Facultad de Ciencias Aplicadas

Departamento de Ciencias de la Vida

Ingeniera en Biotecnologa

Laboratorio de Enzimologa
INTEGRANTES:
Cynthia Andrade
Anah Boada
Carlos Ortiz
FECHA: 2015-05-15

ASIGNATURA: Enzimologa

1. TITULO DE LA PRCTICA: MODIFICACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DEL

A TIROSINASA A PARTIR DE UNA MUESTRA DE CHAMPION.
2. OBJETIVOS:
2.1 Objetivo General
Modificar la actividad enzimtica de la enzima tirosina presente en una muestra de
champin.
2.3.2. Objetivos Especficos
Analizar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica de la tirosina
Determinar la velocidad mxima y la constante de Michaelis-Mentel a partir de la
variacin del sustrato.
Determinar la influencia del cido cinmico como un inhibidor enzimtico en la reaccin.
3. MARCO TEORICO
cido Cinmico: Este compuesto es capaz de unirse a los grupos aminos o carboxlicos,
bloqueando el acceso de la tirosina al sitio activo de la enzima (Martnez, 2006)
Inhibicin Enzimtica: La actividad enzimtica se puede inhibir, es decir, reducir o eliminar la
actividad enzimtica o cataltica de enzimas especficas (Martnez, 2006).
Efecto de la temperatura:Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad
reaccin hasta cierta temperatura optima ya que despus de 45C se comienza a producir la
desnaturalizacin, la mayora de las enzimas en mamferos tienen una temperatura optima de 37C y
por encima de esa temperatura la enzima comienza a inactivarse y se destruye (Campbell, 2007)
Tirosinasa: Es una enzima que cataliza la hidroxilacin de monofenoles y la oxidacin de odifenoles a o-quinoles, reacciones que convierten a la enzima en clave para la sntesis de
pigmentos, como es el caso de la melanina, tanto en eucariotas como en procariotas. En presencia
de catecol, se forma benzoquinona. Los hidrgenos extrados del catecol se combinan con el

oxgeno para formar agua. (Prez & Ortiz, 2010)

Concentracin del sustrato: En toda reaccin catalizada por un enzima, si se mantiene constante
la concentracin del E, la velocidad de la reaccin aumenta exponencialmente al incrementarse la
concentracin del sustrato, ya que al existir ms molculas de sustrato es ms probable el
encuentro con el enzima y la formacin del complejo E-S. Esto es debido a que el enzima est
saturada por el sustrato (Prez & Ortiz, 2010)
Velocidad de Reaccin: Es el ndice de cambio con el tiempo de la concentracin de un reactivo
o producto. Al determinar la velocidad de una reaccin, lo que se observa es la variacin de la
concentracin de uno o ms de los reactivos o de los productos de reaccin en funcin del tiempo.
(Prez & Ortiz, 2010)
4. RESULTADOS
Medicin de la actividad difenolasa
Enzima:
0.1 ml de extracto enzimtico
Buffer:
1 ml de tampn acetato 10 mM
Sustrato:
1 ml de catecol 5 mM
1
1
=1050 M cm
Tabla 2. Medicin de la actividad difenolasa
Tiempo
(s)

Abs

Concentracin
(U/L)

30

0,321

305,714

60

0,314

299,048

6,667

90

0,309

294,286

4,762

120

0,305

290,476

3,810

||

b
C=

(0,321)
min
M
M
C 1=
=3.05714104
106=305.714
1
1
min
lmin
1050 M cm 1 cm
C 1=305.71

U
L

( 0,314)
min
M
M
C 2=
=2.99048104
10 6=299.048
1
1
min
lmin
1050 M cm 1 cm
C 2=299.048

U
L

(0,309)
min
M
M
C 3=
=2.94286104
106=294.286
1
1
min
lmin
1050 M cm 1 cm
C 3=294.286

U
L

(0,305)
min
M
M
C 4=
=2.90476104
10 6=290.476
1
1
min
lmin
1050 M cm 1 cm
C 4=290.476

U
L

( 0.3210.314)
min
M
M
U
C=
=6.667106
106=6.6667
=6.667
1
1
min
lmin
L
1050 M cm 1 cm
(0.3140.309)
min
M
M
U
C=
=4.762106
106=4.762
=4.762
1
1
min
lmin
L
1050 M cm 1 cm
( 0,3090.305)
min
M
M
U
C=
=3.810106
106=3.810
=3.810
1
1
min
lmin
L
1050 M cm 1 cm

Concentracin vs Tiempo
310.000
305.000
300.000

f(x) = - 0.17x + 310

Concentracin (U) 295.000

290.000
285.000
280.000
20

40

60

80

Tempo (s)

100

120

140

Figura 2.Medicion de la actividad difenolasa

Clculo de Km y Vmax
Se debe hacer la representacin de Lineweaver-Burk correspondiente y evaluar las magnitudes de
KM y VMAX para lo cual se midi la actividad enzimtica variando la concentracin de catecol
en la celda de medicin: 50M, 66M, 100M, 200M, 500M, 1mM y 3mM. Para ello se
mezcl en una cubeta espectrofotomtrica de 1 cm de peso ptico: 1mL de catecol (a diferentes
concentraciones), luego 1mL de tampn de acetato 10mM de pH 5 y se aadi 0.1mL de extracto
enzimtico
VARIACIN DEL SUSTRATO
Tabla 3. Medicin de Actividad Enzimtica a diferentes concentraciones de Catecol

Tiempo
(S)
0
30
60
90
120

Tiempo
(S)
0
30
60
90
120

1
50 M
0
0.175
0.175
0.176
0.176

1
50 M
0
0.00583333
3
0.00291666
7
0.00195555
6
0.00195555
6

2
66 M
0
0.272
0.281
0.285
0.288

DATOS
3
4
100 M
200 M
0
0
0.308
0.38
0.329
0.394
0.335
0.397
0.337
0.4

5
500 M
0
0.65
0.67
0.643
0.621

6
1 mM
0
0.748
0.716
0.687
0.669

7
3 mM
0
0.731
0.685
0.656
0.647

ACTIVIDAD ENZIMATICA
3
4
5
6
7
100 M
200 M
500 M
1 mM
3 mM
0
0
0
0
0
0.0102666
0.0216666
0.00906667
7
0.01266667
7
0.02493333 0.02436667
0.0054833
0.00468333
3
0.00656667 0.01116667 0.01193333 0.01141667
0.0037222
0.0071444
0.00316667
2
0.00441111
4
0.00763333 0.00728889
0.0028083
0.0024
3
0.00333333 0.005175
0.005575 0.00539167
2
66 M
0

Tabla 4. Dobles inversos 1/V, 1/ [S]

1/[S]
1/V
789.82010
0.02
3
517.68757
0.015
2
448.82175
0.01
3

370.67542
3
221.47030
6
199.70044
9
206.33919
4

0.005
0.002
0.001
0.000333

ComportamientoMichaelis-Menten
0.06
0.05
0.04

V (mM/s)

R = 0.79

0.03
0.02
0.01
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

[S] (mM)

Figura 3. Curva de Michaelis - Menten para Catecol

Actividad enzimtica
0.06
0.05

f(x) = 0x + 0.01
R = 0.91

0.04

1/V

0.03
0.02
0.01
0
0

10

20

30

40

50

1/S

60

70

80

90

100

Figura 4. Representacin Lineweaver Burk. Inversos de las velocidades enzimticas frente a

los inversos de las concentraciones de sustrato
Vmax=71,9424 uM / seg
Km=0.02877uM

INHIBICIN ENZIMTICA CON CIDO CINMICO

Se debe representar con el mtodo de Dixon. Para ello se realizaron dos series de medidas de la
actividad: una con 1mL de catecol de concentracin de 2 mM y concentracin variable de cido
cinmico desde 0 hasta 0.4 mM (1 ml) y otra con catecol 0.5 mM y concentracin variable de
cido cinmico desde 0 hasta 0.4 mM (1ml).
Catecol: 2mM
Tabla 5. Medicin de la concentracin con cido Cinmico a diferentes concentraciones de
Catecol
CONCENTRACION AC CINMICO
Tiempo
0
30
60
90
120

0
1,065
1,094
1,124
1,123
1,137

0,1
0,746
0,864
0,878
0,886
0,901

0,2
0,556
0,83
0,872
0,884
0,892

0,3
0,549
0,833
0,879
0,882
0,89

0,4
0,489
0,829
0,856
0,865
0,872

Catecol: 0.5mM
Tabla 5. Medicin de la concentracin con cido Cinmico a diferentes concentraciones de
Catecol

Tiempo
0
30
60
90
120
Promedio

CONCENTRACION AC CINMICO
0
0,1
0,2
0,3
0,52
0,508
0,501
0,498
0,608
0,587
0,571
0,564
0,664
0,597
0,576
0,527
0,79
0,626
0,583
0,582
0,804
0,699
0,662
0,658
0,6772

0,6034

0,5786

0,5658

0,4
0,493
0,558
0,552
0,58
0,637
0,564

Abs
0,6449523 0,5746666 0,551047 0,5388571 0,5371428
8
7
62
4
6
155,050,2 174,013,9 18,147,25 185,577,9 186,170,2
07
21
2
43
13

V2
1/V

[I]

1/V1
0,9471490
8
122,807,8
79
130,143,9
39
130,176,1
28
134,237,1
97

0
0,1
0,2
0,3
0,4

1/V2
155,050,2
07
174,013,9
21
18,147,25
2
185,577,9
43
186,170,2
13

REPRESENTACIN DE DIXN-WEBB
2

f(x) = 0.74x + 1.62

1.5

f(x) = 0.86x + 1.05

1/V

1
0.5
0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

[I]

Figura 5. Representacin Lineweaver Burk.

EFECTO DE LA TEMPERATURA
Temperatura 25 Grados Centgrados
Tiempo

Absorbancia

C= A/(a*b)*10^6

0
30
60
90

0,173
0,268
0,353
0,449

164,76
255,24
336,19
427,62

0.45

120
0,502
478,10
Tabla 6. Valores de absorbancia y concentracin a 25 grados centgrados a diferentes tiempos

Temperatura 25 Grados Centgrados

600.00
500.00
400.00
300.00
Concentracin (micro molar) 200.00
100.00
0.00

f(x) = 2.66x + 172.57

R = 0.99
Linear ()

100
200

Tiempo (segundos)

Figura 6. Grfica concentracin vs tiempo a 25 Grados Centgrados

Temperatura 35 Grados Centgrados
Tiempo

Absorbanci C= A/(a*b)*10^6
a
0
0,208
198,10
30
0,378
360,00
60
0,496
472,38
90
0,546
520,00
120
0,618
588,57
Tabla 7. Valores de absorbancia y concentracin a 35 grados centgrados a diferentes tiempos

Temperatura 35 Grados Centgrados

800.00
600.00
Concentracin (micromolar)

f(x) = 3.14x + 239.62

R = 0.94

400.00

Linear ()

200.00
0.00
0

50

100

150

Tiempo (segundos)

Figura 7. Grfica concentracin vs tiempo a 35 Grados Centgrados

Temperatura 50 Grados Centgrados

Tiempo

Absorbanci
C= A/
a
(a*b)*10^6
0
0,443
421,90
30
0,624
594,29
60
0,653
621,90
90
0,697
663,81
120
0,715
680,95
Tabla 8. Valores de absorbancia y concentracin a 50 grados centgrados a diferentes tiempos

Temperatura 50 Grados Centgrados

800.00
600.00
Concentracin (micromolar)

f(x) = 1.96x + 479.05

R = 0.81

400.00

Linear ()

200.00
0.00
0 20 40 60 80 100120140
Tiempo (segundos)

Figura 8. Grfica concentracin vs tiempo a 50 Grados Centgrados

Temperatura 70 Grados Centgrados
Tiempo

Absorbanci C= A/(a*b)*10^6
a
0
0,237
225,71
30
0,239
227,62
60
0,245
233,33
90
0,246
234,29
120
0,246
234,29
Tabla 9. Valores de absorbancia y concentracin a 70 grados centgrados a diferentes tiempos

Temperatura 70 Grados Centgrados

235.00
230.00
Concentracin (micromolar)

f(x) = 0.08x + 226.29

R = 0.85
Linear ()

225.00
220.00
0 20 40 60 80 100120140
Tiempo (segundos)

Figura 9. Grfica concentracin vs tiempo a 70 Grados Centgrados

Temperatur
Actividad
a
Enzimtica
(micromolar/segund
o)
25
2,6635
35
3,1365
50
1,9587
70
0,0794
Tabla 10. Valores de actividad enzimtica a diferentes temperaturas

Actividad Enzimtica
3.5
3
2.5
2

Actividad Enzimtica

1.5
1
0.5
0
20

30

40

50

60

70

80

Temperatura

Figura 10. Grfica de Actividad Enzimtica a diferentes temperaturas

5. DISCUSIN

Medicin de la actividad difenolasa

Como afirma (Muoz, 2012), La difenolasa es una enzima monomrica con forma elipsoidal
cuyo centro activo est formado por un haz de cuatro hlices alfa y por lminas beta. Cada uno
de los tomos de cobre est coordinado por tres residuos de histidina.
Variacin del sustrato
Segn Prez & Ortiz, (2010) si el PH y la temperatura de un sistema enzimtico se mantiene
constante pero hay exceso de substrato, la intensidad de la reaccin es directamente proporcional
a la cantidad de enzima presente. Los datos obtenidos en la prctica nos indic que a diferentes
concentraciones la variacin del sustrato surge conforme iba avanzando la reaccin en la que
poco a poco fue sus absorbancias primero se incrementaron y luego fueron disminuyendo, lo que
explica que el sustrato empez a reaccionar con la enzima y conforme transcurra el tiempo
empez transformarse a producto y poco a poco la velocidad empez a disminuir. Los velocidad
mxima obtenida fue de 71,9424 uM/seg que es directamente proporcional a la cantidad de la
enzima lo que nos indica que hubo una buena actividad enzimtica.
Inhibicin Enzimtica
Como afirma Martnez. (2006) el cido cinmico se ha caracterizado como un inhibidor no
competitivo de la tirosinasa de champin, donde ste ocupa el siti activo de la enzima,
estorbando al sustrato bloqueando la reaccin. En los resultados obtenidos en la prctica realizada
se comprob la accin del cido cinmico frente a la enzima tirosinasa con el grfico de DixnWebb, donde se evidenci que sus pendientes eran diferentes, haciendo que su velocidad mxima
se altere disminuyendo conforme se aumente el inhibidor alterando el avance de la reaccin.
Efecto de la temperatura
Segn (Campbell, 2007) una reaccin enzimtica se incrementa al aumentar la temperatura, sin
embargo, por encima de cierta temperatura la velocidad de la reaccin enzimtica cae
abruptamente. En la prctica realizada se comprob como la temperatura influye sobre la
velocidad de la reaccin y constatamos gracias a la grfica observa que la temperatura ptima de
la tirosinasa es 35 Grados Centgrados.

6. CONCLUSIONES
Se modific la actividad enzimtica de la enzima tirosina presente en una muestra de
champin a travs de varias practicas donde se observaros los factores que pueden influir
en la velocidad de reaccin
Se determin la velocidad mxima y la constante de Michaelis-Mentel a partir de la
variacin del sustrato conociendo que a diferentes concentraciones la actividad de la
enziva puede variar.
Se determin la influencia del cido cinmico como un inhibidor enzimtico en la
reaccin evidenciando como las pendientes obtenidas eran diferentes y comprobando que
puede afectar en la velocidad de la reaccin.
Se observ la influencia de la temperatura comprobando que cuanto mayor es la
temperatura, mayor es la velocidad de reaccin hasta llegar a la temperatura ptima
alrededor de los 35C, por medio de la cual se llega a conocer la temperatura a la que la
enzima acta con mxima eficacia.

7. RECOMENDACIONES
Se recomienda en la prctica de variacin del sustrato realizarlo rpidamente al momento de
llevarlo al espectrofotmetro debido a que la solucin contina con su reaccin donde el sustrato
se est degradando por lo que los resultados se pueden alterar.
Se recomienda revolver la solucin con la pipeta al momento de colocar en la celda para su
lectura en el espectrofotmetro para que la solucin se encuentre bien homogenizada y no se
altere los productos.
Se recomienda medir la actividad enzimtica a varias temperaturas con el fin de facilitar la
determinacin de la temperatura ptima a la cual la enzima trabaja.

8. ANEXOS

Figura: En la Variacin del sustrato se observa diferente coloracin de la solucin debido a la

oxidacin, y a la degradacin de la enzima

Figura: En la Inhibicin enzimtica con cido cinmico se observa diferente coloracin de la

solucin debido a la oxidacin, y a la degradacin de la enzima.
9. BIBLIOGRAFA
1. J, Prez & C, Ortiz. (2010). Factores que intervienen en la Actividad enzimtica. 3ra
Edicin. Editorial Barcelona. Madrid-Espaa. Pg. 123-125.
2. E, Martnez. (2006). Inhibidores Enzimticos competitivos y no competitivos. 1ra Edicin.
Editorial Editorial San Agustn. Mxico-D.F. Mxico Pg. 35-36

3. Muoz J., 2012, Caracterizacin cintica de la catlisis, inactivacin suicida e inhibicin

irreversible de la tirosinasa. Universidad de Murcia
4. Campbell, N. (2007). Biologia. Espaa: Editorial Medica Panamericana. pag154