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TCNICAS HISTOLGICAS
Belo Horizonte
2010
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TCNICAS HISTOLGICAS
Belo Horizonte
Faculdade de Estudos Superiores
2010
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NDICE
INTRODUO.................................................................................................. 3
PREPARAAO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCPICO..................................4
MICROSCOPIA DE LUZ...................................................................................... 7
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE
INTERFERENCIA.............................................................................................. 8
MICROSCOPIA DE POLARIZAO......................................................................9
MICROSCOPIA CONFOCAL................................................................................ 9
MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA................................................................10
MICROSCOPIA ELETRNICA...........................................................................10
RADIOAUTOGRAFIA EM SECES DE TECIDOS................................................12
CULTURA DE CLULAS E TECIDOS..................................................................13
FRACIONAMENTO CELULAR..........................................................................13
HISTOQUMICA E CITOQUMICA.....................................................................14
DETECO DE MOLCULAS EM CORTES HISTOLGICOS POR MEIO DE
INTERAO MOLECULARES DE ALTA AFINIDADE............................................17
PROBLEMAS NA INTERPRETAO DE CORTES.................................................21
CONCLUSO.................................................................................................. 23
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.....................................................................24
INTRODUO
A Histologia o estudo da estrutura do material biolgico e das maneiras
como os seus componentes se inter-relacionam, tanto estrutural quanto funcionalmente.
O estudo da histologia se iniciou com o desenvolvimento de microscpios simples e de
tcnicas para preparo de material biolgico, tornando-o adequado para exame.
Este trabalho apresenta os mtodos de estudos desenvolvidos para
histologia, englobando a preparao de cortes de tecidos em lmina e o uso de
microscpios utilizados para visualizao.
O pequeno tamanho das clulas e dos componentes da matriz torna a
histologia dependente do uso de microscpios. Alm disso, pesquisas em qumica,
fisiologia, imunologia e patologia so fundamentais para um conhecimento adequado da
biologia, dos tecidos e dos rgos e de como seus vrios componentes interagem na
sade e na doena. O conhecimento das ferramentas e dos mtodos de investigao
essencial para uma compreenso adequada da estrutura e funcionamento das clulas,
tecidos e rgos.
Histologia o estudo dos tecidos do corpo e de como estes se organizam
para construir rgos. H quatro tecidos fundamentais: tecido epitelial, tecido
conjuntivo, tecido muscular e tecido nervoso.
Os tecidos so constitudos por clulas e por matriz extracelular (MEC). As
clulas produzem a MEC e so ao mesmo tempo influenciadas e controladas por
molculas da matriz, h uma integrao onde clulas e MEC formam uma entidade
contnua que funcionam conjuntamente e responde de modo coordenado s exigncias
do organismo.
Cada um dos tecidos fundamentais formado por vrios tipos de clulas
caractersticas daquele tecido, e por associaes e arranjos caractersticos entre clula e
matriz extracelular, mas estas associaes so muito peculiares. Por outro lado,
analisando o nvel de organizao dos rgos, observamos que estes so quase sempre
formados por uma associao muito precisa de vrios tecidos. Esta associao de
tecidos resulta no funcionamento adequado de cada rgo e do organismo como um
todo. O sistema nervoso a exceo, pois constitudo quase somente por tecido
nervoso.
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Fixao
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Incluso
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Colorao
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MICROSCOPIA DE LUZ
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Resoluo
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MICROSCOPIA DE POLARIZAO
MICROSCOPIA CONFOCAL
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MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA
at 400000 vezes sejam vistos com detalhes. Esta ampliao s pode ser usada para
analisar partculas ou molculas isoladas, pois cortes delgados de clulas e tecidos
podem ser observados com detalhes em aumento de ate cerca de 120000 vezes.
O funcionamento do microscpio se baseia em: eltrons podem ser
desviados por campos eletromagnticos de uma maneira semelhante ao desvio
(refrao) produzido na luz por lentes de vidro. Eltrons so liberados pelo aquecimento
de um filamento metlico (catodo de tungstnio) em vcuo.Os eltrons liberados no
catodo so submetidos a uma diferena de voltagem de 60-120 kV existente entre
catodo e anodo. Os eltrons so atrados pelo anodo e acelerados, atingindo altas
velocidades. Aps passarem pelo orifcio do anodo eles formam um feixe de eltrons
que percorre o tubo do microscpio. No tubo, o feixe de eltrons passa pelo interior de
bobinas eltricas (bobinas eletromagnticas) e desviado de maneira anloga ao que
acontece com um feixe luminoso em lentes de vidro.
A configurao do microscpio: a primeira lente uma condensadora que
focaliza o feixe de eltrons do espcime. Ao atravessar o corte alguns eltrons interagem
com tomos do espcime e continuam seus trajetos em direo s outras lentes,
enquanto outros eltrons simplesmente cruzam o corte e =sem interagir com ele. Dos
eltrons que atingem a lente objetiva forma-se uma imagem aumentada do objeto que
projetada nas outras lentes que por sua vez aumentam a imagem ainda mais. Para se
observar uma imagem os eltrons necessitam ser captados por um detector, uma placa
fluorescente, um negativo fotogrfico o uma cmera CCD. Como a imagem no
microscpio produzida pelo balano da quantidade de eltrons que atingiram o
detector e eltrons que foram retidos no tubo do microscpio, a imagem resultante
sempre em preto-e-branco. As reas escuras de uma micrografia eletrnica costumam
ser denominada de eltron-densas, e reas claras de eltron-lucentes ou eltrontransparentes
O microscpio utiliza cortes muito mais delgados. Para obter estes cortes
os tecidos so includos em resinas plsticas, como as do tipo epxi. Os blocos de tecido
so seccionados com navalhas de vidro ou de diamante e os cortes so coletados sobre
pequenas grades de metal.
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Clulas podem ser mantidas vivas e estudadas fora do corpo sendo muito
til para estudar o efeito isolado de molculas sobre um determinado tipo de clulas ou
tecido. A cultura de clulas permite tambm a anlise direta do comportamento de
clulas vivas por meio de um microscpio e de varias experincia que podem ser
executadas em um animal vivo pode ser feitas in vitro.
As clulas e os tecidos so cultivados em solues de composio conhecida
(sais, aminocidos, vitaminas) s quais so freqentemente adicionados componentes do
soro. Para preparar devem ser inicialmente separadas mecanicamente ou por meio de
tratamento enzimtico. Uma vez isoladas as clulas podem ser cultivadas em suspenso
ou podem ser colocadas sobre uma placa de Petri ou sobre uma lamnula de vidro,
superfcies sobre as quais elas costumam aderir e crescer sob forma de uma nica
camada de clulas. Culturas feitas desta maneira so culturas primarias. A maioria das
clulas obtidas de tecidos normais tem uma durao de vida finita, programada
geneticamente. Muitos tipos de clulas originalmente isolados a partir de tecidos
normais ou patolgicos e mantidos in vitro constituem agora linhagem permanente de
clulas. Para permitir a imortalidade de clulas normais in vitro h necessidade
submet-las a um processo chamado de transformao. Todos os procedimentos com
clulas e tecidos vivos devem obviamente ser executados em uma rea estril e usandose solues e equipamentos estreis.
FRACIONAMENTO CELULAR
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ons
Vrios ons podem ser localizados em tecidos com estes mtodos, usando
reaes qumicas que produzem produtos insolveis escuros ou coloridos.
cidos nuclicos
O DNA pode ser identificado e quantificado nos ncleos das clulas por
meio de reao de Feugen, que produz uma cor vermelha no DNA. O DNA e o RNA
tambm podem ser evidenciados pela colorao de clulas ou de cortes de tecidos com
corantes bsicos.
Protenas
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vrios
processos
metablicos.
demonstrao
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Polissacardeos e Oligossacardeos
tratados com uma enzima que digere glicognio.(por exemplo, amilase salivar ).
Estruturas que se coram intensamente por PAS mas, que perdem estar capacidade
quando pr-tratadas com amilase contm glicognio.
Glicosaminoglicanos so polissacardeos no ramificados, fortemente
aninico, que contm monossacarodeos aminados (aminoacares). Quando um grande
nmero de cadeias de glicosaminoglicanos se prende ao longo de um eixo prottico elas
constituem os proteoglicanos.Alguns dos componentes mais importante da matriz
extracelular do tecido conjuntivo so proteoglicanos. Diferentemente das glicoprotenas,
nos proteoglicanos as cadeias de carboidrato constituem o componente principal da
molcula. Glicosaminoglicanos e glicoproteinas cidas so fortemente aninicas por
causa do seu alto contedo de grupos carboxila e de sulfato. Por esta razo, eles reagem
intensamente com corante Alcian blue
Lipdios
que pode ser detectadas pela demonstrao da enzima com perxido de hidrognio e
DAB, metais (geralmente partculas de
Imunocitoqumica
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Uma
da
exigncia
mais
importantes
da
imunocitoqumica
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Tcnias de hibridizao
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cadeias esto agora prontas para serem ligadas a um segmento de cadeia simples de
DNA ou a um segmento de RNA que sejam complementares a seqncia que desejamos
analisar. Esta seqncia chamada de sonda que pode ser obtida por clonagem, por
amplificao das seqncias do meio de PCR ou por sntese se a seqncia desejada for
curta. A sonda deve ser ligada a um marcador, normalmente um istopo radioativo ou
um nucleotdeo modificado que pode ser identificado por imunocitoqumica.
Na hibridizao in situ as laminas contendo os cortes de tecidos, clulas ou
cromossomos so inicialmente aquecidas para separas as cadeias duplas de DNA, em
seguida, uma soluo contendo a sonda colocada sobre o espcime. Depois de lavar a
lamina, a localizao da sonda ligada a seqncia complementar denunciada pelo
marcador utilizado.
Hibridizao tambm pode ser executada com DNA ou RNA purificados,
colocados em apoio slidos. Trechos de molculas de DNA ou RNA so separados por
tamanho atravs de eletroforese em gel de agarose ou em gel de policrilamida. Em
seguida so transferidos a uma folha de nilon ou de nitrocelulose por meio de um
solvente onde os cidos nuclicos podem ser analisados por hibridizao. A tcnica de
identificao de DNA chamada de Southerm blotting; quando a eletroforese feita
com molculas de RNA a tcnica chamada de Northerm blotting.
As tcnicas de hibridizao so altamente especificas e habitualmente
usadas em pesquisa, diagnostico clinico e medicina forense.
a perda de molculas que no foram mantidas corretamente nos tecidos pelo fixador
ou que foram retiradas pelas solues de desidratao e clareamento.
Todos estes espaos artificiais e outras distores causadas pelo
procedimento de preparao dos cortes so chamados artefatos de tcnica. Outros
artefatos podem incluir pregas do corte, precipitados de corantes ou sujeira .
A totalidade do tecido
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CONCLUSO
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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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