MTODOS DE AN

ANLISES
MICROBIOL
MICROBIOLGICOS
PARA CONTROLE DE
QUALIDADE DE
ALIMENTOS
Controle
Controle de
de Qualidade
Qualidade na
na indstria
indstria Alimentos
Alimentos
USFMUSFM- 19/09/2009
19/09/2009

Msc. Vania Tronco

VERUS SEGURANA AMBIENTAL E ALIMENTAR

ESCOLHA DOS M
TODOS
MTODOS
DE AN
LISES
ANLISES
FERRAMENTAS
FERRAMENTAS PARA
PARA GARANTIR
GARANTIR A
A
QUALIDADE
O
QUALIDADE DA
DA SUA
SUA PRODU
PRODUO

AN
ANLISES
MICROBIOL
MICROBIOLGICAS SO
FUNDAMENTAIS PARA:
- segurana alimentar
- qualidade geral dos alimentos produzidos
- medidas profilticas
-comercializao no mercado internacional e
nacional

EFICINCIA E
RAPIDEZ
medidas
medidas tomadas
tomadas na
na
hora
hora certa
certa

Garantia
Garantia de
de
resultados
resultados

Conceitos bsicos de preveno e controle da

contaminao alimentar e doenas transmitidas
alimentos sugerem:
Melhorar qualidade
higinica de alimentos
crus (BPP ou BPA);
BPF utilizando tecnologias
de processamento
adequadas;
BP em toda a cadeia
alimentar.....

GAP - Boas Prticas Agrcolas

GMP - Boas Prticas de Fabricao

SSOP /PPOH
(Sanitation Standard Operating Procedures )
PROCEDIMENTOS PADRONIZADOS DE
OPERAO DE SANITIZAO:

PRP - Programa de Reduo de

Patgenos

NOVOS M
MTODOS PARA
AN
ANLISES DE ALIMENTOS
1. simplificao dos tradicionais
2. atividade enzimtica
3. atividade antignica
4. moleculares
5. combinao

ESCOLHA DO M
MTODO
DIAGN
DIAGNSTICO
- capacidade fsica operacional
-volume de testes analticos
- rastreabilidade
- validaes internacionais, nacionais e
internas
-rapidez na liberao de resultados
-Capacidade e custo de estocagem
- custo / benefcio

M to d o s R p id o s
M to d o
R p id o
P o r q u e u tiliz a r?
E s c o lh a
A p ro v a o

P ra tic id a d e

S e le tiv id a d e

S e n sib ilid a d e
R a p id e z

Mtodos rpidos:
Vantagens em tempo de anlise e liberao de
resultados analticos
Possibilidade de eliminar etapas de trabalho intensivo
Potencial para automao
Sempre cumprem com procedimentos de incubao
ainda necessariamente
ELISA e PCR so dominantes
Falta de um procedimento comum de validao
A maioria apresenta dificuldade de aceitao para fins
oficiais

Mtodos rpidos:
Avanos em Mtodos de Contagens de clulas viveis
Miniaturizao e Kits de Diagnstico, Tcnicas de
Identificao Bioqumica
Mtodos baseados em anticorpos
Separao Imunomagntica
Ensasios baseados em cidos nucleicos
Biosensores
Microships
Citometria de Fluxo
Tcnicas baseadas em Bacterifagos
ATP bioluminescncia
Bioluminescncia adenilato quinase
Riboprinter e Pulse-Field Gel Electroforese

Os Mtodos Microbiolgicos
podem ser divididos em:

tradicionais
(convencionais)

mtodos rpidos

IDENTIFICAO
BACTERIANA pode
ser feita por
avaliao
caractersticas
microbianas
FENOTPICAS
GENOTPICAS

METODOLOGIAS
DISPONVEIS
FENOTPICAS

- Metodologia tradicional
- Padro ouro

O QUE CONSIGO
VISUALIZAR !

- Kits prontos
- ELISA tradicional
- ELISA kit visual
ou automatizado.

Problemas com os mtodos

tradicionais:

Sensibilidade insuficiente

Especificidade: nem sempre ocorre(podem
haver falsos negativos)

Repetibilidade: nem sempre se o teste for
repetido por um mesmo operador inmeras
vezes se obtm o mesmo resultado

Reprodutibilidade: capacidade de gerar
resultados estatsticamente iguais (nem
sempre ocorre)

Mtodos convencionais:
Os mtodos convencionais usam a cultura de
microrganismos em placas contendo gar
So laboriosos e consomem muito tempo
operacional
84% de todos os testes so baseados na
contagem de clulas viveis
Requerem controle de agncias regulatrias
nacionais e internacionais para controle oficial

Depende da integridade fisiolgica bacteriana

- Injria, alteraes - processamento;
- Controles - meios de cultura, pessoal e
equipamentos e tempo.

TRADICIONAL
limitaes provveis:

TRADICIONAL
- Quantidade/qualidade
- provas bioqumicas;

- Padro de deciso
- Chaves dicotmicas

MULTIPLICIDADE
DE ETAPAS

L
I
M
I
T
A

E
S

Dependendo do no. de anlises:

- perigo de contaminao cruzada;
- muitas etapas a serem validadas;
- limitada rea fsica e pessoal.

TRADICIONAL

L
I
M
I
T
A

E
S

BIOINDICADORES - KITS
- maior no. anlises/dia
- diminuio de etapas validadas
- menor perigo de contaminao
- devem ser aprovados/validados

TRADICIONAL

Mtodos rpidos alternativos como Tcnica fluorognica:

adiciona o MUG ( 4 metil umbeliferil beta-D-glucorondeo):

Atravs da enzima beta-glucoronidase (maioria

das cepas de E.coli) o MUG transformado em
uma umbiliferona fluorescente quando observada
na luz ultravioleta de onda longa (aps 24 hs)
Aplicao prtica: esta determinao
fundamental na avaliao da condio higinica
do processamento de alimentos( a tcnica
tradicional tubos(NMP) muito lenta pode
durar at 5 dias!

Mtodos para Contagens de

microrganismos:baseados na multiplicao
microbiana

Mtodo tradicional (plaqueamento);

Mtodo de plaqueamento em espiral;
Placas Compact Dry;
Placas de Petrifilm;
Placas do Simplate;
Mtodos alternativos: para NMP (tcnica
fluorognica);
Mtodos alternativos: adio de substratos
cromognicos:(adio de X-Gal, X-Gluc., Salmon.-Gal
no isolamento de microrganismos)

COMPACT
DRY

Enzimas cromognicas:
revela caractersticas
especficos de um grupo,
gnero ou espcie.

Placas de Compact Dry:

- Prontas para uso

-

Reduz as horas de trabalho.

Permite aumento de produtividade e eficincia.

- Uso em anlises de matrias primas ou produtos acabados como

alimentos, bebidas, carne e outros.

VANTAGENS DO COMPACT
DRY


Shelf life de 18 a 24 meses sem refrigerao.

Atende s BPL - maior segurana por possuir tampa.

 A amostra se difunde sozinha e rapidamente pela placa, sem

necessitar de difusores ou outros instrumentos.


Sem limite de empilhamento - menor espao na incubadora.

VANTAGENS DO COMPACT DRY

- Espao tridimensional - excelente crescimento dos bolores e
leveduras.
- Facilidade para checar ou repicar as colnias - forma idntica
ao que faria nas placas tradicionais.
- Rpida manipulao sem etapas de preparao de meios
de cultura, esterilizao de vidraria, etc.
- Manual traduzido em vrios idiomas, inclusive portugus.

DISPONIBILIDADE
Contagem
total

TC

Bolores e
leveduras

YM

Colif. totais
e E. coli

EC

Coliformes
termotolerantes

CF

O QUE POSSO ANALISAR?

Contagem
total

Bolores e
leveduras

TC

YM

O QUE POSSO ANALISAR?

Coliformes totais
e E. coli

Coliformes
fecais

EC

CF

COMO ANALISAR?

As placas j
possuem tudo o que
voc precisa!

s abrir e adicionar 1mL da amostra ou da diluio e

incubar pelos tempos/temperaturas recomendados!

Compact Dry TC
Para contagem total
de bactrias viveis.

Resultados em
24 a 48 horas

Bactrias formam colnias vermelhas

Compact Dry YM
Contagem de bolores
e leveduras.

Resultados em
3 a 5 dias

Leveduras formam colnias azuis ou verdes

Compact Dry EC
Contagem de coliformes
totais e E. coli
Resultados em
24 horas

E. coli forma colnia azul

Coliformes totais formam colnias vermelhas

Compact Dry CF
Contagem de coliformes
totais
Resultados em
18-24 horas

Coliformes totais formam colnias esverdeadas

APROVAES
Certificado Performance Tested Method AOAC:
- Compact Dry EC:110402
-Compact Dry CF:110401
-- Compact Dry TC: 010404
- Compact Dry YM:100401

Monitoramento de Higiene
Necessidade de se desenvolver mtodos de
tempo real para monitorar procedimentos de
limpeza e higienizao(deteco de resduos de
matria orgnica e ATP de clulas bacterianas
Mtodos devem ser baratos, robustos
ATP bioluminescncia

Sistema detecta:

ATP residual em superfcies

A molcula de ATP pode ser encontrada em
clulas viveis; clulas no microbianas
(sangue, carne..)

Sistema rpido para monitoramento de
higiene de processos produtivos na indstria
alimentcia

Sistema preventivo para tomada de medidas
rpidas e efetivas(resultado em tempo real)

PRINCPIO DO TESTE

ESTABILIDADE !

TECNOLOGIA
DE
RECICLAGEM

Mecanismo da reao

Luciferina (LH2)+ATP+Mg++______enzima
luciferase ____forma___complexo
ELH2+AMP+PP

Em presena de oxignio temos:
oxiluciferina+AMP +CO2+ LUZ (medida com
Luminmetro)

AMP (Adenosina Monofosfato)

ATP( Adenosina Trifosfato)
PP (Pirofosfato)
ELH2 (complexo luciferase-luciferina-AMP)

LUMITESTER

REALIZANDO O TESTE

Passar o aplicador LuciPac

na superfcie previamente definida

REALIZANDO O TESTE

Voltar o aplicador no tubo e injetar

o pino para abrir a cpsula dos reagentes.

REALIZANDO O TESTE

Agitar o LuciPac vrias vezes para

que o lquido escoe .

REALIZANDO O TESTE

Colocar o LuciPac na cmara do

Lumitester, fechar a tampa.
ENTER

LENDO O RESULTADO!

ENTER LEITURA EM
10 SEGUNDOS !

Limiar 1 ou inferior

A (aceito)

Limiar >1 e < 2

B (ateno)

Limiar 2 excedido

C (rejeitado)

RESUMINDO ...

LEITURA DOS
RESULTADOS !
10

Imunoensaios:
ELISA (com tecnologias diversas),
Imunocromatografia
Sistemas totalmente automatizados
Novos anticorpos recombinantes e tcnicas de
impresso molecular para melhorar a
sensibilidade e versatilidade

ELISA KIT

FENOTPICAS

Devem possuir
APROVAO !

ELISA - KIT
- Resultados - qualidade dos anticorpos;
- sensibilidade x especificidade;

- Relao quantitativa Ag x Ac variabilidade;

- Nvel de deteco pode variar com o sorovar.

FACILITAM A ROTINA
TESTES DE TRIAGEM !

ELISA - KIT
- Resultados devem ser confirmados;
- Versatilidade quanto aos alvos;
- Capacidade operacional compatvel
com o nmero de anlises necessrias.
- LIMITAES - falsos positivos??

Fundamento dos testes ELISA:

REAES ANTGENO-ANTICORPO

ELISA: Ensaios Imunoabsorventes de Enzima Ligada

1. Se adiciona a amostra suspeita

2. Ac primrios no so facilmente removveis da fase
slida
3. No caso de ser positiva, os Ag ficam presos aos Ac
primrios fixados
4. Ac primrios selecionados se fixam
5. Se adicionan Ac secundrios marcados com enzima
contra Ag buscados
6. Os Ac secundrios se unen ao AG
7. Se libera substrato complementar a enzima
8. Se o conjugado se formou, reage com o substrato por
colorimetra

Lateral Flow
System para

Listeria, Salmonella
e E.coli O 157

LFS Listeria sp
DuPont

Resultados em 40
a 42 horas.

LFS Listeria sp minimize

Adicione
a
amostra
ao tubo.

(-)
LFS
List
eria

Incube
a 30C 40 48
horas.

Adicione
a fita
LFS e
aguarde
10 min.

Ferva
em BM
por 5
minutos.

LFS
Lis
ter
ia

Amostra +
meio LFS
c/
suplemento
.

LFS
List
eri
a

etapas com confiabilidade

(+)

Retire a
fita e
realize
a
leitura.

LFS E. Coli O:157

rapidez na triagem

Resultado em 8 a
18 horas

Pese a
amostra
no meio
LFS.

Incube
a 42C
por 8 a
18 hs.

LFS
List
eri
a

LFS E. Coli O157

resultados em 8 hs
Ferva
em BM
por 5
minutos.

Adicione
0,5mL ao
tubo de
prova.

Adicione
a fita
LFS no
tubo

Aps 10
min.
realize a
leitura.

LFS
Salmonella

Resultados em
27 horas

LFS Salmonella
Amostra +

Adicione

o meio

1mL do

LFS

TT Hajna
ao tubo.

Incube
a 42oC /
8 a 18
hs.

Repique
1mL em TT
Hajna, -19
hs/42oC

Ponha a
fita LFS
no tubo.

Aps 10

min
realize a
leitura.

Teste de ELISA (lateral flow system):

MTODOS
GENOTPICOS
- Segurana e rapidez nos resultados.
- Disponvel para patgenos e bioindicadores.

METODOLOGIAS
DISPONVEIS

GENOTPICAS
- PCR tradicional
- PCR automatizado
- PCR real time

EFICINCIA NA
DETECO !

GENOTPICOS PCR

tradicional

- Dependente da seleo e qualidade do primer

- Necessidade de otimizao das reaes;
- Muitas e delicadas etapas.

INCOMPATVEL COM A
ROTINA DE UMA INDSTRIA

- Mo de obra especializada; ambiente adequado;

- Perigo de contaminao.

GENOTPICOS
PCR

tradicional

BAX SYSTEM
AUTOMATIZADO

UM MUNDO DE INOVAES
TECNOLGICAS DISPONVEL
PARA A GARANTIA DOS
ALIMENTOS !

BAX PCR automatizado

Qualitativo /Quantitativo
- Primers j testados e validados;
- Aprovaes e validaes.
PESQUISAS CONSTANTES GARANTINDO DIFERENAS

TECNOLGICAS

FACILITA A ROTINA
E DIMINUI INTERFERNCIAS !

BAX System

Mtodo de PCR para

anlises de patgenos

BAX SYSTEM

Deteco de DNA ou RNA

PCR automatizado
PCR em tempo real

EFICINCIA NA
DETECO !

METODOLOGIAS
DISPONVEIS

GENOTPICAS
- PCR tradicional
- PCR automatizado
- PCR real time

EFICINCIA NA
DETECO !

BAX SYSTEM

Primers testados e validados;

Aprovaes e validaes.
PESQUISAS CONSTANTES
GARANTINDO DIFERENAS
TECNOLGICAS !

FACILITA A ROTINA
E DIMINUI INTERFERNCIAS !

BAX SYSTEM
POUCAS ETAPAS = MENOR no. DE CONTROLES E
VALIDAES INTERNAS

ETAPAS
- Pr-enriquecimento;
- Extrao do DNA;
- Amplificao;
Resultados rastreveis

Mtodo automatizado e simplificado

1. Prepare o DNA

2. Amplifique o DNA

3. Detecte o DNA

O que acontece com os tubos no

Bax?

INTRODUO
- O que PCR?
Reao em Cadeia da Polimerase
Desenvolvido em 1983 por Kary Mullis.
Prmio Nobel em Qumica 1993;
Cpias idnticas de
determinada sequncia de
DNA

CONCEITOS - PCR
ANLISE
GENOTPICA

CONCEITOS - PCR
Cpias identicas da sequncia
de DNA alvo

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TCCCAGAT

ATCTGCT
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

PRIMER
Sequncia especifica - sequencia do DNA alvo;
Regies altamente conservadas.
ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TCCCAGAT

PRIMERS
ATCTGCT
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

Como ocorre a reao?

Com o aumento da temperatura, a fita de
DNA se separa.
ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

Aumento da
temperatura
ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

Como ocorre a reao?

Com a queda da temperatura, os primers
se ligam a fita de DNA complementar.

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TCCCAGAT

Temperatura mais Baixa

ATCTGCT
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

Como ocorre a reao?

Com o auxlio da Taq polimerase e os dNTPs a
cpia da fita iniciada
ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TCCCAGAT
Polimerase de
T
DNA
C

dNTPs

Iniciador
Polimerase de
DNA

ATCTGCT
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

Molcula de DNA en cuestin

Amplificao
De uma molcula de DNA
obtm-se 02 molculas idnticas!!
ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

2 cpias exatas
da molcula de
DNA em
questo
ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

BAX SYSTEM
Qualitativo /Quantitativo
- Primers j testados e
validados;
- Aprovaes e validaes.
PESQUISAS CONSTANTES
GARANTINDO DIFERENAS
FACILITA A ROTINA

TECNOLGICAS
!
E DIMINUI
INTERFERNCIAS
!

TRANSCRIPTASE
REVERSA - rRNA


RiboPrinter

System

Perfil gentico
Ribogrupo da bactria ou
bolores e leveduras;
Tcnica Southern Blot
resultados em 8hrs;
Biblioteca Nacional Lanagro / MAPA;
Biblioteca atualizvel Mundial!

Como o RiboPrinter System

Funciona

COMO FUNCIONA:
O DNA purificado sofre cortes
por ao enzimtica ( EcoRI
ou PstI ou PvulI), neste
processo de preparao do
DNA.
LISE rompe a clula
DESPROTEINIZAO limpa
debris
DIGESTO enzima de
restrio (e.g., EcoRI) corta
DNA em fragmentos
especficos.

O QUE ACONTECE:

COMO FUNCIONA:
Os fragmentos de DNA
resultantes da ao enzimtica
so separados (por peso
molecular) pelo processo de
eletroforese em gel de agarose
e transferidos para a membrana
(Southern Blot), onde sofrem
hibridizao com a sonda de
hibridizao fluorescente, a qual
seleciona os
fragmentos originrios da ao
das enzimas de restrio.

COMO FUNCIONA:
Os fragmentos ficam fixados na
membrana e ento a cmara
CCD registra a imagem da
membrana.
feita anlise e interpretao
dos dados.

Imagem Digitalizada

RiboPrint Patterns Demonstra

Claramente a Diferenciao

Identificao & Caracterizao

Resultados:
Aps 8 horas tm-se a
impresso digital da bactria, sendo
possvel identificar a real fonte de
contaminao, melhorar ao de
antibiticos mais especficos, fazer um
estudo completo e confivel da
taxonomia bacteriana e muito mais.

INDSTRIA ALIMENTOS NECESSITA MTODOS

MICROBIOLGICOS QUE SEJAM:

Precisos
Rpidos
Fceis de utilizar
Flexveis
Confiveis
Econmicos
Acompanhamento e
suporte tcnicos
contnuos

VANTAGENS DOS MTODOS

RPIDOS:
Especificidade e
confiabilidade;
Aprovaes e aceitaes
internacionais;
Acompanhamento oficial
de desempenho;
Rapidez e agilidade na
liberao de resultados!

VANTAGENS DOS MTODOS

RPIDOS:
Facilitam a aplicao
das boas prticas de
laboratrio;
Diminuio do nmero
de etapas de trabalho;
Diminuio do erro
analtico;
Melhoria da qualidade
dos processos;

No ter nenhum resultado

melhor do que ter um
resultado errado
Nascimento (2005)

OBRIGADA!
troncovm@terra.com.br
tecnologia@madasa.com.br

www.madasa.com.br