Métodos basicos de laboratorio en parasitologia médicaCatalogacion por la Bisoteca e ls OMS Mstodos béscos de aboraoro en parastologia mica 1. Parasilogia- manuals 6 aberatro (SBN 9249546101 (Clasifeacén NLM: WC 28) (© Organizacin Mundial dela Salud 1992 Ls Otganizasn Mira eS dra concern muy aonb la cas de uiean para ead 0 ‘reduc ineranent 0 en pave, ina dees pubscacnes. Ls sod yas ptr densa eben gra Ofer de Puicacones,Organiznn Mansa dela Sali, ner, Sua, gs le uno gio en separ oat ifamacon mds rere sore combos Iason a In ba lana ds ees y romps) fats ‘noe ya seponbiee © Organizacén Mune de a Sah 1982 Las pbleasoes de Orgnzain Mund doa Sad ella scolds al rleckn prvi potas ponent $b epodicin de ogres dl Poco 2 Convene Umer sob Buccs So Aa Mesrtos es De restos as cenorinasonos amieads on esta pbleacn yi forma an qu sprecenpresonados oe dle ae contre ro mates, pe pare dof Secretaria ce la Organzncbn Mandl deh ald, aon algae soe wean hoa Ge les tiaras, cues © zoe, o de ws avorsedeo, reaped ara dew rns o es a more de determina scdes morcanise ode nantes comets de crtos products ro implica qe ‘roanacicn Mina dei ated foe aru orem con poeencas tos andiogee, Soe ere U oma Ma oromincenes de prods palniados leaner is pubcarones def OS lea rc meyscus PRINTED IN SPAIN 91/8844-Gréticas Reuriaas-1800Indice Prefacio Relacién de colaboradores Introduceién Seguridad en el laboratorio Seccién 1. Técnicas de toma, preparacién y examen de muestras. Cuidado de! microscopio Ajuste de! microscopio para medir tamafios Muestras fecales Toma de muestras fecales Examen Examen macroscépico de tas heces Examen microscépico de preparaciones humedas Identificacién de pardsitos Técnicas suplementarias Técnica de concentracién Técnicas de tincién permanente Identiticacién de pardsitos en frotis tefiidos Frotis anales para la deteccién de oxiuros Frotis fecal, en capa gruesa con celofén para el diagnéstico de la esquistosomiasis intestinal (técnica de Kato-Katz) Envio de muestras al laboratorio de referencia Eliminacién de las muestras Control de la calidad en el examen de heces Toma de muestras Preparacién de reactivos Ejecucién de las técnicas Muestras de orina ‘Toma de orina para el diagnéstico de a infeccién por Shistosoma Examen de la orina Método de sedimentacién para la recogida de orina terminal de 24 horas Método de filtracion por jeringuilla Identificacién 10 10 "1 13 15 16 7 24 25 28 888 31 31 34 34 34 34 35 37me | HETOOUS BASICOS DE LABORATORIO EN PARASTOLOOIA MEDICA Muestras vaginales y uretrales 38 Toma de muestras 38 Examen directo de frotis vaginales y uretrales 38 Muestras de sangre y otras muestras 40 Extensiones de sangre tefidas a Toma de muestras at Tincién de extensiones de sangre con colorantes de Giemsa 44 Tincién de extensiones de sangre con colorantes de Field 45 Tincién de extensiones de sangre con hematoxilina de Delafield para detectar microfilarias 46 Examen 46 Control de la calidad en los examenes de sangre ar Técnicas especiales para plasmodios 48 Identificacién de pardsitos palidicos 48 Examen de la resistencia a la cloroquina en el Paludismo por P. falciparum 49 Técnicas especiales para Trypanosoma 50 Deteccién de tripanosomas en la sangre 50 Deteccién de tripanosomas en material aspirado de ‘ganglios linfaticos 55 Deteccién de tripanosomas en liquido cefalorraquideo «LcR) 87 Técnicas especiales para microfilarias 59 Toma de sangre para detectar microfilarias 59 Deteccién de microfilarias en la sangre periférica 59 Técnicas especiales para Leishmania 60 Muestras cutaneas 64 ‘Toma de muestras 64 Examen de las muestras 65 de especies parasitas 67 Seccién 2. Identifica Pardsitos intestinal 68 Helmintos. 68 Clave de identificacién de los huevos 69 Larvas de gusanos 72 Protozoos 73 Trofozoitos amebianos 73Quistes amebianos Flagelados Balantidium coti Isospora belli y Cryptosporidium Toxoplasma gondii Problemas de identificacién Pardsitos sanguineos Paludismo Identificacién de pardsitos en extensiones sanguineas finas Identificacion de parésitos palidicos en preparaciones de sangre en gota gruesa Elementos que pueden confundirse con pardsitos Paliidicos Tripanosomas Microfilarias Bibliogratia ‘Anexo 1. Equipo y material para el diagnéstico parasitolégico en laboratorios de centros de salud y hospitales de distrito ‘Anexo 2. Reactivos y soluciones: preparacién ‘Anexo 3. Preparacién de medios de cultivo ‘Anexo 4. Limpieza y conservacién de portaobjetos Indice alfabético, 75 78 79 80 80 81 83 83 83 83 1 92 92 95 96 99 110 112 113,Prefacio Este manual pretende ser una guia prictica para el personal que trabaja en los la boratorios de centros de salud y hospitales del primer nivel de envio de casos. Los métodos de diagnéstico se limitan al microscopio, si bien el serodiagnéstico puede requeris el envio de muestras de referencia, El contenido de este manual se basa en la informacién que se halla en el material docente y los manuales producidos por el Hospital de Enfermedades Tropicales de Londres (Inglaterra); el Departamento de Formacién en Parasitologia, de Ia Divi- sidn de Formacién y Consultas en Materia de Laboratorio, Oficina de Programa de Laboratorios, Centros de Lucha contra las Enfermedades, Atlanta, Georgia (EB.UU.); la Organizaci6n Mundial de la Salud, Ginebra (Suiza); y la Organizacion Panamericana de la Salud, Washington, DC (EE.UU.). En particular, se tomaron, varias ilustraciones de las publicaciones siguientes: Brooke, M.M. y Melvin, D.M. Morphology of diognestc stages of intestinal parasites of bumans, 2 ed., Atlanta, GA, Depar- tamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., 1984 (HHS Publication No. (CDC) 84-8116); Melvin, D.M. y Brooke, M.M., Laboratory procedures for the diagnasis of intestinal parasites, 3 ed., Atlanta GA, Departamento de Salud y Servicios Huma- ‘nos de los EE.UU., 1982 (HHS Publication No. (CDC) 82-8282). viiRelacion de colaboradores Las siguientes personas han colaborado en la preparacién de la presente obra: De. P. L. Chiodini, Consultor en Parasitologia, Hospital de Enfermedades Tropi- cales, Londres (Inglatetra); Dr. K. Engback, Departamento de Microbiologia Clinica, Hospital del Condado de Copenhague, Herlev (Dinamarca); Dr. C. C. Heuck, Tecnologia de Laboratorio de Salud y Seguridad Hematol6gica, ‘OMS, Ginebra (Suiza); Dr. L Houang, Annemasse (Francia); Dr. R. C. Mahajan, Departamento de Parasitologia, Instituto Superior de Ensefian- as ¢ Investigaciones Médicas, Chandigath (India); Dr. M. A. Melvin, Atlanta, Georgia (BE.UU,); De. L. Monjout, Parasitologia y Micologia, Enfermedades Tropicales y Parasitarias, Groupe Hospitalier Pitié-Salpétriére, Pavillon Lavercan, Paris (Francia). Dr. J.C. Petithory, Control Nacional de la Calidad en Parasitologia, Departamento de Biologia Médica, Centre Hospitalier, Gonesse (Francia); Dr. J. Vandepitte, Departamento de Microbiologia Clinica, Hospital Universitario de San Rafael, Lovaina (Bélgica). villIntroduccién Las enfermedades parasitarias causan una elevada morbilidad y numerosas defun- ciones en todo el mundo y a menudo cursan con sintomas y signos inespecificos. La mayorfa de esas enfermedades no pueden diagnosticarse slo mediante un re- conocimiento fisico, sino que exigen un estudio en el laboratorio para determinar si el paciente esté infectado 0 no por un parisito y, en caso afirmativo, la especie 1 la que pertencce ese parisito. As{ pues, el laboratorio desempefia un papel im- portante en el diagnéstico de las parasitosis y por ello constituye la clave en la se- leccién de los firmacos més apropiados para el tratamiento, Las pruebas de labo- ratorio deben ser precisas y flables si se desea que los resultados sean iitiles para el médico y beneficien al paciente. El presente manual es una guia para el agente de laboratorio, En la seccién 1 se presentan las técnicas de examen de heces, sangre, orina y otros materiales para la deteccién de parisitos. Se indican los inconvenientes y los errores que pueden co- rmeterse con cada técnica, as{ como los medios de evitarlos, También se examinan las medidas de control de la calidad. El agente de laboratorio debe tener presente que sélo la cuidadosa observancia de las téenicas adecuadas en Ia toma y Ja mani pulacién de las muestras permitici observar claramente los parisitas en el microsco- pio. En Ia secci6n 2 del manual se describen los etiterios morfoldgicos utilizados para identificar a los pardsitos. También se examinan los artefactos y los problemas de identificacién. En los cuatro anexos se ofece informacién sobre el equipo y los reactivos necesa ios. Fn el anexo 1 se enumeran los materiales y el equipo necesarios en los labo- ratorios de centros de salud y hospitales en el nivel de atencién primaria; en el anexo 2 se dan las formulas y las instrucciones para preparar los reactivos; el anexo 3 contiene las formulas ¢ instrucciones para preparar medios de cultivo, y en el anexo 4 se describe el procedimiento de limpieza y conservacién de portaobjetos destinados a la preparacién de extensiones sanguineas.Seguridad en el laboratorio Principios generales 1, En todo laboratorio debe existit un manual de seguridad en el laboratorio cu- {os principios deben aplicarse en todo momento. 2. El laboratorio debe disponer de un botiquin de primeros auxilios y se debe de- signar entre el personal un encargado de los primeros auxilios 3. No debe permitirse Ia entrada de personal ajeno al laboratorio en la zona de trabajo del mismo. 4. Se prohibird comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos en el laboratorio. 5. El personal del laboratorio debe llevar indumentaria protectors, que se quitari cuando abandone la zona de laboratorio, BI personal del laboratorio debe limpiar los mostradores con una solucién de- texgente (abn) y desinfectar Ia superficie después de Ia jornada laboral, cuan- do se haya derramado material infeccioso, Los desinfectantes mas comunes son: — etanol 0 isopropanol al 96 9 (irritante para la piel) — solucién de fenol al 1% (corrosiva, caustics) — solucién de hipoclorito al 0,5 %-1 % (céustica corrosiva) (la solucisa alea- lina de hipoclorito es més fuerte que la solucién neutsa), — solucién de foraldehido al 1% o de glutaraldehido al 2% (téxica irtitan- te para la piel) Las soluciones de aldehidos y fenoles mantienen su actividad durante mis tiem- po. Es aconsejable limpias las zonas de trabajo con un paiio empapado en so- ucién desinfectante en lugar de utilizar un nebulfsador. HI personal siempre debe lavarse las manos antes de abandonar el laboratorio, Manipulacién de muestras Es preciso manejar con gran cuidado todas las muestras de laboratorio y utilizar siempre guantes de goma. ‘Mustras de sangre. Todas las muestras de sangre deben considerarse potencialmente infecciosas. Como la sangre puede transmitic agentes patdgenos sumamente peli .gros0s (por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el de Ia he- patitis B), es preciso proceder con gran cuidado en la toma y la manipulacién de ‘muestras. En particular. los riesgos son: 42) Pinchazos o cortes: conviene ir desechando las agujas o las lancetas usadas en un recipiente que pueda después incinerarse o introducirse en otz0 recipiente de muestras desechable tras sumergirlo en una solucién desinfectante. Las lan- cetas usadas no deben volver a utilizarse ni dejarse sin zecoger. No deben usar- se utensilios de vidrio que presenten grietas 0 estén mellados. 4) Contaminacién de pequefias heridas 0 de las mucosas: cibrase todo corte con un apésito impermeable. Evitense las salpicaduras de sangre en la piel o las mu- cosas. Debe prohibirse terminantemente pipetear material con la boca. Si sal- pica sangre sobre la piel, lévese de inmediato la zona afectada con agua y ja ‘bon; sila sangre entra en los ojos, lévense éstos con agua abundante, La sangre que se haya derramado sobre las superficies de trabajo debe empaparse con so- lucién de hipoctorito y a continuacién limpiarse con un paflo impregnado con solucién de hipoclorito. Muestras de bees. Debe evitarse el contacto con la piel. Una ver terminado el trabajo con las muestras, éstas se deben a) incinerar o b) empapar en solucién desinfectan- te y enterrar después en recipientes de muestras desechables. 2SEQURIOAD EN EL LABORATORIO ‘Muestras de orina. Debe evitarse el contacto con la piel. Las muestras pueden dese- charse por el sistema de desagie. Eliminacién de portaobjetos usados Los portaobjetos usados deben colocarse en una vasija que contenga solucién de hi- poclorito al 19 y a continuacién enterrarse en un recipiente desechable, « menos {que vayan a limpiarse pare utilizatios de nuevo.Seccion 1 Técnicas de toma, preparacién y examen de muestrasCuidado del microscopio Lo que debe hacerse: 1. Manténgase el microscopio cubierto con una funda limpia de plistico o de tela mientras ao se esté utilizando. 2. Procirese en especial proteger el microscopio del polvo durante los periodos de calor seco. 3. Téngase especial cuidado de proteger las lentes y los prismas de! microscopio de la proliferacin de hongos durante los perfodos calurosos y himedos. Esto puede hacerse de varios modos: — mantener el microscopio en un cuarto con aire acondicionado, ° — mantener el microscopio en un cuarto especial deshumificado mediante un aparato eléctrico, que cuesta aproximadamente la mitad que un aparato de sire acondicionado, ° — conectar vasias bombillas de 15 6 25 vatios dentzo de un armario cuyas puer- tas cierren bien, = colocar una bombilla de 15 vatios en la caja del microscopio, para que haga las veces de armario climatizado, ° — en las zonas que carecen de electricidad, colocar un estante para la caja del ‘microscopio que se encuentre 2 uno 30 em sobre la campana de humos del refrigerador o el congelador a gas 0 queroseno; una holsa hermética y sili- ccagel en estado seco (indicado por su color azul) mantendrén el microsco- pio lo bastante seco como para proteger las lentes de los hongos. 4. Limpiese el aceite del objetivo de inmersién todos los dias, utilicese un pafto suave humedecido con etanol/éter (3 ml/7 ml) o bencina/etanol /éter (2 ml/2 ‘ml/1 ml) y séquese con un pao limpio sin pelo. 5, Limpiense los oculazes con un pao suave sin pelo; también puede usarse una ‘gamuza para gafas o servilletas para la cara. 6. Utilicese el tomillo de sujecién del microscopio que se encuentra en la base de la caja para evitar dafos al instrumento cuando se transporta de un lado a otro, 7. Conviene citar el némero de modelo y, de ser posible, el nimero de instru- ‘mento y de pieza cuando se pidan piezas de repuesto. Lo que no debe hacerse 1. No utilizar el mismo tejido © pafo para limpiar el objetivo de inmersién y los, 2. No utilizar alcohol para limpiar las partes del microscopio que van pintadas, 3, Nunca se debe desmontar ni intentar limpiar partes del microscopio de dificil acceso a menos que se haya aprendido a hacerlo. 4. No deben dejarse vacios los orificios de las lentes utilice la tapa apropiada 0 tun poco de masilla para tapar el orifico. 5. No intercambie las lentes de microscopios de distinto fabricante; incluso algu- rnos modelos del mismo fabricante tienen diferentes especificaciones.Ajuste del microscopio para medir tamafos El temafio es un criterio importante para la identificacién de numerosos pardsitos, ‘en particular en el caso de los quistes y los huevos. El tamafio puede determinarse utilizando una cémara de recuento de células sanguineas (Neubauer), 0 un micré- metro ocular, Con este diltimo instrumento, el procedimiento que debe seguirse es cl siguiente: 1. La escala graduada del ocular esté dividida en 100 divisiones pequefias. 2. Laescala graduada del micsémetro del portaobjetos consta de 1 mm dividido cen porciones de 0,1 mm, a su vez divididas en otras de 0,01 mm. 3, Insértese la escala del ocular (un disco de vidrio) en el ocular reticando la len- te superior y colocando la escala en el limitador del campo visual. 4, Inséztese el ocular en el microscopic. Coléquese el micrémetzo del portachjetos sobre la platina 6. Enféquese el objetivo de menor aumento sobre la escala graduada de Ia plati- “Ajstense las escalas graduadas de la platina y del ocular hasta que queden pa- ralelas. 8 Anétese el mimero de divisiones del ocular y su medida correspondiente en Ia platina, por ejemplo, 50 divisiones del ocular = 0,75 mm; 10 divisiones del ocular = 0,15 mm. 9. A partir de esta lectura, calcilese el valor de una divisién del ocular, por ejem- plo: 50 divisiones del ocular = 0,75 mm 1 divisién del ocular = 0,75/50 = 0,015 mm ° 10 divisiones del ocular = 0,15 mm 1 divisi6n del ocular = 0,15/10= 0,015 mm. 10. Conviértase el valor de la medida de min a jim (1 mm = 1000 Him), por ejem- plo, 0,015 mm = 15 wm. 11, Repftase la operacién para todos los objetivos y anétese la lectura obtenida en cada caso. 12, Basta con calibrar cada microscopio una sola vexMuestras fecales Las muestras fecales se examinan para detectar la presencia de protozoos y larvas © huevos de helmintos. Bn las heces, los protozoos suelen encontrarse en Ia fase de trofozoito y de quiste. ‘Los helmintos aparecen habitualmente en forma de huevos y de Iaevas, aunque @ veces también pueden observarse gusanos adultos enteros 0 en segmentos, Pot lo general, las tenias adultas y sus segmentos resultan visibles a simple vista, pero los hhuevos, las larvas, los trofozoitos y los quistes s6lo pueden verse al microscopio. La observaci6n de esas estructuras exige Ia preparacién y el examen correctos del material Toma de muestras fecales Dada la fragilidad de muchos parisitos intestinales y la necesidad de preservar su morfologia para identificarlos con exactitud, no puede hacerse un diagnéstico fia- ble al microscopio a menos que Ja toma de las heces se haga debidamente. 1, Entréguese al paciente lo siguiente: — una caja de cartén encerado cuya tapa cubta los bordes por el exterior, © un recipiente o caja de plistico cuya tapa encaje bien, y — dos varillas aplicadoras. Si no se dispone de cajas enceradas ni de recipientes de pléstico, también sit- ven las cajas de hojalata o los recipientes de vidrio, Las hojas de bananero y las cajas de cerillas no son recipientes adecuados pars la toma y el almacena- miento de muestras de heces. En los programas de lucha basta 2 menudo el examen de una sola muestra, pero en el caso de los pacientes suelen necesitarse tres muestras obtenidas a in- tervalos de tres dias, a fin de detectar todas las parasitosis. Diversas sustancias pueden interferir con el examen de las heces en busca de parisitos (por cjem- plo, los laxantes, los antiécidos, los medios de contraste y ciertos antibisticos). 2. Pidase al paciente que defeque directamente en el recipiente, 0 que lo haga en tun trozo de papel y utilice las varillas aplicadoras para introducir Ia muestra en el recipiente. Si no se dispone de papel, puede defecarse en una hoja grande y limpia, por ejemplo de bananero. De todos modos, e] exeremento debe rans- friseinmediatamente al recipiene indicade, No debe dejarse sobre la hoja ni llevarse al laboratorio envuelto en ella, 3. Algunos microorganismos, especialmente los trofozoites amebianos, comien- zan 2 desintegrarse o alterarse al poco tiempo de ser excretados y se vuelven irreconocibles. Las temperaturas clevadas aceleran esos cambios. Asi pues, las muestras deben llegar al laboratorio tan pronto como sea posible (por ejemplo, al cabo de media hora) después de la defecacién. Si no es posible, Ia muestra debe tratarse con conservantes (véase la pagina 29). 4. El recipiente que contiene Ja muestra debe rotularse claramente con los si iguientes datos: — nombre 0 nimero del paciente = fecha de toma — hora de la excrecién (pregiintese al paciente). ‘La muestra fecal debe ser lo bastante grande para un examen satisfactorio. La muestra més pequefia que debe aceptarse es del tamafio aproximado de un hue- vo de paloma. La orina y la suciedad deben separarse. La orina destruye los tro- foottos amebianos que pudieran existiry Ia suciedad interfiere con el examen. Si la muestra es demasiado pequetia o si estd mezclada con orina o suciedad, debe rechazarse, Pidase al paciente que traign otra8 (elanda) Swen anal TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DELAS MUESTS 6, Manténgase la caja de cartén en la que se encuentra le muestra dentro de un frigorifico; si ello no ¢s posible, coléquese en el lugar més fresco y sombreado del laboratotio, No debe mantenerse la muestra artificialmente templada ni de- jarse al sol Examen Examen macroscdpico de las heces 1, "Tan pronto como se reciba la muestra de excremento en el laboratorio, obsér- ‘vese su consistencia (grado de humedad) y andtese una de las siguientes letras cen el recipiente: F (formada), B (blanda), § (suelta) 0 A (acuos:), Si se observan mucosidades, andtese la letra M, y si se observa sangre eserfbase Sa. Por ejemplo, una deposicién suelea con sangre y mucosidades se describirfa ‘con las letras, S, Sa, M. La consistencia o grado de humedad serving de orien- tucidn para saber si serd més probable encontrar les protozoos en fase de tro: foroito 0 de quiste, Las diversas eategorias de excrementos y las técnicas més apropiadas en cada caso se muestran en el cuadro 1, 2, Sise reciben varias muestras al mismo tiempo, hay que examinar primero las que contengan sangre y mucosidades, y a continuacién las muestras liquidas. Estas muestras son las que con més probabilidad contienen trofozoftos ame~ bianos, que mueren al poco tiempo de la excrecién, por lo que deben exami- rarse durante la primera hora que sigue a ésta. Las heces formadas pueden exa- minarse en cualquier momento del primer dia, pero no deben dejarse de un da para otto (los quistes pueden desintegrarse). Examen microscopico de preparaciones humedas La prepatacion en hiimedo es la técnica mas sencilla y ficil para examina las he- ces; este método debe aplicarse en todos los laboratories del nivel periférico. Una preparacién hémeda puede prepararse directamente a partir de material fecal 6 de muestras concentradas (wéase la pagina 16). Las principales formas de pre- paracién en hiimedo que deben usarse en cada examen fecal son las realizadas con solucién salina, con solucién yodada y con azul de metileno amortiguado: = La prparacién co soln salina se usa en el examen microscépico preliminar de los excrementos. Se utiliza primordialmente para observar los huevos y larvas Cuadro 1. Categorias de heces y técnicas apropiadas Tecnica Consistencia Fase protozoaria Solucién Solucién Azul de metilano mas probable" salina -yodada_-—‘tamponado (6i se observan trofozoltes) Formada Quistes + + Bianca Quistes + + + (ocasionaimente trofozoitos) Suetta Trotozoltos + + ‘Acuosa Trofozottos + * Los huevos y las larvas de gusanos pueden encontrarse en los excrementos de cualquier ‘consistencia 10MUESTIAS FECALES de gusanos, los trofozoitos de protoz0os y los quistes. También puede revelat la presencia de eritrocitos y leucocitos — La preparacin con solu yodada se utiliza principalmente para teftir el glucégeno y los niicleos de los quistes, si existen, Por lo general, con esta preparacion puc- den identificarse los quistes — La preparaciin con azul de metilno amortiquade (AMA) debe hacerse cada vez que se observen trofozoitos amebianos en una preparacién salina, o cuando se sos- peche su presencia. El AMA tite los trofozoitos amebianos, pero no los quistes amebianos, ni los trofozoites si los quistes de flagelados. La coloracién con AMA sélo debe usarse para las muestras frescas sin conservantes; no se usa en las muestras tratadas con conservantes, en las que los organismos han muerto, Material y reactivos 1. Cubreobjetos Frascos cuentagotas con: solucién salina isoténica (reactivo n® 24).! ‘Yodo de Lugol (solucién al 1%) (seactivo n° 18) azul de metileno amortiguado (reactivo n° 2). Portaobjetos Boligrafos o rotuladores para las etiquetas Asa de siembra (o varillas aplicadoras, cerillas 0 mondadientes). Preparaciones directas con soluci6n salina y solucién yodada 1. Con un Lipiz de cera, eseribase el nombre o el niimero del paciente y la fecha en la parte iaquierda del portacbjetos. 10/4/84 - N N 2. Coldquese una gota de solucién salina en el centro de la mitad iequierda del portaobjetos y una gota de solucién yodada en el centro de la mitad derecha. NOTA Si se sospecha la presencia de trofozoitos amebianos, debe utilizarse solucién salina tibia (37° ©). 7 En todo el manual el endmero de reactivo» se refiere al nimero asignado al reactivo en el anexo 2 "eee TOA PREPARACION YENSAYODE LS HUET SE 3. Con una varilla aplicadora (cerilla o mondadientes), tomese una pequetta por- cin de la muestra (del tamafio de la cabeza de una cerilla) y mézclese con la ‘gota de solucién salina, NoTA _Exeremente forma: omese Ia porcién de excremento de modo que contenga ma- terial del exterior y del interior de la muestea. Bxcremento on mussidades: si hay mucosidades, rotilese un segundo portaobjetos ‘con el nombre o el siimero del paciente. Coléquese una gota de solucién sa- lina en el portaobjetos, t6mese una pequeha porcién de mucosidad y mézclese con la solucién salina, Si existen trofozoites, a veces es mAs fécil encontrarlos cen las mucosidades que en las partes s6lidas del excremento. Exzremento sultoy aeaete: ino hay mucosidades t6mese una pequefta porcién del excremento (de cualquier parte) y mézclese con la solucién salina 4. Del mismo modo, témese una pequefia cantidad del excremento y mézclese ‘con la gota de solucién yodada. Si se utiliza un asa de siembra, pasese por la llama después de hacer la preparacién. Si se utilizan varillas aplicadoras, tiren- se después 5. Ciibrase la gota de solucién salina y la gota de solucién yodada con sendos cu- breobjetos. Se apoya el cubreobjetos sobre el portaobjetos en posicién inclina- da, se toca con él el borde de la gota y se hace descender lentamente hasta que quede sobre el portaobjetos. Con ello se reducita al minimo la posibilidad de que se formen burbujas de aire en la preparacién. Preparaci6n con azul de metileno amortiguado (AMA) (prepérese si se observan trofozoitos amebianos en la preparacién con soluci6n salina) Procédase como en Jos patos 1 a § en «Preparaciones directas con solucién salina y solucién yodada», pero colocando una gota grande AMA sobre el portaobjeto en 12SUEUR died lugar de solucién salina yodada, Déjense pasar 5-10 minutos antes del examen, para que el colorante penetre en los teofo2nitos. No deben dejarse pasar més de 30 minutos desde la preparacién del portaobjetos, pues de lo conteario el AMA daria tuna tincién excesiva de los trofozoftes Examen 1. Coléquese el portaobjetos con las prepariciones en la platina del microscopio y enfoquese la preparacién con el objetivo X10 0 uno de menor aumento. 2. Regilese la luz en el campo visual con el diafragma de debajo de Ia platina Los objetos deben verse con nitidez en el campo. Gradiiese adecuadamente la iluminacién del campo. 3. Examinese toda la zona del cubreabjetos con el objetivo x10; enféquese el én gulo superior izquierdo y mievase el portaobjetos con movimientos regulares en horizontal o en vertical. 4. Cuando se vean microorganismos © material sospechoso, pisese al objetivo de més aumento en seco y auméntese la iluminacidn abriendo el diafragma de de. bajo de Ia platina pata observar la morfologia en detale. Este es un examen sistemitico. Por este método podré localizarse habitualmente todo parisito que esté presente. Si la preparacin no se examina sistematicamente, cabe la posibilidad de pasar por alto algiin pardsito, Examinese cada campo mi- croseépico cuidadosamente, enfocando arriba y abajo, antes de pasar al campo si- guiente. RECUERDE EXAMINE SISTEMATICAMENTE LAS PREPARACIONES En la figura 1 se indican los exémenes que deben Ilevarse a cabo en los laborato- ios de distintos niveles. Identificacién de parasitos Huevos y larvas de gusanos en preparaciones con solucién lina Los huevos son ficiles de detectar y de identificar en las preparaciones con solu- cidn salina. No deben teairse (la tincién puede entorpecer la identificacién). Aun- gue la mayoria de los huevos son lo bastante grandes para poderlos reconocer con el objetivo de menor aumento (x10), algunos huevos pequefios deben examinarse fen seco con un objetivo de mayor aumento, En las preparaciones salinas pueden verse las larvas de Sirongylidessteroral. Las larvas de los anquilostomas no suelen hallarse en las muestras frescas, pero tal vez sea necesario distinguir estas dos especies si se examina una muestra antigua. Las caracteristicas en que se basa la identificacién de especies de huevos y larvas se describen en la seccién 2, pp 69-72, Los diagramas y las claves de esa seccién pueden usarse para identificar huevos y larvas. 13TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DE LAS MUCSTRAS SS Fig. 1. Técnicas de examen de heces segiin el nivel del laboratorio Laboratorio de centro de salud soluciin— y(sise — azul de Salina.” observan—metileno tofozotos _tamponado ‘amebianos) _amortiguado Proparacién muestra focal humeda ‘extension gruesa con celotan directa yodo solucién concentracisn [~ salina todas las muestras — con formaiina/ oer yodo Hospital de distrito ‘Muestras de heces sin conservante Preparaciones himedes directas solucion _yisise azul {sison heces emortas 0 salina’ observan — metileno fcompanadas de sangre y trotooites amortiguado ‘mucosidades) amebianos) yodo solucién todas las muestras-— concentracién --— salina con formalina/ eter = Muestras de heces con conservante solucién {lade con concentracisn | *2Hn® formatina on formalina) Stor yodo [No todos Io gusanos se hallan en todas las regiones del mundo; algunos tienen una disteibucién geogrifica limitada, Es conveniente elaborar una lista de las especies aque se encuentran en la zona geogrifica del laboratorio. Protozoos en preparaciones himedas Preparaciones con soluci6n salina En las preparaciones con solucién salina, pueden observarse los trofozoitos y los quistes de amebas y flagelados. Los quistes aparecen como estructuras refringentes redondas u ovaladas. Los trofozoitos amebianos pueden ser redondos o irregulares;, los trofozoitos de flagelados suelen ser piriformes (alargados, con forma de pers). En las heces recientes (de no més de una hora) pueden observarse trofozoitos mé- viles, La observacién de la motilidad puede ser muy stil para identificar especies, sobre todo en el caso de los flagelados. La motilidad caracteristica de cada especie se deseribe en Ia seccidn 2 (pp. 73-81). Aunque con el objetivo de menor aumento (x10) pueden detectarse microorga- rnismos, serd necesario recutrir al objetivo de mayor aumento y al examen en seco para determinar de modo fiable si la estructura es un quiste 0 un trofozoite. Con ese objetivo puede observarse la motilidad, las inclusiones como los eritrocitos y 4las levaduras en los trofozoltos amebianos, los ézganos cromatoides en los quistes amebianos y la forma y los detalles estructurales (por ejemplo, los discos de suc~ cidn, los surcos en espiral o los filamentos) de os trofozoitos y quistes de flagela dos. No se podra ver ningin detalle del nucleo en las preparaciones con solucién salina, No obstante, es necesario regular caidadosamente la iluminacién del mi- croscopio a fin de que los objetos aparezcan con claridad, Tanto el exceso como la cescaser de luz entorpecerin la observacién. También es preciso enfocar hacia arri- ba y hacia abajo para ver todas las capas o planos de la muestra, Examinese toda Ja zona del eubreobjetos de modo sistematico para reducie la posibilidad de que pase desapercibido algin microorganismo. Preparacién himeda con azul de metileno amortiguado (AMA) Si se observan trofozoitos amebianos o estructuras que lo parecen debe prepararse y examinarse una preparaciéa con AMA. Tras 5-10 minutos de tineida, los trofo- zoftos a veces conservan la movilidad, pero a menudo se enroscan en las prepara: ciones con AMA. (No deben confundirse con la solueién de AMA). Ea los trofo. zoftos, el micleo y las inclusiones (eritsocitos, levadusas) se tinen de color azul os: cura y el citoplasma se tifte de azul claro, Ocasionalmente quedan algunos trofo. zoitos sin tefl, de modo que conviene buscar microorganismos bien coloreados. Basquense grénulos en la periferia del micleo (en la membrana perinucleas); si exis- ten, el trofozoito pertenece al género Examorha: a continuacién debe identificarse la especie. (Las caracteristicas para identifica los trofozottos amebianos figuran en. Ia seccién 2, pp. 73-75). Si no se observan grénulos perinucleares, el trofozoito no pertenece al género Extamoba Preparacion himeda con yodo Las preparaciones con yodo sirven para observar los quistes de amebas y lagela- dos. Pueden detectarse con ¢l objetivo X10, pero no son tan refringentes como en las preparaciones con solucién salina, Debe usarse un objetivo de gran aumento en. seco pasa estudiar las caracteristicas de los quistes; Estos deben medirse para garan- tizar una identificacién correcta En Ia preparacién con yodo, el citoplasma de los quistes se tine de amarillo 0 de martén claro y los nticleos de mars6n oscuro. En los quistes de Fatanecba tenidos ‘con yodo, puede observarse la disposicién de la ceomatina periférica y Ia posicién del cariosoma, (Si no hay cromatina periférica, el quiste no pertenece al género Ex tamotha), Bstos oxgiulos cromatoides periféricos se tinen de amarillo claro y a ve- ces no se ven con nitidez. En ocasiones, los quistes jévenes contienen glucégeno, que se tine de color matrén oscuro con el yodo. En los quistes lagelados tefidos con yodo pueden verse las fibrillas (Flamentos), Aunque por lo general en estas preparaciones puede identificarse Ia especie a la que pertenecen los quistes de amebas y flagelados, a veces es imposible una iden- tificacién definida, en cayo caso hay que utilizar tinciones petmanentes. En Ia seccién 2 (pp. 75-81) figuran las caracterstcas para la identiicacién de quistes. Técnicas suplementarias Adems de las preparaciones himedas directas, existen procedimientos suplemen- tarios para el diagnéstico de pardsitos intestinales, Los més comunes soa las técai: cas de concentracién para la recuperacién de huevos, larvas y quistes, y las técnicas de tincién permanente para la observacién de trofozoites y quistes. 15TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DE LAS MUEST?AS Técnica de concentracién Si la muestra de heces contiene pocos microorganismos, es posible que no se de- tecten parisitos en una preparacién hiimeda directa. Asf pues, siempre que sea po- sible, debe concentrarse la muestra. Los huevos y larvas de gusanos y los quistes, de protozoos pueden recuperarse por concentracién, pero los trofozoitos de proto- zoos no se verin ya que este procedimiento suele destruitlos. Por ese motivo es im- prescindible el examen de Ia preparcién hiimeda directa como fase inicial del es- tudio microseépico. El procedimiento de concentracién esti indicado cuando el examen preliminar de ln preparacién hnimeda dé resultado negativo a pesar de los s{ntomas clinicos que indican la infeccién por parisitos del paciente, y para la deteccién de Schistosoma y Tenia El procedimiento de concentracién que se recomienda es el método formalina-éter (@ formalina acetato etflico)', Por este método pueden recuperarse todos los tipos de larvas y huevos de gusanos (iscaris, tenias, esquistasomas y otros huevos de tre- ‘matodos), asi como quistes de protazoos Material y reactivos 1. Varillas aplicadoras de madera. 2, Feascos, distribuidores 0 de plitico wexprimibles, de 250 ml 0 500 ml, Estos frascos son muy cémodos para aftadir formalina a los tubos de la centrifuga dora. Puede usarse también cualquier tipo de frasco o botella pequefia. 3, Centeifugadora, con cabezal y cubetas para alojar tubos cénicos de 15 ml. De- ben usurse cubetas herméticamente cerradas 4. Tubos de centrifugadora, 15 ml, ednicos (higase una marca a7 ml y 10 ml con un lipiz graso). 8, Torundas de algodén. 6. Cubseobjetos. 7. Embudo, 8. Gasa quinirgica. 9, Portacbjetos, 10. Pipetas Pasteur con perilla de goma. 11, Gradilla o soporte para los tubos. 12, Formalina, 10% (ceactivo n® 10). Para el uso cotidiano, viértase parte de la solucién en un frasco «exprimibles. El frasco debe ir etiquetado. 13, Bter 0 acetato etilico. ' 14. Yodo de Lugol, solucién al 1 9, en un frasco distribuido con pipeta (reacti- vo n° 18). 15. Solucién salina, isoténica (reactivo n° 24). PRECAUCION El éter es un producto sumamente inflamable que se prende y explota répidamente si hay una llama o una chispa en sus proximidades, Gudrdense las latas 0 frascos abiertos en un estante abierto en la parte mas fresca del laboratorio, Hay que cer- cionarse de que as latas o las botellas estén tapadas, Nunca debe ponerse ua reci- piente abierto de éter dentro del frigrorifico: los vapores se acumulan en el interior de éste, incluso cuando el recipiente esté cerrado, y pueden explotar cuando se abre Ia puerta, No deben colocarse recipientes abiertos en un armario. Es preferible de- jar el recipiente en un estante abierto de modo que los vapores puedan dispersarse sin dificultad. ¥ Sino se dispone de éter ni acetatoetiico, puede usarse gasolina ordinaria en idénticas pro- pporciones que at éter. El acetato etiico no es tan inflamable ni tan expiosivo como el ter, por lo que resulta menos peligroso en el laboratoio. 161 sae unto capas vasa Shima csrrtogacion EE Tecnica 1. Anédase 10 ml de formalina al 10% a aproximadamente 1 g de heces y re rmuévase utilizando un palilo aplicador hasta obtener wna svspensin ligera mente tabi 2. ‘Ajstese un feo de gis al embudo y coloquese éste sobre un tubo de centifa- gudorn 3. Higase pasar la suspensin fecal por el filtro dentro del tubo de centrifugadora hasta alcanzar la marca de los 7 tal 4. Retitese el fltzo 0 y urese junto com el residuo s6lido. 5. Aaidanse 3 ml de éter o de acetatoetlico y mézclese bien durante un minoto. 6. Wuelvase a verter en el tubo de centefagadora y centrifiguese durante un mi sto. El rabo debe presentar el mismo aspecto que en a ilustacién, Despéguese el tapéa grasa (rsiduo) con wn palillo apicador,y tirese el sobre nadante invirtiendo rapidamente el tubo 8, Coldquese de nuevo el tubo en la grailla y déjese que el liquide de los lados del tubo escurea hast el sedimeato. Mézclese bien y transfirase una gota a un portobjetos para examinarlo bajo un cubreabjctos, Hégase también una prepa- racién tetido con yoo. 9. Usillcense los objesivos x10 y x40 para examinar todo el material que queda bajo el cubreobjetos en busca de huevos, quistes y larvas Examen del sedimento ‘Las preparaciones de material concentrado deben examinasse del mismo modo que se ha descrito para las preparaciones hnimedas directas (véase la p. 13). La prepa- racién con solucién salina (o sin tefis) debe examinarse de modo sistematico en busca de huevos, larvas y quistes. Si se observan quistes o estructuras que Io pare- ccen, debe examinarse la preparacién con yodo para hallar més detalles. Los microorganismos tendrin el mismo aspecto que se ha deserito en el caso de las preparaciones himedas directas. Ein las preparaciones con solucién salina con. entradas con formalina-tter (0 acetato etilico), los niicleos de los quistes quedan fijados y pueden resultar visibles. No obstante, las preparaciones hiimedas con yodo. deben examinarse para alcanzar una identificacién més fiable, Técnicas de tincién permanente Normalmente no suele recurritse a los métodos de tincién permanente para el diag- néstico, porque no son necesarios para la identificacién de huevos o larvas de gu: sanos. No obstante, a veces es preciso urilizarlos con los siguientes fines — identificacién de oocistos de Crypioporidinm, — identificacién de trofozoitos de protoz00s, en aso de dudas — confirmacién de la especie a la que pertenecen los quistes de protozoos, en caso de duda.s — mantenimiento de un registro permanente; — envio a un laboratorio de referencia para obtener Ia opinién de un experto. Tincién de oocistos de Cryptosporidium Los oocistos de Cryptosporidium que aparecen en las heces son esféricos, con un dié- metro de 4.6 pt. Pueden concentrarse usando una técnica modificada de formali- nna-éter, pero deben identificarse por métodos de coloracién. El método recomen- dado es la técnica modifieada de Zichl-Neelsen; otra posibilidad es la tinciéa con safranina-azul de metileno. Material Palillos aplicadores de madera Cubreobjetos 7TOMA, PREPARACIONY ENGAYO DE LAS MUESTRAS Pinas Portaobjetos Boligrafo o rorulador para las etiquetas Vatilla de cristal Soporte para portaobjetos, para preparaciones terminadas Frasco pequefio de medio de preparacién Cubetas de tincién Esponja o papel sccante, Técnica modificada de Ziehl-Neelsen Reactivos Carbol-fucsina (reactivo n° 4) Formalina (formaldehido) (reactivo a° 10) Solucién de fcido clorhidrico - etanol (reactivo n° 13) Solucién de glicerina - verde de malaquita (o azul de metileno) (reactivo n° 12) Solucién de acido clorhfdrico - metanol (reactive n° 14) ‘Agua, Preparacion 1, Haigase una extensién de material fecal en capa fina, déjese secat al aire y fijese fen metano! durante 2-3 minutos. Si es posible, debe seguirse fijando eon vapor de formalina, a fin de reducir la infecciosidad. (No puede usarse el sedimento de la extracci6n con formalina-éter) 2. Titiase la extension con carbol-fucsina frla durante 5-10 minutos. 3. Diferénciese en dcido clorhidrico-etanol al 1 % hasta que éste deje de salir colo- reado, 4. Aclérese con agua del grifo, 5. Hégase una tincién de contraste con verde de malaquita al 0,25 % (o azul de metileno) durante 30 segundos. 6, Aclirese con agua del grifo, 7. Bseicrase hasta sequedad o eliminese el sobrante con papel secante. 8, Examinese con el objetivo de gran aumento en seco y confirmese la morfologta examinando con el objetivo de inmersién, Midanse los quistes. Los quistes de Coptoporidium mien entre 4 y 6 jum, Cuando se tien con esta técnica, los oocistos de Cryptaporidium aparecen como es: férulas de color rosa fuerte sobre un fondo de color verde pilido. Se abservan dis tintos grados de tincién interna, atendiendo a Ia edad y el estado del aocisto, Tincién con safranina - azul de metileno Reactivos Solucién de dcido clorhideico - metanol (reactivo n° 14) Solucién de azul de metileno - fosfato (reactivo n° 19) Solucién de safranina (reactive n° 23) Agua, Preparacion 1. Prepirese una extensi6n de heces en capa fina. 2. Déjese secar la extensién al aire, Pésese una ver el portacbjetos por la llama de un mechero de alcohol. 3. Fijese la extensién con solucién de fcido clorhidrico - metanol dusante 4 minu- tos. 4. Lavese con agua limpia del grifo 18NT 5, Tifiase la extensién con solucién acuosa de safranina al 1 % durante un minuto. Caligntese el colorante colocando debajo del portaobjetos una torunda empa- pada en alcohol y encendida. No debe dejarse que el colorante se seque sobre Is extensin, 6. Livese el colorante que sobsa con agua limpia del grifo. 7. Higase una tincién de contraste con solucién al 1 % (p/v) de azul de metileno durante 30 segundos. 8. Livese con agua limpia del grifo y séquese el portacbjetos 9. Recérrase la extensién en busca de oocistos con el objetivo x40 y tsese el ob- jetivo 100 para identificar los que se encuentren. Los oocistos de Cyptospor ridium aparecen como corpisculos redondos u ovalados de color anaranjado © rosa (4-6 im de didmetro). Los esporozoitos que hay dentro de los oocistos se tinea de un color ligeramente més oscuro. Técnica de tincién tricromética para protozoos La tincién tricromética resulta util para colorear las muestras fecales recientes, asi como el material fiiado con polivinil-alcohol (PVA). No obstante, para conseguir resultados fiables hay que cerciorarse de que no se ha exigido la fecha de caducidad de los reactivos y de que se aplica el método con exactitud, Reactivos Solucién decolorante de icido acético-alcohol (teactivo n° 1) Etanol al 70°% (seactivo n° 7) Etanol al 9596! Solucién de carbol-xileno (reactivo n° 5) 0 etanol absoluto Solucién de alcohol yodado (reactivo n° 16) Fijador de Schavdinn (zesctivo n° 25) Solucién de colorante tricromético (ceativo n° 27) Xileno * Preparacién de los iscos de tincion y sustitucion de los colorantes i) Bhigutene os dios de sia necearios pry el procedimienoy dapén ganse en fila en el orden siguiente: Fijador de Schaudinn Solucién de aleohol yodade Etanol al 70% (1) Etanol al 70% (2) Solucién decolorante tricromético Solucién decolorante acido acético-alcohol Etanol al 9596 (1) 8, Etanol al 95% (2) 9, Carhol-xileno 0 etanol puro 10, Xileno Coléquense varias capas de papel absorbente delante de los discos, 0, en s0 defecto, esponjas o papel de pe: ii) Lignese cada disco con la solucién apropiada. Compruchese que se ha aftadi do Acido acético al Sjador de Schaudinn iil) Vigrease una pequeta cantidad de medio de preparacida en un pequetio fras- co con tapa o tapén, (Manténgase la botella grande de reserva bien cerrada para evitar Ia evaporaci6n). adico, El conjunto de discos de tincién se dispone en un lugar conveniente y se deja listo para usarlo cuando se necesite. Si las tapas de los discos tienen el borde de cristal " Este reactivo no requiere preparacién. Se usa drectamente a partir del envase comercial 19TOMA, PREPARACION Y ENSAYO OE LAS MUESTRAS esmerilado, péngase una capa fina de vaselina en el borde para que la tapa quede bien sellada. Las soluciones deberin reemplazarse periddicamente, de acuerdo con las siguientes 1. Fijador de Schaudina: cémbiese todos los meses, Viértase el fijador usado en tun frasco de desechos de soluciones orginicas y sustitiyase con una solucién recién preparada. 2. Solucién de alcohol yodado: cimbiese cada tzes semanas, Si el color desapa- rece 0 se vuelve muy pilido, sustitiyase inmediatamente. 3. Etanol al 70°96 (1). Bsta solucién amarilleart por el yodo del alcohol yodado. biese cada tres semanas 0 cuando se hayan tefiido 30 extensiones, segin lo que suceda antes, 4. Etanol al 70 9 (2): cémbiese cada tres semanas. 5, Solucién de colorante tricromatico: cémbiese sélo cuando la solucién se vuel- vva verdosa. Mueva suavemente el frasco hacia delante y hacia atris, Si el co- lorante que queda en las paredies del frasco esté més verde que violeta, tirese el colorante del frasco sustitdyase por colorante nuevo. 6. Solucién decolorante de Acido acético-alcohol: cambiese cuando se hayan de- colorado 20 extensi6n o una vez a la semana, Etanol al 95% (I): cdmbiese todas las semanas. Etanol al 95% (2): cdmbiese cada dos semanas. Etanol puro: cémbiese cada semana; carbol-xileno: cémbiese todos los meses. Xileno: cimbiese todos los meses, 1 Anétese el nombre de cada solucién y la fecha en que se llené el frasco como sigue: Nombre de la slacin Fecha de comionza Fecha de cambio Schaudinn 13 enero 1990 12 febrero 1990 Aleohol yodado. T enero 1990 28 enero 1990 Compruébense estas anotaciones, todas las semanas. Ast, las soluciones de coloran. tes siempre estarin en buen estado para tefir extensiones de heces. NOTA [Abra los frascos de colorante solamente para introducir o extraer preparaciones. Nunca deben dejarse destapados mientras las muestras se estén tiflendo, ya que las soluciones absorben Ia humedad del aire y dejan de teflir de modo satisfactorio, 20NT La solucién de catbol-xileno y el xileno sirven para deshideatar y aclarar las pre paraciones; eliminan el agua de la extensién y vuelven el material transhicido para poderlo examinas. Si penetra humedad en estas soluciones, no se obtendri el re- sultado apetecido. A veces se forman gotas de humedad en las paredes de los fras. cox; en ese caso, deséchese la solucién y sustitiyase por otza aueva. Tecnica 1, Etiquétese un portaobjetor con el nombre o el nimero del paciente y la fecha, 2. Con un palillo aplicador, témese una pequesa cantidad de excremento y ex tiéndase en capa fina frotando el material a derecha e izquierda con el apli- ceador en la parte central del portaobjetos. La capa de material debe ser tan uuniforme y homogénea como sea posible y de la densidad adecuada. Ello debe hacesse sépidamente para evitar que se seque Ia muestra, Introdizcase inmediatamente la extensién en el fjador de Schaudinn, NOTA Si el excremento es duro, puede mezclarse una pequefia porcién con solucién sx- lina para ablandarlo y hacer la extensi6n a partir de esta mezcla, LA EXTENSION NO DEBE SECARSE DESDE EL MOMENTO EN QUE SE PREPARA HASTA, EL MOMENTO EN QUE SE MONTA se en el fjador de Schandinn durante 1 hora a la temperatura ambiente, (La extensién puede permanecer en el fijador incluso hasta 2 dias, en caso ne- cesario). Coléquese el portaobjeros en el disco de modo que el extremo que leva el nombre del paciente quede en Ja parte superior. 4, Extrdigase el portaobjetos del disco con unas pinaas. Escirrase el exceso de liquido tocando el borde del portaobjetos con papel secante 0 una esponja. A. continuacién, coléquese el portaobjetos en el siguiente disco de tincién. 5. Déese en solucién de alcohol yodado durante exactamente 1 minuto. Retf- rese la extensidn y déjese escurrir como en el paso 4, Pasese al disco siguiente. 6 Introduzcase en etanol al 70% (1)* durante 1 minuto. Siquese el portaobje- tos y escirrase el exceso de liquide. Invrodiizcase en etanol al 70 % (2)* durante 1 minuto. Retirese el portaobje- tos y déjese escurrir. 8, Tiase con solucién de colorante tricromético durante 8 minutos. Retirese el portacbjetos y escuirrase. 9. Decol6rese con solucién de dcido acético-aleohol: sujétese el portaobjetos con las pinzas ¢ introdiizease dos veces en la solucién (tiempo total: 5 segundos) El dcido-aleohol seguir decolorando Ia muestra mientras estén en contacto y. por lo tanto, 5 segundos resultan suficientes. (No debe introducirse el por taobjetos en el disco y contar hasta 5). Déese escurrit el exceso de liquido del portaobjetos sobre un papel secante 0 ‘una esponja, Lavese inmediatamente la extension en etanol al 90% (1) para climinas el acido, 10, Introdiizcase una ver el portaobjetos en etanol al 95 % (1) durante 1-2 segun- dos. Retirese el exceso de liquido antes de colocaslo en el disco siguiente. 11, Introddzcase el portaobjetos 2 veces en etanol al 95 % (2) durante 2-3 segun- dos. Déjese escurrir el exceso de liquido antes de colocar el portaobjetos en. interrumpirse el proceso. Si tincion ya ha legado a la segunda etapa de lavado con etanl al 70 % (paso 7), debe tor- inarse. En ningun caso debe interrumpirse después del paso 7. 24TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DELASMUEST®S 12, Introdiiacase el portaobjetos en cargol-xileno o etanol puro durtnte 1 minuto, Déjese escusrir el exceso de liquido antes de colocarlo en el disco siguiente. 13, Déjese la preparacién en xileno durante 2-3 minutos. 14, Retirese el portaobjetos y escirrase el Uguido sobrante. NO DEBE DEJAR- SE SECAR EL PORTAOBJETOS ANTES DE PONER EL CUBREOBJE- TOS, currie el xileno sobrante antes de poner el medio de montaje sobre Ia exten- comicnza a secarse, vuélvase a introducir en el xileno, pero déjese es- 15, Coléquese plano el portaabjetos sobre un papel secante 0 de periédico; con una varilla de cristal, pénganse 3 6 4 gotas de medio de montaje sobre la ex tensién, Sujtese un Cubreobjetos formando ingulo con el portaobjetos, con el borde en contacto con el de la extensién, Hagalo descender suavemente so bye la extensién de modo que el medio se distribuya uniformemente bajo cl eubreobjetos y que éste no aprsione busbujas de aie. NOTA, Si se estérinlendo més de una extensidn al mismo tiempo, decolore cada una por se- parado, Extrdigase una extensién del bao decolorante, retirese el exceso de Iiqui- do, decolérese, aclirese en etanol al 95.%, séquese y sumérjase en carbol-xileno 0 etanol puro (pasos 9-12). A continuacién, siquese otro portaobjetos del colorante y trhtese del mismo modo, Repitase hasta haber decolorado todas las extensiones, Si se esté tidendo mis de un portaobjetos al mismo tiempo, retirese del xileno uno de cada vez, esciirrase y méntese. No importa que algunas de las preparaciones de- ‘ban quedar en el xileno durante 4 6 5 minutos. Déjese la preparacién montada so- bre una mesa o un mostrador en posicién horizontal sobre un papel secante o de pe- riédico; debe permanecer en un lugar plano hasta que se seque. Ello puede llevar toda la noche o més. No obstante, aunque no estén completamente secas, las pre: paraciones pueden examinarse al cabo de 30 minutos. Una vez examinadas, no debe intentarse limpiar el aceite de inmersién hasta que el montaje esté completamente seco (alrededor de 24 horas), ya que si se frota para eliminar el aceite puede mo: verse el cubreobjetos. Si esto sucediera, aclérese inmediatamente la extensién en xi- leno durante 5 segundos y vuélvase a hacer el montai. Tecnica para muestras fecales fijadas con PVA 1. Agitese el material fijado con PVA (véanse las pp. 29-30), suave pero minu- ciosamente, a fin de mezclar de modo homogéneo el excremento con el fijador. 2. Rotiilese un portaobjetos como se indica en el paso 1 para material fresco. 3. Introdizease un palillo aplicador en Ia muestra fjada con PVA para tomar un poco de materal. Extiéndase haciendo girar el palillo sobre el protaobjetos. El ‘material también puede extenderse moviendo el palillo en sentido lateral y en. Zigaag sobre el portaobjetos. La capa de material debe ser tan uniforme y ho- mogénea como sea posible. Su espesor debe ser tel que a través del material pueda verse texto impreso pequefio sobre un papel colocado detris pero no ccon bastante claridad como para leerlo. Las preparzciones demasiado espesas Despiazarionts 22fo se tien bien y son dificiles de examinar. Si la preparacién es demasiado fina, no hay bastante material para llevar a cabo un examen fiable, 4, Las extensiones DEBEN SECARSE antes de tenirlas. Déjense sobre una su- perficie plana o en un soporte para que se sequen, a temperatura ambiente 0 ‘en una incubadora a 39°C, El tiempo de secado es de 8-10 horas, por lo ge- neral de un dia para oto. Es preferible preparar las extensiones un dia, dejar las secar durante la noche y tefielas al dia siguiente. En caso necesario, las ex- tensiones secas y sin tefir pueden conservarse durante 3-4 semanas antes de proceder a la tincién, 5, Sumérjase la extensién fijada con PVA y seca en una solucién de alcohol yo- dado, ) i) ii) iv) vi) vii) viii) ix) ») Solucién de alcohol yodador 15 minutos. Escirrase la extensién como se indies anteriormente pata los frotis de heces recientes. Etanol al 70° (1): 5 minutos, Bscdcras. Etanol al 70° (2): 5 minutos. Bscirrase Solucién colorante tricromitica: 8 minutos, Siquese un portaobjetos del colorante y déjese escurit. Si se esti tilendo mis de un portaobjetos, dé jease los ot dentro del colorante. Decolore sélo una preparacién cada Solucién decolorante de Acido acético-alcohok: sujétese el portaobjetos con las pinzas y sumérase en el decolorante 2 6 3 veces (tiempo total: 5 segundos). Déjese escurtir el portaobjetos durante 1-2 segundos. (Vi se cl paso 9 paca heces recientes, pp. 21). Exanol al 958 (1): sumésjase el portacbjetos en la solucién 2 veces para lavar el dcido, Déjese escurzir el portacbjetos durante 2 segundos. Etanol al 95% (2): 5 minutos. Déjese escusri. Solucién de carbol-ileno o alcohol puro: 7 minutos: Déjese escurzs Xileno: 10 minutos, Skquese un poraobjetos del xileno, déjese escurrir durante 2 segundos, y coldquese a continuacién plano sobre un papel absorbente 0 corrien- te. Para el monte, procédase como se indieé en el easo de muestras de haces freseas (pp. 21) Aspecto microscépico de la muestra tefiida El aspecto de las extensiones preparadas a pattie de heces sin conservante y a partir de heces fijadas con PVA es el mismo, aunque hay ciertas variaciones por las si- guientes causas: — el espesor de la extension no sera exactamente el mismo, — el tiempo de decoloracién puede ser ligeramente distinto, y — las muestras fecales varian de una persona a otra, En general, el material del fondo se tine de verde o de azul verdoso. En algunas cocasiones la muestra puede tefirse de rojo, pero ello no interfiere con el recono- cimiento y la identificacién de los microorganismos. Las distintas inclusiones del cexcremento se tien ast VERDE (0 verde azulado) — citoplasma de trofozoltos y quistes (bien fjados y tefidos), — citoplasma de eélulas de pus y tisulares, — levaduras y mohos (en general), — protozoos degenerados, — microorganismos que se han decolorado en exceso o demasiado poco, — Blaituyits bominis (protozoo que & menudo se observa en las heces); contiene gré- rnulos rojos alrededor del borde exterior de la célula, 23TOMA, PREPARACION YENSAYODE LAS MUEST?AS VIOLETA (o violeta azulado o violeta rojizo) itoplasma de trofozoltos y quistes (en ocasiones), = quistes de Entamoeba ca (en ocasiones), = glébulos rojos y bacterias ingeridos dentro de los trofozottos. ROJO (0 violeta rojizo) — glébulos rojos y bacterias ingeridos dentro de los trofozo‘tos, = levaduras y mohos (en ocasiones), = quistes mal fijados, = nieleos de eélulas de pus y tisulares, = cromatina nuclear de trofozoitos y quistes, = Grganos cromatoides de quistes amebianos. Examen del frotis tefiido 1. Coléquese el frotis montado y completamente seco sobre la platina del micros- copio y enféquese con el objetivo de poco aumento (X10). Eljase una zona que no parezca ni demasiado fina ni demasiado gruesa. Si el frotis es uniforme (Codas las zonas tienen aproximadamente el mismo grosor), enféquese cual- quier zona con el objetivo x10. Parte del frotis puede ser demasiado grueso para ver ficilmente a su través; otras zonsas pueden set demasiado finas. Si todo el frotis es grueso, bisquese la parte més fina. Los organismos mejor tefidos suelen verse en las zonas mas fina. Si todo el frotis parece claro o fino, bisquense las partes més gruesas, Proba- Dlemente, los organismos estarén mejor tefidos en las zonas mas gruesas 2 Coléquese una gota de aceite de inmersién en la zona elegida y cémbiese al objetivo de inmersién. Los frotis fecales tefidos deben examinarse con ese ob- jetivo, y no con el de gran aumento y de observacién en seco. 3, Enféquese cuidadosamente con el objetivo de inmersién. Regilese la ilumina. cin del microscopio con el diafragma iris de debajo de la platina de modo que haya suficiente luz y se vean aitidamente las células, las bacterias y otros ob- jetos de! campo. Muévase el portaobjetos por la platina del microscopio enfo- cando ciudadosamente en cada nuevo campo para ver lo que aparece en los distintos planos del frotis. Debe examinarse aproximadamente la mitad del fro- tis; no hace falta examinar toda la extensin del cubreobjetos como en el caso de las preparaciones con solucién salina. 4. En este caso se intenta detectar trofozoites y quistes de Entamoeba bisolstca y de Giardia. Si hay muchos microorganismos en la muestra, se encontrarin en pocos minutos. De no ser ast, sfgase examinando la extensién. Si no se encuen- tran microorganismos de E. bistlytca 0 Giardia, rotilese la preparacién con la frase «No se han hallado microorganismos. Identificacién de pardsitos en frotis teflidos En los frotis tendos se obsesvarin tanto trofozoftos como quistes de amebas y Ha- gelados. El citoplasma se teri de azul verdoso 0 verde; el nicleo ls inclusiones como globulos rojos y bacterias, los Gxpanos exomatoides en los quistes amebianos y las fibrillas (Hlamentos) de los flagelados se teria pot lo general de rojo 0 vio- leta. El glacégeno se disuelve durante el proceso de tincién y no resulta visible en las preparaciones renidas. Se observard una zona clara o blanca al donde se ha eli minado el glucégeno. En la seccién 2, pp. 73-81, se presentan las caracteristicas utilizadas para identifi- car protoz00s en los frotis tetidos. 24Frotis anales para la deteccién de oxiuros Los frotis anales se usan para detectar la presencia de oxiucos (Enterobins sermicalat). Los oxiuos son mas corrientes en los nifios que en los adultos, y a menudo el nifio parasitado infecta a oteos miembros de la familia, Asi pues, si se observa que un niflo est4 infectado, conviene examinar muestras de todos sus familiares, especial- mente de sus hermanos. Los huevos de oxiuros suelen encontrarse en los pliegues ccutdneos que rodean al ano rara veces aparecen en las heces, Toma de muestras Material para el método A Contrifugadora Torundas de algodén Portaobjetos Pipetas Pasteur con perilla de goma Solucién salina para humedecer las torundas de algodén Tubos de ensayo, 100 * 13 mm. Técnica (método A) Separense las nalgas y pésese la torunda de algod6n por la zona perianal, sin intro- cit el algodén en el ano. Introdizease Ia torunda de algodén en el tubo. Material para el método B Cinta adhesiva transparente Depresor lingual 0 cuchara de plistico con mango de 10 em de longitud Portaobjetos. Tecnica (método B) 1. Entéllese una tira de cinta adhesiva transparente en el extremo del mango de tuna cuchara o de un depresor lingual, 2. Sepirense las nalgas del paciente con la otea mano. Hagase presién con el ex- ttemo de la cuchara eubierto de cinta adhesiva sobre la piel que rodea al ano cen varios lugares. 3, Coléquese la cinta con la parte adhesiva hacia abajo sobre un portaobjetos. An- tes de examina éste, levintese la cinta adhesiva, déjese caer una gota de aceite de inmersién en el centro del troz0 de cinta y vuélvase a colocar ésta en su sitio, Ello mejorar la transpacencia de la cinta EL agente de salud debe lavarse las manos después de tomar la muestra; de otro modo, los huevos que tal vez hayan contaminado las snanos entrardn en la boca y producirén una infeccién. Para aument Ia probabilidad de recoger huevos, la toma debe hacerse entre las 22 horas y las 24, 0 a primera hora de la maflana antes de que el paciente orine, defeque 6 se batte, En algunos casos es necestrio tomar varias muestras antes de llegar a un diagnéstico positive. Procedimiento de examen Las preparaciones con cinta adhesiva pueden examinarse directamente. En caso de que se utilicen torundas de algodén, procédase como sigue: 1. Dentro del tubo que contiene Ia torunda, viéetase solucién salina en cantidad suficiente py 2, Déese reposar durante + cubritla, ¢s decir, unos 25TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DE LAS MUESTRAS Fig. 2. tos gastrointestinales por hel Técnica de examen de extensiones fecales en capa gruesa con celofan (Kato) para el diagnéstico de la esquistosomiasis intestinal y las fecciones 1, Se dispone de distintos materiales, Ea esta fotogra: fia se observa la espitula de plistico, la plantilla de plis tico y Ia sejilla de nailon en un estuche Kato-Katz que puede encontrarse en el comercio. Los dos primeros ar- ticalos y los portaobjetos pueden volver a utilizarse la re jilla de nailon es desechable, Pueden encargarse varios, cestuches para disponer de plantillas normalizadas reutili- zables. 2 La rgjilla de nailon y el celofin necesarios para la técnica de frotis en capa gruesa pueden compararse a gra nel. El celofin del rollo se corta en tiras de 25-30 mm que se colocan en un tarto de boca ancha y fondo plano que contenga una solucién al 50 96 (o més) de glicerina con verde de malaquita o azul de metileno (100 ml de agua, 100 ml de glicerol, 1 ml de solucién acuosa al 3 % de verde de malaquita o azal de metileno), 3. El procedimiento para esta técnica es el mismo cual: quiera que sea el material utilizado, La muestra fecal se hace pasar por la reillautilizando la espétula para sepa. rar el material fecal de los residuos més grandes. 26 4. El matesial fecal pasado por Ia rgjlla se transfiere a la plantilla que se coloca en posicién horizontal en el centro de un portacbjetos. El agujero de la plantilla que- dda completamente lleno de material fecal pasado por la rejilla y al ras de la superficie de Ia plantilla, La plantilla de Kato-Karz que aparece en | 41,7 mg de heces. El mimero de huevos observado se tmultiplica por 24 para obtener el niimero de huevos por ‘gramo de exeremento. agen puede contenerFig. 2 (Continuacion) 5. Bl cuadrado de celofin inmerso durante por lo m nos 24 horas se coloea sobre Ia muestra fecal Los huevos de Auaris (aquierda) cha) pueden verse en cualquier momento, Los huevos de anguilostomas (no aparecen en la fotografia) son visibles durante Jos 30 primeros minutos a partir de la prepara Trieburs (dete 6. El portaobjetos se pone boca abajo sobre un cristal a otto portaobjetos y Ia muestza se reparte uniformemen- te bajo el celofin como se observa en la fotografia, Una ver preparado el portaobjetos, puede ponerse otra gota de glicerol en el celofin y alisar los bordes de éste para que la preparacién se conserve bien. Si se forman bur- Dujas de aice bajo el celofiin mientras se conserva la pre~ paracion, pueden eliminarse poniendo un par de gotas de glicerol en el celofin y dejando reposar la prepara- ccién durante la noche. Los frotis en capa grucsa con ce- Jofin pueden prepararse en el terreno, guardarse en ca jas para portabjetos y enviarse a largas distancias, lo que permite su examen en un laboratorio central en caso ne- cetario al cabo de varios dias o semanas de su prepara ° oo 2 (a ean oe , 8. El momento ideal para observar los huevos de S rmarson,S. intercalatum 0 S. japonicum es alas 24 horas de su preparacién, En luz solar directa los portaobjetos se acla- ran ripidamente y a veces no es necesario esperar 24 ho- 27TOA PREPARACION Y ENSAYO DE LAS HUESTAAS 3. Extrdignse Ia torunda de algodén de la solucién salina, escsrrase ésta apretan- do con un movimiento giratorio contra las pacedes del tubo. Tirese la torunda de algodé, Concéntrese por centrifugacién durante un minuto. Con una pipeta, deséchese el liquido sobrenadante con cuidado para no remover I pequena cantidad de sedimento presente. 7. Con ayuda de una pipeta, eransfigrase el sedimento a un portaobjetos a fin de examinarlo. Rediizcase la iluminacién del mizoscopio y enfSquense las distin- tas capas de Ia preparacién en busca de los huevos de En‘eraine (la descripeién figura en la seccién 2, pp. 69-71). Frotis-fecal en capa gruesa con celofan para el diagnéstico de la esquistosomiasis intestinal (técnica de Kato-Karz) La técnica de examen de frotis fecales gruesos con celofin ha demostrado su efi cacia en el diagnéstico de la esquistosomiasis y la helmintiasis intestinales. Este tipo de frotis puede prepararse sobre el terreno, conservarse en cajas para portacb- jetos y enviarse a grandes distancias para que sean examinadas en un laboratorio. ccental en caso necesario. La técnica no sirve para examinar larvas, quistes 0 hue- vos de ciertos parisitos intestinales. Material y reactivo Palillos aplicadores de madera Rejilla de aceto inoxidable, aailon o plistico (malla 60-105) Plantilla de acero inoxidable, plistico 0 castéa Postaobjeros Celofin, 40-50 mm de grosor, tiras de 25 x 30 6 25 35 mm Tarro de fondo plano Pinzas Papel higiénico secante Papel de periédico Solucién de glicerol-verde de malaquita (o azul de metileno) (reactive n° 12). Tecnica La manipulacién de muestras fecales debe hacesse siempre con mucha precaucién, Siempre deben levarse guantes pata evitar la contaminacién de los dedos. 1, Sumérjanse las tras de celofin en la solucién de glicezol - verde de malaquita (© azul de metileno) al 50 % durante al menos 24 horas antes de usalas 2. Transfiérase una pequefia parte del excremento a un tro20 de papel viejo de periddico 3. Coléquese la cela sobre la muestea fecal y presinese Con una espatula o un palillo aplieador que tenga un lado plano, raspe Ia su- pesficie superior de la rejilla para que pase al material fecal. 5. Coléquese una plantilla sobre un portaobjetos limpio, “Transfirase una pequetia cantidad de material fecal tamizado al agujero de Ja plaatilla y lénese cuidadosamente. Alisese la superficie con la espatula. 7, Retirese cuidadosamente la plantila de modo que todo el material feeal quede sobre el portaobjetos y no haya material adherido a ella 8. Ciibrase la muestra fecal del portaobjetos con una tira de celofin empapada cn glicerol 9. Si hay un exceso de glicerol en It paste superior del celofin retiese con un troz0 de papel higiéaico o secante 10. Inviérase el portaobjetos y apriérese Ia muestra fecal contra el celofka sobre luna superficie lisa (lo mas adecuado es un pedazo de azulejo 0 una piedza pla- ‘na) para extender la muestra uniformemente. 28Co 11, Levintese cuidadosamente ¢! portaobjetos; de lo contrario el celofin puede desprendesse. Deslicese suavemente e portaobjetos hacia un lado sujetando el celofia, Coa esto termina la preparacién del portaobjetos. Tal vex haya que retirar el exce- so de glicerol con un trozo de papel higiénico paca asegurarse de que el celofin per- manece en su sitio, Con un poco de prictica, las preparaciones serin perfectas. Las diversas etapas de Ia preparacion de la extensién en capa gruesa se muestran en la figura 2. Muestras fecales espesas 0 duras El principal problema de la téenica de extensién en capa gruess es la imposibilidad de ver los huevos de helmintos en algunos excrementos de consistencia dura. Ea. = despaés de la preparacién por el método normal, espérense 24-48 horas antes de contar los huevos en los portsobjetos: la preparacién puede tardar bastante tiem. po en aclararse; = prepirese otro par de muestras en un portaobjetos grande (5 « 7,6 em) y utilicese lua fragmento de celofin ligeramente mayor (35 x 35 mm); a continuacién, pre~ sidnese con fuerza para aplastar la muestra tanto como sea posible; cuando se utiliza el portacbjetos grande, el excremento puede ablandarse con so: lucién salina o glicerol antes de tamizato. Observacién de las preparaciones La preparaci6n debe conservarse a temperatura ambiente durante al menos 24 ho- ras antes del examen microseépico (véase més adelante en la paste relativa a los huevos de anquilostomas). Si se coloca el portaobjetos en una incubadora (40°C) © bajo una intensa luz fluoresceate o incandescente en el laboratorio, o a la luz del sol sobre el terreno, puede examinarse al etbo de pocos minutos. Para facilitar el examen microscépico, pueden ponerse una 0 dos gotas de eosina en solucién salina (1:100) sobre la parte superior del celofin, dejarse durante 3-5, minutos, y a continuacién retirar el exceso con un txo20 de papel higiénico © se- cante. Con ello es mis fécil observar los huevos de Sehistsoma, Envio de muestras al laboratorio de referencia Si hay que enviar las muestras a otro laboratorio para que las examinen, es preciso afiadirles un conservante a fin de mantener los pardsitos en buen estado. Se usan dos conservantes: ~ formalina al 10 9: conserva los huevos, las larvas y los quistes para los eximenes de preparaciones hrimedas; - fijador del PVA: conserva los troforoitos y los quistes para poder preparar frotis teflidos de modo permanente Material y reactivos Cinta adhesiva Palillos aplicadores de madera Frascos de 1000 ml Etiquetas Boligrafo 0 rotulador para las etiquetas ‘Viales, 20 ml, con tapas de rosca que cierren bien 29TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DELASMUCSTAS Formalina (formaldehido) al 1096 (reactive n° 10) Fijador de PVA * (reactivo n° 22), Conservacion de las muestras 1, Rotdlense dos viales de 20 mi.con el nombre 0 el ntimero del paciente, Escri- base una F en el angulo superior derecho de la etiqueta de un vial; eseribase PVA en el angulo superior derecho de la etiqueta del otro vial. 2. Rellénese el vial «By hasta la mitad con formalina al 10%, Rellénese el vial «PV Ap hasta aproximadamente la mitad con fijador del PVA, 3. Con un palillo aplicador, témese una pequeda parte del excremento que tenga partes del interior y del exterior de la muestra y mézelese con la formalina al 1096. Es importante mezclar muy bien; deshiganse los granos. Utilicese una ccantidad suficiente, aunque no exagerada, del excremento de modo que la mez- cla ocupe entre dos tercios y tres cuartos del vial, 4. Con un palillo aplicador, témese una porcién de la parte mis blanda del ex cremento y mézclese con el fijador de PVA como en el caso de la formalina, La cantidad total de mezcla de excremento y PVA no debe ocupar més de tres cuartas partes del vial. Es preciso cerciorarse de que el excremento queda com- pletamente mezclado con el fiador. Deshéganse los fragmentos aplastindolos contra las paredes del vial, 5. Enrdsquense fuertemente las tapas de los viales, Séllense con un trozo de cinta adhesiva para evitar que se derrame el contenido, 6. Embilense cuidadosamente los viales en una caja 0 recipiente y enviense al la- oratorio de referencia. Hay que cerciorarse de que los viales estin rodeados de material absorbente (por ejemplo, algodén o papel de periédico) y se han envasado de modo que no puedan rompers, 7. Es imprescindible incluir la informacién necesaria: nombre o miimero del pa ciente, fecha de envio, microorganismos encontrades. Eliminaci6n de las muestras 1, Sila xecogida de los excrementos se ha hecho en cajas de papel, la mejor ma- rnera de deshacerse de ellos es incinerando el recipiente completo. Si ello no € posible, o si el excremento se recogié en un recipiente de metal o de vidrio, vvigstase formalina al 10 % en el recipiente has destrair todos los pardsitos que pueda haber. Déjese reposar durante una hora ‘0 mis antes de eliminarlo o lavarlo (si el recipiente es de vidrio), 2, Los portaobjetos utilizados para las preparaciones hiimedas deben colocarse en tuna cubeta llena de desinfectante (por ejemplo hipoclorito sédico) durante una hora al menos antes de lavarlos. Utilicese un palillo aplicador para retirar el cubreabjetos y hacerlo caer en un vaso 0 platillo lleno de desinfectante; a con- tinuacién, introdiizcase el portaobjetos en otra cubeta con desinfectante. Los cu- breobjetos son muy quebradizos; si se desinfectan en el mismo recipiente que los portaobjetos, pueden romperse y provocar cortes en las manos al lavarlos. 3. Los embudos, las tapas y los tubos de centrifugadora también deben introdu. cirse en desinfectante durante una hora antes de proceder a lavarlos. 4. Los palillos aplicadores y las gasas han de incinerarse. Si no es posible, pueden desecharse después de impregnarlos de desinfectante. ccubrir el excremento, a fin de Control de Ia calidad en el examen de heces Para conseguir resultados precisos y fiables, debe controlarse la calidad de los pro- cedimicntos de laboratorio en el diagnéstico de las parasitosis. Los controles deben 1 La preparacién del fjador de PVA resulta complicada y entrafa el majeno de soluciones téxieas y corrosivas. La técnica se explica en el anexo 2 (reactvo "° 22), pero 88 preferble [Preparacion se eve a cabo en un laboratorio més especialzado. Otra posibidad osee comprender la toma de muesteas, la preparacién de los reactivos, la ejecucién de Is técnicas y el examen de las preparaciones finales. Toma de muestras Si las muesteas fecales no se recogen y manipulan adecuadamente antes de exami- nares, su valor para un diagnéstico exacto seri escaso © nulo, sobre todo en el caso de los protozoos. Los trofozoitos amebianos comienzan a degenerar al cabo de 1-2 hhoras de la defecacién y las alteraciones en el aspecto pueden dar lugar a confu- siones en la identificacién, Los trofozoftos de flagelados también pueden sufi cam- bios que dificulten la diferenciacién. Los quistes se deterioran si las muestras feca- les quedan sin tratar durante muchas horas o de un dia para otto, especialmente a temperaturas elevadas Aunque los huevos y las larvas de helmintos se ven menos afectados por la edad de la muestra que los protozoos, pueden sufrir alteraciones que afecten a la iden- tificaciéa, Por ejemplo, los huevos de anquilostomas pueden transformarse en em- Deiones y nacer las larvas. Incluso fos huevos de Awaris pueden desarrollarse hasta las fases plaricelulares, Ademés, es posible que las larvas degeneren en las muestras vies impidiendo la identificacién de las especies. Para cerciorarse de que se dispone de especimenes adecuados para el examen, debe prestarse atencién a los siguientes puntos 1. Usilicense ecipientes limpios y secos para la recogida de las heces. (La sucie~ dad intesfiere con el examen y puede introducir microorganismos de desarro- Ilo libre procedentes del suelo que plantearén problemas 2 la hora de identifi- car las especies. La orina y el agua destruyen los trofozoitos que pudieran exis tin) 2. Proctirese que la muestra llegue al laboratorio tan fresea como sea posible para eviter que se deterioren los protozoos y que se altere la morfologia de los pro- toz00s y los helmintos. Andtese en la muestra el nombre del paciente y la fe- cha y Ja hota de la defecacién, 3, Solo deben aceptarse muestens frescas para el examen. Nunca debe intentarse cexaminas especimenes antiguos o contaminados con suciedad, agua u orina. Es preferible pedi al paciente que traiga una muestra reciente. 4. Si las muestras no pueden examinarse en cuanto llegan, coléquense en el re- frigerador (4-5°C) 0 en la zona mis fresca y sombreada del laboratorio. Nunca deben dejarse al so 5, Examine ea cuanto lleguen al Iahoratorio los exerementos diasreicos y los que contengan sangre y mucosidades. Preparacion de reactivos Los reactivos han de prepararse exactamente de acuerdo con la formula y Jas ins- trucciones. No deben modificarse los ingredientes, ni su cantidad, ai el método de preparacién en modo alguno. Almacénense los reactivos como se recomienda en cl procedimiento de preparacisn, “Algunos reactivos se conservan indefinidamente si se mantienen bien tapados y fue- 1a de la luz del sol directa, Entre estos reactivos se encuentran las soluciones de formalina, la solucién salina isoténica, los fiadores y las soluciones alcohélicas (a ‘menos gue se produzca evaporacién). Otros reactivos duran muy poco tiempo y des- pués quedan inutilizados. La wviday de cada solucién viene indicada en las instruc- ciones de preparaciéa, 1. Rotilense todos os reactivas con su fecha de preparacién, Rellénese y consérvese una ficha para cada solucién, Examinense una vex a la semana y tirense las soluciones pasadas de fecha. aTOA, PREPARACION Y ENSAYO DE LAS MUESTEAS 2, Muchas de las soluciones utilizadas en el método de tincidn trieromética de- ben renovarse peridicamente. La periodicidad viene indicada en las insteuc- cones para esa técnica y debe respetarse. De lo contrario, las preparaciones se- in de mala calidad y no tended valor alguno para el diagnéstico, Ejecucién de las técnicas No existe ningiin procedimiento de examen de especimenes fecales que sea eficar al 100 %; los procedimientas no siempre recuperarin todas las especies presentes ys si una especie en particular esti representada por unos pocos ejemplares, cabe la posibilidad de que la técnica empleada no consiga ponerlos de manifiesto en una sola muestra. Dado que las técnicas no son perfectas, deben aplicarse con todo el ccuidado que sea posible para conseguir un resultado éptimo. Asimismo, es preciso velar por que se utilice In técnica més apropiada para el material que se est exami- nando, Preparaciones himedas directas 1. Compruébese que la densidad de Ia preparacién sea correcta. Para ello, debe poderse leer letra pequeda a su través (Pero no con demasiada claridad). Si es demasiado gruesa 0 demasiado fina, la observacién de los elementos de la pre- paracién puede resultar dificil 2. Es preciso renovar las soluciones de yodo cada 10-14 dias. El yodo pasado no tenird correctamente los quistes. No debe ser demasiado fuerte 0 de lo contea- tio provocari la formacién de grumos en las heces de la muestra; los microor- ganismos pueden quedar encerrados en esos grumos y no verse. Si la solucién de yodo es demasiado débil, no tefird los quistes debidamente. Proced nto de concentracion Selecciénese una muestra plenamente representativa del excremento para su Prepirense suspensiones bien mezeladas de heces y agua o solucién salina Utilicense las cantidades apropiadas de material Regilense la velocidad y el tiempo adecuados en la centrifugadora, Mentense y examinense las preparaciones cuidadosamente, tal y como se des- cfibié en el caso de las preparaciones hnimedas directas 6, No debe desecharse el tubo que contiene el material concentrado hasta que haya terminado el examen, Tal vex haya que realizar otra preparacién, Procedi nto de tincin 1. Selecciénense partes blandas del exeremento y porciones de mucosidad, si exis- te, para preparar extensiones destinadas a la tincién. 2, Compruébese que las soluciones estin en buen estado. Renuévense de acuerdo con Jo explicado en los procedimientos de tincién “Manténganse las botellas de soluciones de reserva bien cerradas y alejadas de In luz solar directa 3. Manténganse bien tapados los discos de tincién. Déjense las tapas siempre pues tas salvo cuando se esté introduciendo o extrayendo preparaciones. Si no se hhace asf, las soluciones pueden evaporarse puede caerles suciedad que se ad- heritd a las preparaciones. 4, Utilicese la cantidad correcta de medio de montaje. El exceso de medio da hi gar a una capa gruesa cuyas distintas partes resultan dificiles de enfocar, y no se podré ver la extensin con claridad, Si la cantidad de medio es insuficiente, quedarin huecos bajo el cubreobjetos. Si el frotis se preparé a partir de heces frescas sin conservante, las zonas en las que existen intersticios no servirin para 32NT [ —necueRDE a 33 el diagnéstico, Los intersticios en el medio también dificultan el examen de Ia preparacién, Examinense siempre los frotis teAidos con el objetivo de inmersién. Utilicese €l objetivo x10 para enfocar el frotis si éste no es uniforme, localicese una zona en que a capa no sea ni demasiado fina ni demasiado geuesa y en la que cl materi sién y examinese la preparacin esté bien coloreado. A continuacién, pésese al objetivo de inmer: busca de trofazoites y/o quistes de proto- PARA IDENTIFICAR PARASITOS DE MODO FIABLE Y EXACTO, ES PRECISO: © CONTAR CON MUESTRAS SATISFACTORIAS © PREPARAR Y CONSERVAR CORRECTAMENTE LOS REACTIVOS © EJECUTAR CUIDADOSAMENTE LAS TECNICAS APROPIADAS. Y EXAMINAR METICULOSAMENTE LAS PREPARACIONES TERMINADASMuestras de orina Las muestras de orina suelen examinarse en busca de huevos de Sehistsoma haeora- tohinme, También pueden observarse trofozoitos de Trichomonas vaginal. Cabe econ: trar microfilarias de Wachereria baneof y Onchwcera selulur en el sedimento que s& obtiene al centrifugar Ia orina lechosa de los pacientes en aquellos paises en los aque la filariasis es endémica En las zonas donde la esquistosomiasis es endémica, la primera prueba indixecta de infeccidn es Ia hematuria y/o la proteinuria, que pueden detectarse mediante tuna banda de reactivo. Una hematuria intensa indica que se trata de una infeccién rave. Toma de orina para el diagnéstico de la infeccién por Schistosoma El nimero de huevos presentes en la orina varia a lo largo del dia, alcanzando el nivel mis alto entre las 10.00 horas y las 14,00 horas, La muestra debe recogerse entre estas horas y ha de resultar de una miceién tinica y completa de al menos 10 ml, Otra posibilidad es recoger la orina emitida en 24 horas. Debe examinarse la muestra completa ya que los huevos pueden ser muy escasos. Pidase al paciente que orine en un frasco limpio y examinese la orina inmediatamente Si la orina debe esperar durante una hora 0 més, afdase 1 ml de formalina (37% de formaldehido) sin diluir por cada 100 ml de orina, AAsf se conservarin Jos hue- vvos que pudieran existr. NOTA, Si no se dispone de formalina, puede aadirse 2 ml de lejia ordinaria por cada 100 ml de orina. ADVERTENCIA La formalina y la lejia son corrosivas y muy peligrosas si se ingieren, Examen de la orina Los dos métodos utilizados para la deteccién de huevos de Schistosoma haematobium son la sedimentacidn y Ia filtraci6n. FE] método de sedimentacidn es menos sensi- ble pero resulta mis barato y mas sencillo de cjecurar. La técnica de filtracién se usa en salud publica principalmente cuando se necesita informacién de tipo cuanti- Método de sedimentacién para la recogida de orina terminal de 24 horas Material Centrifugadora, con cabezal y cubetas para tubos de 15 ml Tubos de centrifugidors, eénico, 15 ml Cubreabjetos Vaso cénico para recogida de orina Portaobjetos Boligrafo o rotulador para las etiquetas Pipetas Pasteur con perilla de goma, 34Tecnica 1. Agitese bien la muestra de orina y viértase en un vaso cénico. Déjese sedimentar la orina durante on hora. Retirese el sobrenadante, trans: Fiérase el sedimento a un tubo de centrifugadora y centrfiiguese a 2000 g du: ante 2 minutos 3, _Examinese el depdsito de Ia muestra centrifugada en busea de huevos utilizan- do el objetivo x10, hasta examinar todo el depésito, No aumente el tiempo de centrifugacién ni pase de 2000 g ya que con ello pueden romperse los huevos y iberarse los miracidios © PROCESESE LA MUESTRA TAN PRONTO COMO SEA POSIBLE | © AGITESE EL RECIPIENTE ANTES DE VERTER EL CONTENIDO | © ETIQUETENSE LOS PORTAOBJETOS, TUBOS Y PAPELES CUIDADOSAMENTE Método de filtracién por jeringuilla Mater I y reactivos Cubreabjetos Soporte pata filtro, didmetro 13 mm 6 16 mm. Pinzas Jeringuilla de plistico, 10 ml Filtto de membrana,* 12 Hm 6 20 4m (policarbonato), filtro de nailon o filtro de papel. Portaobjetos ‘Yodo de lugel (solueién de reserva al 5 %) (reactive n° 17), Tecnica 1. Coldquese un filtro de policarbonata © de nailon (¢amafio del poro 12-20 jim) en el soporte. También puede utilizarse un filtro de papel (Whatman N° 541 oN? 1). Agitese la muestra de orina suavemente o Iiénese ¥ vaclese la jeri: uilla dos veces, * Los fitros de policarbonato y los soportes pueden pecirse &: Sartorius GmbH, P.O. Box 490-3400 Gottingen, Alemania; Millpore Intertech Ine, Ashby Road, P.O. Box 258, Becfors, Masechussetts 31736, EE UU. Los {iros do nation (Nyirel TT HD 20) en rolls o paquetes de 500 unidades pueden pecirse Union Gazes a Bluter, BP. 2, F-42380 Panissiores, Francia. 36TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DELAS NUS S 2, Témense 10 ml de orina con la jeringuilla y ajistese el soporte del filtro en la parte inferior de la misma, (Si se dispone de menos de 10 ml, andtese en el cuaderno,) 3, Sujetando el conjunto, en posicién vertical, expilsese la orina de la jeringuilla f teavés del soporte del filtro para que caiga en una cubeta o en la pila, 4, Desenrésquese cuidadosamente el soporte, hagase entrar aire en la jeringuilla, ajdstese de nuevo el soporte del filtro en el extremo y expalsese el aire. (Esto cs importante porque contribuye a eliminar la orina sobrante y garantiza que los huevos, de estar presentes, queden pegados al filtro.) 5. Desenrésquese el soporte del filtro, extrdigase éste con las pinzas y coléquese (con la cara superior hacia arriba) sobre un portaobjetos. Viertase una gota de yodo de Lugol y espérese 15 segundos a que el colorante impregne los huevos. 6. Examinese inmediatamente todo el filtro al microscopio con el objetivo x40, Los huevos de esquistosoma se tifien de naranja y pueden verse claramente. La tasa de infeccidn se mide por el nimero de huevos en cada 10 ml de orina. Por este motivo es importante anotar el volumen de orina examinado en caso de que sea inferior a 10 mi. Para caleular la tasa de infeccién de la muestra, dividase el numero de huevos contados por diez. Si se examinaron menos de 10 ml, utilce 1a ecuacién siguiente: inimero de huevos por 10 mi de muestra = N° 4¢ huevos contador, 9, donde x= N° de mi de orina filtrada examinada 36Reutilizacién de los filtros Retizese el filtro de plistico inmediatamente después de su uso y déjese hasta el dia siguiente en una solucién de hipoclorito al 196 (lejia doméstica). Livese a fondo 1 filtro con tna salucin detergente y depués acldzese varias veces con agua lim- pia, Examinese el filtro al microscopio para comprobar que no han quedado pari- sitos antes de volverlo 4 usar, Identificacion Los huevos de Schictssama haematobium son grandes (entre 120 y 150 jum de largo) y tienen un espolén terminal en un extremo, En el interior se puede ver el embrién. (miracidio), A veces es precisa determinar si los huevos son viables, lo que puesie hacerse cuan- do Ja muestra es fresca y no se le han afadido conservantes CObsérvense cuidadosamente los huevos para ver si los embriones se mueven. Este es €l signo mis claro de viabilidad. Si no se observa movimiento alguno, busquense las wcélulas flamigerasy; existen cuatro oélulas de este tipo, una en cada angulo del embtién, Utilicese un objetivo de gran aumento y observacién en seco, redizcase Ja iluminacién ligeramente y bisquese el ripido movimiento de los cilios (vellosi- dades cortas) en las células amigeras Examen cuantitativo de la orina Los datos cuantitativos obtenides en los anilisis de orina, mediante la téenica de filteacién por jeringuilla para detectar la infeccién por S, haematobium, pueden regis- tes de mimero de huevos: trarse de acuerdo con los grupos si infeccién Jeve: 1-49 huevos por 10 ml de orina infeceién grave: > $0 huevos por 10 ml de orina Puede hacerse un tercer grupo, por ejemplo superior a 500 0 2 1000 huevos de S. buematobium por 10 ml de orina, en aquellas zonas en las que la intensidad de in- decir, en més del 10.% de los casos). feccidn aleance con frecuencia este nivel ( 37Muestras vaginales y uretrales El material procedente de la vagina y la uretra se examina en busca de Trichomonas aginalis, un flagelado que parasita ¢l sistema genitourinario tanto masculino como femenino, si bien la parasitosis en el hombre suele ser asintomitica. Trichmonar va ‘ginalt sucle identificarse en las preparaciones hiimedas de material y vaginal y ure. tal. (En las preparaciones teftidas estos microorganismos se quedan muy deforma- dos lo que dificulta su econocimiento,) Toma de muestras Material Centrifugadora con cabeza y cubetas para tubos de 100 » 13 mm (las mismas cube- tas servirin para tubos e6nicos de 15 ml y tubos de 100 «13 mm) Cubreabjetos Torundas de algodén estésil Portaobjetos Pipetas de Pasteur con perilla de goma Boligtafo o rorulador Tubos de ensayo, pequeftos, 100 x {3 mm, con tapones de algodén o de rosca y 3 mil de solucidn salina en cada uno, Tecnica 1, Con una tonunda de algodén estésil, recdjase el exudado vaginal 0 ureteal. Incrodizease inmediatamente la torunda en un tubo estéril que contenga unos 3 ml de solucién salina estéril. Puede cortarse la parte superior de la vasilla si resulta demasiado larga para el tubo. 3. Sise desea, pueden prepararse frotis para Ia tincidn. Para ello, recéjase més ma- terial con una segunda torunda estéril y frétese sobre el portanbjetos. Déese 4. Anétese en los tubos y portaobjetos el nombre o el nimero del paciente y la fecha de la toma, Nora, Si el paciente puede acudir al laboratorio, las preparaciones Inimedas pueden exa- minarse directamente; no se precisan tubos Examen directo de frotis vaginales y uretrales 1. Sil paciente puede acudis al laboratorio, témese un poco de exudado vaginal © uretral con una torunda estéril y mézclese con una gota de solucién salina en un portaobjetos. 2. Tapese con un cubreobjeto y examfnese con los objetivos, x10 y X40 en busca de flagelados méviles. Material centrifugado o sedimentado 1. Sise recibe una torunda de algodén en solucién salina, eliminese el liquide so- brante apretando la torunda contra las paredes del tubo. Tirese el algodén. 2. Centrfiguese el tubo durante 2 minutos. Sino se dispone de una centrifuga. dora, déjese el tubo en reposo durante 10 minutos para que cualquier sedimen- to que haya se pose en el fondo. 3, Fliminese el liquide sobrenadante con una pipeta. No debe removerse el sedi- 384. Témese una gota del sedimento y caléquese sobre un portaabjetos 5. Tapese con un cubreobjetos y extminese con los objetivos X10 y x40 en busca de flagelados méviles. En las preparaciones himedas, los flagelados pueden identificarse por su forma de movesse, Los trofozoites de Trichomonar tienen un movimiento nervioso, espasmé- ico 0 4 saltos, Puesto que T: sagnalis es la nica especie de Trichomonas que habita en el sistema genitourinario, no hay necesidad de estudiar sus earucteristicas mor folégicas para diferenciarla de T: hominis, que vive en el intestino, En raras ocasio- nes, los coxpiisculos ciliados de las células epiteliales que tapizan el tracto genital pueden identificarse erréneamente como algiin tipo de parisito, 39Muestras de sangre y otras muestras La sangre se examina en busca de los siguientes paisitos: = Plaswodinm = microfilasias = Trypanosoma = Leishmania La técnica que se utiliza con més frecuencia para examinar la sangre son las exten- siones sanguineas tefidas. Corrientemente se usa para tefir las extensiones el co- lorante de Giemsa (uno de los colorantes de Romanowsky). El colorante de Field 5 otra posibilidad cuando se necesita hacer un diagndstico rapido. La tinciéa con hematoxilina de Delafield se usa para la deteccién de microfilarias. Segin las cir- cunstancias, pueden prepararse extensiones gruesas o finas, Las preparaciones de gota gruesa facilitan la deteccién de los patdsitos y ahorran tiempo en el examen, Por otea parte, Ia técnica de la extensién en capa fina deforma muy poco los pari- sitos y permite identificar la especie en aquellos casos en que ello no es posible en. las preparaciones de gota gruesa, si bien es necesario examinar numerosos campos microscépicos para detectar los parisitos cuando éstos son muy escasos. Asi pues, siempre deben prepararse extensiones de los dos tipos cuando se buscan plasmo- dios y tripanosomas; si no puede identificarse con exactitud Ia especie en una pre- paracién de gota graesa deben usarse cuando se busquen microfilarias. La mejor forma de aprovechar los portaobjetos es hacer preparaciones combinadas, es decir, una preparacién de gota gruesa y una extension fina sobre el mismo por- taobjetos, No obstante, estas preparuciones combinadas deben secarse por comple. to (8-10 horas o de un dia para otto) antes de podeslas tenis de modo satisfactorio. Los portaobjetos para la deteccién del paludismo deben teairse el mismo dia, A ve ces, el médico necesita un diagndstico con rapide; en ese caso, las extensiones fi nas y gruesas deben hacerse en portaobjetos distintos. Las extensiones en capa fina se secan ripidamente y pueden teRirse enseguida. Uti- licese el método sfpido de tinci6n de Field y examinese la preparacién mientras esté actuando el colorante de Giemsa. Bisquense los parisitos palidicos. Si se ob- servan, puede diagnosticarse la enfermedad y, mediante el colorante de Giemsa, identificarse la especie. Sino se observan parisitos en la extension fina, tase la preparacién de gota grue- sa con colorante de Field. Examinese en busca de parisitos palidicos. AA veces es dificil identificar la especie en las preparaciones de gota gruesa y es ne- cesario enviarlas a otro laboratorio para que las examine un experto. ara la deteccidn de microfilarias y tripanosomas suelen utilizarse preparaciones hii- imedas dircetas de sangre entera fresca (o sangre centrifugada). Con ello slo se con- sigue demostrar Ia existencia de infeccidn y es preciso examinar extensiones tefi das para confirmar la especie de que se trata En aquellas zonas en las que pueden aparecer en la muestra no s6lo parisitos pa. lidicos sino tambien tripanosomas y microfilarias, deben prepararse y examinarse extensiones tanto en hiimedo como teftidas. Si en la regién no aparecen tripano- somas ni microfilarias, sélo es necesario preparar extensiones tefidas para detectar plasmodios, 404a NE Extensiones de sangre tefiidas Toma de muestras Es necesatio poner mucha atenciéa en la técnica de toma de muestras de sangre y de preparacién de extensiones sanguineas, Debe tenerse siempre en cuenta que varias enfermedades viricas, bacterianas y parasitarias pueden transmitirse por la sangre, Material y reactivos Bloque de madera con ranuras (pata sostener los portacbjetos) Frasco, pequefto (capacidad 30-100 ml) con tapén gotero y tapén de rosca 0 pe- quefia botella de cristal (capacidad 30-100 ml) con tapén de rosca y un cuentagotas (con perilla de goma) Probetas cuadradas, 10 ml, 25 ml y 50 ml Pinas Gasas Varilla de cristal Lancetas estériles Boligrafo 0 rotulador Portaobjetos Fichas o impresos de registro Discos de tincién Toallas de papel o esponja Aleohol, etanol o isopropanol al 70 % Solucién amortiguadora de fosfato (reactive n° 3) Metanol en un frasco gotero Dilucién colorante (véase «Tincién de extensiones de sangre con colorante de Giemsa», pp. 44-45). Las instrueciones para preparar la dilucién de colorante ne- ccesaria para cada tipo de extensién se dan con los detalles de la técnica." Las dilu- clones de colorante de Giemsa sdlo sirven durante 8 horas, por lo que la dilucién debe prepararse cuando se necesita y no antes. Los colorantes diluidos deben tirae- se al final de la jornada, Preparaci6n de una extensién en capa gruesa y en capa fina en el mismo portaobjetos Para el examen microse6pico ordinario del paludismo, se hace una extensién fina y una de gota gruesa en el mismo portaobjetos. La extensién fina se utiliza como ctiqueta pero, si esti bien preparada, también sirve para confirmat la especie. Para el examen debe utilizarse la preparacién de gota gruesa, Tecnica Una vex registrados los datos del paciente en el impreso o la ficha apropiados, se reparan las extensiones de sangre como sigue: 1, ‘Témese la mano izquierda del paciente, con la palma hacia arriba, y sujécese el dedo corazén. (En los lactantes puede uitilizarse el dedo gordo del pic. Nun- cca debe hacerse Ja toma en el pulgar ni en los adultos ni en los nifos). Lim- Piese el dedo con una torunda de algodén ligeramente empapada en alcohol, frotando enérgicamente para eliminar la suciedad y Ia grasa de la yema. Séquese el dedo con un pafuelo de algodén limpio, con movimientos enérgi- cos a fin de estimular Ia circulacién sanguinea, 1 Elcolorante de Giemsa suele adquirrse en el comercio en forma de solucion ya preparada,TOMA PREPARACIONY EMSAM 2. Con una lanceta estéril, higase una puncién en la yema del dedo con movi miento circular ripido, Presidnese ligeramente el dedo exprimiendo la prime: ra gota de sangre y limpiese ésta con un algodén seco. Prociirese que no que- den fibras de algodén en el dedo, 3. Con rapides y sujetando los portaobjetoslimpios s6lo por los bordes, t6mese la sangre como sigue Presignese ligeramente el dedo y témese una sola gota de sangre, aproximada mente de este tamatio @, en el centro del portaobjetos. Esta gota sexvird para Ia extensién fina. Presidnese de auevo para extracr més sangre y témense dos © tres gotas mas grandes, aproximadamente de este tamaio @, sobre el por- taobjetos, a un centimetso de distancia de la gota tomada anteriormente, tal y como se indica en la ilustracién Limpie la sangre restante del dedo con una torunda de algodén, 4. Extemiin on capa fina. Uilizando otro portacbjetos limpio para hacer Ia exten- sién, y poniendo el portaobjetos que contiene las gotas de sangre sobre una su: 42ANCE OS ET 43 perfici lisa y firme, téquese Ia gota pequefia con el segundo portaobjetos y dé- jese que la sangre se extienda por el horde de éste, Deslicese con firmeza el se- gundo portaobjetos a lo largo del primero, alejindolo de las potas més gruesas, y manteniéndolo a un angulo de 45°. Bl segundo portaobjetos debe mantener lun contacto homogéneo con la superficie del portaobjetas horizontal durante todo el tiempo que se esté extendiendo Ia sangre. La extensién de sangre no debe llegar 2 los bordes del portaobjetos para evitar que se infecte el investiga- dor. Priparacin de ota grucsa. Suiétease siempre los portaobjetos por los bordes 0 por lun ngulo para hacer la extensi6n en capa gruesa como sigue: Con la esquina del segundo portaobjetos, \inanse en movimientos répidos las sgotas de sangre mas grandes y extiéndanse en una capa gruesa y uniforme, La sangre no debe removerse en exceso pero puede extenderse en circulo o en ree. tingulo con 3-6 movimientos. Déjese secar la prepacacidin de gota gruesa en posicién horizontal, protegiendo el portaobjetos de las moscas, el polvo y el calor excesive, Una ver seca, mér- quese con una pluma 0 un rorulador escribiendo frente a Ia parte més gruesa de la extensi6n fina el nombre o el niimero del pacies la ilustraci6n). No utilice un boligrafo para rotulas el portaobjetos 1 y la fecha (como en Enyuélvase el portacbjetos seco en un papel limpio y enviese acompafiado de la ficha del paciente al laboratorio en cuanto sea posible,ee TOMA PREPARACION YENSAYODELAS MEST 8. El portaobjetos utilizado para extender la sangre debe desinfectarse y a conti- nuacién puede usarse para el préximo paciente; para preparar la extensién de Ia sangre se tomard otro portaobjetos limpio del paquete. Tincion de extensiones de sangre con colorante de Giemsa. Método normal para tefir extensiones de sangre gruesas y finas en el mismo portaobjetos Para que la tincin sea éptima, las extensiones en capa gruesa y capa fina deben prepararse en portaobjetos distintos y utilizarse diferentes concentraciones y tiem- ‘pos de tincién, Como a menudo esto no es posible, las extensiones en capa gruesa y capa fina se suelen hacer sobre el mismo portaobjetos. En este caso, la correcta, tineién de Ia preparacién de gota gruesa es de primordial importancia. Los mejores esultados se consiguen cuando las extensiones se dejan secar durante toda la noche. 1. Fijese la extensién fina aftadiéndole tres gotas de metanol o sumergiéndola en tun recipiente con metanol durante algunos segundos. Si se prolonga demasia do el tiempo de fjacién puede resultar dificil observar los puntos de Schiiffaer y de Maurer, Para permitir Ia deshemoglobinizacién, no debe fijarse Ia prepa- racién de gota graess, as{ pues, evitese exponerla al metanol o sus vapores. 2. Coléquense los portaobjetos con los reversos en contacto en un disco colora- 3. Prepérese una solucién de Giemsa al 3 % en agua amortiguads, destilada o de- sionizada, pH 7,2, en cantidad suficiente para llenar el niimero de discos que ‘vayan a usarse. Mézclese bien el colorante. 4, Viertase suavemente el colorante en la cubeta, hasta que los portaobjetos que- den totalmente cubiertos, 5. Déese actuar al colorante durante 30-45 minutos, al abrigo de la luz del sol. 6. Vigrase suavemente agua limpia en el disco hasta que desborde la espuma iri- descente de la superficie del colorante, Otea posibilidad es sumergir con cui- dado todo el disco en una cubeta llena de agua limpia. 7. Vaciese con cuidado el colorante que quede en el disco y aclérense de nuevo Ios portaobjetos en agua limpia durante algunos segundos. Tirese el agua 8, Extrdiganse los portaobjetos uno a uno y coléquense en un soporte para que se ‘escurran y sequen, con la parte de la extensidn hacia abajo, cerciorindose de que la extension no toca el soporte. Método rapido de tincién de extensiones en capa gruesa y en capa fina sobre el mismo portaobjetos. Con este método se tien répidamente las preparaciones de gota gruesa cuando hay mucho trabajo en el labotatorio y se necesitan resultados con urgencia, pero se pre- cisa mucho més colorante. 1. Déese secar completamente la extensién en capa gruess; silos resultados se ne- cesitan con urgencia, puede acelerarse el secado agitando el portacbjetos o ex poniéndolo brevemente a una fuente de calor suave como Ia bombilla del mi ‘croscopio. Hay que tener mucho cuidado de no calentar en exceso, de Io con- trario Ia extensiéa quedaré fijada por el calor. 2, Fijese la extensién fina dando ligeros toques con una torunda de algodén em- papado metanol o sumergiéndola en un tecipiente con metanol durante algu- ‘nos segundos. Para permitir la deshemoglobinizacién, no debe fijarse la prepa- racién de gota grucsa; as{ pues, evitese que ésta quede expuesta al metanol 0 1a us vapores. 3, Prepérese una solucién de Giemsa al 10% en agua amortiguada, destilada 0 desionizada, de pH 7,2; si se necesita poca cantidad, 3 gotas de colorante por 44TM ml de agua amortiguada bastarin para conseguir la concentracién correcta de solucién de Giemsa. Cada portaabjetos necesita unos 3 ml de colorante prepara do, 4, Viertase suavemente el colorante sobre el portaobjetos; para ello, puede usarse tuna pipeta, Otra posibilidad es colocar los portaobjetos hacia abajo en un disco de tincién cénvavo e introducie el colorante por debajo del portaobjetos. 5. Déjese actuar al colorante 5-10 minutos. 6. Blimfnese suavemente el colorante del portaobjetos atadiendo agua limpia gota 1 gota; no debe inclinarse el portaobjetos para que caiga cl colorante y lavar a continuacién, ya que ast quedacd un depésito de espuma sobre la extensin, Coléquese el portaobjetos en la gradilla, con la cara de Ia extension hacia aba- jo, para que escurta y se seque, asegurindose de que la extensién no toca el soporte. Tincién de extensiones de sangre con colorante de Field El colorante de Field permite detectar ripidamente los parisitos palidicos (aunque no siempre tife los puntos de Schiiffner). Método de tincién de extensiones en capa gruesa Material Un disco de tinciéa lleno de colorante A de Field Un disco de tincida lleno de colorante B de Field Dos discos llenos de agua limpia, Tecnica Sumérjase el portaobjetos en el colorante A de Field durante 3 segundos. Lvese con cuidado sumergiendo una vez en agua limpia, Sumérjase en el colorante B durante 3 segundos. Lavese con cuidado como en el apartado 2 Coléquese verticalmente el portaobjetos en el escusridor para que se seque al Método de tincién de extensiones en capa fina Reactivos Colorante A de Field, Colorante B de Field diluido (una parte por volumen de colorante con cuatro vo- Jimenes de agua amortiguada (pHi 7,2) Agua amortiguada (pH 7,2) Tecnica Fijese la extensign en metanal durante ua minuto, Eliminese el metanol con agua. Usilizando una pipeta, cibbrase la extensién con colorante B diluido. Anidase inmediatamente un volumen igual de colorante A de Field y mézcle- se bien inclinando el portaabjetos. Déese actuar al colorante durante un minuto, Eliminese el colorante con agua limpia, Coléquese el portaobjetos en posicién vertical en un escurridor para que se se- que al aire 45TOMA, PREPARACION YERSAYO CE LAS MUSTS Tincién de extensiones de sangre con hematoxilina de Delafield para detectar microfilarias Materiales y reactivos Cinco discos de tineiéa Fijador éter-ctanol (ceactivo n° 8) Decolorante Acido clorhidrico-agua (teactivo n° 15) Colorante de hematoxilina de Delafield (reactivo n° 6). Este colorante puede ad. quirirse en el comercio en forma de solucién ya preparada. Tecnica 1, Prepirense extensiones de gota gruesa' con sangre obtenida por puncién del dedo. Déjense secar durante 8-10 horas o de un dia para otro. 2. Prepérense discos de tineién como sigue: disco 1 - agua del grifo disco 2 - éter-etanol disco 3 - colorante de hematoxilina de Delafield disco 4 - Acido clorhidrico-agua (HCI al 0,05 %) disco 5 - agua del grifo. 3. Sumérjase Ia extensién seca en el disco con agua del grifo (disco 1) durante 5-10 minutos. Los glébulos sanguineos se rompen y la extensidn tend un co- lor claro 0 blanco cuando la lisis haya terminado, Déjese secar la extensisn Sumérjase en éter-ctanol durante 10 minutos (disco 2). Déjese secar. Sumérjase en hematoxilina de Delafield durante 15 minutos (disco 3). Decolérese con cido elorhidico-agua (diseo 4). Sumérjase el portaobjetos dos ‘veces en écido clorhidrico-agua. Hagase esto RAPIDAMENTE. La extensia tomari un color rojo. 9, Inmediatamente, sumnérjase el portaobjetos en agua del grifo (disco 5) para lavar el dcido, Coléquese el disco bajo el chorzo de agua cozriente hasta que la ex- tensidn se vuelva de color azul. Ajdstese al grifo un trozo de tubo lo bastante largo para llegar a la parte superior del disco y déjese correr el agua suave. mente; si el chorto es demasiado fuerte, a extension se desprenderd Sino puede usarse agua cossiente, chmbiese el agua del disco varias veces has ta que la extensidn se vuelva de color azul. Péngase un dedo en el borde del disco para impedir que el portaobjetos se caiga, viértase el agua y vuélvase a Ienar el disco. 10. Déjese secar la extensidn y examinese con los objetivos x10 y de inmersién ‘en busca de microfilarias. Examen Preparaciones de gota gruesa 1, Enféquese la extensién con el objetivo x10 y bisquense las microfilarias, Son ficiles de detectar con ese objetivo. 2. Si se observan microfilarias, pisese al objetivo de inmessién e identifiquese la especie. Busquense también parisitos palidicos con el objetivo de inmersién, Deben examinarse al menos 100 campos. * Si se usan extensiones de secimentos de sangre concentrada, comiéncese en el punto 5 46I El aspecto que presentan al microscopio las preparaciones de gota gruesa debe ser el siguiente: ~ Bl fondo debe estar limpio, exento de residuos, con un color gris palido mo- teado debido a Ia lisis de los eritrocitos. ~ Los niicleos de los leucocitos estin tefiidos de color morade fuerte y vivo. ~ Los parisitos paltidicos estén bien definidos, presentan Ia cromatina de co- lor rojo oscuro y el citoplasma de color azul violiceo claro, Ea las infeccio- nes por Plasmodium vivax y P. oule, puede observarse en el borde de Ia exten- si6n el moteado de Schiiffner en el afantasmay del eritrocito huésped. Extensiones en capa fina 1. Enféquese con el objetivo X10 en el extremo menos espeso de la extensién, don- de los gldbulos rojas estan dispuestos en una sola capa. 2. Péngase un poco de aceite de inmessién en el portaobjetos y pasese al objetivo de inmersisa, Cuando se buscan parisitos palidicos y tripanosomas, deben examinarse al me- ‘nos 200 campos. Fl aspecto que presentan estas preparaciones al microscopic es el siguiente: El fondo debe estar limpio y exento de residuos; los eritrocitos estin tefiidos de color rasa grisicen palido. ~ Los leucocitas neutesfilos tienen micleos de color morado oscuro y grinulos bien definidos, ~ La cromatina de los parisitos palidicos se tine de color rojo violéceo oscuro y el citoplasma de color azu! violiceo claro. = Los puntos de Schiiffner deben verse como un moteado en los eritrocitos que contienen P. sitax o P. ral ¥ Ios puntos de Maurer deben aparecer como un ‘moteado en los eritrocitos que contienen las formas anulares més grandes de P. faliparane Control de la calidad en los examenes de sangre Para garantizar resultados fiahles en el examen de los paésitos sanguineos, el téc- nico de laboratorio debe prestar atenciéa a los puntos siguientes: 1, Elinstramental debe estar limpio.1.os portaobjetos debe estar exentos de polvo, gra- sa, detergente, huellas dactilazes y sesiduos; de lo conteasio, es posible que la sangze n0 se adhiera al portacbjetos © no se tia apropiadamente, Deben usar se lancetas estériles para las punciones de los dedos o de las orejas, a fin de evi- tar la trasmision de enfermedades de un paciente a otto. La puncién debe sex lo bastante profunda para que haya sangre suficiente para las extensions. Debe tusarse gasa, mejor que algodén, para limpiar el dedo. (Del algodéa se despren- den fibras que se introducen en la extensién de sangre.) El dedo debe limpiar- se minuciosamente antes de Is puncién para eliminar la suciedad, los mohos uy otros contaminantes. Puede usarse sangre obtenida por puncién venosa si las extensiones se preparin inmediatamente después de le toma, Los anticoagu- lnates alteran e] grado de adhesidn de la sangre al portaobjetos y la tincién, 2. Las extensoneedeben tener lz demidad adecuada, La extensién en capa fina debe te- ner un borde terminal en el que las células sanguineas estén dispuestas en una sola capa, lo que permite cbservar la morfologia de los glébulos rojos. Si la ex- tensién es demasiado gruesa, los gldbulos rojos quedan eapiladoss en varias ca- ppas y no podré observarse su mozfologia con clasidad, Si es demasido fina, las células sanguineas pueden estar muy deformadas y probublemente la extensién no se tefiri bien. Ademis, ex las zonas mis delgadas también los parisitos sue- Jen hallarse deformados. En las preparaciones de gota gruesa, el espesor debe ser tal que pueda leerse a su través un texto escrito en letra pequefia, Si el geo- sor es excesivo, Ia sangre puede descamarse o desprenderse durante la tincién, 47TON, PREPARACION Y ENSAYO DEAS LETS perdiéndose partes de la extensién, $i es demasiado fina, se pierde Ia ventaja ‘que representa el espesor para el examen. 3. Las extensions deben dejarse scar en poscién borézontal y durante el tempo adecuado para ‘obtener buenos resultados. Si una preparacién de gota grucsa se encuentea in- clinada, Ia sangre puede desplazarse hacia el borde del portaobjetos y la exten- sién no tended un espesor homogéneo. La parte mas gruesa puede descamarse, Si la extensién no se seca completamente, no se tefiiré como es debido, ‘Mientras se secan, las preparaciones deben protegerse del polvo, los mohos u otras particulas que puedan caer sobre la sangre y dificultar del diagnéstico, ‘También deben protegerse de las moseas o de otros insectos que pueden es- tropear la preparacién Las extensiones finas dehen fijarse con metanol antes de teflclas para impediz la lisis de los glébulos rojos. El metanol debe ser puro y estar exento de hu- medad; de lo contrario, las células sanguiness se estroperin y la tinciéa seri muy mediocre. Las preparaciones de gota gruesa nunca deben fijarse. Es preciso tener mucho cuidado para que estas preparaciones no entren en con- tacto con metanol. 4, La diluciones de los colorantes y el agua amortiguada empleada para tenir de- ben prepararse correctamente y el colorante de reserva ha de ser de buena ca lidad, El frasco de colorante de Giemsa de reserva debe mantenerse bien cert do y protegido de la luz del sol; si se humedece, se estropearé. Se recomienda ‘que, para el uso cotidiano, se ponga una pequefia cantidad de colorante de re- serva en un frasco limpio y seco. Con ello se protegeri el resto dela reserva de la contaminacién accidental con humedad o residuos. Nunca debe intro- ducisse una pipeta mojada en el frasco de colorante de reserva. El colorante de Giemsa diluido conserva sus propiedades durante unas ocho horas. Ast pues, es preciso preparar una nueva dilucién de colorante el dia que se vaya autilizar El pH del colorante es un factor decisivo en la calidad de la tincién, El pH se regula utilizando agua amortiguada a pH 7,2 con la que se consiguen los me- jores resultados de tincién. Bl agua amortiguada puede conservarse durante al- gin tiempo si el frasco se mantiene bien cerrado. No obstante, debe compro barse el pH de cuando en cuando para cerciorarse de que sigue siendo neutro. 5. El procedimiento de tncén debe seguirse minucocamente. Hay que aseguratse de que se utiliza el procedimiento concebido para el tipo de extensi6n que se esté tifien- do. Lévese el colorante exactamente como se indica en las instrucciones. Si se Javan demasiado las extensiones en capa fina, el color se perderi. Si no se Ia- van bastante las extensiones en capa gruesa, pueden quedar muchos residuos de células y de colorante sobre el portaobjetos, lo que dificulte el examen, Es preciso asegqurarse de que las extensiones combinadas en capa gruesa y en capa fina se secan en posicién vertical con Ia primera en la parte inferior, De otto ‘modo, el agua resbalard por encima de Ia parte fina y arrastrard el colorante. Técnicas especiales para plasmodios Identificacién de parasitos paludicos En los parisitos palidicos pueden observarse tes componentes: el citoplasma que si se tine de azul, la cromatina que se tine de rojo 0 de violeta, y los grinulos 6 bastoncillos de pigmento que se tiften de maze 0 de negro. Salvo en las formas anulares precoces (J6venes), deben verse los tees componentes (esas formas anula- res no suelen tener pigmentos). La observacidn de los tres componentes permite distinguir los paristos palidicos de las células que los alojan, como los leucocitos, y de los artefactos que puedan aparecer en el portaobjetos durante la preparaciéa, En las extensiones en capa fina, obsérvese el aspecto de los pardsitos y el de los l6bulos rojos que los contienen. Obsérvese lo siguiente: 48Cee ee EEE! 1. Aspecto del gldbulo rojo que contiene el parisito ~ Tamato, eTiene la célula parasitada el mismo tamafo que las células sangui- reas sin parisitos (es decir, tamafo normal) o es mis grande? ~ Mottado, ZEsté el globulo rojo lleno de motas tefidas de rosa o de rojo? En caso afirmativo, se trata de los puntos de Schaffner y s6lo se observan en las infecciones por P.rsax y P. wale. (No se observarin en las eélulas sanguineas no patasitadas). Las células que contienen las iltimas fasestrofozoitias de P. Jakiparum 2 menudo presentan motas irregulares de color rojo-malva. Se tra- ta de los puntos de Maurer, 2. Aspecto del parisito ~ éTienen las fases trofozoiticas en crecimiento wn contorno irregular? ~ Son regulares o lisas? eDe qué color es el pigmento en los trofozoitos, los esquizontes y los gameto~ éaaintos merozoitos hay en el esquizonte maduro (si existen)? ~ 100 pardsitos/campo* 5+ 10-100 pardsitos/campo a 1-10 parasitos/campo 3 41-10 pardsitos/campo 2+ 1-40 parasitos/10 campos u 4-10 parasitos/100 campos o 4-10 parasitos/1000 campos 0 parasitos/1000 campos. and ol euler x10 la lente de eraion x00 La descripcién detallada de las numerosas técnicas inmunolégicas disponibles re- basa el aleance de este manual, Las més adecuadas son la prueba de inmunosorcién, ‘enzimética (ELISA) y la valoraci6n indirecta de anticuerpos fluorescentes. La va- loracién puede llevarse a cabo en suero o en un volumen determinado de sangre ecogida por puncién del dedo en tiras de papel absorbente adecuadas que se han dejado seca, La muestra se eluye en el laboratorio y se ensaya en una dilucién dni ca, de la que se ha determinado previamente que da una sensibilidad y una espe- cificidad adecuadas en esa regién. Pueden producirse reacciones cruzadas con in- feeciones por Tiypaneioma envi. Normalmente pueden eliminarse por dilucién 0 identificare con ensayos en paralelo contra antigenos de T. ene 63Muestras cutaneas En el easo de Ia oncocercosis (ceguera de los sios), una infeccién filariasica que afec- ta al hombre en Africa, América Cental y del Sur, y partes de la Regién del Me- diterrineo Oriental, se examinan pequefios fragmentos de piel. Los gusanos se alo- jan en nédulos en los tejdos subcutineos. Para tomar muestras de piel sin sangre suelen utilizarse punzones corneoesclersticos. Material y reactivos Cabreobjetos Almohadillas de gasa Portaobjetos o placas de microtitulacién Aguja, calibre 22 Escalpelo, hoja de afeitar © punzin de 2 mm' Eranol, 95% Solucién salina isoténica (reactivo n° 24) o agua destilada Toma de muestras Pacientes con nddulos Bisquense los nédulos: — en el torax (sobre las costillas), = en las caderas, — en las piernas (pantorrillas), — en la espalda (cegidn escapular), ‘Los nédulos son redondos y duros, de 1-5 em de didmetro; cuando se aprietan con Ia yema del dedo se deslizan por debajo de la piel. Témese Ia muestra de piel en el centzo del nédulo. Pacientes sin nédulos Témese Ia muestra de piel de: — Ia parte alta de las nalgas (Ia parte superior externa, donde se aplican las inyec: ciones intramusculares), — a pantorzilla (parte superior externa), = ln espalda (en el centro de la regién escepular) Se recomienda examinar seis muestens (dos de las nalgas, dos de las pantorrillas y dos de las regiones escapulares). 1. Sino se dispone de un punzin corneosclerstico, utilicese un escalpelo estétil desechable y agujas © punzones. Si no se dispone de instrumental desechable, el material debe esterilizarse antes de usarlo en cada paciente. Ello puede ha- cerse colocando el escalpelo, la hoja de afeitar, el punzén o la aguja en un poco de alcohol y flamedndolo. 2. Desinféctese la piel con una gasa empapada en alcohol, 1 punzén a: Kart Storz, Tutlingen, Alemania,VS ES 3. Introdd2case Ia punta de la aguja hasta una profundidad de 2-3 mm y levintese Ia agua, 4. Coléquese ef filo del escalpelo o de Ia hoja de afeitar sobre Ia piel levantada por encima de la punta de la aguja. Corte con un movimiento répido el tx0z0 de piel levantado por la punta de la aguja, tan cerca de ésta como sea posible, La muestra debe tener unos 2-3 mm de ancho; debe quedar adherida a la pun- ta de la aguja. La muestra no debe estar manchada de sangre; en la biopsia no debe encontrarse sangre para evitar la posible contaminacién con parisitos sanguineos. Examen de las muestras 1, Péngase una gota de agua destilada o solucién salina en 18 portaobjetos. Depositese el fragmento de piel en la gota y tépese con x cubseobjetos. No aplar- 1e la muestra nie eabreobetes. Si no hay bastante solucién salina para cubris el tro- 20 de piel, afada un poco en el borde del cubreabjetos para que se introduzca por debajo. 3. Déjese la preparacién en reposo durante 30 minutos y a continuacién exami- nese al microscopic con el objetivo X10, Si hay microfilatias, suelen verse en movimiento en la solucién salina. Sino hay, deben dejarse los feagmentos de piel en solucién salina durante 4 horas a la temperatura ambiente y examinar- se de nuevo. El examen cuantitativo puede hacerse como sigue: Pésese una muestra de piel en Ia balanza (1-10 mg) ‘Transfiérase la muestra a uno de los orificios de una placa de microtitulacién, Anddase 0,1 ml de solucién salina (Caibrase la placa para impedir la evaporacién del agua y déjese incubar a tem- peratura ambiente durante 24 horas, 5. Cuéntese el mimero de microfilarias presentes en la solucién salina usando el microscopio con el objetivo x0, y exprésense los resultados por peso hiime- do de muestra, La digestién de la piel con colagenasa durante mas de 24 horas puede aumentar la Sensibilidad del examen en muestras de pacientes con carga parasitaria reducida, La digestion también puede levarse a cabo en material fjado con etanol y alma. cenado a la temperatura ambiente, 65Seccion 2 Identificacion de especies parasitas