nativos A partir del crecimiento obtenido en las placas de recuento
de desnitrificantes y hetertrofos se realiz el aislamiento de los consorcios bacte
rianos nativos mediante resiembra en medio de sales minerales. Los cultivos se m
anipularon en iguales condiciones de crecimiento a las descritas para los recuen
tos bacterianos y se realizaron las resiembras necesarias en medio slido hasta ob
tener cepas puras. Las cepas puras componentes de los consorcios nativos se rese
mbraron en medios de cultivo de aislamiento primario bsicos y con el fin de obten
er el crecimiento suficiente para su completa identificacin y para mantenerlas vi
ables. Los microorganismos aislados se determinaron segn los protocolos convencio
nales de identificacin: teniendo
en cuenta las caractersticas macroscpicas de las colonias, la morfologa microscpica,
por medio de la tincin de Gram y coloraciones especiales para cpsula, esporas e i
nclusiones citoplasmticas. Segn las caractersticas micro y macroscpicas de las colon
ias aisladas se procedi a la aplicacin de los protocolos convencionales y pruebas
bioqumicas especiales para la identificacin de bacterias provenientes de suelo.
Resultados
Recuento Inicial de clulas viables:1.3 x 104UFC/g. de suelo. Una vez se observ cre
cimiento a partir de los aislamientos positivos se procedi a realizar caracteriza
cin macro y microscpica de las colonias aisladas. El recuento promedio de UFC/g de
suelo post-tratamiento fue de 6.3x 104, el recuento promedio en el surco contro
l fue de 2,6x104. Identificacin bioqumica. En la Tabla 1 se presentan los microorg
anismos aislados e identificados mediante pruebas bioqumicas.
Tabla 1. Microorganismos aislados e identificados mediante pruebas bioqumicas.

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Figura 1. Anlisis estadstico para nitratos post-tratamiento con el consorcio bacte
riano aislado.
La actividad
nte anlisis
ificativa de
l despus de

desnitrificante (AD) del consorcio bacteriano, fue demostrada media

fisicoqumicos observando mediante espectrofotometra, una disminucin sign
nitratos en las Unidades experimentales (p 0.05) en relacin al contro
introducir el consorcio bacteriano, figura 1.

Discusin
El consorcio bacteriano identificado a partir del suelo problema estuvo compuest
o por: Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Pseudomonas sp, Acinetobacte
r sp, Propionibacterium, Clostridium sp, Actinomyces. Peptoestreptococcus, Sthap
hylococcus coagulasa negativa, Corynebacterium. El recuento promedio de UFC/g de
suelo post-tratamiento fue de 6.3x 104 y en el surco control fue de 2,6x104. Ut
ilizando todo el consorcio no se pudo determinar una concentracin bacteriana ptima
para la desnitrificacin; por lo que se sugiere en futuros ensayos probar diferen
tes asociaciones bacterianas y diferentes concentraciones de las mismas. En cuan
to al anlisis de los nitratos se observaron diferencias significativas entre las
unidades experimentales y el control, mostrando que el consorcio bacteriano aisl
ado llev a cabo el proceso de desnitrificacin de una manera efectiva.
Numerosos estudios han reportado microorganismos como potentes desnitrificantes
en suelo (3,5,6). Sin embargo, no existen reportes de trabajos utilizando consor
cios bacterianos. En este trabajo se realiz la biorremediacin con un consorcio nat
ivo de bacterias desnitrificantes, lo que permite combinar y complementar las fu
nciones metablicas de diferentes microorganismos, para que colectivamente desnitr
ifiquen el suelo. Adicionalmente al estar en grupo las diferentes especies bacte
rianas pueden tolerar los cambios fsico-qumicos que se den en el ambiente durante
el proceso de biorremediacin (3, 6, 7, 8). En la presente investigacin se aisl Pseu
domonas stutzeri, la cual se encuentra ampliamente distribuida en la suelos y ag
ua, y ha sido recuperada de humus, estircol, paja, aguas servidas, aguas estancad
as, alimentos preparados para bebes, equipos hospitalarios, cosmticos para los oj
os, y diversos materiales clnicos. Esta especie ha sido reportada frecuentemente
como desnitrificante del suelo (9). Tambin se aislaron diferentes microorganismos
de la familia Bacillaceae, sus numerosas especies suelen ser mesfilas, aerobias
o anaerobias facultativas, algunas de sus especies termfilas pueden desarrollarse
tambin en los extremos de acidez y alcalinidad con pH entre 2-10, por lo que pue
den recuperarse a partir de una variedad de nichos ecolgicos. Las diferentes espe
cies de Bacillus son de amplia distribucin, habitan suelos, agua y polvo ambienta
l. El gnero Bacillus, ha sido informado como desnitrificantes fuertes y rpidos, ya
que convierten los nitratos a nitritos en 24 horas como es el caso de la especi
e Bacillus licheniformis (8). Otro de los gneros, pertenecientes a la familia Bac
illaceae, el Clostridium, con especies anaerobias facultativos estrictas, comnmen
te encontradas en suelo tambin han sido informados como potentes biorremediadores
, utilizados con frecuencia para degradacin de derivados de petrleo (10). En este
trabajo se encontraron, haciendo parte del consorcio nativo, especies de Staphyl
ococcus coagulasa negativa, las cuales estn ampliamente distribuidas en

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diferentes nichos ecolgicos y se caracterizan por su gran capacidad de tolerancia
al medio ambiente (8). Tambin se encontraron especies de: Propionibacterium, que
son bacilos Gram positivos, anaerobios facultativos, frecuentemente aislados de
suelos, los cuales tambin utilizan el NO3- como aceptor de electrones; de Peptos
treptococcus, cocos Gram positivos, de crecimiento lento en medios convencionale
s, no hemolticos, distribuidos en el medio ambiente. Otro gnero encontrado fue Cor
ynebacterium, bacilos aerobios, Gram positivos, formadores de grnulos metacromtico
s, sus diferentes especies han sido reportadas con frecuencia aisladas de difere
ntes tipos de suelo (6,11). El Acinetobacter un bacilo Gram negativo, no ferment
ador de glucosa, distribuido ampliamente en el medio ambiente, en diferentes tip
os de suelo y agua ha sido reportado como especie capaz de desnitrificar de mane
ra lenta y dbil (12), tambin fue identificado en este estudio haciendo parte del c
onsorcio nativo. Finalmente, otro de los microorganismos encontrados fue el gnero
Actinomyces, bacilos filamentosos y ramificados, pleomorficos, Gram variables,
de crecimiento tpico en placas de agar, que tambin ha sido reportado en la literat
ura como microorganismo desnitrificante (12). Debido a que algunas especies comnm
ente identificadas por PCR no fueron aisladas en nuestro estudio, se recomienda
en futuros estudios utilizar tcnicas de biologa molecular para la identificacin de
microorganismos difciles de recuperar por cultivo en placa o en medio lquido que a
parecen en la literatura identificados y haciendo parte de la poblacin nativa de
suelos contaminados (13).
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Universidad de la Salle y a la Universidad Colegio Ma
yor de Cundinamarca por la financiacin de la investigacin, al Sr. Guillermo Lpez, p
ropietario de la Finca Siempre Viva, y al Dr. Ricardo Montealegre Coordinador de
Laboratorios Universidad de la Salle por su apoyo incondicional.
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