KETTELIN APARECIDA ARBOS

ESTUDO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE VEGETAIS

DA FAMLIA CRUCIFERAE DE DIFERENTES CULTIVOS

Dissertao apresentada como requisito parcial

obteno do grau de Mestre, pelo Programa de
Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas - rea
de Medicamentos, Insumos e Correlatos, do Setor
de Cincias da Sade da Universidade Federal do
Paran.
Orientadora:
Prof.a Dr.a Almeriane M. Weffort Santos
Co-orientador:
Prof. Tit. Cid Aimbir de M. Santos

CURITIBA
2004

TERMO DE APROVAO

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B. Candido /
/
/ -Departamento de Nutrio/
Universidade Federal do Paran

Curitiba, 30 de janeiro de 2004

Nota biogrfica
A autora graduou-se em Nutrio pela Universidade Federal do Paran em
2001, tendo iniciado sua carreira como nutricionista da empresa GR, atuando
como gerente de produo nos restaurantes da Renault e Kraft Foods. Em
2002, iniciou sua carreira como professora do Curso de Nutrio da
UniAndrade, assumindo as disciplinas de Higiene de Alimentos e Superviso
de Estgio de Aprendizagem Capacitao Prtica em Nutrio Clnica, pelas
quais responsvel at o momento. No ano de 2002, ingressou no Programa
de

Ps-graduao

em

Cincias

Farmacuticas,

rea

de

Insumos,

Medicamentos e Correlatos, onde desenvolveu uma pesquisa sobre a

capacidade antioxidante de crucferas de diferentes culturas, cujos resultados
esto contidos nesta dissertao. Em fevereiro de 2004, a autora assumir a
coordenao do Curso de Nutrio da Faculdade de Pato Branco-PR.

Dedicatria

Ao meu amor, Srgio.

Agradecimentos
A Deus, que conduz minha vida e me deu foras para vencer mais
este desafio.
A UFPR, por toda minha formao profissional.
Aos meus orientadores, pelo constante apoio, incentivo e amizade,
fundamentais em todos os momentos. Em especial a professora Almeriane,
pelo seu surpreendente entusiasmo e dedicao e por ter acreditado e
possibilitado a realizao deste trabalho.
Aos professores Maria Sue/y Soares e Jos Domingos Fontana, pelo
acesso aos equipamentos e reagentes, e ao professor Adilson dos Anjos,
pelo apoio estatstico.
Ao Dr. Michael A. Cross e Dra.llria Bellantuono, pela doao da
fenil-hidrazina e vitamina C.
Aos produtores
pesquisa cientfica.

que gentilmente cederam os vegetais para esta

As funcionrias Irene, Clar e Maria, pela

organizao do laboratrio e coleta de sangue.

contribuio

na

Aos meus amigos Carla, Waldemar, Lilian, Lucielly, Larissa,

Vanessa, Carina, Mnica, Carolina e Fabiana e aos colegas da psgraduao, pelas alegrias e tristezas compartilhadas durante o perodo do
mestrado e que esta amizade perdure aps a finalizao desta etapa.
Aos meus pais Marcos e Sueli, que partilharam comigo conquistas e
derrotas no percurso de minha vida.
As minhas queridas irms Kerlay e Kemyle, pelo constante carinho e
por tornarem minha vida especial.
Ao Srgio, a quem dedico este trabalho, por sempre acreditar no
meu sucesso e por dar um significado especial minha vida.
E a todos aqueles que, voluntariamente, doaram seu sangue em prol
desta investigao cientfica.

Epgrafe

"Enquanto estivermos tentando, estaremos felizes,

lutando pela definio do indefinido,
pela conquista do impossvel,
pelo limite do ilimitado,
pela iluso de viver.
Quando o impossvel toma-se um desafio,
a satisfao estar no esforo
e no apenas na realizao final."
Gandhi

Sumrio
NOTA BIOGRFICA

"

DEDICATRIA

iii

AGRADECIMENTOS

iv

EPGRAFE

LISTA DE FIGURAS E ESQUEMA

viii

LISTA DE TABELAS

LISTA DE SMBOLOS, ABREVIAES E SIGLAS

xi

RESUMO

xiv

ABSTRACT

xv

INTRODUO

1.1 Espcies Reativas de Oxignio

1.2 Conseqncias do estresse oxidativo

1.3 Antioxidantes

1.4 Compostos naturais como fonte de antioxidantes

1.5 Vegetais como protetores e promotores da sade

1.6 Diferentes tipos de cultivos vegetais

10

1.7 Agricultura orgnica: uma viso mundial e o mercado brasileiro....

12

1.8 Qualidade dos alimentos orgnicos

14

1.9 Composio qumica e valor nutricional de vegetais da famlia

Cruciferae

14

1.10. Poder antioxidante de vegetais da famlia Cruciferae

16

1 . 1 1 0 eritrcito humano e seu sistema antioxidante

16

1.12 0 eritrcito humano e o estresse oxidativo

18

1.13 Eritrcitos sob ao de drogas oxidantes

22

1.14 Mtodos experimentais de avaliao da atividade antioxidante.

22

OBJETIVOS

27

JUSTIFICATIVA

28

METODOLOGIA

29

2.1 Solues

29

2.2 Material vegetal

30

2.3 Determinao do teor em umidade

31

2.4 Preparao dos extratos

31

2.5 Abordagem do potencial antioxidante

cromatografia em camada delgada

dos

extratos

por
33

2.6 Ensaio da reduo do complexo fosfomolibdnio

33

2.7 Ensaio de reduo do radical livre DPPH

33

2.8 Ensaio de inibio de formao de metahemoglobina induzida

pelo cloridrato de fenil-hidrazina em eritrcitos humanos

34

2.9 Pesquisa de flavonides

37

2.10 Anlise estatstica

38

RESULTADOS E DISCUSSO

39

3.1 Teor de umidade

40

3.2 Avaliao da atividade antioxidante de crucferas pelo mtodo

da reduo do complexo fosfomolibdnio

42

3.3 Cromatografia em camada delgada (CCD) dos extratos de

brcolis e couve-manteiga

44

3.4 Avaliao da atividade antioxidante dos extratos de brcolis e

couve-manteiga pelo mtodo da reduo do DPPH
3.5 Doseamento de flavonoides

47
cq
^

3.6 Ensaio de inibio da formao de metahemoglobina induzida

por fenil-hidrazina em eritrcitos humanos

60

CONCLUSO

70

CONSIDERAES FINAIS

72

REFERNCIAS

73

ANEXOS

83

Lista de Figuras e Esquema

Figura 1. Espcies reativas de oxignio comumente geradas durante
processos metablicos

Figura 2. Converso do oxignio em gua em sistemas enzimticos

biolgicos
Figura 3. Produo de vegetais pelo sistema hidropnico
Figura 4. Apresentao comercial de vegetais produzidos pelo sistema
orgnico
Figura 5. Metabolismo anaerbico do eritrcito humano e sua interrelao
com o ciclo das pentoses

6
11

13
19

Figura 6. Formao de corpos de Heinz pela ao de espcies reativas

de oxignio

21

Figura 7. Coloraes dos extratos aps reduo do complexo

fosfomolibdnico

43

Figura 8. Comparao da atividade antioxidante de extratos vegetais da

famlia Cruciferae obtidos de cultivo orgnico, hidropnico e
convencional

45

Figura 9. Cromatografia em camada delgada dos extratos de couvemanteiga e brcolis, revelados com soluo de DPPH

46

Figura 10. Atividade antioxidante de extrato de brcolis avaliada pelo

mtodo de reduo do DPPH
Figura 11. Influncia do tempo de reao na reduo do radical DPPH*
Figura 12. Avaliao da capacidade antioxidante do extrato de brcolis
avaliada pelo teste de reduo do radical DPPH*

48
49

54

Figura 13. Avaliao da capacidade antioxidante do extrato de brcolis

avaliada pelo teste de reduo do radical DPPH*

56

Figura 14. Avaliao da capacidade antioxidante do extrato de cruciferas

avaliados pelo teste de reduo do radical DPPH*

58

Figura 15. Efeito da fenil-hidrazina sobre eritrcitos humanos

62

Figura 16. Efeito do extrato de couve-manteiga obtida de cultivo orgnico

sobre a formao de metahemoglobina induzida por fenilhidrazina sobre eritrcitos humanos

63

Figura 17. Efeito do extrato de couve-manteiga obtida de cultivo

hidropnico sobre a formao de metahemoglobina induzida
por fenil-hidrazina sobre eritrcitos humanos

64

Figura 18. Efeito do extrato de couve-manteiga obtida de cultivo

convencional sobre a formao de metahemoglobina induzida
por fenil-hidrazina sobre eritrcitos humanos

66

Figura 19. Efeito do extrato de brcolis obtido de cultivo orgnico sobre a

formao de metahemoglobina induzida por fenil-hidrazina
sobre eritrcitos humanos

67

Figura 20. Efeito do extrato de brcolis obtido de cultivo convencional

sobre a formao de metahemoglobina induzida por fenilhidrazina sobre eritrcitos humanos

69

Esquema 1. Proposta de mecanismos de reao para substncias

fenlicas com DPPH

24

Lista de Tabelas
Tabela 1. Espcies de vegetais da famlia Cruciferae e sua
denominao popular, comumente presentes na dieta
humana

15

Tabela 2. Teor de umidade de vegetais frescos da famlia Cruciferae

obtidos sob diferentes tipos de cultura

41

Tabela 3. Capacidade antioxidante dos extratos de couve-manteiga e

brcolis (mg/ml), obtidos de diferentes cultivos, na
presena ou no de clorofila e substncias lipoflicas,
avaliada pelo mtodo do DPPH, usando-se a vitamina C
como padro de referncia

53

Tabela 4. Doseamento de flavonides totais em extrato de vegetais

da famlia Cruciferae

59

Lista de Smbolos,
Abreviaes e Siglas
alfa

beta

delta

ng

micrograma

ng/ml

microgramas por mililitro

|.im
(NH4)6M07O24.4H2O

micrometro
molibdato de amnio hidratado
concentrao
aproximadamente

o2

oxignio singlete

Abs

absorvncia

AcOEt

acetato de etila

ADP

adenosina-5'-difosfato

AICI3

cloreto de alumnio

ANVISA

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

ARP

poder antioxidante ou antiradical

ATP

adenosina 5' trifosfato

BHA

butil-hidroxianisol

BHT

butil-hidroxitolueno

CCD

cromatografia em camada delgada

co2

dixido de carbono

conv.

tipo de cultivo convencional

Cu

cobre

dia

dl

decilitro

DNA

cido dexoxiribonuclico

DPPH'

1,1-difenil-2-picrilhidrazil

DP

desvio padro

e"

eltron

EC

concentrao efetiva

EDTA-K3

etilenodiaminotetracetato tripotssico

EPM

erro padro da mdia

ERO

espcies reativas de oxignio

Fe

tomo de ferro

Fe

+2

ion ferroso

Fe+3

Ion frrico

Fh

cloridrato de fenil-hidrazina
acelerao da gravidade

Fe+3

on frrico

Fh

cloridrato de fenil-hidrazina

acelerao da gravidade

gramas

G6-PD

glucose 6-fosfato desidrogenase

GSH

glutationa reduzida

GSH-Px

glutationa peroxidase

GSSG

glutationa oxidada

horas

on hidrognio

H20

gua

H202

perxido de hidrognio

H 2 S0 4

cido sulfrico

Hb

hemoglobina

HCI

cido clordrico

hidrop.

tipo de cultivo hidropnico

infloresc.

inflorescncia

K 2 HP0 4

fosfato de potssio dibsico

K3[Fe(CN)6]

ferricianeto de potssio

KH 2 P0 4

fosfato de potssio monobsico anidro

M/15

tampo fosfato 67 mM

M/60

tampo fosfato 16 mM

metaHb

metahemoglobina

mg

miligrama

mg/ml

miligrama por mililitro

min

minuto

ml

mililitros

mM

milimolar

Mo

molibdato

normal

nmero

Na 2 HP0 4

fosfato dissdico

Na 2 HP0 4

fosfato de sdio dibsico anidro

NaCI

cloreto de sdio

NaCN

cianeto de sdio

NAD+

nicotinamida adenina dinucleotdeo

NADH

nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato

NADPH

nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato reduzido

NaH 2 P0 4 .2H 2 0

fosfato monossdico di-hidratado

NaOH

hidrxido de sdio

NaP0 4

fosfato de sdio

NH4CI

cloreto de amnio

nm

nanmetros

02

oxignio

02~*

radical superxido

graus Celsius

OH"

radical hidroxila

org.

tipo de cultivo orgnico

p/v

peso por volume

PBS

soluo salina tamponada com fosfato

pH

potencial hidrogninico

RNA

cido ribonuclico

SOD

enzima superxido dismutase

TBH

terc-butil

hidroperxido

USDA

Departamento de Agricultura dos Estados Unidos

UV

radiao ultravioleta

v/v

volume por volume

var.

variedade

Zn

zinco

Resumo
Radicais livres (RL) so formados durante o metabolismo celular regular e, por
serem substncias eletricamente instveis e potencialmente reativas, so
capazes de causar oxidao e danos irreversveis clula, comprometendo
sua funo. Apesar da excessiva produo de RL, estes so inativados por
antioxidantes. A famlia Cruciferae possui exemplares importantes na dieta do
homem, contribuindo como fonte importante de vitaminas antioxidantes,
minerais, fibras, flavonides, carotenides, dentre outros fitoqumicos. Desta
maneira, destaca-se a importncia de avaliar-se o seu potencial antioxidante,
uma vez que seu consumo regular na dieta do brasileiro. No presente
trabalho, a capacidade antioxidante de extratos obtidos de repolho branco
(Brassica oleracea var. capita L.), couve-manteiga (Brassica oleracea L. var.
acephala D.C.), couve-flor (Brassica oleracea L. var. botrytis L. subv. cauliflora),
brcolis (Brassica oleracea L. var. botrytis L. subv. cymosa), agrio (Nasturtium
officinalis L.) e rabanete (Raphanus sativus radiculal), obtidos de cultivo
convencional, hidropnico e orgnico quando possvel, foi avaliada in vitro
pelos mtodos qumicos de reduo do complexo fosfomolibdnio e do radical
livre 1,1 -difenif-2-picrilhidrazil (DPPH). Em paralelo, desenvolveu-se um ensaio
biolgico in vitro para avaliao da ao antioxidante dos extratos de couvemanteiga e brcolis utilizando eritrcitos humanos normais submetidos
sobrecarga oxidativa imposta pela fenil-hidrazina como modelo experimental,
onde se mensurou a formao de metahemoglobina. Investigou-se, tambm, a
influncia da presena de clorofila e substncias lipoflicas (C/SL) no potencial
antioxidante desses vegetais. Os extratos das crucferas avaliados
demonstraram relevante capacidade antioxidante, porm com variao na
intensidade do efeito dependendo da espcie estudada, da concentrao do
extrato, do tipo de cultivo, assim como do mtodo analtico empregado. A
retirada de C/SL parece aumentar a capacidade antioxidante dos extratos,
independente do tipo de cultivo, mas de forma significativa apenas nos vegetais
de cultivo convencional. Importante destacar que o ensaio biolgico proposto
por este trabalho, mostrou ser um mtodo sensvel, rpido, reprodutvel e de
custo praticvel. Embora devam ser interpretados com cautela, pois inmeros
fatores interferem na qualidade dos vegetais, como a composio do solo, o
clima e o tipo de cultivo, os resultados dos efeitos antioxidantes aqui
apresentados e discutidos favorecerem os efeitos benficos do consumo de
crucferas, com destaque quelas de cultivo orgnico associados,
possivelmente, ao fato de no apresentarem resduos de agrotxicos e
fertilizantes sintticos e terem maior contedo em nutrientes.

Palavras-chave: Cruciferae, antioxidante, tipos de cultivo, clorofila, DPPH,

metahemoglobina.

Abstract
Free radicals are formed throughout cellular metabolism. As fairly unstable and
highly reactive substances, they are able to cause oxidation and sometimesirreversible damage to the cells, compromising their function. Although
produced at high levels, most of them can be inactivated by antioxidants. The
Cruciferae family has many species that are important for the regular human
diet, as they provide important antioxidant components such as vitamins,
minerals, fibers, flavonoids, carotenoids amongst others phytochemicals. As
such, it is important to evaluate their antioxidant potential as they are routinely
present as part of the Brazilian folk meals. In the present work, the antioxidant
capability of the extracts prepared from white cabbage (Brassica oleracea var.
capitata L.j, kale (Brassica oleracea L. var. acephala D.C.J, cauliflower
(Brassica oleracea L. var. botrytis L. subv. cauliflora), broccoli (Brassica
oleracea L. var. botrytis L. subv. cymosa), water-cress (Nasturtium officinalis L.)
and radish (Raphanus sativus radiculal L.J, obtained from conventional,
hydroponics, and organic agricultural procedures whereas possible, was
investigated in vitro by the chemical methods of phosphomolybdenum complex
and DPPH. In parallel, we have developed an in vitro biological assay for
investigating the antioxidant potential of the kale and broccoli extracts using
normal human erythrocytes under oxidative stress imposed by phenylhydrazine
as an experimental model, in which the methemoglobin levels were measured.
The influence of chlorophyll and lipophilic components (C/LS) on the antioxidant
properties of these extracts was also studied. Although the intensity of the
effects varied according to the species and dose investigated, their way of
growing, and the methodological approach used, all Cruciferae extracts
included in this work have shown significant antioxidant capacity when
compared to the controls. The absence of C/LS resulted in the enhancement of
the extracts' antioxidant potential, independently of the type of culture, but it
reached significant levels only for the extracts prepared from the conventional
agriculture. Of particular interest were the results derived from the biological
method proposed that have shown to be sensitive, fast, reproducible, and
economically feasible. Although the antioxidant results herein presented and
discussed must be interpreted with caution as a list of factors such as soil
composition, climate or culture technology can influence the vegetables' quality,
they favor the beneficial effects of consuming Cruciferae vegetables, particularly
those obtained from organic culture, including their advantage of having less
fertilizer and toxic residues associated with high levels of solid nutrients.

Key

words:
Cruciferae,
antioxidant,
methehemoglobin, DPPH.

agricultural

type,

chlorophyll,

UFPR

UNV
I ERSD
I ADE FEDERAL DO PARANA

A transio de nosso planeta para uma biosfera com oxignio (O2)

abundante permitiu a proliferao de organismos com vias metablicas altamente
energticas, requisitando um fluxo contnuo e seguro de 0 2 do ambiente para os
tecidos

(Anderson

organismos

Phillips,

aerbios,

apenas

1999).

Do oxignio

10-15%

total

metabolizado

consumido
via

pelos

oxidases;

remanescente principalmente utilizado na cadeia de transporte de eltrons da

mitocndria. Neste processo, o oxignio reduzido gua sob a ao da
citocromo oxidase, enquanto o fosfato de nicotinamida adenina dinucleotdeo
(NADH), cofator da reao, oxidado a nicotinamida adenina dinucleotdeo
(NAD+), necessrio produo de adenosina-5'-trifosfato (ATP) (Alberts et ai,
1994).
Durante o metabolismo celular regular, vrias substncias eletricamente
instveis e potencialmente reativas com molculas biolgicas so produzidas, as
quais so genericamente denominadas radicais livres. Essas molculas so
capazes de causar oxidao e danos irreversveis clula, comprometendo sua
funo (Anderson, 1996; Benavente et ai, 2000; Oliveira, 2003).
A fonte desses radicais livres pode ser endgena, associada reaes
metablicas como, por exemplo, na reao de oxidao na mitocndria com a
interrupo do transporte de eltrons; na fagocitose excessiva durante o processo
de inflamao; na ativao do metabolismo do cido araquidnico, exgena
devido, por exemplo, s radiaes ultravioleta (UV) ou mesmo
(pesticidas, poluio, fumaa de cigarro) (Jay e Berthon,

ambiental

1998; Podda e

Grundmann-Kollmann, 2001; Sousselier e Berthon, 1998). No entanto, sob

condies normais, sua principal fonte o escape eletrnico das cadeias de
transporte, particularmente nas mitocndrias, local onde o O2 reduzido gua
em etapas seqenciais (Yamamoto, 2001).
Para a reduo completa de uma molcula de O2 em duas molculas de
gua, quatro eltrons so transportados no interior da membrana mitocondrial

interna. Entretanto, 1-2% desses eletrons sao perdidos durante o transports,

levando

a formac;ao do radical

super6xido (02--) e, subsequentemente, de outras

numerosas especies reativas de 02, como o per6xido de hidrogemio (H 20 2) e os

radicais hidroxila (OH) (Anderson, 1996; Chaudiere e Ferrari-lliou, 1999; Podda e
Grundmann-Kollmann, 2001; Wickens, 2001; Yamamoto, 2001 ). Essas especies
qulmicas estao habitualmente envolvidas como estresse oxidativo, definido como
uma ruptura do equilibria entre antioxidantes e pr6-oxidantes em favor destes
ultimos, levando a danos celulares ou teciduais (Chow, 2002; Chu eta/., 2002).

1.1 Especies Reativas de Oxigenio

Especies reativas de oxigemio (ERO), como as ilustradas na Figura 1, sao
caracterizadas pela sua alta reatividade e facilidade de oxidar outras moleculas,
contudo com intensidade de ac;ao distintas (Podda e Grundmann-Kollmann, 2001;
Wickens, 2001 ).

.. ..
0 :: 0

..

0 ::

--o

oxigenio

radical superbxido

.o;

:
:o

radical hidroxila

....

:o:

:o

per6xido de hidrogenio

Figura 1. Especies reativas de oxigenio comumente geradas

durante processos metab61icos
Adaptado de Biology, 2002

Nos organismos vivos, o nion superxido

(O2"*)

formado a partir da

reduo do O2 pela transferncia de um eltron (e") doado pela hemoglobina,

citocromos, quinonas, tiis ou metais de transio (Equao 1).

0 2 + e"

02"

[Equao 1 ]

O O2"* fracamente reativo, mas pode converter-se em espcies mais

reativas devido possibilidade de dois radicais superxido combinarem-se com
gerando o radical OH*. Deve-se ressaltar que essa converso ferro-

H2O2,

dependente e que muitos dos efeitos txicos atribudos ao radical O2"* so

devidos sua converso OH* (Anderson e Phillips, 1999; Jay e Berthon, 1998).
J o H2O2 pode ser formado pela reduo bivalente do oxignio (Equao
2) ou pela reao de duas molculas, em uma reao chamada dismutao
(Equao 3), ocorrendo espontaneamente ou catalisada pela enzima superxido
dismutase (SOD) (Saltman, 1989).

2 0 2 + 2e " + 2H +

2O2*

+ 2H +

02

H 2 O 2

+ H 2 O 2

[Equao 2]

[Equao 3]

O 2

O H2O2 uma molcula estvel, com capacidade de reagir com o Fe +2 dos

sistemas biolgicos, produzindo OH*, atravs da Reao de Fenton (Equao 4),
(recentemente revisado por Filho, Silva et al. 1999). decomposto em gua
espontaneamente ou por ao enzimtica da catalase ou peroxidase. Este radical
possui

baixa

reatividade

e seus

efeitos

danosos

no

esto

diretamente

associados a um ataque a componentes celulares.

H 2 0 2 + Fe +2

Fe +3 + OH"

+ OH*

[Equao4]

O OH* altamente reativo e pode reagir com molculas capazes de doar

um

eltron

como

enzimas,

acares,

aminocidos,

cidos

nuclicos

ou

fosfolipdios de membranas. Este radical, no sistema biolgico, possui potencial

destrutivo e mutagnico. Por exemplo, ao reagir com cidos graxos da membrana

(principalmente

poliinsaturados),

pode

provocar

alteraes

estruturais,

ocasionando desorganizao celular ou falha na transmisso das mensagens

para dentro da clula. Ao reagir com protenas, pode modificar sua estrutura; com
o DNA, provoca a quebra da dupla fita, levando mutaes e morte celular (Jay e
Berthon, 1998).
O radical OH* pode ser formado de trs maneiras. (1) pela hidrlise da
gua devido ao de radiao ionizante ( H 2 0 -> H*+ OH*); (2) pela interao
com metais, como o ferro e o cobre, atravs da Reao de Fenton (Fe +2 + H2O2
->Fe + 3 + OH*+ OH") ou (3) pela Reao de Haber-Weiss ( H 2 0 2 + 0 2 " * ^ OH*+ OH"
+ O2) (Cotran et a/., 1994). A reao que produz o OH* requer um metal de
transio, como o ferro, cobre ou cobalto, como agente catalisador.

Essa

produo facilitada porque toda agresso a tecidos, traumtica ou infecciosa,

libera ferro. Esses eventos causam, ainda, a migrao de neutrfilos, que tambm
atuam como fontes geradoras de radical O2". Alm disso, os neutrfilos produzem
oxignio no estado singlete ( 1 0 2 ) capaz de atuar como radical livre, pois seus
eltrons, mesmo emparelhados,

situam-se em rbitas distantes do ncleo,

tornando o tomo altamente reativo (Anderson, 1996; Anderson e Phillips, 1999;

Fraga Filho, 2003).

1.2 Conseqncias do estresse oxidativo

O organismo est normalmente em equilbrio entre produo e degradao
de radicais livres. Quando existe um desequilbrio entre as espcies reativas
produzidas e a capacidade antioxidante, cria-se uma situao que se denomina
estresse oxidativo (Chaudiere e Ferrari-lliou, 1999; Chow, 2002). As principais
conseqncias do estresse oxidativo em sistemas biolgicos so:
a) a peroxidao dos lipdios da membrana celular: inicia-se com a subtrao de
ons hidrognio do grupo metileno dos fosfolipidios, com posterior produo de
dienos conjugados, hidroperxidos e formao de outras espcies reativas mais
deletrias clula, como os radicais alcoxil e peroxil. Com a leso, altera-se a
fluidez da membrana e, com isso, a sua permeabilidade; como conseqncia,
ocorrem alterao das trocas inicas, acarretando um influxo excessivo de clcio,

o qual ativa enzimas autoliticas, causando protelise e morte celular (Fraga Filho,
2003; Oliveira, 2003).
b) a oxidao de protenas, resultante da ao dos radicais livres sobre os grupos
tiis, causa agregao e fragmentao de aminocidos. A ciso pelos radicais
livres do anel desoxirribose dos cidos nuclicos promove mutaes no cido
desoxirribonuclico (DNA) e no cido ribonuclico (RNA) e inibio da sntese
protica (Oliveira, 2003), como j comentado.

1.3 Antioxidantes
O dano oxidativo a conseqncia da diminuio do potencial antioxidante
e/ou aumento do estresse oxidativo. Apesar de existir normalmente excessiva
produo

de

espcies

reativas,

estas

so

inativadas

por

substncias

denominadas antioxidantes (Chaudiere e Ferrari-lliou, 1999; Chow, 2002), que

so substncias capazes de retardar ou inibir a oxidao de um substrato. Podem
agir bloqueando a formao dos radicais livres ou interagindo com estes,
inativando-os. Portanto, os antioxidante so definidos como qualquer substncia
capaz de doar eltrons para um radical livre, inativando-o, tornando-o um
composto eletricamente estvel (Oliveira, 2003).
O perigo do estresse oxidativo no organismo to elevado que, alm de
uma defesa antioxidante enrgica, sistemas de reparo presentes nas clulas e
fora delas esto envolvidos para a proteo contra sua destruio por radicais
livres (Chaudiere e Ferrari-lliou, 1999). Alm disso, a clula tambm protegida
por vrios captadores no enzimticos, incluindo carotenides, a vitamina C
(hidrossolvel), a vitamina E (lipossolvel), ubiquinol-10 (coenzima Q 10 ) e outras
substncias como cistena, cido rico e glutationa. Utiliza-se, tambm, de
substncias quelantes de ons metlicos para prevenir a Reao de Fenton
(Podda e Grundmann-Kollmann, 2001; Sousselier e Berthon, 1998; Wickens,
2001; Yamamoto, 2001).

a) Antioxidantes intracelulares
A evoluo permitiu ao organismo desenvolver mecanismos de defesa para
limitar a ao das ERO (Anderson e Phillips, 1999) e, neste contexto, as enzimas
antioxidantes superxido dismutase (SOD), as catalases e a glutationa peroxidase

(GSH-Px) constituem sua primeira linha de defesa (Figura 2) (Anderson e Phillips,

1999; Oliveira, 2003).
A maioria das enzimas antioxidantes sao dependentes de co-fatores
extemos para que possam desempenhar suas atividades. A SOD, por exemplo,

uma enzima dependente de cobre e zinco, localizada no citosol, responsavel pela

dismutac;ao de dois radicais super6xido em urn per6xido de hidrogenio. Possui
meia vida curta (me nos de 10 min) e nao penetra nas celulas (Halliwell, 1999;
Renz, 2003; Telen e Kaufman, 1999).

....

Fe2

'

Fe+3

----....

0 2-
2GSH

~
CATALASE

Glutationa
Glutationa
redutase
peroxidase
~

GSSG

Figura 2. Converslo do oxig~nio em Agua em sistemas enzimAticos biologicos. 0

02 convertido em 02... pode ser inativado espontaneamente ou, mais rapidamente, pela
enzima SOD, formando H202 que, por sua vez, pode ser convertida em agua pela ayao
da catalase. 0 H202 pode tambem ser reduzido atraves do NADPH, em rea9ao mediada
pela GSH. 0 envolvimento do ion Fe+ 2 atraves da Rea9ao de Fenton gera, como
produtos, alem do ion Fe+ 3 , oH, urn radical livre extremamente reativo com moleculas
biol6gicas.
02: oxigenio; 02... : anion super6xido; SOD: super6xido dismutase; H202: per6xido de
hidrogenio; NADPH: nicotinamida adenina dinucleotideofosfato reduzido; GSH: glutatina
reduzida; GSSG: glutationa oxidada, oH: ion hidroxila.

A catalase um tetrmero com quatro grupamentos heme e, encontrandose predominantemente nos peroxissomos, responsvel pela converso do H2O2
em H2O e O2 (Chaudiere e Ferrari-lliou, 1999). O H2O2 pode ser eliminado pela
ao da GSH-Px, localizada no citosol, na mitocndria ou no meio extracelular.
Sua ao converter o

H 2 O 2

em H 2 0 e os hidroperxidos lipdicos oriundos da

membrana, em lcoois estveis (Anderson e Phillips, 1999; Chaudiere e Ferrarilliou,

1999; Fraga Filho, 2003; Fridovich,

1998). A ao desta enzima

desempenhada atravs da utilizao da glutationa reduzida (GSH), em reao

catalisada pela glutationa peroxidase. Aps a doao de eltrons, a GSH passa a
sua forma oxidada (GSSG), mas poder ser regenerada atravs da glutationa
redutase, com transferncia do hidrognio do nicotinamida adenina dinucleotdeo
fosfato reduzido (NADPH) (Renz, 2003).
b) Antioxidantes Extracelulares
Os antioxidantes hidroflicos encontrados no sangue circulante ou nos
fluidos intersticiais agem neutralizando diretamente os radicais livres ou atravs
da sua participao em sistemas enzimticos. Os principais so a glutationa, o
cido rico, a albumina, a haptoglobina e a hemopexina (Chaudiere e Ferrari-lliou,
1999).
A vitamina C, ou cido L-ascrbico, uma substncia hidroflica, cuja
funo principal proteger lipoprotenas da oxidao (May, 1998).

Como

antioxidante, seqestra oxidantes neutroflicos, OH", H2O2 e cido hipocloroso

(Havsteen, 1983; Oliveira, 2003). Contudo, na presena de ons metlicos de
transio, como o ferro e o cobre, o ascorbato pode tornar-se um agente proxidante, causando intensa peroxidao lipdica (Carr e Frei, 1999).
A vitamina E encontra-se localizada tanto na membrana celular como nas
lipoprotenas circulantes. Bloqueia a peroxidao lipdica por remover radicais
peroxil, alm de remover radicais O2", OH* e 1 0 2 (Chaudiere e Ferrari-lliou, 1999;
Havsteen, 1983; Oliveira, 2003). Os carotenides, em geral, devido ao sistema de
duplas conjugadas, protegem contra os efeitos deletrios de radicais livres
(Cndido e Campos, 1995; Rao e Agarwal, 1999). O p-caroteno constitui a maior
fonte de vitamina A e age como antioxidante

por inibir a oxidao

da

fosfatidilcolina, impedindo a peroxidao lipdica (Chaudiere e Ferrari-lliou, 1999;

Oliveira, 2003).

1.4 Compostos naturais como fonte de antioxidantes

Vrios compostos isolados de plantas e vegetais

de natureza qumica

diversificada promovem ao antioxidante reconhecida, em potencial aqueles que

possuem, na sua estrutura, um grupamento fenlico, representados por taninos
(Demirezer et al., 2001; Gil et al., 2000; Lin et ai, 2001), cumarinas (Fabre et ai,
2000; Kontogiorgis e Hadjipavlou-Litina, 2003), antraquinonas (Demirezer et al.,
2001; Kim et ai, 2003), (como revisado por Spilkova e Dusek, 1996). Na ltima
dcada,

especial

ateno

tem

sido

dada

ao

potencial

antioxidante

dos

flavonides, em paralelo s suas propriedades antiinflamatrias (Hertog et ai,

1993), antivirais e antibacteriana (Hanasaki et al., 1994), reduzindo o risco de
desenvolvimento de doenas cardiovasculares (Burns et ai,

2000), cncer

(Havsteen, 2002) e do envelhecimento precoce (Yamamoto, 2001).

O termo flavonide engloba um grupo de compostos fenlicos com
estrutura comum caracterizada por dois anis aromticos (A e B) e um anel
heterocclico oxigenado, representado abaixo pela rutina (1) (Filho et ai, 1999),
que, na natureza, possui distribuio ubqa, sendo encontrado em praticamente
todas as plantas, frutas e vegetais, estando presente abundantemente na dieta do
homem (Bravo, 1998; van Acker et ai, 1998).

O-rutinose
OH

Estudos in vitro tm sugerido que o potencial antioxidante dos flavonides

possa estar associado s hidroxilas fenlicas presentes na sua estrutura,
possibilitando a doao de eltrons dos grupos OH para os radicais livres (Chen,
1996; Heijnen et a., 2001), estabilizando-os, alm da quelao de ons metlicos,
particularmente os divalentes, como o Cu+2 e o Zn+2 (Havsteen, 1983; Leake,
2001; Magnani et ai, 2000; Rice-Evans et ai, 1996). Neste contexto, possvel
que a importante atividade antioxidante atribuda aos flavonides seja a
neutralizao de radicais livres, inibindo a peroxidao lipdica (Anderson, 1996;
Benavente et ai, 2000).

1.5 Vegetais como protetores e promotores da sade

Dietas ricas em frutas e vegetais tm sido associadas reduo de
doenas cardiovasculares (Rice-Evans et ai, 1996), certas formas de cncer
(Bonnesen et al., 2001) e outras doenas (Dashwood et ai, 1994; Sorensen et ai,
2001), mas pouco se sabe sobre o mecanismo de ao dessas substncias ou a
sua relao com a quimiopreveno do cncer (Sorensen et ai, 2001). Neste
contexto, estudos epidemiolgicos em humanos e em animais demonstraram
correlao entre o consumo de vegetais e a proteo contra cnceres de
estmago, esfago, pulmes, cavidade oral, faringe, endomtrio, pncreas e
clon (revisado por Steinmetz e Potter, 1996).
Os antioxidantes denominados nutricionais so aqueles comumente
encontrados em frutas e vegetais, como o cido ascrbico (vitamina C), o atocoferol (vitamina E) e o p-caroteno (vitamina A), os carotenides e os
compostos fenlicos, como os flavonides (Oliveira, 2003), anteriormente
apresentados.
Devido a sua diversificada composio, provvel que a ao antioxidante
de extratos vegetais seja resultante da ao sinrgica dessas vrias substncias,
pertencentes a diferentes

grupos

qumicos,

agindo simultaneamente

no

organismo (Sano et al., 2003; Vang et ai, 2001). Entretanto, para se avaliar
efetivamente a ao antioxidante dos vegetais, deve-se buscar, alm do enfoque
analtico de nutrientes, um enfoque sistmico, pois inmeros fatores interferem na
qualidade dos vegetais, como a composio do solo, o clima ou o tipo de cultivo
(Azevedo, 2003).

1.6 Diferentes tipos de cultivos vegetais

Atualmente, o principal sistema de produo de vegetais comestveis o
denominado "convencional", no qual esses alimentos so cultivados diretamente
no solo, com o uso de fertilizantes qumicos diversos e agrotxicos, os quais so
hormnios que atuam como inibidores da sntese de protenas, enzimas e outras
molculas que impedem a proliferao dos agentes que parasitam essas plantas.
So,

tambm,

chamados

pesticidas,

produtos

fitosanitrios

ou

defensivos

agrcolas. Dentre os tipos de agrotxicos mais usados e, ao mesmo tempo, os

menos txicos; esto os herbicidas, enquanto os mais txicos so os inseticidas e
os fungicidas.

Dentre os maiores consumidores

mundiais de

agrotxicos,

destacam-se o Japo, Estados Unidos, Itlia, Reino Unido, Alemanha, Dinamarca

e Brasil. Inmeros casos de intoxicao, diagnosticados por sintomas como dor
de cabea, nervosismo, dificuldade para dormir e falta de apetite, tm sido
relatados (Ferreira et ai, 2003). Alm disso, uma srie de problemas ambientais
tem surgido, como problemas de eroso, baixa produtividade das terras e das
culturas (Darolt, 2003). Por causa desta elevada toxicidade, a utilizao dos
agrotxicos.foi limitada atravs de leis federais que determinam a venda desses
produtos somente com a apresentao de prescrio por profissional da rea
(Ferreira et al., 2003).
Como uma alternativa ao sistema de produo convencional, surgiu o
sistema de produo "hidropnico", no qual os alimentos so cultivados sobre
suportes artificiais, sem a presena do solo e sempre em ambiente protegido
(estufas) (Figura 3) (Darolt, 2003). Entretanto, preciso salientar que os alimentos
produzidos em hidroponia tambm recebem solues qumicas para sua nutrio
e para o tratamento de eventuais doenas pela gua, embora a maioria dos
consumidores desconhea esta informao.
Assim, torna-se importante destacar que os nitratos fornecidos

aos

vegetais atravs da gua, utilizados para aumentar rapidamente a produtividade,

quando ingeridos, passam corrente sangnea, podendo ser reduzidos a nitritos
pela acidez do suco gstrico (Darolt, 2003). Esses, por sua vez, podem combinarse com aminas, formando

as nitrosaminas,

substncias

com

reconhecido

potencial carcinognico (Leito, 2003; Rodet, 2003). De fato, dados recentes tm

revelado que o teor em nitratos encontrado em vegetais hidropnicos tem sido
relevantemente superior ao observado em vegetais de cultivo convencional ou

orgimico (Miyazawa
substancias

et a/. , 2001 ), reafirmando que o monitoramento destas

e essencial

para garantir a qualidade dos alimentos consumidos pela

populac;ao.

Figura 3.

Produ~ao

de vegetais pelo sistema hidroponico

11

1.7 Agricultura orgnica: uma viso mundial e o mercado brasileiro

Se a utilizao de adubos qumicos, por um lado, veio possibilitar maior
rendimento das colheitas de modo a satisfazer quantitativamente as necessidades
do homem, por outro lado, a qualidade nutricional desses alimentos tornou-se
duvidosa. Hbitos alimentares mais saudveis ligados conscincia sobre a
questo ambiental so fatores que tm formado um novo tipo de consumidor e
que aceleraram, na ltima dcada, a produo de alimentos cultivados pelo
sistema "orgnico". Este, segundo a Instruo Normativa N 007 em vigor no
Brasil desde 1999, considera "sistema orgnico de produo, todo aquele em que
se adotam tecnologias

que otimizem o uso de recursos

objetivo a auto-sustentao,
da dependncia

naturais,

tendo

como

a maximizao dos benefcios sociais, a minimizao

de recursos

no renovveis

e a eliminao

de agrotxicos

outros insumos artificiais txicos" (Brasil, 1999).

Os alimentos provenientes de sistema orgnico so identificados com um
selo de qualidade presente nas embalagens (Figura 4), emitido por uma
instituio certificadora, assegurando, desta maneira, que estes alimentos foram
produzidos visando a preservao da sade dos consumidores e do meio
ambiente (Biodinmico, 2003).
O desenvolvimento da agricultura orgnica mundial iniciou-se a partir dos
trabalhos de adubao orgnica 1 realizados por Howard na ndia, no perodo de
1925-30 e, no Brasil, o movimento expandiu-se no final da dcada de 80, com a
criao da Associao de Agricultura Orgnica (Ehlers, 1996). Nos ltimos quatro
anos, o mercado brasileiro de consumo de alimentos orgnicos foi um dos que
mais cresceu no mundo, com taxas de 35% a 50% ao ano, contra 20% a 30%
registrados nos EUA e em alguns pases europeus (Penteado, 2000). O volume
nacional de produo orgnica situa-se na faixa de US$ 220-300 milhes,
plantados em aproximadamente 100 mil hetctares (Ormond eia/., 2002).
O Estado do Paran vem se destacando, no cenrio nacional, como grande
produtor orgnico. Sua produo passou de 4.365 toneladas na safra 1996/97,
para 35.539 toneladas na safra 2.000/01. Mais surpreendente ainda que esse
contingente produtivo caracterizado pela explorao familiar, cuja rea mdia
por produtor da ordem de 3,30 hectares (Emater, 2002).
1

Uso de htnus de minhoca e adubos base de resduos animais e vegetais, como esterco, restos de folhas,
minerais, vegetais e lixo orgnico.

Figura 4.

Apresenta~ao

comercial de vegetais produzidos pelo sistema

organico

13

1.8 Qualidade dos alimentos orgnicos

At o momento, trabalhos que permitam uma comparao, considerando
aspectos nutricionais e de sade humana, entre alimentos produzidos por cultivo
orgnico e pelo cultivo convencional, so escassos (Bourn e Prescott, 2002; Ren
et ai, 2001; Williams, 2002) e estudos epidemiolgicos em grandes populaes
submetidas a dietas com alimentos orgnicos comparadas dietas com alimentos
convencionais ainda no foram realizados (Darolt, 2003).
Em relao qualidade nutricional, de forma geral, para a maioria dos
nutrientes ainda no h um consenso em relao superioridade dos orgnicos.
Todavia, para alguns elementos, parece existir uma tendncia mais clara, como
por exemplo, um menor teor de nitratos (Azevedo, 2003; Bourn e Prescott, 2002),
um teor superior de matria seca (Bourn e Prescott, 2002; Williams, 2002) e um
maior teor de vitamina C (Ren et a., 2001; Smith, 1993; Williams, 2002) em
produtos orgnicos, notadamente em legumes e folhosas. Em relao presena
de compostos fenlicos, a maioria dos estudos mostra um teor mais elevado em
produtos provenientes da agricultura orgnica (Azevedo, 2003; Ren et al., 2001).

1.9 Composio qumica e valor nutricional de vegetais da famlia Cruciferae

Um novo sistema de classificao de vegetais foi proposto por Cronquist
(1988), no qual a famlia Cruciferae, do sistema de Engler (Joly, 1979), foi
denominada Brassicaceae. No entanto, foi adotado neste trabalho o nome
anterior, uma vez que as espcies desta famlia utilizadas como alimento so
mais conhecidas como "crucferas", principalmente entre os pesquisadores da
rea de nutrio.
A famlia Cruciferae representada por mais de 2.000 espcies, com
exemplares importantes na dieta humana (Tabela 1) (Delaquis e Mazza, 1998).
S o mercado de

Brassica oleracea, incluindo brcolis, couve de bruxelas,

repolho e couve-flor, movimentou nos Estados Unidos, mais de US$ 1 bilho,

entre 1996 e 1999. A colheita de brcolis foi a mais rentvel, excedendo US$ 500
milhes/ano, seguida pela do repolho e da couve-flor. Enquanto as estatsticas de
produo e consumo de outros vegetais desta famlia nos Estados Unidos so
escassas (Farnham, 2003), para o Brasil elas so inexistentes.
O incentivo ao consumo de vegetais em geral, e de crucferas em
particular, baseia-se no seu valor nutricional como fonte importante de vitaminas

antioxidantes (vitamina A, C, E, acido f61ico) ,

especiais tais como caroten6ides,

presen~

cumarinas,

de fibras e metabolites

flavon6ides,

glucosinolatos,

compostos fen61icos e terpenos, alto tear de fibras e baixo tear de gordura

(Delaquis e Mazza, 1998; Farnham, 2003; Nestle, 1998).

Tabela 1 - Especies de vegetais da familia Cruciferae e sua

denomina~ao popular, comumente presentes na dieta humana.
ESPECIE

NOME POPULAR

Brassica oleracea L. var. capitata L.

Repolho branco

Brassica oleracea L. var. acephala D.C.

Couve-manteiga

Brassica o/eracea L. var. botrytis L. subv. cauliflora

Couve-flor

Brassica oleracea L. var. gemmifera DC

Couve de bruxelas

Brassica oleracea L. var. botrytis L. subv. cymosa

Br6colis

Raphanus sativus radiculal L.

Rabanete

Brassica napus L. var. napobrassica L.

Nabo

Brassica nigra L.

Mostarda preta

Sinapis alba L.

Mostarda

Raphanus sativus L.

Rabanete

Nasturtium officina/is R. Br.

Agriao

Fonte: (Delaquis e Mazza , 1998)

Neste sentido, Kurilich e colegas (1999) ao avaliarem os teores de

carotene, tocoferol e acido asc6rbico presente nas partes comestfveis de 63
gen6tipos destes vegetais, incluindo br6colis (B. oleracea var. italica) , repolho (B.

oleracea var. capitata), couve (B. oleracea var. acephala) , couve-flor (B. oleracea
var. botrytis) e couve de bruxelas (B. oleracea var. gemmifera) , demostraram que
embora com variac;oes consideraveis, a couve foi a que apresentou maior tear em
vitaminas, seguida pelo br6colis e couve de bruxelas (Kuri lich eta/. , 1999).

15

Por outro lado, estudos tm demonstrado que o tempo entre a colheita e o

processamento do vegetal fator determinante na manuteno da sua qualidade
nutricional e ao antioxidante (Ou et al., 2002; Verhoeven et ai, 1997; Willett,
1994).

1.10. Poder antioxidante de vegetais da famlia Cruciferae

A atividade antioxidante de alguns exemplares de crucferas (brcolis,
couve de bruxelas,

couve-flor,

couve e repolho)

mensurada

por

ensaios

espectrofluorimtricos, demonstrou diversa, porm pronunciada ao (Cao et ai,

1996). Llorach e colegas analisaram a atividade de um subproduto da couve-flor
constitudo, principalmente, de folhas e, em menor quantidade, talos em inibir a
peroxidao lipdica (Llorach et ai, 2003). Esses resultados sugerem utilizao
potencial desses subprodutos como fonte de antioxidantes de custo acessvel
para a indstria, a qual poderia utiliz-los como ingredientes funcionais no
enriquecimento de produtos alimentcios.
Extratos aquosos de couve de bruxelas cozidas e autolisadas,

em

contraste com o efeito de extratos in natura, inibiram a quebra das fitas de DNA
de linfcitos humanos induzida pelo perxido de hidrognio in vitro (Zhu e Loft,
2001). Sucos obtidos de variedades de Brassica oleracea

(brcolis, couve de

bruxelas, repolho e couve-flor) demonstraram atividade antimutagnica induzida

por aminas aromticas heterocclicas em Salmonella typhimurium TA98 e TA100
(Edenharder et ai, 1994). Estas substncias so formadas durante a coco de
alimentos

proticos,

como

carnes

e peixes,

tendo

sua

ao

mutagnica

comprovada em diversos estudos (Colvin et ai, 1998; Krul et ai, 2000). Como os
vegetais da famlia Cruciferae so tambm importantes fontes de tocoferis e
carotenos, possvel inferir que os seus efeitos benficos estejam relacionados
sua ao antioxidante decorrente do efeito sinrgico ou aditivo entre as
substncias neles presentes.

1.11 O eritrcito humano e seu sistema antioxidante

O eritrcito humano maduro uma clula altamente

especializada,

anucleada, na forma de disco bicncavo, sem organelas, com dimetro mdio de

7,4 (im e que vive cerca de 120 dias na circulao perifrica. Possui flexibilidade
fisiolgica notvel conferida pela composio complexa de sua membrana. Sua

principal funyao fisiol6gica esta no transporte de gases entre os tecidos e os

pulm6es, atraves da molecula de hemoglobina (Telen e Kaufman, 1999).
A hemoglobina (Hb) e uma protefna globosa basica, com 64.500 Daltons,
cuja principal fun<;ao e a de transportar 0 2 . Sua molecula e composta par uma
parte proteica, constituida por quatro cadeias polipeptidicas, denominada globina.
Cada uma destas cadeias contem o grupo prostetico heme, constituido de uma
protoporfirina (anel tetrapirr61ico). No centro do anel insere-se urn atomo de ferro
(Fe), o qual deve estar na forma ferrosa 3 (Fe++) para possibilitar o transporte de
02. Devido a exposi<;ao continua
oxida-se vagarosamente

a elevadas concentra<;6es de 02,

a metahemoglobina

o Fe++ da Hb

(metaHb) 2, uma protefna incapaz

de carrear oxigenio, par possuir o Fe+++_ Para o restabelecimento da fun<;ao da

Hb, a metaHb deve ser reduzida pela enzima metaHb redutase (Telen e Kaufman,
1999).

met aH b-red utas e

CH2

CH 2

CH2

CH2

COOH

COOH

I
I

Heme ferrico

Heme

0 fato de o eritr6cito maduro nao possuir determinadas organelas implica

na inexistencia do ciclo de Krebs. Para sobreviver, esta celula utiliza fontes de

17

energia alternativas, principalmente a via glucoltica anaerbia de EmbdemMeyerhof e o ciclo das pentoses, ou via das hexoses monofosfato (Figura 5). Em
situaes normais, aproximadamente 90% da glucose metabolizada pela via
anaerbia, enquanto que os 10% restantes seguem pela via aerbia (Naoum,
1997; Telen e Kaufman, 1999). Enquanto a via glucoltica anaerbia ocorre no
citoplasma e gera duas molculas de ATP para cada molcula de glucose
degradada a lactato, o produto mais importante do ciclo das pentoses o
NADPH, que mantm os nveis de glutationa reduzida (GSH) normais (Champe e
Harvey, 1997).
Essa substncia tem a capacidade de modular a reatividade de espcies
reativas, freqentemente formados, como por exemplo, H2O2, neutralizando-os,
em reao catalisada pela glutationa peroxidase. Aps a neutralizao do radical
livre, a glutationa passa forma oxidada (GSSG), destituda de propriedades
protetoras. No entanto, a clula regenera a GSH em reao catalisada pela
glutationa redutase, utilizando o NADPH como fonte de eltrons. Assim, o NADPH
fornece eltrons indiretamente para a reduo do H2O2 (Champe e Harvey, 1997)
ou outros radicais livres, constituindo um mecanismo de fundamental importncia
na proteo dos eritrcitos contra a sobrecarga oxidativa, sendo capaz de impedir
a oxidao lipdica e de protenas, em particular da Hb (Telen e Kaufman, 1999).
A gerao de NADPH o principal estmulo para a utilizao de glucose 6fosfato

desidrogenase

(G6-PD)

pelo

ciclo

das

pentoses.

Alguns

agentes

redutores, tais como o azul de metileno, a cistena ou o ascorbato, podem

estimular em at vinte vezes o ciclo das pentoses, presumivelmente por causar a
oxidao da GSH. Esta flexibilidade metablica permite ao eritrcito responder a
estresses oxidativos inesperados (Davidson e Tanaka, 1972; Halley, 1985; Stern,
1989; Tavazzi et al., 2000).

1.12 O eritrcito humano e o estresse oxidativo

O termo hemlise abrange todos os mecanismos diretos e indiretos que
causam a destruio do eritrcito (Telen e Kaufman, 1999), diminuindo o seu
tempo de vida na circulao. As leses do eritrcito causadas por uma
sobrecarga oxidativa so, geralmente, resultado final de dois processos: a
oxidao e desnaturao da Hb e o ataque de radicais livres aos lipdeos e s
protenas da membrana.

Estresse

glucose

oxidativo

glicose 6-fosfato (G6P)

G6PD

Glutationa
redutase
NADPH+H+

Glutationa
peroxidase

2H 20

6-fosfo-

Figura 5. Metabolismo anaer6bico do eritr6cito humano e sua interrela~io com o

ciclo das pentoses. Devido a inexistemcia de determinadas organelas, o eritr6cito utiliza
como fonte de energia vias alternativas (via glucolitica e o ciclo das pentoses). Na via
glucolitica, sao geradas duas moleculas de A TP para cada molecula de glucose. 0 ciclo
da pentoses con some cerca de 10% da glucose, mas e de fundamental importancia na
manutenyao dos niveis normais de NADPH, atraves da oxida~o da glucose-6-fosfato,
reayao catalisada pela glucose-6-fosfato desidrogenase (G6-PD). A glutationa reduzida
(GSH) pode neutralizar quimicamente radicais livres, como o per6xido de hidrogemio
(H 20 2) em reayao catalisada pela glutationa peroxidase, formando glutationa oxidada
(GSSG). A celula regenera a GSH utilizando o NADPH como fonte de eletrons redutores.
Adaptado de Champe e Harvey, 1997.

19

Quando h sobrecarga das defesas antioxidantes do eritrcito, pode

ocorrer hemlise devido inabilidade do eritrcito em regenerar os componentes
lesados (Hatherill et al., 1991).
A oxidao da Hb envolve o compartilhamento de eltrons do Fe +2 do
grupamento heme com o O2, levando a oxihemoglobina para a forma de
superoxiferrihemoglobina. A reao reversvel e, quando o 0 2 liberado, a
oxihemoglobina dissocia-se parcialmente em sua forma desoxigenada e O2 O
radical 02~* tambm pode ser dissociado, causando a oxidao do Fe +2 para a
forma Fe+3, com produo de metahemoglobina (metaHb), tambm denominada
de ferrihemoglobina, a qual tambm gerada pela exposio da Hb ao

H2O2,

pela

dismutao do O2 (Mansouri e Lurie, 1993; Telen e Kaufman, 1999). A velocidade

de oxidao aumenta quando h um aumento de temperatura, diminuio do pH e
na presena de fosfato orgnico ou ons metlicos (Telen e Kaufman, 1999).
O Fe +2 da Hb exposto continuamente elevadas concentraes de O2 e
oxida-se vagarosamente metaHb, uma protena incapaz de carrear oxignio,
como anteriormente referido. Para o restabelecimento da funo da Hb, a metaHb
em condies fisiolgicas, reduzida pela enzima

NADH-metahemoglobina

redutase 2 (metaHb redutase), a qual atua principalmente na presena de dois

transportadores de eltrons: o citocromo b5 e o NADH. Uma pequena parte da
metaHb reduzida por sistemas no-enzimticos, atravs do cido ascrbico e
da glutationa. O sistema de reduo altamente eficiente, sendo que, no sangue
circulante, so encontradas quantidades insignificantes de metaHb (Atamna e
Ginsburg, 1995; Mansouri e Lurie, 1993; Telen e Kaufman, 1999). Em eritrcitos
normais, a produo diria de metaHb menor que 1% da hemoglobina total
devido ao equilbrio entre produo e reduo da mesma (Telen e Kaufman,
1999).
Quando o balano entre a oxidao e a reduo do heme perturbado
pela presena de excesso de oxidantes, diminuio da capacidade de sistema de
reduo (metaHb anormal que no responde reduo, deficincia do citocromo
b5 redutase nos eritrcitos) ou pela presena de Hb anormais, ocorre um
aumento de metaHb (Atamna e Ginsburg, 1995; Mansouri, 1985; Mansouri e
Lurie, 1993).

Sinnimos da metaHb redutase: citocromo b5 redutase, NADH desidrogenase, diaforase 1.

Como ilustrado na Figura 6, in vitro, durante uma desnaturao oxidativa, a

metaHb pode ser convertida em hemicromos reversveis, os quais podem ser
reduzidos Hb funcional. Porm, se o estresse continuar, ocorre produo de
hemicromos irreversveis, que precipitam junto com a globina e a hemina,
formando os chamados corpos de Heinz (heinz, 1890), produtos finais de
desnaturao oxidativa da Hb (Peisach et ai, 1975).

Oxihemoglobina
Deoxihemoglobina
Metahemoglobina

Hemicromo reversvel

Hemicromo irreversvel

Precipitados de hemicromo
"Corpos de Heinz"

Figura 6. Formao de corpos de Heinz pela ao de espcies

r e a t i v a s d e o x i g n i o . A metahemoglobina (metaHb) pode ser
reduzida desoxihemoglobina atravs da ao de enzimas e por
outros mecanismos. No entanto, um aumento na sobrecarga
oxidativa ou enfraquecimento das defesas antioxidantes, resulta em
um aumento das espcies reativas de oxignio. O radical
superxido um dos principais responsveis pelo processo de
oxidao da hemoglobina, levando formao de metaHb e,
posteriormente, formao de hemicromos que se ligam
membrana e evoluem para a forma de corpos de Heinz, destruindo
a membrana e provocado hemlise do eritrcito.

1.13 Eritrcitos sob ao de drogas oxidantes

Substncias como a acrolena, dapsona, cloridrato de fenil-hidrazina (Fh),
terc-butil hidroperxido e isouramil geram espcies reativas de O2 no interior dos
eritrcitos e, desta forma, podem causar danos oxidativos aos lipdeos e
protenas, ou mesmo produzir metaHb (Ciccoli et al.: 1994; Ferrali et ai, 1997;
Stern, 1989). O mesmo pode ocorrer com o uso de alguns medicamentos, como
por exemplo, o acetaminofeno e algumas drogas utilizadas no tratamento do
cncer, como a hidroxiuria (Malec, 1984).
A fenil-hidrazina (Fh) um exemplo clssico de droga que induz dano
oxidativo nos eritrcitos de indivduos saudveis, interagindo diretamente com
essas clulas, formando espcies reativas, que podem provocar desnaturao
oxidativa da Hb e efeitos deletrios sobre as protenas e lipdeos da membrana
(Chakrabarti etal., 1995; Misra e Fridovich, 1976; Stern, 1989).

1.14 Mtodos experimentais de avaliao da atividade antioxidante

A atividade antioxidante de uma substncia no pode ser mensurada
diretamente, mas atravs dos seus efeitos sobre um substrato ou sistema
passvel de ser monitorado. A maioria desses mtodos usa processos oxidativos,
que envolvem a adio de um agente iniciador, como a temperatura, agitao ou
uma presso parcial de O2, um metal de transio ou mesmo exposio luz,
para acelerar o processo, e uma fonte de radicais livres especfica. Esses radicais
so, ento, oxidados sob condies padronizadas e o grau de oxidao, ou sua
extenso, medido (Antolovich et ai, 2002).
Muitos mtodos e modos de expressar a atividade antioxidante de extratos
obtidos de plantas e vegetais tm sido utilizados, onde o efeito de vrias
concentraes comparado ao efeito exercido por uma substncia de referncia,
como as vitaminas C ou a E, ou mesmo um composto puro, como a quercitina e a
rutina. Contudo, como recentemente destacado por Antolovich e colegas (2002),
distino entre atividade antioxidante e capacidade antioxidante deve estar
presente quando se interpreta os resultados, uma vez que esta refere-se
somatria de todas as atividades antioxidantes exercidas individualmente por
cada componente presente em uma mistura, como o caso de extratos.

1.14.1 Metodos quimicos

Oentre OS metodos qufmicos, destaca-se 0 metodo que utiliza 0 radical

DPPH (1 ,1-difenil-2-picrilhidrazil) 4, o qual e um radical livre estavel (DPPH.) que,

na

presen~a

de urn antioxidante doador de hidrogenio (AH), pode ser reduzido em

meio alco61ico, formando difenil picrilhidrazina 5 (Koleva eta/., 2002).

Esta
pela

redu~ao

diminui~o

pode ser acompanhada espectrometricamente em 518 nm,

da absorvfmcia, com simultanea

escura original da

solu~ao

mudan~

da

colora~o

violeta

para amare Ia (4-5), descorando a medida que a reac;ao

com a soluc;ao teste se processa. Quanto maior a atividade antioxidante, menor

sera a

colora~o

violeta da

solu~ao ,

ou seja, o DPPH. residual, mensurado ap6s

certo tempo, corresponde inversamente

a capacidade antioxidante da substancia

analisada.

+A"

+AH

Os mecanismos de

rea~ao

propostos para o metodo do DPPH, descritos

por Brand-Williams e colaboradores (1995, 1997) para substancias fen61icas e

ilustrados em seguida, parecem envolver, de forma isolada ou combinada, a [1]
dimeriza~ao

entre dois radicais fenoxil, seguida da regenerac;ao de dois grupos

hidroxila pela transferencia do hidrogenio, podendo novamente reagir com DPPH.

e [2] uma molecula de DPPH. pode complexar-se com urn radical aril.

23

DPPH '

r\r\

O-H

R'

DPPH-H

aNX)
R'

VJ

NN^jN0

NO2

OH

'

OH

NOR

Esquema 1. Proposta de mecanismos de reao para substncias fenlicas

com DPPH (Brand-Williams, 1995).
[1] dimerizao entre dois radicais fenoxil, seguida da regenerao de dois grupos
hidroxila pela transferncia do hidrognio, podendo novamente reagir com DPPH" e [2]
uma molcula de DPPH* pode complexar-se com um radical aril, os quais podem ocorrer
de forma isolada ou combinada.

O mtodo do DPPH mostra-se como uma alternativa rpida, pois ocorre em

aproximadamente 30 min, de custo praticvel por utilizar reagentes acessveis e
por no necessitar de equipamentos sofisticados. Alm disso, neste mtodo, a
eficincia antioxidante mensurada em temperatura ambiente, eliminando-se o
risco potencial de degradao trmica de algumas das substncias analisadas
(Bondet et a., 1997).
Outro mtodo freqentemente usado para avaliar a atividade antioxidante
+6
+5
o ensaio do fosfomolibdnio, o qual baseia-se na reduo do Mo

para Mo

com subseqente formao de um complexo fosfato-Mo +5 , distinto por sua

colorao verde em pH cido, com absoro mxima em 695 nm (Lu e Food,
2001; Prieto et a, 1999). Em contraste com o mtodo do DPPH acima descrito,
esta reao se processa a temperaturas elevadas e por tempo prolongado (Prieto
et ai, 1999).
1.14.2 Sistemas biolgicos
Devido

ao

reconhecido

efeito

dos

radicais

livres

contribuindo

na

patognese das vrias doenas humanas (Holley e Cheeseman, 1993), com

conseqncias, muitas vezes, devastadoras, a procura por substncias que
possam atenuar ou mesmo impedir suas aes tem se ampliando, assim como os
mtodos para avaliar o potencial antioxidante dessas substncias, de origem
natural ou sinttica.
De maneira geral, pode-se estudar os efeitos protetores de antioxidantes
atravs de sistemas biolgicos in vivo e in vitro. Para ambos, necessrio, como
relatado para os mtodos qumicos, estabelecer-se modelos de induo de
oxidao, selecionar o agente indutor do dano oxidativo e o modo de se mensurar
o efeito exercido pelo(s) antioxidante(s) ou sua extenso (Lon et a,

1999).

Porm, em contraste com os mtodos qumicos, os radicais livres biolgicos de

interesse so extremamente reativos e de vida curta, pois, sendo produzidos in
vivo, reagem no local ou prximo sua fonte de gerao. Conseqentemente,
sua atividade , usualmente, medida por mtodos indiretos, onde se avalia a
interao desses com componentes lipdicos ou proticos das clulas. Alm
disso, quando substncias antioxidantes so administradas em animais ou
humanos, o ambiente qumico no qual atuam altamente controlado e seus nveis

so limitados pelos seus ndices de absoro e excreo. Assim, h maiores

dificuldades em induzir-lhes um estresse oxidativo ou medir seu efeito (Anderson
e Phillips, 1999).
As tcnicas

atualmente

disponveis

para

a medio

do efeito

dos

antioxidantes frente ao de radicais livres in vivo so, assim, limitadas a

ensaios semiquantitativos do dano oxidativo residual imposto a diferentes classes
de biomolculas (Holley e Cheeseman, 1993). Por exemplo, tecidos so mantidos
sob condies constantes de estresse oxidativo e a atividade de enzimas
antioxidantes endgenas pode ser mensurada, possibilitando a investigao dos
efeitos exercidos pelo antioxidante em teste (Anderson e Phillips, 1999).
Os mtodos in vitro para avaliar a capacidade antioxidante so muito
sensveis ao ambiente qumico em que eles ocorrem, particularmente

na

concentrao de oxignio, presena de metais de transio e de numerosos

compostos 'redox' ativos (Anderson e Phillips, 1999). Dessa forma, vrios testes
podem ser utilizados como, por exemplo, os sistemas xantina-xantina oxidase
(Chang et ai., 1994; Chang et ai, 1993), peroxidao do cido linolico (Kuo et
al., 1999), substncias reativas aos produtos de oxidao do cido tiobarbitrico
(TBA) (Holley e Cheeseman, 1993).
Recentemente, os efeitos protetor e oxidante da vitamina C sobre o
estresse oxidativo induzido pela Fh em eritrcitos humanos foi investigado atravs
dos nveis de metaHb formada (Claro, 2002), assim como a preveno na
formao

de

corpos

de

Heinz

e depleo

de

GSH

induzido

por

terc-

butilhidroxiperoxido (TBH) pelo extrato hidroalcolico de Vitis vinifera, rutina e

quercitina (Cornar, 2002). Devido s propriedades morfofisiolgicas, relativa
estabilidade quando preservados in vitro e, principalmente, facilidade de obteno
(Ferrali et al., 1992), este sistema tornou-se alvo de interesse com a finalidade de
se estabelecer um sistema biolgico alternativo que se aplicasse ao estudo da
atividade antioxidante de extratos de vegetais e plantas medicinais.
Assim, no presente trabalho, a capacidade antioxidante de extratos obtidos
de crucferas foi investigado usando-se os mtodos qumicos do fosfomolibdnio
e do DPPH. Ainda, estudou-se o sistema antioxidante natural dos eritrcitos
humanos e a influncia das culturas convencional, orgnica e hidropnica na ao
antioxidante exercida por esses extratos.

So objetivos gerais deste projeto:

Avaliar a capacidade antioxidante de extratos de vegetais da famlia

Cruciferae usados na dieta regular, obtidos de diferentes cultivos, utilizando
mtodos qumicos e um sistema biolgico.

1.

Avaliao in vitro da capacidade antioxidante dos extratos aquosos de

Brassica oleracea L. var. capitata (repolho branco), de Brassica oleracea L. var.

acephala
cauliflora

DC (couve-manteiga), de Brassica oleracea

(couve-flor), de Brassica

(brcolis), de Nasturtium

officinalis

oleracea

L. var. botrytis L. subv.

L. var. botrytis L. subv. cymosa

(agrio) e de Raphanus

sativus

radiculal

(rabanete), usando o mtodo de reduo pelo fosfato de molibdnio, tendo a

vitamina C e a rutina como substncias de referncias.
2.

Avaliao in vitro da capacidade antioxidante dos extratos hidroalcolicos

de Brassica oleracea L. var. acephala DC (couve-manteiga) e Brassica

oleracea

L. var. botrytis L. subv. cymosa (brcolis), mediada pelo radical 1,1 -difenil-2picrilhidrazil (DPPH), antes e aps a retirada da clorofila e substncias lipoflicas,
tendo a vitamina C como referncia.
3.

Avaliao da capacidade antioxidante dos extratos hidroalcolicos de

Brassica oleracea L. var. acephala DC (couve-manteiga) e Brassica oleracea L.

var. botrytis L. subv. cymosa (brcolis), usando os mecanismos antioxidantes
naturais do eritrcito humano mediados pela hemoglobina contra o estresse
oxidativo induzido pela fenil-hidrazina.
4.

Avaliao da influncia dos cultivos convencional, hidropnico e orgnico

sobre a capacidade antioxidante de Brassica

oleracea

L. var. acephala

DC

(couve-manteiga) e Brassica oleracea L. var. botrytis L. subv. cymosa (brcolis).

H consenso entre profissionais da rea da sade (nutricionistas, mdicos,

farmacuticos etc), pesquisadores, indstrias de alimentos e consumidores da
inter-relao entre dieta e sade e que a ingesto de alimentos ricos em fibras,
pobres em gorduras e alimentao predominantemente base de frutas e
verduras diminuem o risco de doenas crnicas como artrite, cncer, osteoporose
e corionariopatias (Cndido e Campos, 1995; WCRF, 2002).
Vrios

estudos

tm

demonstrado

que

atividade

antioxidante

de

compostos presentes em uma dieta regular concorre para com a reduo do risco
de desenvolvimento de certas doenas degenerativas. Alm disso, observa-se um
aumento das evidncias sobre os efeitos protetores que exercem as substncias
presentes nos vegetais tais como os flavonides, folatos, carotenides e
glucosinolatos

(Dekker

et

a,

2000),

demonstrados

atravs

de

ensaios

experimentais in vivo e in vitro. Baseado nessas observaes, o comit do World

Cncer Research Fund e o Institute for Cncer Research recomendam o consumo
dirio de 400 a 800 g de frutas e verduras (WCRF, 2002).
A ingesto de vegetais da famlia Cruciferae como parte de uma dieta
balanceada poderia, ento, ser uma fonte alternativa efetiva de substncias
contra o estresse oxidativo imposto ao organismo humano diariamente. Devido
diversidade desses vegetais presentes na dieta regular dos brasileiros e aos
efeitos biolgicos relacionados com seu consumo, toma-se relevante avaliar-se a
capacidade

antioxidante de alguns exemplares,

assim como investigar

diferentes tcnicas de cultivo podem influenciar essa atividade.

se

Metodologia
Os sais e reagentes utilizados neste trabalho so pr-anlise. No preparo
das solues, utilizou-se gua ultrapura, obtida pelo sistema Puritech/Permution.
Todos os solventes foram purificados antes do uso (Perrin et al., 1966).
Para o preparo das solues utilizou-se balana analtica Belmark 210-A e
pHmetro Mettler MP220, sendo o pH das solues ajustado com soluo NaOH N
quando necessrio. As solues foram armazenadas em temperatura de 4-8C,
salvo indicao contrria.
A homogeneizao das amostras se deu por rotao em aparelho Phoenix
Hs e, para a separao dos eritrcitos, utilizou-se centrfuga Sigma 4K15. As
absorvncias foram obtidas em espectrofotmetro Shimadzu UV 1601.
Para as cromatografias em camada delgada, utilizou-se cromatoplacas de
slica, pr-ativadas com fase estacionria Kiesegel 60

(F254,

Merck), visualizadas

sob luz ultravioleta (UV).

2.1 Solues

Soluo reagente para ensaio antioxidante pelo mtodo do complexo

fosfomolibdnio: cido sulfrico (0,6 M), fosfato de sdio (28 mM) e
molibdato de amnio (4 mM) em gua.

Soluo reagente para ensaio antioxidante da reduo do radical livre

1,1 -difenil-2-picrilhidrazil (DPPH): 0,3 mM em etanol

Soluo salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 (Ciccoli et al.,

1994; Ferrali et al., 1997): NaH 2 P0 4 .2H 2 0 (123 mM), Na 2 HP0 4 (27 mM) e
NaCI (123 mM) em gua.

Soluo salina tamponada com fosfato (PBS) e glucose, pH 7,6: PBS

acrescido de glucose (200 mg/dl).

Tampo fosfato M/15 pH 6,6: K 2 H P 0 4 (67 mM) e KH 2 P0 4 (67 mM) em

gua.

Tampo fosfato M/60: diluio 1:4 (v/v) do tampo fosfato M/15.

Soluo de cido actico 12% (v/v): CH 3 C0 2 H (1,2 ml) em gua (8,8 ml).

Soluo de cianeto de sdio 10% (p/v): NaCN (1 g) em gua (10 ml).

Para o preparo de cianeto de sdio neutralizado procedeu-se diluio 1:1
(v/v) com cido actico 12%.

Soluo de ferricianeto de potssio 20% (p/v): K 3 [Fe(CN) 6 ]) (2 g) em

gua (10 ml).

Soluo de hexametilenotetramina 0,5% (p/v): hexametilenotetramina

(250 mg) em gua (50 ml).

Soluo de cido clordrico 25% (v/v): HCI (25 ml) em gua (100 ml).

Soluo de cido actico glacial 5% (v/v):

C H 3 C O 2 H

(5 ml) em metanol

100 ml.

Reativo de cloreto de alumnio 20% (p/v):

A I C I 3

(20 g) em soluo de

cido actico glacial 5 % (100 ml).

2.2 Material vegetal

Os vegetais Brassica oleracea L. var. capitata L (repolho branco), Brassica
oleracea L. var. acephala DC (couve-manteiga), Brassica oleracea L. var. botrytis
L. subv. cauliflora (couve-flor), Brassica oleracea L. var. botrytis L. subv. cymosa
(brcolis), Nasturtium officinalis (agrio) e Raphanus sativus radiculal (rabanete),
todos da famlia Cruciferae, foram gentilmente cedidos pelos produtores conforme
discriminado a seguir:

cultura convencional: couve-manteiga, couve-flor, rabanete, brcolis e repolho

(Ovos Agro, So Jos dos Pinhais/PR);

cultura orgnica: couve-manteiga, couve-flor, rabanete, brcolis e repolho

(Chcara Fruto da Terra, Colombo /PR);

vegetais

hidropnicos:

couve-manteiga

agrio

(Irmos

Lazarotto,

Colombo/PR).

Os exemplares foram coletados em 17 de maio de 2003 acondiciondos em

caixas isotrmicas contendo gelo, sendo encaminhados imediatamente para o
laboratrio, onde os vegetais foram fracionados em triturador marca Philips e
armazenados temperatura de -10C. O tempo entre a colheita, o processamento
e o armazenamento foi inferior a 8 h. A identificao dos vegetais foi fornecida
pelos produtores no dia da coleta, bem como os defensivos utilizados, os quais
no esto listados neste trabalho por ser de caracter particular para cada tipo de
vegetal e tcnica de cultivo empregada.

2.3 Determinao do teor em umidade

Uma alquota de cada vegetal in natura (25 g) foi levada secura em
estufa de circulao de ar modelo Fanem 315-SE (50C/4 h) para determinao
do teor de umidade, o qual foi obtido pela diferena entre o peso inicial do vegetal
e seu peso aps secagem. O material seco foi usado para obteno do extrato
aquoso, o qual foi utilizado para realizao do ensaio da reduo do complexo
fosfomolibdnio.

2.4 Preparao dos extratos

2.4.1 Extrato aquoso

Os extratos aquosos foram usados para os ensaios de reduo do
complexo fosfomolibdnio. Para tanto, preparou-se infuses com o material seco
(1,25 g) em gua fervente (25 ml), por 30 min. Em seguida, foram filtrados e

transferidos para balao volumetrico, sendo o volume final ajustado para 50 ml com
agua (concentra98o final de 2,5%).

2.4.2 Extrato etan61ico

Os extratos etan61icos foram utilizados para os ensaios de reduc;8o do
DPPH, onde os vegetais in natura (200 g), previamente fracionados, foram
macerados por 6 dias em funil de

separa~o,

utilizando-se urn sistema solvente

composto por etanol-agua (7:3), sendo que ap6s este periodo houve visualmente
a descolorac;ao dos extratos. Os extratos obtidos ap6s a evaporac;ao do solvente
em rotavapor sob pressao reduzida e temperatura inferior a 50 C, foram divididos
em duas frayoes: uma para

liofiliza~o

e a outra, para

elimina~o

da clorofila e

substancias lipofflicas (C/SL), seguida de liofilizayao (Fiuxograma 1). Os extratos

vegetais foram liofilizados em aparelho Labconco, permanecendo armazenados a
-18

oc ate o momenta do uso.

[

Vegetal (200 g)

~ macera~ao com etoh 70%, -144 h

Extrato Total

evapora~ao do solvente

[ Extrato Concentrado

retirada da clorofila *

Extrato liofilizado

*agitaGao por 8 h em
banho de gelo

Extrato sem C/SL

Extrato sem C/SL
liofilizado

Fluxograma 1 - Esquema geral de obten~ao de extrato etan61ico

das cruciferas usadas neste trabalho.
C/SL: extrato ap6s retirada de clorofila e substancias lipofilicas.

32

2.4.3 Eliminao da clorofila e de substncias lipoflicas dos extratos

de crucferas (Santos, 2003)
Fraes liofilizadas dos extratos (7 g) foram suspensas em gua (70 ml).
Aps 8 h de agitao mecnica contnua em banho de gelo seguida de repouso
refrigerado por 12 h, observou-se deposio da clorofila junto com material
lipoflico nas laterais e fundo do recipiente, os quais foram retirados por filtrao
em funil de Bchner utilizando-se papel filtro. Em seguida, as fraes foram
liofilizadas e conservados a - 1 0 C, at o momento do uso.

2.5 Abordagem do potencial antioxidante dos extratos por cromatografia de

camada delgada (Conforti et ai, 2002; Wagner e Bladt, 1996)
Foram aplicados 10 ^l de rutina (1 mg/ml), usada como padro, e os
extratos

de couve-manteiga

e brcolis

(10 mg/ml) foram submetidos

cromatografia em camada delgada (CCD), usando-se, como fase mvel, acetato

de etila:cido frmico:cido actico:gua (100:11:11:26). Em seguida, as placas
foram reveladas com soluo a 0,2% (p/v) de DPPH em etanol e fotografadas
com auxilio de cmara digital Canon A102.

2.6 Ensaio da reduo do complexo fosfomolibdnio (Prieto etal., 1999)

Extratos aquosos (200 ng/ml, 0,3 ml) foram adicionados de soluo
reagente do complexo fosfomolibdnio (1 ml) e incubados por 90 min a 95 C.
Aps resfriamento, procedeu-se a leitura em 695 nm para obteno das
absorvncias, usando-se gua como branco. A capacidade antioxidante dos
extratos foi expressa em relao a vitamina C (200 ng/ml) usado como padro, e
rutina (200 ng/ml) cuja atividade antioxidante de referncia foi considerada 1,00.

2.7 Ensaio de reduo do radical livre DPPH

Este ensaio foi realizado segundo metodologia descrita por Koleva e
colaboradores (Koleva et ai, 2002) com modificaes propostas por Choi e
colegas (Choi et al., 2002). Dessa forma, a vitamina C (200 ^g/rnl) como padro e
concentraes de 0,01 a 10 mg/ml dos extratos de vegetais liofilizados foram
preparadas em etanol (p/v - 2,5 ml), tratadas com soluo de DPPH (1,0 ml) por
30 min a temperatura ambiente e a absorvncia das amostras obtidas em 518 nm

contra um branco especfico para cada concentrao (2,5 ml de extrato e 1,0 ml

de etanol). Como controle, utilizou-se uma soluo de etanol (2,5 ml) e de DPPH
(1,0 ml). Os resultados esto apresentados como a percentagem de DPPH*
consumido, obtida segundo a frmula abaixo:

% de DPPH* consumido = 100 - {[(Absamostra - Absbranco) x 100] / Absc0ntr0ie}

2.8 Ensaio de inibio de formao de metahemoglobina induzida pelo

cloridrato de fenil-hidrazina (Fh) em eritrcitos humanos, segundo
Evelyn (Evelyn e Malloy, 1938) modificado por Beutler (Beutler et ai,
1995)
Amostras de sangue perifrico foram coletadas por puno venosa aps
consentimento livre e esclarecido (Anexo A), aprovado pelo Comit de tica em
Pesquisa em Seres Humanos do Hospital de Clnicas da UFPR (Anexo B).

2.8.1 Obteno e isolamento de eritrcitos humanos (Ciccoli et ai,

1994; Ferrali et ai, 1997)
Sangue venoso humano (20 ml) anticoagulados com EDTA-K3, coletado de
voluntrios adultos considerados saudveis por no apresentarem nenhum sinal
ou sintoma de enfermidade, com idade variando entre vinte e cinqenta anos, foi
centrifugado (25 min, 800 g) a temperatura ambiente, para retirada do plasma e
da camada leucocitria, sendo, em seguida, lavado (5 min, 800 g) duas vezes
com PBS. Os eritrcitos foram, ento, ressuspensos em PBS e o volume globular
ajustado para 35%, usando-se o mtodo do microhematcrito (Dacie e Lewis,
1995).

2.8.2 Tratamento das amostras (Claro, 2002; Ferrali et ai, 1997)

Alquotas da suspenso de eritrcitos (1 ml) foram tratadas com soluo de
vitamina C (concentrao final 20mM) ou com extratos vegetais (concentraes
finais de 0,01 a 100 mg/ml), por 1 h sob homogeneizao contnua ou com
soluo de cloridrato de fenil-hidrazina (concentrao final 1 mM), por 20 min a
temperatura ambiente sob homogeneizao contnua, aps serem aeradas com

auxlio de pipeta Pauster. Em alguns experimentos, primeiramente, tratou-se os

eritrcitos com vitamina C ou com diferentes concentraes dos extratos por 30
min a temperatura ambiente e, em seguida, com soluo de Fh por 20 min,
ambos sob homogeneizao contnua.

2.8.3 Obteno dos fatores FA, FB e FD (Beutler et ai, 1995)

Alquotas de sangue total (50 nl) recm coletados foram diludas em
tampo fosfato M/60 (5 ml) e adicionadas de soluo de ferricianeto de potssio
20% (25 nl). Aps homogeneizao por 5 min a temperatura ambiente, as
absorvncias da metaHb formada foram obtidas em 630 nm (FA), contra gua.
Em seguida, adicionou-se cianeto neutralizado (25 jil) e, aps 5 min de repouso,
procedeu-se nova leitura em 630 nm (FB), usando-se gua como branco. Nesta
etapa a metaHb desaparee.
Alquotas das solues anteriores (1 ml) foram transferidas para outra srie
de tubos contendo tampo fosfato M/15 (4 ml) e solues de ferricianeto de
potssio 20% (25 ^l) e de cianeto de sdio 10% (25|il) foram adicionadas. Aps
homogeneizao, realizou-se leitura da cianometahemoglobina a 540 nm (FD),
utilizando-se, como branco, uma soluo de tampo fosfato M/15 (10 ml), soluo
ferricianeto de potssio 20% (50 ^il) e cianeto de sdio 10% (50 ^l). Os resultados
foram obtidos segundo a frmula abaixo e cada fator obtido corresponde mdia
aritmtica de quatro determinaes independentes.

Onde:
A: absorvncia obtida em 630 nm, leitura da metaHb
B: absorvncia obtida em 630 nm, desaparecimento da metaHb
D: absorvncia obtida em 540 nm, leitura da cianometahemoglobina

2.8.4 Determinao da formao de metahemoglobina (metaHb)

Em tubo de ensaio, adicionou-se tampo fosfato M/60 (5 ml) e suspenso
de eritrcitos (50 pl) previamente tratados ou no com Fh, vitamina C ou com
diferentes concentraes dos extratos de crucferas. As amostras foram
homogeneizadas por 5 min a temperatura ambiente e as absorvncias para
metahemoglobina foram obtidas em 630 nm, utilizando-se gua como branco (A).
Em seguida, adicionou-se cianeto neutralizado (25 pl) em cada amostra,
homogeneizou-se e, aps 5 min de repouso, procedeu-se nova leitura em 630
nm, utilizando-se gua como branco (B).
Alquotas das solues anteriores (1 ml) foram transferidas para outra srie
de tubos contendo tampo fosfato M/15 (4 ml), onde adicionou-se soluo de
ferricianeto de potssio 20% (25 pl) e de cianeto de sdio 10% (25 pl). Aps
homogeinizao e repouso a temperatura ambiente por 5 min, realizou-se leitura
em 540 nm (D), utilizando-se, como branco, uma mistura de tampo fosfato M/15
(10 ml), soluo ferricianeto de potssio 20% (50 pl) e cianeto de sdio 10% (50
pl).
A concentrao de metahemoglobina foi determinada de acordo com a
frmula abaixo:

MetaHb% =

FB

Onde:
A:absorvncia obtida em 630 nm, leitura da metaHb
B: absorvncia obtida em 630 nm, desaparecimento da metaHb
D: absorvncia obtida em 540 nm, leitura da cianometahemoglobina
FB: fator varivel de acordo com o espectrofotmetro utilizado

2.9 Pesquisa de flavonides

2.9.1 Mtodo qualitativo:

Reao

de

Shinoda:

aos extratos

etanlicos

de crucferas

foram

adicionados fragmentos de magnsio metlico e, vagarosamente pelas

paredes do tubo de ensaio, adicionou-se HCI concentrado (2 ml). A
positividade da reao, dada pela formao de cianidina, foi monitorada
minutos aps a reao, atravs do aparecimento de colorao vermelha.

Reao com AICI3: reas distintas de papel filtro foram umedecidas (1)
somente com gotas do extrato ou com (2) gotas de extrato juntamente com
soluo de AICI3 a 5% (p/v) ou (3) somente com gotas de soluo de AICI3
a 5% (p/v) e observadas sob luz UV (360 nm). A positividade da reao foi
caracterizada pelo desenvolvimento de fluorescncia na rea umedecida
com extrato e soluo reagente.

2.9.2 Doseamento de flavonides totais (Suisse, 1995)

Extratos liofilizados de couve-manteiga e brcolis, com e sem clorofila,
foram exatamente pesados (0,3 g) e colocados em balo contendo solues de
hexametilenotetramina 0,5% (1 ml), soluo de HCI 25% (2 ml) e acetato de etila
(20 ml). Os flavonides foram extrados aps aquecimento por refluxo durante 30
min, seguido de resfriamento e filtrao. Para proporcionar maior extrao dos
flavonides, o resduo obtido da extrao foi tratado duas vezes com acetona (20
ml) sob refluxo (10 min). Os filtrados foram, ento, reunidos e o volume ajustado
para 100 ml com acetona. Deste, uma alquota (20 ml) foi particionada com gua
(30 ml) e acetato de etila (4 x 10 ml). Aps descarte da fase aquosa, a fase
orgnica foi transferida para um balo volumtrico, ajustando-se o volume para 50
ml com acetona, obtendo-se a soluo A.
Soluo teste: transferiu-se uma alquota da soluo A (10 ml) para balo
volumtrico contendo soluo de cloreto de alumnio (1 ml) e ajustou-se o volume
para 25 ml com cido actico glacial em metanol a 5%. Aps 30 min de repouso,
obteve-se a absorvncia da soluo teste em 422 nm em relao ao branco (10

ml da soluo A e 15 ml de cido actico glacial em metanol). O teor total de

flavonides da amostra analisada foi determinado segundo a frmula abaixo:

Onde:
A: absorvncia em 422nm; m: massa da amostra em gramas

2.10 Anlise estatstica

Os resultados esto apresentados como mdia 1 desvio padro da mdia
(DP) para um nmero de amostra (n) de, pelo menos, trs experimentos
independentes, realizados em triplicata. Para anlise estatstica dos resultados,
utilizou-se o teste t de Student, o teste de regresso simples e intervalos de
confiana, quando indicado e foram considerados significativos quando p < 0,005.

UFPR
UNV
I ERSD
I AOe FEDERAL OO PARAN

Resultados e Discusso
inquestionvel atualmente que o sistema de produo convencional de
alimentos tem deixado resduos de agrotxicos em nveis preocupantes para a
sade pblica. Uma pesquisa recente realizada pela ANVISA em parceria com a
Fiocruz, revelou que, aps analisar amostras de frutas e verduras nos estados de
So Paulo, Minas Gerais, Paran e Pernambuco, 81,2% delas continham
resduos de agrotxicos e, destas, mais de 22% apresentavam resduos acima do
limite permitido (ANVISA, 2001).
Diante deste cenrio, justifica-se o aumento no nmero de consumidores
de alimentos produzidos com tecnologias alternativas, motivados por aspectos
relacionados sade e preservao do meio ambiente, destacando-se aqueles
obtidos de cultivo orgnico, embora ainda no haja um consenso sobre a
superioridade nutricional desses alimentos em relao aos demais (Darolt, 2003).
Vegetais so fundamentais na dieta do homem devido ao seu valor
nutricional como fonte relevante de antioxidantes, substncias capazes de
combater a ao oxidante de muitas substncias (Guo et a., 2001; Ramarathnam
et a, 1995; Steinkellner et a., 2001; Steinmetz e Potter, 1996). Por essa razo, o
Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) recomenda o consumo
de vegetais, com destaque aos da famlia Cruciferae, devido, principalmente, ao
seu contedo em vitamina C, cido flico, flavonides e carotenides (Famham,
2003).

Parece haver, tambm, uma associao

inversa entre o consumo

adequado de frutas e verduras e a reduo do risco de desenvolver doenas

crnico-degerativas. Estas aes benficas esto, provavelmente, associadas
presena de vrias substncias nesses alimentos, incluindo aquelas dotadas de
atividade antioxidante como, por exemplo, as vitaminas C e E, carotenides,
licopenos e flavonides.
Existem antioxidantes sintticos como o BHT ou o BHA, contudo seu uso
tm sido restrito devido sua toxicidade e aos riscos sade. Assim, torna-se

relevante o uso de antioxidantes naturais em substituio aos sintticos (Mansour

e Khalil, 2000). A proposta do presente trabalho foi a de investigar a influncia de
diferentes tcnicas de cultivo sobre o potencial antioxidante de extratos de
crucferas, utilizando-se dois mtodos qumicos regularmente empregados. Alm
disso, usou-se o eritrcito humano como modelo experimental alternativo, com a
finalidade de se propor um sistema biolgico eficaz, sensvel e acessvel que
pudesse,

em

paralelo

aos

ensaios

qumicos

convencionais,

atestar

as

propriedades antioxidantes de extratos vegetais.

Para tanto, foram selecionados seis crucferas que, alm de fazerem
parte da dieta regular humana e estarem disponveis para consumo sob diferentes
tipos de cultivo, tambm pudessem ser colhidas e processadas no mesmo dia,
evitando alteraes ou deteriorao de seu contedo. Dessa forma, repolho
branco, couve-manteiga,

couve-flor,

brcolis, agrio e rabanete, obtidos de

culturas convencional, hidropnica e orgnica quando possvel e de diferentes

fornecedores

foram

colhidos,

transportados

em

baixas

temperaturas

processados em menos de oito horas.

Como garantia dessa operao, o teor de umidade de cada vegetal foi
verificado, pois este parmetro tem sido empregado quando se deseja certificar a
qualidade de vegetais e frutas. O teor em gua aumentado indica, geralmente,
adulterao do produto (Ascar, 1985), enquanto valores dentro de intervalos de
referncia

traduzem adequao

nos procedimentos

de coleta, transporte

armazenamento desses produtos, tornando-os apropriados para o consumo e, no

caso particular deste trabalho, aptos a terem suas propriedades antioxidantes
investigadas.

3.1 Teor de umidade

A Tabela 2 apresenta o teor de umidade das crucferas

estudadas,

determinado aps secagem em estufa (Metodologia, item 2.3). Dentre os trs

tipos de cultura analisados, pode-se observar que os vegetais de culturas
hidropnica e convencional apresentaram maior contedo aquoso em relao aos
cultivados organicamente (p < 0,005), como exemplificado pelos brcolis, onde
teores de umidade de 84,7 0 , 0 3 % e 82,9 0 , 0 1 % nas culturas convencional e
orgnica, respectivamente, foram registrados. Da mesma maneira, para couve-

manteiga, obteve-se 89,1 0,02% de umidade na cultura hidrop6nica, 86,7

0,07% na cultura convencional e 84,3 0,02% na organica.

Tabela 2- Teor de umidade de vegetais frescos da familia

Cruciferae obtidos sob diferentes tipos de cultura.

VEGETAL

TIPO DE
CULTURA

TEORDE
UMIDADE(%)

86,5 0,01

84,7 0,03

82,9 0,01

89,7 0,13

82,2 0,07

86,7 0,07

89,1 0,02

84,3 0,02

94,0 0,17

91,00,13

89,8 0,04

Agriao (folhas e talos)

Br6colis (inflorescencia)
Couve-flor
( inflorescenci as)

Couve-manteiga
(folhas)
Rabanete (raiz)
Repolho branco
(folhas)

Vegetais frescos de diferentes cultivos (C, convencional; 0, orgfmico;

H, hidrop6nico) foram colhidos e processados em menos de oito horas
e seu teor de umidade determinado ap6s secagem em estufa, por 4 h
a 50C. Os val ores representam a media 1DP da percentagem de
umidade obtida pela diferen~a entre o peso inicial do vegetal e seu
peso ap6s secagem (n = 2) .

0 elevado teor em agua em vegetais da familia Cruciferae e amplamente

conhecido e os resultados obtidos com as especies aqui avaliadas foram
semelhantes aos documentados por outros autores (Herrmann, 1994; Singh et at. ,
2001 ).

menor teor

de

umidade

observado

nos

vegetais

organicos,

possivelmente resultante de urn maior teor de materia seca, ou seja, maior teor de
nutrientes por peso de alimento, contribui de forma significativa na durabilidade
destes, como tambem referido por alguns autores (Azevedo, 2003; Darolt, 2003).

41

Este fato est associado com a reduo da atividade de gua dos alimentos
orgnicos, pois havendo menor umidade e menor teor de gua livre, haver
menor grau de proliferao bacteriana e de deteriorao precoce do alimento.

3.2 Avaliao da atividade antioxidante de crucferas pelo mtodo da

reduo do complexo fosfomolibdnio
Embora pequenas diferenas para um mesmo vegetal foram encontradas
conforme o tipo de cultivo, todos os vegetais includos neste trabalho mostraram
teores de umidade muito prximos aos relatados por outros autores, no estando
desta maneira deteriorados, e portanto aptos a serem investigados quanto ao seu
potencial antioxidante. Dessa forma, procedeu-se primeiramente, ao ensaio de
reduo do complexo fosfomolibdnio por ser este um mtodo considerado
simples, de baixo custo e usado quando se deseja avaliar e comparar a
capacidade antioxidante de uma variedade de extratos (Prieto et al., 1999).
Assim, concentraes crescentes de extratos aquosos preparados de diferentes
partes dos vegetais, obtidos de culturas convencional, hidropnica e orgnica
foram submetidas reao de xido-reduo como previamente descrito
(Metodologia, item 2.6) (Figura 7).
A Figura 8 mostra os valores encontrados para a capacidade antioxidante
desses extratos em relao vitamina C (200 jj-g/ml), substncia reconhecida
pelo seu poder antioxidante (May, 1999; VanDuijn et al., 2001, 2002) e
freqentemente utilizada como padro neste tipo de ensaio experimental (Prieto
et al., 1999).
Nela, pode-se observar que todos os extratos avaliados apresentaram
relevante atividade antioxidante, no s com relao vitamina C, mas tambm
com relao rutina, um flavonide abundante em frutas e vegetais, dotado de
comprovada atividade antioxidante (Afanas'ev et al., 1989; Ferrali et al., 1997;
Fiorani et al., 2002). A soluo teste inicial possui colorao amarela tomando-se
verde medida que a soluo de fosfato de mobilidnio reduz-se (Figura 7)
(Prieto et al., 1999)

Figura 7. Colora~Oes dos extratos ap6s redu~ao do complexo

fosfomolibidAnico. As colora~oes mais claras sao resultantes de

pouca transfer6ncia de eletrons, tornando-se mais escuras

que ocorre maier transfer6ncia de eletrons.

a medida

Dentre os extratos estudados, o que apresentou maier potencial para

reduzir o complexo fosfomolibdenico foi o preparado com as inflorescencias de
br6colis proveniente de cultura organica, cuja atividade foi 7,13 0,24 vezes
superior a apresentada pela vitamina C, cuja atividade foi aqui considerada como
1,00. Em uma escala decrescente de val ores para a atividade antioxidante,
seguiu-se o repolho organico (6,06 0,02), a couve-manteiga organica (5,49
0,07), a couve-flor organica (5,47 0,07), os talos de couve-flor convencional
(5,36 0, 10), os talos e folhas de br6colis convencional (5,3 0,08), as
inflorescencias de couve-flor convencional (5, 16 0,07), o rabanete organico
(4,94 0,13), a couve-manteiga hidroponica (4,51 0,17), as inflorescencias de
br6colis convencional {4,2 0,06), couve-manteiga convencional (3,87 0,05) e,

43

por ltimo, o extrato de agrio hidropnico, cuja atividade foi de 2,34 0,06 maior
do que a apresentada pela vitamina C em condies similares.
Esses resultados permitiram observar tambm que (1) h variao no
potencial antioxidante entre as espcies de crucferas analisadas; (2) que os
mtodos de cultivo exercem influncia nessa atividade, exemplificada pelos
extratos de couve-manteiga, onde um potencial antioxidante decrescente foi
observado entre as culturas orgnicas (5,49 0,07), hidropnica (4,51 0,17) e
convencional (3,87 0,05) ou pelos extratos de inflorescncias de brcolis, com
4.2 0,06 e 7,13 0,24 observados para o cultivo convencional e orgnico,
respectivamente; e que (3) a capacidade antioxidante varia de acordo com a parte
do vegetal investigada, ilustrada pelas diferenas observadas quando testou-se
extratos preparados de inflorescncias (4,2 0,06) com aqueles preparados de
talos e folhas (5,3 0,08) de brcolis, ambos oriundos de cultivo convencional.
Embora referncias quanto ao potencial antioxidante de extratos de agrio
e rabanete ainda no se encontrem disponveis na literatura especializada, para
as demais crucferas avaliadas, como brcolis (Cao et al., 1996; Chu et a/., 2002;
Ninfali e Bacchiocca, 2003; Ou et al., 2002), repolho (Cao et al., 1996; Chu et ai,
2002; Ou et al., 2002; Plumb et al., 1997), couve-flor (Llorach et al., 2003; Ou et
al., 2002) e couve-manteiga (Cao et al., 1996), elas so abundantes e, de modo
semelhante aos nossos resultados, revelam um potencial antioxidante desses
vegetais, porm em nveis variveis decorrentes, provavelmente, das diversas
metodologias empregadas.

3.3 Cromatografia em camada delgada (CCD) dos extratos de brcolis e

couve-manteiga
Tendo o extrato aquoso de brcolis apresentado maior efeito antioxidante
em relao aos demais, avaliados pelo mtodo do complexo fosfomolibdnio,
prosseguiu-se na investigao de sua capacidade antioxidante por outra
metodologia qumica, usando-se, desta vez, a da reduo do DPPH. Investigouse, tambm, com mais detalhes a atividade antioxidante de couve-manteiga por
ter sido o nico vegetal, dentre os estudados, obtido sob trs diferentes formas de
cultivo. Para tanto, extratos etanlicos foram preparados e submetidos a CCD
como ensaio preliminar, usando-se a rutina como substncia de referncia, cuja

capacidade de reduzir o DPPH em

condi~oes

experimentais similares foi

recentemente descrita (Bianco, 2003; Choi eta/., 2002).

vltamlna C

rutlna
agriAo hldrop.

''II"

fl

couve-mant. conv.

jl

br6colls(lnftoresc) conv.
couve-mant. hldrop. l.o

.J
;J"/' i)

~;,

..

. ~--=~~)

rabanete org.
couve-nor (lnftorsc.) conv.

jl

br6colls(talolfolha) conv.

jl

couve-nor (talo) conv.

"'

tt

0 ~~

couve-nor org.

.. H

couve-mant. org .

II

repolho org.
br6colls (lnftoresc.) org.

AAR
...,j

Figura 8. Compara~ao da atividade antioxidante de extratos vegetais da famflia

Cruciferae obtidos de cultivo orgAnico (org.), hidropOnico (hidrop.) e convencional
(conv.) Extratos aquosos (200J..Lg/ml) preparados de diferentes partes cruciferas obtidos
de cultivos l;J organico, 0 hidropOnico e D convencional, foram preparados e seu
potencial antioxidante investigado pelo metodo de reduyao do complexo
fosfomolibdemico. Cada coluna representa a media 1 desvio padrao da atividade
antioxidante em relayao a atividade desempenhada pela vitamina C (AAR), usada como
padrao (200J..Lg/ml) e rutina (200J..Lg/ml) obtida de tr~s ensaios independentes, realizados
em triplicada.

45

A Figura 9 ilustra os resultados obtidos, onde o aparecimento de manchas

amarelas, evidenciadas ap6s revela~o com solu~o de DPPH, contrastadas com
a colorayao violeta de fundo, indicou a presenc;:a de substancias com potencial
antioxidante (Choi

et

a/., 2002). Interessante notar que todas as manchas

desenvolvidas pelos extratos foram semelhantes as apresentadas pelo padrao

rutina, sugerindo sua presenya nesses extratos. Com esses resultados investigouse quantitativamente a capacidade desses extartos em reduzir o DPPH.

Figura 9. Cromatografia em camada delgada dos extratos de

couve-manteiga e br6colis, revelados com solu~ao de DPPH
0,2%. Fase m6vel: acetato de etila:acido f6rmico:acido acetico:agua
(100:11:11:26). (a) extrato de couve-manteiga organica; (b) extrato
de couve-manteiga hidrop6nica; (c) extrato de couve-manteiga
convencional; (d) extrato de br6colis orgfmico; (e) extrato de br6colis
convencional; (P) rutina, usada como padrao na concentrayao de
1mg/ml.

46

3.4 Avaliao da capacidade antioxidante dos extratos de brcolis e couvemanteiga pelo mtodo de reduo do DPPH
3.4.1. Adequao da metodologia: tempo de reao
O ensaio de reduo do radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH*)
(Blois, 1958) tem sido amplamente utilizado como um mtodo qumico para a
investigao do potencial antioxidante de produtos naturais, particularmente para
extratos de plantas medicinais (Braa et ai, 2001; Braa et a!., 2002; Lu e Food,
2001; Mensor et a., 2001) e vegetais comestveis (Guo et a., 2001; Llorach et a.,
2003; Sandoval et ai, 2002). Como anteriormente referido, neste ensaio,
medida que o DPPH* sofre reduo pelos componentes presentes na soluo
teste, observa-se mudana da colorao violeta intensa original da soluo para
amarela (Figura 10), cuja intensidade proporcional concentrao da(s)
substncia(s) com potencial antioxidante presente(s), de conformidade com as
leis

de

Lambert

Beer

(Blois,

1958),

que

pode

ser

medida

espectrofotometricamente a 518 nm. Esta descolorao gradativa se deve ao

pareamento, tambm gradativo, dos eltrons do DPPH* disponveis (Blois, 1958).
Ou seja, quanto maior a atividade antioxidante, menor ser a colorao violeta da
soluo e maior a colorao amarela.
Entretanto, relatos tm alertado para o fato de que h substncias
antioxidantes que reagem de forma particular com o DPPH*, implicando uma
cintica diferenciada (Brand-Williams et ai, 1995). Por exemplo, a vitamina C,
freqentemente usada como padro, assim como o cido isoascrbico e o
isogenol, reage com o DPPH* em menos de um minuto, em contraste com o
guaiacol, BHT ou o BHA, os quais podem levar algumas horas para reagir. Numa
posio intermediria, com reaes entre cinco e trinta minutos, esto compostos
como o -tocoferol ou o cido rosmarnico. Essas diferenas parecem ser
decorrentes no s de um impedimento estrico (Hogg et ai, 1961; McGowan et
ai, 1959; Pokorny, 1987), como tambm da presena e do nmero de hidroxilas
existentes nessas molculas (Brand-Williams et ai, 1995), as quais podem doar
H+ para estabilizar o radical livre.

Figura 10. Atividade antioxidante de extrato de br6colis

avaliada pelo metodo de redu~Ao do DPPH. concentrat;oes
como indicado do extrato de br6colis foram tratadas com solut;ao
de DPPH par 30 min a temperatura ambiente e a mudanya de
colorat;ao de violeta para amarela foi proporcional concentrat;ao
do extrato.

Neste contexte e devido ao fato de que, neste trabalho, usou-se extratos de

diversos vegetais, os quais sao constitufdos por uma variedade indefinida de
compostos com potencial antioxidante, tomou-se imprescindfvel estudar-se o
comportamento nas condic;Qes experimentais em varios intervalos de tempo, com
o objetivo de se avaliar uma cinetica adequada de reayao. Assim, concentraes
crescentes do extrato etan61ico de br6colis obtido de cultura organica (0,01 a 10
mg/ml) foram submetidas

a reayao

com o DPPH (Metodologia, item 2. 7). Em

seguida, para cada concentrayao de extrato testada, uma cinetica de reayao foi
graficamente construfda e, desses graficos, a percentagem de DPPH consumido
foi determinada pelo decaimento da absorvancia em 518 nm, medida nos tempos
0, 15, 30 e 60 min.

48

Como ilustrado na Figura 11, foi observado perfil semelhante, porem com
variactao na capacidade antioxidante nas diversas concentraye>es testadas em
todos os tempos avaliados, com 7,8, 11 ,7, 13,1 e 13,0% de DPPH consumido na
concentra~o

concentractao de 0,01 mg/ml; 17,1, 22,3, 24,0 e 22,0%, na

de 0,1

mg/ml; 50,6, 62,9, 71,0 e 69,1% na concentractao de 1 mg/ml e 79,0, 87,1, 94,6 e
93,4%, na concentractao de 10 mg/ml de extrato de br6colis para 0, 15, 30 e 60

min, respectivamente .
Entretanto, os valores obtidos nos tempos de 30 e 60 min foram muito
pr6ximos, inclusive com sobreposictao das cineticas, indicando que urn aumento
do tempo de reactao alem de 30 min nao resultaria em aumento da

redu~o

deste

radical.

100

e
::I
Cl)

c:
0

(,)

50

::I:

a.
a.

-c

~
0

0
0

0,2

0,4

0,8

0,6

[ mg/ml]
0 min

15 min

Figura 11. lnflu@ncia do tempo de

rea~ao

30 min

na

redu~ao

60 min

do radical DPPH.

Concentrayoes crescentes (0,01 - 1 mg/ml) do extrato de br6colis foram preparadas em

etanol e tratadas com soluyao de DPPH. a temperatura ambiente. Para cada
concentrayao de extrato testada, uma cinetica de reayao foi graficamente construida,
onde a percentagem de DPPH. foi determinada pelo decaimento da absorvancia em 518
nm, medida nos tempos 0, 15, 30 e 60 min. Cada ponto representa a percentagem de
radical livre consumido na concentrayao indicada, obtida de urn experimento, realizado
em triplicata.

49

Com esses resultados, definiu-se que o tempo de 30 min de reao seria,

ento, adequado para as anlises pretendidas, corroborando com grande parte da
literatura (Braa etal., 2002; Guo et ai., 2001; Lu e Food, 2001), onde esse ensaio
empregado.

3.4.2. Adequao da metodologia: expresso dos resultados

Quando o mtodo do DPPH utilizado, variao acentuada no modo de
apresentao dos resultados concernentes atividade antioxidante investigada
observada, dificultando comparaes. Por exemplo, pode-se expressar os
resultados como a capacidade de seqestrar/reduzir o radical DPPH* em
percentagem (Choi et ai, 2002; Lu e Food, 2001), pelo valor de EC5o, ou seja, a
quantidade de substncia antioxidante necessria para reduzir em 50% a
concentrao inicial de DPPH* (Brand-Williams et ai, 1995; Sandoval et ai, 2002)
ou, ainda, pelo poder antioxidante ou poder anti-radical, o qual expressa a relao
inversa da EC50 (Brand-Williams etal., 1995; Sandoval et ai, 2002).
Neste trabalho, os resultados da capacidade antioxidante dos extratos de
crucferas estudados por esta metodologia esto apresentados sob duas formas:
(a) pela EC50 e (b) por meio da percentagem de reduo da quantidade inicial de
DPPH (% de DPPH consumido).
Para a determinao da EC50, da mesma forma como realizado para o
estabelecimento do tempo ideal de reao anteriormente discutido, concentraes
crescentes (0,01 a 10 mg/ml) dos extratos etanlicos de couve-manteiga e
brcolis, obtidos de cultura convencional, hidropnica e orgnica conforme
indicado, foram submetidas reao com o DPPH*. Em paralelo, a influncia da
presena de clorofila e substncias lipoflicas no potencial antioxidante tambm foi
investigada usando-se, para tanto, extratos preparados como descrito no item
2.4.3, da seo de Metodologia e nominados sem C/SL. Em seguida, para cada
concentrao testada, construiu-se a cintica de reao graficamente e, desses
grficos, a percentagem de DPPH* consumido foi determinada como previamente
descrito. Entretanto, se faz necessrio esclarecer que, no presente trabalho, da
representao grfica, obteve-se a equao, do tipo y= ax + b, a qual serviu
como base para o clculo da EC50 por meio da equao de de 1 o grau:

Como exemplo desses procedimentos, a Figura 12 abaixo mostra os

resultados obtidos com o extrato de br6colis organico com C/SL, destacando a
equa9ao da reta que, aplicada

equa(fao, resultou nos valores de EC50

apresentados na Tabela 3. No exemplo acima, a equa9ao da reta obtida foi:

y =84,415x + 4,8447

~
b

considerando-se o valor de "y'' = 50, tem-se:

50 == 84,415x + 4,844 7

EC50 ==

== 0,53

51

Tabela 3 - Capacidade antioxidante dos extratos de couve-manteiga e

br6colis (mg/ml), obtidos de diferentes cultivos, na presen~a ou nao de
clorofila e substancias lipofilicas (C/SL), avaliada pelo metodo do DPPH,
usando-se a vitamina C como padrao de referlmcia.
----------- ----- - - - -

Couve-manteiga organica
._________,_
extrato
DPPH
Equa~ao da reta
2
0
__[_m
_ g_
lm
_l_]_ _c_o_n_s_u_m_i_d _
o _( _Yo_) _ _ _ _ _ _ _R
_ ___________
1
0,01
5,1 0,6
y =77,091x + 3,2023
0,1
13,2 1'9
2
R =0,996
1
80,1 1,7
10
95,2 2,0

ECso
(mg/ml)_

0,60

Couve-manteiga organica sem C/SL* _ _

0,01
0,1
1
10

6,2 1,5
16,2 1,6
89,0 2,6
93,7 0,3

y = 85, 141x + 4,2133

R

0,53

=0,994

Couve-manteiga hidroponica
0,01
0,1
1

10

11 ,8 2,2
31,1 0,6
79,0 2,8
96,9 2,9

y =72,556x + 5,4994
2

R = 0,982

0 61
'

Couve-manteiga hidroponica sem C/SL

0,01
0,1
1

10

22,7 1,3
42,3 1,2
85,8 0,3
96,7 1,9

y =69,005x + 18,513
2

R = 0,939

0,45

Couve-mantei a convencional
0,01
0,1
1
10

14 0,7
23,2 1,9
68,9 0,7
94,9 2,0

y = 59,689x + 9,9313
2

0,67

R = 0,938

Couve-manteiga convencional sem C/SL__

0,01
0,1
1

10

7,7 0,2
24 0,6
88,8 0,5
93,4 0,2

y = 82,345x + 7,2619
2

R = 0,991

0,52

52

continuac;ao Tabe/a 2

Br6colis organico
0,01
0,1
1
10

6,5 0,2
17,80,4
88,8 0,2
95,8 1,9

=84,415x + 4,8447
2
R =0,991

0,53

Br6colis organico sem C/SL

0,01
0,1
1
10

7,8 0,4
24,4 0,7
92,91 ,1
96,7 0,2

=86,487x+ 7,2548
2
R =0,976

0,49

Br6colis convencional
0,01
0,1
1
10

1,70,5
6,9 0,2
80,7 0,9
91,00,8

=80,682x- 0,0743
2
R =0,999

0,62

Br6colis convencional sem C/SL

0,01
0,1
1
10

10,0 0,6
18,0 0,1
87,8 0,6
96,1 0,1

[x10-3

DPPH
consumido (%)

=81,993x + 6,1968
2
R =0,987

0,63

Vitamina C
mg/ml]

5
10
25
50

Equacao da reta

R2

ECso

[x10-3
mg/ml]

8,0 0,6
17,00,7
39,0 0,6
69,0 0,4

=-0,0074x2 + 1,7542x- 0,1479

2
R =0,9999

0,033

(*] extratos vegetais sem clorofila e substancias lipofilicas.

53

Br6colis organico
200 ~----------------------------~~==---=~~~

y =86,487x + 7,2548

~::s 150 +-------------------------~-2~=~0y,9~7~6~8~-

t/)

0u 100 +-------------------------------------------~
J:

~
c

50~----------------~=---~~-----------------

';fl.

0,4

0,6

0,8

extrato [mg/ml]

Figura 12. Avalia(fao da capacidade antioxidante do extrato de br6colis pelo

teste de redu(fao do radical DPPH. Concentra96es crescentes (0,01 - 1 mg/ml) do
extrato de br6colis foram tratadas com solu~o de DPPH. por 30 min a temperatura
ambiente. Para cada concentra9ao testada , uma cinetica de rea9ao foi graficamente
construida, onde a percentagem de DPPH. foi determinada pelo decaimento da
absorvancia em 518 nm. Cada ponto representa a percentagem media de radical livre
consumido na concentra98o indicada, obtida de tres experimentos independentes,
realizados em triplicata, dos quais obteve-se a equa9ao da reta.

A EC 50 foi variavel e, seguindo uma escala crescente, o maior potencial

antioxidante demonstrado foi pelo extrato de couve-manteiga hidrop6nica sem

C/SL (EC 50 = 0,45 mg/ml), seguido do extrato de br6colis orgfmico sem C/SL
(EC 50 = 0,49 mg/ml), couve-manteiga convencional sem C/SL (ECso= 0,52 mg/ml),

couve-manteiga organica sem C/SL (ECso = 0,53 mg/ml), br6colis organico (ECso =
0,53 mg/ml), couve-manteiga organica (ECso = 0,60 mg/ml), couve-manteiga

hidrop6nica (EC 50 = 0,61 mg/ml), br6colis convencional (ECso = 0,62 mg/ml),

br6colis convencional sem C/SL (ECso = 0,63 mg/ml) e, por ultimo, o de couvemanteiga convencional (ECso = 0,67 mg/ml).

54

Para a couve-manteiga, quando os tipos de cultura foram analisados,

destacou-se a capacidade antioxidante demonstrada pelo extrato preparado de
cultivo orgnico,

superior s demonstradas

pelas culturas hidropnica e

convencional. J para o brcolis, no disponvel em cultura hidropnica, o cultivo

orgnico apresentou-se com capacidade antioxidante superior demonstrada
pelo extrato convencional.
Embora o extrato de couve-manteiga hidropnica tenha demonstrado
capacidade antioxidante superior ao do extrato obtido de cultivo convencional,
deve-se interpretar esses resultados com cautela, pois como revisto na
introduo deste trabalho, alimentos hidropnicos apresentam-se comumente
com elevado teor de nitratos, cujos derivados parecem contribuir na patognese
de algumas doenas como, por exemplo, o cncer (Leito, 2003; Rodet, 2003).
Estudos semelhantes realizados com outros vegetais da famlia Cruciferae,
como maca (Lepidium meyenii, ECso= 0,6 mg/ml), nativa do Peru (Sandoval et ai.,
2002), mostarda (Sinapis alba, EC5o= 245 mg/ml), canola (Brassica napus, EC5o=
187,6 mg/ml) e outras variedades de Brassica sp. (Matthaus, 2002) tambm
demonstraram relevante atividade antioxidante, porm com valores de ECso muito
superiores aos aqui relatados. possvel que isso se deva no s diferenas
entre as espcies estudadas, como tambm s inmeras variveis ambientais,
alm dos mtodos utilizados para o preparo dos extratos. Ao se comparar estes
resultados com a ao exercida por extratos de plantas medicinais foi possvel
verificar que estas apresentam maior capacidade antioxidante (Hu et ai., 2003;
Kim et ai, 2002; Tang et al., 2001). No entanto, importante destacar que plantas
medicinais no so consumidas usualmente como parte integrante de uma dieta,
e que, portanto, o efeito antioxidante exercido por extratos vegetais so de
inestimvel importncia, contribuindo de forma significativa na proteo e
manuteno da sade do homem.
Entretanto, outro fator que poderia contribuir para a marcante diferena dos
resultados o modo de como o valor de ECso foi determinado. Freqentemente, a
ECso um valor obtido pela interpolao da concentrao da substncia
analisada (eixo das abscissas - "x") com a % de DPPH* consumido (eixo das
ordenadas - "y") (Brand-Williams et ai, 1995), como ilustrado na Figura 13, para o
mesmo extrato de brcolis orgnico demonstrado na Figura 12.

br6col is organ ico

100
iii

::::J

75

"0

"'~
:I:

a..
a..

50

Ql

"0
;;!

25

0,2

0,6

0,4

1 ,2

0,8

1 ,4
[mg/ml]

Figura 13. Avalia~ao da capacidade antioxidante do extrato de br6colis pelo teste

de redu~ao do radical DPPH". Concentra9oes crescentes (0,01 - 1 mg/ml) do extrato

de br6colis foram tratadas com solu9ao de DPPH" par 30 min a temperatura ambiente.
Para cada concentra9ao de extrato testada, uma cinetica de rea9ao foi graficamente
construida , onde a percentagem de DPPH" foi determinada pelo decaimento da
absorvancia em 518 nm. Cada ponto representa a percentagem media de DPPH"
residual na concentra~o indicada, obtida de tres experimentos independentes,
realizados em triplicata. A EC50 de aproximadamente 0,3 mg/ml (seta) representa a
quantidade de extrato de br6colis organico, em mg/ml, necessaria para reduzir a
concentra9ao inicial de DPPH" em 50%.

A ECso de 0,53 mg/ml encontrada ap6s interpolac;ao dos eixos constitui-se

em urn valor muito proximo ao encontrado quando se usa a equac;ao da reta em
associa((ao com a equa((ao do 1 grau. Entretanto, ao se usar a expressao
matematica, o resultado torna-se precise em rela((ao aquele obtido com a
interpolac;ao, o qual e urn "valor estimado". Essas considera((oes podem nao ser
relevantes quando se compara a capacidade antioxidants de extratos com
capacidades muito distintas, como por exemplo, as demonstradas pelos extratos
de

br6colis

convencional

orgfmico

(ECso

de

0,62

0,53

mg/ml ,

respectivamente). Porem, quando se pretende comparar substfmcias com

capacidade antioxidants muito pr6ximas, como e o caso dos obtidos com o
br6colis organico

com

e sem

clorofila

(ECso de

0,53 e 0,49

mg/ml ,

respectivamente), ele permite distinguir mais precisamente o efeito. Sua aplicac;ao

56

pode ter grande relevncia quando se pretende avaliar, por exemplo, a atividade
antioxidante ou qualquer outro tipo de ao exercida por substncias puras em
sistemas biolgicos, como em cultura de clulas, onde o efeito de quantidades
extremamente pequenas pode e/ou deve ser monitorado rigorosamente.
Por outro lado, quando a capacidade antioxidante desses extratos em
reduzir o DPPH* expressa em funo da quantidade de radical livre consumido,
conforme demonstrado na Figura 14, pode-se observar que (1) o efeito
antioxidante dose-dependente; (2) que, exceo do extrato de couvemanteiga convencional na concentrao de 1 mg/ml, todos os extratos testados
nessa concentrao foram capazes de reduzir em mais de 80% a quantidade de
DPPH* e que (3) todos os extratos, na concentrao de 10 mg/ml, demonstraram
capacidade superior a 90% em reduzir o DPPH*, semelhante ao demonstrado
recentemente pelo extrato metanlico de brcolis (Guo et a/., 2001).
Relevante se faz, neste momento, comentar o modo como o efeito
antioxidante de vrios extratos de crucferas usando-se o sistema do DPPH foi
apresentado

neste trabalho.

Expressos

sob duas formas

freqentemente

encontradas na literatura, ambas retrataram a mesma ao, mas de forma

complementar,

possibilitando

observar, comparativamente,

diferenas

entre

extratos de um mesmo vegetal, a influncia do tipo de cultivo ou da

presena/ausncia de substncias nesta atividade.
Neste ltimo aspecto, um dos fatores interessantes desta srie de
experimentos foi com relao significativa atividade antioxidante demonstrada
pelos extratos de crucferas aps a retirada de clorofila e substncias lipoflicas
(C/SL) quando comparada demonstrada pelos extratos etanlicos originais. Por
exemplo, enquanto o extrato de brcolis orgnico demonstrou uma EC50 de 0,34
mg/ml, o mesmo extrato, aps tratamento, apresentou uma ECso de 0,23 mg/ml.
J para a couve-manteiga orgnica, observou-se uma EC50 de 0,48 mg/ml contra
uma EC50 de 0,38 mg/ml, para os extratos com e sem C/SL, respectivamente.
Esses resultados esto em contraste com dados recentemente publicados para
extratos de plantas medicinais, onde extratos de carqueja (Baccharis) aps a
remoo da C/SL reduziram menos de 10% o radical DPPH (Boas et ai, 2003) ou
para extratos de brcolis, usando outros mtdodos qumicos de avaliao da
capacidade antioxidante (ORAC) (Kurilich et ai, 2002).

100

--

r-

90

--

~
~

80
70

:I:

60

50

Q.
Q.

;:x

;:z:

'"'

;z:

-- -

;:z:

--

:x;

;:z:

1"'

'"'
r-

Cl

40

'3.
::I

30

al
a::

20
10
0

r-

J
1

,..
I

i"'

I
2

I
5

I
6

J
8

10

(mg/ml]

Figura 14. Avalia~ao da capacidade antioxidante do extrato de cruciferas pelo

teste de redu~ao do radical DPPH. Concentra9oes crescentes (0,01- 10 mg/ml)
dos extratos indicados foram tratadas com soluyao de DPPH. por 30 min a
temperatura ambiente. Cada coluna representa a percentagem media 1DP de
DPPH. consumido , obtida de tres experimentos independentes, realizados em
triplicata, onde 0,01 mg/m(J
0,1 mg/miO
1 mg/ml eO 10 mg/ml.
Os numeros representam os extratos etan61icos dos vegetais:
1- couve-manteiga organica
2- couve-manteiga organica sem C/SL
3- couve-manteiga hidroponica
4- couve-manteiga hidroponica sem C/SL
5- couve-manteiga convencional 6- couve-manteiga convencional sem C/SL
7- br6colis organico
8- br6colis organico sem C/SL
9- br6colis convencional
10- br6colis convencional sem C/SL

Apesar de que estudos mais direcionados sejam necessaries,

e provavel

que o processo de remo<;ao desses compostos tenha, indiretamente, extraido

substancias que poderiam, eventualmente, nao estar contribuindo para com a
capacidade antioxidante dos extratos. Ou seja, com a sua remo<;ao,
que uma maior

concentra~o

e possivel

de substancias com potencial antioxidante tenha

ocorrido, resultando no aumento na capacidade antioxidante observada nos

extratos sem C/SL e que, portanto, a clorofila e substancias lipofilicas nao sejam
as responsaveis pela

a~o

antioxidante desses extratos.

58

3.5 Doseamento de flavonides

Com o objetivo de tentar esclarecer se essas diferenas poderiam ser
decorrentes dos processos de cultivo e devido ao fato de que vegetais da famlia
Crucifrae possuem reconhecidamente alto teor em flavonides, substncias com
elevado potencial antioxidante (Hertog et ai, 1992; Justesen et ai, 1998; Kurilich
et ai, 2002; Nielsen et ai, 1997; Ninfali e Bacchiocca, 2003; Plumb et ai, 1997),
investigou-se sua presena usando-se metodologia tradicional (item 2.9.1,
Metodologia), a qual foi fortemente positiva em todos os extratos e em ambas
fraes, visualizada pela formao de colorao vermelha no tubo reator. Em
seguida,

quantificou-se

esses flavonides

pela metodologia descrita

na

Farmacopia Helvtica (1995), cujos resultados esto apresentados na Tabela 4.

Tabela 4. Doseamento de flavonides totais em extrato de

vegetais da famlia Cruciferae.
FLAVONIDES TOTAIS (g%)
VEGETAL

extrato
etanlico

extrato
etanlico
sem C/SL

Couve-manteiga orgnica

0,217 + 0,018

0,167 0,020

Couve-manteiga hidropnica

0,198 0,014

0,181 0,010

Couve-manteiga convencional

0,199 0,009

0,169 0,013

Brcolis orgnico

0,174 0,006

0,161 0,018

Brcolis convencional

0,233 0,001

0,196 0,036

Fraes liofilizadas de extratos das crucferas indicadas foram suspensas em gua

e a retirada da clorofila e de substncias lipoflicas deu-se aps 8 h de agitao
mecnica continua em banho de gelo seguida de repouso refrigerado por 12 h. Os
flavonides totais foram, ento, doseados em ambas fraes conforme
metodologia preconizada pela Farm acopia Helvtica (1995). Cada valor
representa a quantidade mdia 1DP de flavonides totais em g%, de trs
experimentos. C/SL: extrato aps a retirada de clorofila e substncias lipoflicas.

Para todos os extratos de couve-manteiga, os valores encontrados foram

muito prximos, independente do processo de cultivo ou da presena de clorofila
e substncias lipoflicas. Entretanto, para os extratos de brcolis, a quantidade de
flavonides no cultivo convencional (0,233 0,001) foi significativamente superior
(n = 3; p < 0,01) quela encontrada no cultivo orgnico (0,174 0,006), porm
somente nos extratos que no sofreram tratamento para a retirada de clorofila e
substncias lipoflicas.
Esses resultados sugerem que a variao observada na atividade
antioxidante dos extratos investigados possivelmente no esteja associada
apenas ao teor de flavonides e que a capacidade antioxidante observada em
nossos experimentos possa estar tambm associada a substncias outras,
atuando sinergicamente na reduo de radicais livres, como sugerido por outros
(Kurilich et a/., 2002).
Mesmo sabendo-se que vegetais da famlia Cruciferae so fontes ricas de
antioxidantes, confirmado inclusive pelos resultados experimentais at aqui
apresentados, nenhuma delas demonstrou capacidade antioxidante similar ou
mesmo prxima atividade da vitamina C, cuja EC50 foi extremamente baixa, ou
seja, 33 (o.g/ml. Isto poderia ser decorrente do fato de que a vitamina C, utilizada
como padro de referncia de nosso procedimento experimental, uma
substncia pura, em contraste com os extratos vegetais investigados, os quais
possuem diferentes compostos, muitos dos quais com capacidade para influenciar
o potencial antioxidante como acima mencionado. Neste contexto, interessante
seria poder isolar todos os componentes desses extratos e, aps conhecer-se a
atividade antioxidante de cada um, determinar a capacidade antioxidante do
extrato.

3.6 Ensaio de inibio da formao de metahemoglobina induzida por fenilhidrazina em eritrcitos humanos
Um dos objetivos do presente trabalho foi, em paralelo aos ensaios
qumicos, o de desenvolver um ensaio biolgico para a avaliao da atividade
antioxidante de extratos de vegetais usando eritrcitos humanos, os quais so
dotados de um sistema natural capaz de proteg-los contra a oxidao de seus

constituintes, de forma a garantir sua integridade estrutural e funcional, alm de

assegurar que o ferro da molcula de hemoglobina permanea na forma ferrosa
(Fe+2). No entanto, se o eritrcito for exposto a uma sobrecarga oxidativa que
supere sua capacidade redutora, poder haver um aumento proporcional na
produo de metaHb, uma protena incapaz de carrear o oxignio por apresentar
o ferro no estado oxidado (Fe+3), a qual pode ser avaliada quantitativamente aps
leitura em 630 nm.
Assim, alquotas de suspenso de eritrcitos obtidos de doadores
voluntrios (item 2.8.1, Metodologia), pr-tratadas ou no com vitamina C (20
mM) ou concentraes crescentes (0,01 a 100 mg/ml) dos extratos etanlicos,
com e sem C/SL, de brcolis e couve-manteiga, foram submetidas ao estresse
oxidativo induzido por Fh (1 mM) como descrito no item 2.8.2, da seo de
Metodologia. Os resultados esto apresentados nas Figuras 15 a 20, onde cada
coluna representa, na concentrao indicada, a porcentagem de metaHb formada
em relao amostra controle, tratada apenas com Fh e normalizada em 100%.
A exposio de eritrcitos humanos pr-tratados com vitamina C e Fh
(Figura 15) resultou na reduo significativa de 48,0 4,7% de metaHb formada
(n=20; p< 0,005), confirmando resultados recentemente demonstrados por outros
(Claro, 2002), indicando uma proteo eficiente dessa substncia sobre os
eritrcitos no modelo proposto, corroborando com sua reconhecida ao
antioxidante (Carre Frei, 1999; Leonard e/a/., 2002; Toit et ai, 2001).
Ao investigar-se os efeitos protetores do extrato de couve-manteiga obtida
de cultivo orgnico sob condies experimentais similares (Figura 16), as
concentraes de 0,01 a 100 mg/ml foram capazes de reduzir significativamente a
formao de metaHb (n = 3; p < 0,005) em comparao amostra controle,
produzindo 58,5 1,0%, 44,4 1,7%, 29,5 0,1%, 14,5 1,3% e 91,0 0,6% de
metaHb, respectivamente.
Quando semelhante experimento foi realizado com o extrato de couvemanteiga orgnica onde a clorofila e as substncias lipoflicas foram extradas
(extrato sem C/SL), padro similar de efeito protetor foi observado, com formao
de 69,3 0,7%, 54,0 0,7%, 19,9 0,9%, 13,5 0,3% e 93,3 0,3% de metaHb
para as concentraes de 0,01, 0,1, 1, 10 e 100 mg/ml, respectivamente, todas
significativamente inferiores amostra controle (n = 3; p < 0,005).

120
100

--

80

0~

.c

:I:

(U
....,

60

Q)

40
20
0

C+ Fh

Fh

Figura 15. Efeito da fenil-hidrazina sobre eritr6citos humanos. Suspensao de

eritr6citos humanos, pre-tratados ou nao com vitamina C (C, 20mM), foram
incubadas com cloridrato de fenil-hidrazina (Fh, 1 mM) por 20 min a temperatura
ambiente sob homogeneiza~ao continua e a forma~ao de metahemoglobina obtida
pela absorvfmcia em 630nm, como descrito no item 2.8.4 da sec;ao de Metodologia.
Gada coluna representa a media da porcentagem de formac;ao de
metahemoglobina 1DP, normalizada em 100%, de vinte experimentos
independentes, realizados em triplicata (* p ~ 0,005, teste t de Student).

Esses resultados demonstraram que o melhor efeito antioxidante exercido

par esses extratos no sistema proposto foi na concentra<;ao de 10 mg/ml,
independente da presenc;a de clorofila e substanicas lipofflicas (n = 3; p > 0,005) e
que sua capacidade protetora foi semelhante

a apresentada pela vitamina C (52,7

1,6%) nas concentrac;oes de 0,01 para ambos extratos. Contudo, efeito

significativamente superior ao da vitamina C foi observado nas concentrac;oes de
0,1 mg/ml para o extrato com C/SL e nas concentrac;oes de 1 e 10 mg/ml para os
extratos come sem C/SL (n = 3; p ~ 0,005 para ambos).

62

-.cz
0~

anica

couve-mantei
140

D
0

120

com C/SL
sem C/SL

cu
..,
Cl>

100

* *

80
60

0,01

0,1

10

100

[mg/ml]
Figura 16. Efeito do extrato de couve-manteiga obtida de cultivo organico sobre a
de metahemoglobina (metaHb) induzida por fenil-hidrazina (Fh) sobre
eritr6citos humanos. Suspensao de eritr6citos humanos, pre-tratados ou nao com
vitamina C (C, 20mM) ou concentra<;6es como indicado do extrato de couve-manteiga
obtida de cultivo organico, com [j e sem clorofila e substancias lipofilicas D , foram
incubadas com Fh (1 mM) por 20 min a temperatura ambiente sob homogeneizayao
continua e a formaryao de metaHb obtida pela absorvancia em 630nm, como descrito no
item 2.8.4 da seryao de Metodologia. Cada coluna representa a media da porcentagem de
formaryao de metaHb 1DP, normalizada em 100%, de tres experimentos independentes,
realizados em triplicata ("" p :::;; 0,005 em rela<;ao a Fh; p :::;; 0,005 em relaryao a vitamina
C; teste t de Student).

forma~ao

Ao investigar-se os extratos de couve-manteiga hidroponica com e sem

C/SL (Figura 17), verificou-se que, nas concentra<;6es de 0,01 a 10 mg/ml , os
extratos mostraram-se significativamente superior em rela<;ao ao efeito protetor
sabre os eritr6citos submetidos

a a<;ao

oxidante da Fh, com forma<;ao de 81,8

0,5%, 63,8 3,7% , 53,3 2,6%e 19,0 0,4% e de 64,3 2,4%, 50,1 3,1%, 20,5

63

 1,4% e 45,4 3,0% de metaHb, respectivamente (n = 3; p

0,005). Os extratos

sem C/SL, nas concentra<;oes de 0,1 a 10 mg/ml, apresentaram capacidade

antioxidante significativamente superior ada vitamina C (n

= 3; p ::;; 0,005).

Efeito

similar a este foi observado apenas nas concentra<;oes de 1 e 10 mg/ml, quando o

extrato apresentava C/SL.

--

140

:I:
co

120

Cl)

100

~
0

couve-man e1ga

ropon1ca
com C/SL
D semC/SL

.Q

....
E

-*
1-=-

r---

-* *

80

60

*
*
ri-

40

20

Fh

0,01

0,1

*
r=10

100

[mg/ml]
Figura 17. Efeito do extrato de couve-manteiga obtida de cultivo hidroponico sobre
a formactao de metahemoglobina (metaHB) induzida por fenil-hidrazina (Fh) sobre
eritr6citos humanos. Suspensao de eritr6citos humanos, pre-tratados ou nao com
vitamina C (C, 20mM) ou concentra<;6es como indicado do extrato de couve-manteiga
obtida de cultivo hidroponico, com D e sem clorofila e substancias lipofilicas D , foram
incubadas com Fh (1 mM) por 20 min a temperatura ambiente sob homogeneiza<;ao
continua e a forma<;ao de metaHb obtida pela absorvancia em 630 nm, como descrito no
item 2.8.4 da se<;ao de Metodologia. Cada coluna representa a media da porcentagem de
forma<;ao de metaHb 1DP, normalizada em 100%, de tres experimentos independentes,
realizados em triplicata (* p ::;; 0,005 em rela<;ao Fh; p ::;; 0,005 em relayao vitamina
C; teste t de Student) .

64

Nesta srie de experimentos, embora o melhor efeito antioxidante

observado tenha sido significativamente semelhante para ambos extratos, quando
comparados ao controle, sua concentrao foi diferente, sendo de 10 mg/ml para
o extrato com C/SL e de 1 mg/ml para o extrato sem C/SL. Ou seja, os resultados
indicam que necessrio dez vezes mais extrato de couve-manteiga hidropnica
com C/SL para que o mesmo efeito antioxidante produzido pelo extrato de couvemanteiga hidropnica sem C/SL seja observado.
Com relao couve-manteiga convencional (Figura 18), ao antioxidante
significativa foi observada nas concentraes de 0,01 a 1 mg/ml, com a produo
de 92,3 0,6%, 85,1 1,6% e 45,7 0,7% de metaHb, respectivamente (n = 3; p
< 0,005). E, em contraste com os extratos anteriores, nas concentraes de 10 e
100 mg/ml observou-se uma diminuio da proteo exercida pelos extratos
sobre o sistema, com formao de metaHb semelhante ao produzido pela Fh, ou
seja, 104,4 1,9% e 152,9 2,0% de metaHb, respectivamente (n=3; p <0,005).
Ao investigar-se os efeitos antioxidantes quando se retirou a clorofila e as
substncia lipoflicas, esses foram significativos nas concentraes de 0,01 a 10
mg/ml, com a formao de 62,5 2,7%, 16,6 1,2%, 29,1 1,8% e 66,5 2,2%
de metaHb,

respectivamente

(n=3;

p <0,005).

Esse mesmo

extrato, na

concentrao de 100 mg/ml, tambm se apresentou txico ao sistema, formando

quantidade de metaHb semelhante ao controle (102,5 0,7%).
Nesta srie de experimentos, o melhor efeito antioxidante observado foi na
concentrao de 1 mg/ml para o extrato de couve-manteiga convencional com
C/SL e na concentrao de 0,1 mg/ml no extrato sem C/SL, sendo este
significativamente superior quele (n = 3; p < 0,005).
Os extratos com e sem C/SL, na concentrao de 1 mg/ml, apresentaram
ao antioxidante significativamente superior observada para a vitamina C (53,2
0,8%) assim como o extrato sem C/SL, na concentrao de 0,1 mg/ml (n = 3; p
<0,005).
Quando se investigou os efeitos protetores dos extratos de brcolis obtido
de cultivo orgnico sob as mesmas condies experimentais (Figura 19), as
concentraes de 0,01 a 10 mg/ml foram capazes de reduzir significativamente
sua formao (n = 3; p < 0,005) em comparao amostra controle, produzindo

63,0 1,2%, 54,5 3,5%,

15,3 1,1% e 26,8 1,7% de metaHb,

respectivamente.

. convencaona I
couve-man teaga

~
0

140

.c

120

.J:

(U
....,
Q)

D com C/SL
D

100

r-'-

sem C/SL

,...=.

*
r-

80
60

r40

20

.*- .*

..z...

f.=-

Fh

0,01

0,1

10

100

[mg/ml]

Figura 18. Efeito do extrato de couve-manteiga obtida de cultivo convencional

sobre a forma~ao de metahemoglobina (metaHB) induzida por fenil-hidrazina
(Fh) sobre eritr6citos humanos. Suspensao de eritr6citos humanos, pre-tratados ou
nao com vitamina C (C, 20mM) ou com as concentra~6es indicadas do extrato de
couve-manteiga obtida de cultivo hidroponico, comO e sem clorofila e substancias
lipofilicas D foram incubadas com Fh (1 mM) por 20 min a temperatura ambiente sob
homogeneiza~o continua e a forma~o de metaHb obtida pela absorvancia em 630
nm, como descrito no item 2.8.4 da se~ao de Metodologia. Cada coluna representa a
media da porcentagem de forma~o de metaHb 1DP, normalizada em 100%, de tres
experimentos independentes, realizados em triplicata (* p ~ 0,005 em rela~ao a Fh; p
~ 0,005 em rela~ao a vitamina C; teste t de Student).

66

~
0

140

.c

120

:I:

..,cu
(I)

brocolis
r:::J com C/SL
0 sem C/SL

100
80

* *

Al

0,01

0,1

10

100

[mg/ml]

Figura 19. Efeito do extrato de br6colis obtido de cultivo organico sobre a formac;ao
de metahemoglobina (metaHb) induzida por fenil-hidrazina (Fh) sobre eritr6citos
humanos. Suspensao de eritr6citos humanos, pre-tratados ou nao com vitamina C (C,
20mM) ou concentra<;6es como indicado do extrato de br6colis obtido de cultivo organico,
com 1:1 e sem clorofila e substancias lipofilicas 0 foram incubadas Fh (1 mM) por 20
min a temperatura ambiente sob homogeneiza<;ao continua e a forma<;ao de metaHb
obtida pela absorvancia em 630 nm, como descrito no item 2.8.4 da se<;ao de
Metodologia. Cada coluna representa a media da porcentagem de forma<;ao de metaHb
1DP, normalizada em 100%, de tres experimentos independentes, realizados em
triplicata (* p ~ 0,005 em rela<;ao a Fh; p ~ 0,005 em rela<;ao a vitamina C; teste t de
Student).

67

Ao testar-se o extrato de brcolis orgnico onde a clorofila e as substncias

lipoflicas foram extradas (extrato C/SL), padro similar de efeito protetor foi
observado, com formao de 60,9 0,5%, 40,7 0,1%, 13,6 0,3% e 22,0
0,3% de metaHb para as concentraes de 0,01, 0,1, 1 e 10 mg/ml,
respectivamente, todas significativamente inferiores amostra controle (n = 3; p <
0,005).
Ao investigar-se os extratos com e sem C/SL de brcolis convencional
(Figura

20),

verificou-se

que

ambos,

na

concentrao

de

0,01

ml/ml,

comportaram-se de forma semelhante vitamina C (52,4 2,0%), formando 61,6

1,2% e 67,8 0,5%, respectivamente. No entanto ambos extratos nas
concentraes

de

10

mg/ml,

mostraram

capacidade

antioxidante

significativamente superior da vitamina C, com formao de somente 34,6

1,1%, 34,9 0,3%, 33,3 1,3% e 18,5 0,4% de metaHb (n = 3; p < 0,005).
Nesta srie de experimentos, o melhor efeito antioxidante observado foi na
concentrao de 10 mg/ml, independente da presena de clorofila ou substncias
lipoflicas, mas significativamente diferente entre ambos extratos (p < 0,005). Alm
disso e, em contraste com os efeitos protetores observados para as outras
concentraes, em ambas fraes, os extratos de brcolis, independente do tipo
de cultivo, na concentrao de 100 mg/ml demonstraram capacidade antioxidante
significativamente inferior as demais concentraes, formando mais metaHb do
que a prpria Fh, com 136,0 3,7%, 109,0 0,6%, 127,2 3,4% e 131,0 0,9%
para os extratos orgnicos com e sem C/SL e de cultura convencional com e sem
C/SL, respectivamente.
Embora se tenha observado um comportamento dependente da dose nos
ensaios

realizados,

em nenhum dos extratos avaliados,

o aumento

da

concentrao para 100 mg/ml, resultou em diminuio na formao de metaHb.

Ao contrrio, observou-se, para a maioria dos extratos analisados, uma
diminuio significativa do efeito protetor. possvel que esses resultados sejam
decorrentes de um efeito fsico indesejvel quanto extratos concentrados so
adicionados suspenso de eritrcitos devido perda do estado isosmtico,

passando a urn estado hipert6nico, desestabilizando o sistema e tomando-o

inadequado como modelo experimental.

-~
0

.c

br6colis convencional
140

0
0

com C/SL
semC/SL

* *
r-I-r-

120

J:

..,ca
Q)

100

r--

80

-*

60

40
20

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* *
r=-f--

**
--

* .
r=-

10

!"

Fh

0,01

0,1

n
*

100

[mg/ml]

Figura 20. Efeito do extrato de br6colis obtido de cultivo convencional sobre a

de metahemoglobina (metaHB) induzida por fenil-hidrazina (Fh) sobre
eritr6citos humanos. Suspensao de eritr6citos humanos, pre-tratados ou nao com
vitamina C (C, 20mM) ou concentrac;oes como indicado do extrato de br6colis obtido de
cultivo convencional, com D
e sem clorofila e substancias lipofilicas D
foram
incubadas com Fh (1 mM) par 20 min a temperatura ambiente sob homogeneizac;ao
continua e a formac;ao de metaHb obtida pela absorvancia em 630 nm, como descrito no
item 2.8.4 da sec;ao de Metodologia . Cada coluna representa a media da porcentagem de
formac;ao de metaHb 1DP, normalizada em 100%, de tres experimentos independentes,
realizados em triplicata \' p ~ 0,005 em relac;ao Fh ; p ~ 0 ,005 em relac;ao vitamina
C; teste t de Student).

forma~ao

69

U
N
V
IF
R
S
O
IA
n
F

Concluses
Os extratos de Brassica oleracea var. capitata L. (repolho branco), de

Brassica oleracea L. var. acephala DC (couve-manteiga), de Brassica oleracea L.

var. botrytis L. subv. cauliflora (couve-flor), de Brassica oleracea L. var. botrytis L.
subv. cymosa (brcolis), de Nasturtium officirialis Br. (agrio) e de Raphanus
sativus radiculal (rabanete), obtidos de cultivo convencional, hidropnico e
orgnico, quando possvel, avaliados neste trabalho pelos mtodos qumicos de
reduo pelo fosfato de molibdnio e do DPPH e pelo sistema biolgico usando o
eritrcito humano como modelo, demonstraram, de forma geral, relevante
capacidade antioxidante, independente da parte vegetal analisada, corroborando
com a literatura concernente ao valor de crucferas como fonte importante de
substncias antioxidantes (Chu et ai, 2002; Farnham, 2003; Hirano et ai, 2001;
Leonard et ai, 2002; Nestle, 1998; Ninfali e Bacchiocca, 2003; Ou et ai, 2002).
Algumas diferenas no potencial antioxidante desses vegetais, entretanto,
foram observadas quando se relaciona as espcies vegetais s diferentes
tcnicas de cultivo e ao mtodo analtico.
Ao investigar-se a couve-manteiga, o extrato proveniente de cultivo
orgnico demonstrou maior capacidade antioxidante, seguida pelo de cultivo
hidropnico e convencional. De forma semelhante, o brcolis, quando cultivado
organicamente, a capacidade antioxidante demonstrada foi superior quela do
extrato proveniente de cultivo convencional, tanto pelos mtodos qumicos como
para o sistema biolgico. Ou seja, o modo de cultivo parece influenciar de forma
expressiva a capacidade antioxidante das crucferas aqui estudadas, sendo o
orgnico superior, quando comparado aos cultivos hidropnico e convencional,
nos trs modelos estudados. Todavia, mesmo com resultados diversos, todos os
extratos estudados nas concentraes entre 0,01 e 10 mg/ml, demonstraram um
efeito antioxidante dependente da dose e que, na concentrao de 10 mg/ml,
foram capazes de reduzir em mais de 90% a concentrao inicial de DPPH.
Quando a atividade antioxidante dos extratos foi investigada aps a
retirada da clorofila e das substncias lipoflicas, tanto no mtodo do DPPH
quanto no sistema biolgico, avaliados sob condies idnticas aos extratos

originais, observou-se que, independente do tipo de cultivo, todos reduziram

maior quantidade de DPPH e, simultaneamente, formaram menor quantidade de
metaHb, indicando maior efeito protetor ao sistema. interessante destacar que a
retirada dessas substncias nos vegetais de cultivo convencional levou a um
efeito antioxidante significativamente maior quando comparado ao efeito exercido
pelos extratos com C/SL (p <

0,01).

Neste contexto, importante ressaltar que a capacidade antioxidante de

misturas complexas, como as dos extratos aqui estudados, no pode ser
satisfatoriamente

avaliada

por

um nico

mtodo

e,

portanto,

diferentes

procedimentos devem ser empregados para que a capacidade antioxidante total

possa ser medida, levando-se em considerao todas as possveis variveis que
possam influenciar os resultados.
Embora s o potencial antioxidante de algumas crucferas tenha sido
investigado, os resultados aqui apresentados e discutidos parecem favorecer os
efeitos

benficos

associados

ao

seu

consumo,

com

destaque

quelas

provenientes de cultivo orgnico. De fato, essas parecem ser as mais saudveis,

no s pelos resultados aqui demonstrados, mas tambm por no apresentarem
resduos de agrotxicos e fertilizantes sintticos como aqueles observados nos
vegetais provenientes de agriculturas convencional e hidropnica, alm de um
maior teor de nutrientes, como j revisto na introduo deste trabalho.
Como a atividade antioxidante de vegetais, frutas e plantas medicinais tem
sido avaliada particularmente por mtodos qumicos, um dos objetivos deste
trabalho foi o de propor um ensaio biolgico in vitro no qual semelhante atividade
pudesse ser investigada de forma sensvel, rpida, reprodutvel e de custo
praticvel. Para tanto, optou-se pelo sistema antioxidante natural do eritrcito
humano, no apenas pela sua facilidade de obteno, mas tambm pela sua
relativa estabilidade in vitro.
Os resultados preliminares derivados desses ensaios aqui descritos
permitiram comparaes com os mtodos qumicos, demonstrando ser factvel
como um sistema biolgico experimental, abrindo um horizonte de possibilidades.
Porm, mais estudos so necessrios para confirmar sua utilidade como mtodo
alternativo para investigar a atividade antioxidante de vegetais e plantas
medicinais.

Consideraes finais
Desde que as tcnicas tradicionais de agricultura foram abandonadas em
detrimento do uso massivo de insumos qumicos nas plantaes, tm-se colhido
alimentos menos saudveis e nutritivos (Aditai, 2003). Hoje, sabe-se que o uso de
insumos no plantio - como adubos qumicos, inseticidas, fungicidas e herbicidas pode causar problemas sade de quem os aplica, ao meio ambiente e sade
dos consumidores, provavelmente em decorrncia de resduos de agrotxicos,
como anteriormente citado (ANVISA).
Com o volume de descobertas avanando nessa direo, o caminho agora
inverso.

Muitos

convencionalmente

pesquisadores

buscam

comparar

alimentos

com outras tcnicas, particularmente

cultivados

a orgnica e a

hidropnica, no tocante qualidade agronmica (Darolt, 2003; Epagri, 2003),

organolptica, nutricional (Bourn e Prescott, 2002; Williams, 2002) e sanitria
(Bourn e Prescott, 2002).
Como as investigaes nesta rea so, ainda, insipientes, os resultados do
presente trabalho, embora simples, vieram trazer contribuies relevantes sobre a
influncia de diferentes tcnicas de cultivo sobre o potencial antioxidante de
crucferas.
Devido diversidade de vegetais da famlia Cruciferae presentes na dieta
regular dos brasileiros e aos incontveis efeitos biolgicos relacionados com seu
consumo, em particular sua atividade antioxidante aqui demonstrada, torna-se
relevante a sua ingesto como parte de uma dieta balanceada, tornando-se uma
fonte alternativa eficaz de substncias contra o estresse oxidativo imposto ao
organismo humano diariamente.

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Anexos

HOSPITAL DE CLNICAS
" I f f UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN

Curitiba, 01 de outubro de 2003.

limo (a) Sr. (a)
Dra. Kettelin Aparecida Arbos
Nesta

Prezado(a) Senhor(a):

Comunicamos que o Projeto de Pesquisa intitulado "ESTUDO IN VITRO DO

POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE CRUCFERAS", foi a n a l i s a d o e a p r o v a d o

pelo Comit

de tica em Pesquisa em Seres Humanos, em reunio realizada no dia 30 de

setembro de 2003, o referido projeto atende aos aspectos das Resolues CNS
196/96, 251/97 e 292/99, sobre Diretrizes e Normas Regulamentadoras de
Pesquisa Envolvendo Seres Humanos.
Protocolo CEP/HC 100EXT054/2003-09

Conforme a Resoluo 196/96, solicitamos que sejam apresentados a este

CEP, relatrios sobre o andamento da pesquisa, bem como informaes
relativas s modificaes do protocolo, cancelamento, encerramento e
destino dos conhecimentos obtidos.
Data para entrega do primeiro relatrio: 01 de abril de 2004.

Atenciosamente,

Prof. Dr
a Filho
Coordenador do Comit de tica em Pesquisa
em Seres Humanos do Hospital de Clinicas/UFPR

Anexo B

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

a) O objetivo deste projeto de pesquisa estabelecer e padronizar um ensaio biolgico in
vitro, que possa, de forma dinmica, demonstrara atividade antioxidante de constituintes de
vegetais cruciferos como brcolis, couve-flor, couve-manteiga, rabanete e repolho,
tradicionalmente utilizadas pela populao como parte da dieta usual.
b) Caso voc participe da pesquisa, ser necessrio doar uma amostra de sangue a qual
ser obtida por puno venosa de uma de suas veias, localizadas na regio da prega do
cotovelo. A quantidade de sangue por voc doada ser destinada separao dos
eritrcitos para padronizao do mtodo de formao de metahemoglobina.
c) Como em qualquer outro diagnstico clnico-laboratorial, voc poder experimentar alguns
leves desconfortos relacionados a essa coleta, porm de ordem passageira.
d) Esto garantidas todas as informaes pertinentes ao projeto que voc queira obter, antes,
durante e depois do estudo.
e) A sua participao neste estudo voluntria. Voc tem a liberdade de se recusar a
participar do estudo ou, se aceitar participar, retirar seu consentimento a qualquer momento.
f) As informaes relacionadas a este estudo podero ser inspecionadas por profissionais
que executam a pesquisa ou por autoridades legais. No entanto, no saco de alguma
informao ser divulgada em relatrio ou publicao, isto ser feito sob forma codificada,
para que a confidencialidade seja mantida.
g) Em caso de necessidade, voc poder comunicar-se imediatamente com Kettelin
Aparecida Arbos ou Almeriane Maria Weffort Santos, nos telefones 3022 2970, 360 4087 ou
232 4037.
h) Todas as despesas necessrias para a realizao dessa pesquisa (exames, etc) no so
da responsabilidade do doador.
i) Pela sua participao no estudo, voc no receber qualquer valor em dinheiro.
j) Quando os resultados forem publicados, no aparecer seu nome e, sim, um cdigo.

Eu,
, abaixo assinado,
li o texto acima e compreendi a natureza e o objetivo desse estudo do qual fui convidado a
participar. Eu entendi que sou livre para interromper minha participao no estudo a
qualquer momento sem justificar minha deciso e concordo voluntariamente em participar
deste estudo.

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Assinatura do doador

Assinatura do P e s q u i s a d o r

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Data

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Data