ASSOCIAÇÃO ENTRE PRESENÇA DE HETEROPLASMIA NA REGIÃO

CONTROLE DO DNA MITOCONDRIAL E A IDADE, SEXO E

HAPLOGRUPO DE ORIGEM EM HUMANOS

RELATIONSHIP BETWEEN POINT HETEROPLASMY IN

MITOCHONDRIAL DNA CONTROL REGION AND AGE RANGE, SEX
AND HAPLOGROUP IN HUMAN.
Aluno-autor: Maria Angélica de Camargo
Orientadora: Regina Maria Barretto Cicarelli
Colaboradores: Greiciane Gaburro Paneto; Joyce Aparecida Martins; Aline Carolina Omai de
Mello

Laboratório de Investigação de Paternidade, Faculdade de Ciências Farmacêuticas- UNESP/Araraquara.

Bolsista FAPESP
Email: angellica13@gmail.com

Palavras-chave: heteroplasmia; DNA mitocondrial; cabelo.

Keywords: heteroplasmy; mitochondrial DNA; hair

INTRODUÇÃO
O DNA mitocondrial (DNA mt) passou a ser usado em estudos de genética de populações,
identificação forense, e em estudos de filogenética por vários motivos: primeiro esse DNA também
contém regiões polimórficas que permitem sua individualização; segundo, os descendentes recebem
esse DNA apenas da mãe, o que permite traçar a linhagem materna de uma pessoa; e, terceiro, esse
DNA é mais resistente à degradação que o DNA nuclear, além de estar presente em várias cópias
por célula. Assim, em grandes desastres (incêndios, explosões, queda de avião, etc.), quando é mais
difícil identificar os corpos, analisa-se o DNA mt (Anjos et al., 2004). Este é extraído dos restos
mortais e a seqüência de interesse é comparada com seqüências obtidas de irmãos ou ascendentes
maternos.
Durante o desenvolvimento do indivíduo, as moléculas de DNA mt se replicam
independentemente umas das outras e são ditas não-recombinantes. Além disso, o DNAmt é muito
mais exposto aos eventos mutagênicos que o DNA nuclear por apresentar alta taxa de replicação,
perda do mecanismo de reparo, e produção de Espécies Reativas do Oxigênio (ERO) resultantes da
fosforilação oxidativa (Rose et al, 2007). Somando-se isso ao fato dessa replicação possuir baixa
fidelidade, existe a possibilidade de que populações de moléculas de DNA mt encontradas em um
indivíduo sejam diferentes, com variantes das mesmas replicando e segregando de forma
independente. Essa condição denomina-se heteroplasmia.
A associação de variações do DNA mt e doenças já foi amplamente estudado e é conhecido
na literatura, entre eles diabetes, câncer, sepse e outras doenças neurodegenerativas e
neuromusculares. Além disso, a presença de um componente genético na longevidade também já e
conhecido (Iwata et al, 2007). A associação de uma mutação no DNAmt com uma vida prolongada
em humanos já foi investigada em muitos estudos, como foi demonstrado, por exemplo, por
Giuseppina Rose e colaboradores que em um estudo recente demonstrou que indivíduos centenários
e seus descendentes possuíam um nível de heteroplasmia maior que os níveis de indivíduos
controle.
A frequência de heteroplasmia e sua correlação com a idade já foi analisada utilizando
diferentes tecidos, como sangue, músculo, coração, osso e cérebro e em diferentes regiões do
DNAmt, mas essa análise nunca havia sido feita usando amostras de cabelo. Além disso,
analisamos o haplogrupo de origem de cada pessoa e checamos se a frequência de heteroplasmia
variava entre os haplogrupos.

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OBJETIVO
O objetivo desse trabalho foi estudar a possível relação entre a presença de heteroplasmia e a
idade, sexo e haplogrupo de origem dos indivíduos usando amostras de cabelo e sangue.

MATERIAIS E MÉTODOS
Amostras Biológicas
Foram analisados 144 indivíduos, destes 88 se auto-declararam “brancos” e 56 se auto-
declararam “negros”. Amostras de cabelo e sangue foram coletadas (3-6 anos antes), e estocadas a
8°C (em refrigerador) até a análise. Todos os indivíduos eram residentes na Grande São Paulo-
Brasil.
As amostras foram agrupadas por idade (3 subgrupos), sexo (masculino e feminino) e
haplogrupo de origem (Europeu, Africano e Asiático), e analisadas usando o teste estatístico Qui-
quadrado(χ2).
Na classificação por idade, as amostras foram divididas em três grupos: 16-37 anos (68
indivíduos com media de idade de 26 anos); 38-59 anos (50 indivíduos com media de idade de 48
anos) e 60-80 anos (26 indivíduos com media de idade de 70 anos). As categorias foram
determinadas dividindo o intervalo total das idades em três grupos iguais. Dos 144 indivíduos
analisados, 76 eram mulheres e 68 eram homens. A afiliação em haplogrupos foi conduzida
utilizando mtDNAManager e o Phylotree (van Oven M, Kayser M. 2009).

Métodos
As amostras de sangue foram coletadas em papel de filtro e a extração do DNA foi realizada
utilizando o kit DNA IQ (Promega) ; já a extração de DNA do cabelo foi realizada utilizando o
protocolo descrito por Paneto et al (2007). Amplificou-se o DNA por PCR com os primers L15997
e H16401 em HV1, L29 e H408 em HV2, e F314 e R638 em HV3. Após a amplificação, a
avaliação dos produtos da reação e sua quantificação foram realizadas visualmente após eletroforese
em gel de agarose 1%. O DNA amplificado foi purificado utilizando-se o kit GFX PCR DNA and
gel band purification (Amersham). O seqüenciamento foi feito com BigDye Terminator, e após
precipitação do DNA com álcool, a eletroforese foi realizada em seqüenciador automático ABI 377.
O programa Bioedit foi o escolhido para a análise das seqüências e a leitura de heteroplasmia foi
realizada manualmente em cada eletroferograma.
Somente os eletroferogramas de alta qualidade contendo pouco ou nenhum ruído foram
utilizados. As sequências foram alinhadas com a Sequência Referência Revisada de Cambridge.
As amostras foram agrupadas por idade (3 subgrupos), sexo (masculino e feminino) e
haplogrupo de origem (Europeu, Africano e Asiático), e analisadas usando o teste estatístico Qui-
quadrado(χ2).

RESULTADOS
A presença de heteroplasmia foi observada em 16 indivíduos (11,11%), distribuídos em 7
posições nas regiões HV1 e HV2.

Idade
Dividimos a população amostral em três grupos iguais em relação a idade, e comparamos a
quantidade de heteroplasmia encontrada em cada faixa com o valor esperado para aquele
determinado numero de pessoas utilizando o teste estatístico χ2. Os valores encontrados estão
apresentados na tabela 1:

Tabela 1: Número de pessoas por idade em relação a heteroplasmia.

Número de pessoas por idade
Categoria TOTAL
16-37 38-59 60-80
Com heteroplasmia 9 3 4 16
Sem heteroplasmia 59 47 22 128

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 TOTAL 68 50 26 144

Ao observar o número de pessoas com heteroplasmia levantamos a hipótese se a ocorrência

era maior na faixa de idade mais alta, 60-80 anos, o que indicaria um acúmulo de mutações do
DNAmt ao decorrer da idade, aumentando assim a freqüência de heteroplasmia. Para confirmar essa
hipótese aplicamos o teste estatístico χ2. O método χ2 foi escolhido por ser um teste de hipóteses
não paramétrico, utilizado para grandes amostras, onde o valor obtido experimentalmente e
comparado com a freqüência esperada a fim de verificar se há uma diferença estatística entre elas, e
com isso aceitar ou rejeitar a hipótese levantada.
Na nossa análise, para df = 2, temos, da tabela de χ2, que o valor crítico para α de 5% é 5,99.
O valor χ2calculado foi 2,2066.

Sexo
Nesta etapa dividimos a população amostral em relação ao sexo, e comparamos a quantidade
de heteroplasmia encontrada em cada gênero com o valor esperado para aquele determinado
número de pessoas utilizando novamente o teste estatístico χ2. Os valores obtidos estão
apresentados na tabela 2.

Tabela 2: Número de pessoas por sexo para heteroplasmia.

SEXO
Categoria TOTAL
FEMININO MASCULINO
Com heteroplasmia 12 4 16
Sem heteroplasmia 64 64 128
TOTAL 76 68 144

Comparando inicialmente a distribuição de heteroplasmia entre os sexos notamos uma

elevada taxa dessa mutação entre as mulheres quando comparada aos homens. Aplicamos então o
teste χ2 a fim de confirmar se a frequência de heteroplasmia em pessoas do sexo feminino é
diferente daquela encontrada em pessoas do sexo masculino.
O valor de χ2 encontrado nos cálculos foi 3,7874. Para df = 1, temos, da tabela de χ2, que o
valor crítico para α de 5% é 3,84.

Haplogrupo de Origem
Nesta terceira etapa dividimos a população amostral em três grupos baseados na origem do
haplogrupo (europeu, africano e asiático) de acordo com a análise do genótipo utilizando
mtDNAManager e o Phylotree (van Oven M, Kayser M. 2009). Das 144 amostras, 7 não puderam
ser classificadas em haplogrupos apenas pela análise dos polimorfismos encontrados na região
hipervariável, restando 137 amostras classificadas.
A distribuição de heteroplasmia encontrada em cada grupo é mostrada a seguir (Tabela 3).

Tabela 3: Número de pessoas por haplogrupo de origem para heteroplasmia.

HAPLOGRUPO DE ORIGEM
Categoria TOTAL
EUROPEU ASIÁTICO AFRICANO
Com heteroplasmia 6 3 7 16
Sem heteroplasmia 40 33 48 121
TOTAL 46 36 55 137

Ao observar os dados obtidos queríamos investigar se a distribuição de heteroplasmia era

diferente entre os 3 grupos de origem. Novamente aplicamos o teste χ2 a fim de verificar essa
relação.

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 O valor de χ2 encontrado nos cálculos foi 1,6590. Para df = 2, temos, da tabela de χ2, que o
valor crítico para α de 5% é 5,9254.

CONCLUSÃO
• Idade
Na nossa análise, para df = 2, temos, da tabela de χ2, que o valor crítico para α de 5% é 5,99.
O valor χ2calculado foi 2,2066 . Logo, como χ2calculado foi menor que o χ2crítico (tabelado),
rejeitamos a hipótese apresentada, e concluímos que a distribuição de heteroplasmia é igual entre as
diferentes faixas etárias.

• Sexo
O valor de χ2 encontrado nos cálculos foi 3,7874. Para df = 1, temos, da tabela de χ2, que o
valor crítico para α de 5% é 3,84. Sendo assim, não encontramos significância estatística
relacionando a distribuição de heteroplasmia e o sexo em amostras de cabelo e sangue, pois o teste
estatístico resultou em um valor muito próximo do valor tabelado, dizemos então que a hipótese
levantada está no limite de significância.

• Haplogrupo de Origem
O valor de χ2 encontrado nos cálculos foi 1,6590. Para df = 2, temos, da tabela de χ2, que o
valor crítico para α de 5% é 5,9254. Logo, como χ2 calculado é menor que o χ2 tabelado, rejeitamos
a hipótese apresentada, e concluímos que a freqüência de heteroplasmia é igual entre os grupos de
origem.

A análise estatística dos dados mostrou que não há uma correlação estatística entre a
freqüência de heteroplasmia encontrada e a idade ou sexo ou origem do haplogrupo do indivíduo,
utilizando amostras de cabelo e sangue.
Estudos já publicados encontraram significância estatística relacionando a freqüência de
heteroplasmia e a idade utilizando amostras de tecido muscular (Calloway, 2000).

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. ANJOS, M. J.; CARVALHO, M.; ANDRADE, L. et al. Individual genetic identification of
biological samples: a case of an aircraft accident. Forensic Sci. Int., v. 146S, p. S115–S117,
2004.
2. CALLOWAY, C. D.; REYNOLDS, R. L.; HERRIN, G. L. et al. The frequency of
heteroplasmy in the HVII region of mtDNA differs across tissue types and increases with
age. Am. J. Hum. Genet., v. 66, n. 4, p. 1384-97, 2000.
3. IWATA, N.; ZHANG, J.; ATZMON, G. et al. Aging-related occurrence in Ashkenazi Jews
of leukocyte heteroplasmic mtDNA mutation adjacent to replication origin frequently
remodeled in Italian centenarians. Mitochondrion, v. 7, p. 267–272, 2007.
4. PANETO, G. G.; MARTINS, J. A.; LONGO, L. V. G. et al. Heteroplasmy in hair:
Differences among hair and blood from the same individuals are still a matter of debate.
Forensic Sci. Int., v. 173, p. 317-121, 2007.
5. ROSE, G.; PASSARINO, G.; SCORNAIENCHI, V. et al. The mitochondrial DNA control
region shows genetically correlated levels of heteroplasmy in leukocytes of centenarians and
their offspring. BMC Genomics, 8:293, 2007
6. VAN OVEN, M.; KAYSER, M. Updated comprehensive phylogenetic tree of global human
mitochondrial DNA variation. Hum Mutat, v. 30, n. 2, p. 386-394.
http://www.phylotree.org, mtDNA tree Build 3, 2009.

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