Pontificia Universidad Catlica de Chile

Facultad de Ciencias Biolgicas

Departamento de Gentica Molecular y Microbiologa
Biologa de Microorganismos
BIO 151E

Informe N2:
Anlisis e Identificacin de Bacterias, Virus
Bacterifagos, Hongos y Levaduras, Movilidad de
Material Gentico Bacteriano por Conjugacin,
Transposicin y Transduccin

Nombre: Cristbal Mahias

Profesor: Dr. Bruno Tesser
Ayudante: Isidora Suazo
Seccin: 1
Mesn: 1
Grupo: 1
Fecha de entrega: 31 de Mayo 2016

Introduccin
En estos tres prcticos, se cubrieron tres grupos de entidades biolgicas importantes:
Bacterias, virus y hongos o fungi. Estos tres grupos resultan particularmente importantes
ya que los tres contienen patgenos para el ser humano, a pesar de sus diferencias entre
s (1). Los prcticos hechos se enfocaron en la identificacin y caracterizacin de estos
elementos, y en el caso de virus y bacterias la interaccin entre ellos.
Las bacterias utilizadas, aparte de las desconocidas obtenidas mediante muestras de los
alumnos, fueron Salmonella typhimurium (S. typhimurium) y Escherichia coli (E. coli). La
primera es parte de un amplio gnero de bacilos Gram-negativos flagelados y
anaerbicos, conocidos por provocar infecciones intestinales de variable intensidad,
dependiente de la especie (2). La S. typhimurium tendr la particularidad que ser capaz
de causar estas infecciones en humanos, otros mamferos, e incluso aves y reptiles (3).
La E. coli es otro bacilo Gram-negativo anaerbico del tracto intestinal, con gran variedad
de cepas tanto patognicas como inofensivas (4).
Una de las particularidades de la E. coli, que fue de importancia en los prcticos, es su
alta capacidad de conjugacin (5). La conjugacin es una de las formas en que el DNA
bacteriano es capaz de moverse entre distintos organismos, que consiste en la
transferencia de material gentico, en forma de plsmidos o hasta porciones de un
cromosoma, a travs de contacto directo entre dos bacterias, no necesariamente de la
misma especie (6).
La conjugacin es una de varias formas de movilidad que tiene el DNA bacteriano, de las
cuales dos ms fueron vistas en los prcticos: Transposicin y transduccin. La
transposicin consistir en el movimiento de un gen particular especializado, llamado
transposn, entre diferentes lugares de un cromosoma, entre cromosomas distintos, e
incluso entre cromosoma y plsmido (7), mientras que la transduccin ser el movimiento
de DNA bacteriano de una clula a otra a travs de un virus que haya adquirido parte del
material gentico de la bacteria durante su ciclo reproductivo (8). Estos tres mtodos de
movimiento gentico harn que genes de varias clases, especialmente genes de
resistencia a amenazas como antibiticos, puedan trasladarse entre distintos individuos, e
incluso distintas especies.
Esto lleva al tema de los virus utilizados en el laboratorio, los cuales fueron cepas de un
bacterifago particular, el P22. Este bacterifago tiene como blanco original al gnero
Salmonella, por ende su utilizacin en este caso, pero cepas de ste han sido usadas con
otras bacterias incluyendo E. coli para transducciones controladas y especializadas, con
tal de editar genticamente ciertos cultivos bacterianos (9). Si no se utilizan cepas
especializadas para ello, el P22 simplemente lisar la Salmonella como parte de su ciclo
reproductivo.
Finalmente, se llega a los hongos utilizados durante los prcticos, que se dividirn en dos
categoras: Levaduras, y hongos filamentosos. Las levaduras utilizadas fueron
Rhodotorula, Cryptococcus y Candida albicans (C. albicans). Rhodotorula es un gnero
relativamente pequeo de levaduras presentes en el ambiente, pero contiene especies
capaces de causar enfermedades en pacientes con el sistema inmunolgico dbil, debido
a su capacidad de formar colonias en la sangre de la persona (10). C. albicans estar
presente en forma limitada en la flora microbiana normal, pero si se le permite crecimiento

descontrolado generar infecciones genitales en mujeres, e infecciones nasofarngeas en

las personas en general (11). Y Cryptococcus es un gnero de levaduras, capaces de
formar cpsulas similares a las bacterianas, que contiene varios patgenos para el ser
humano. El ms importante y conocido de estos ser el Cryptococcus neoformans, cuyas
infecciones suelen generar neumonas, y en descontrol puede llegar a causar una grave
meningitis (12).
Finalmente, estn los hongos filamentosos usados en los prcticos: Mucor, Aspergillus
niger (A. niger) y Penicillium notatum (P. notatum). Mucor es un hongo saprfito,
omnipresente en el ambiente, que puede causar enfermedades en pacientes con el
sistema inmune particularmente debilitado, causadas por la inhalacin de sus esporas,
que luego crecern dentro de las mucosas del paciente (13). A. niger tendr efectos
similares, causando infecciones de gravedad a personas con un sistema inmune
suprimido o debilitado, en las cuales las esporas inhaladas invaden los pulmones de la
persona afectada y crean colonias en ellos (14). Finalmente, se tiene a P. notatum, hongo
conocido por su capacidad de producir el antibitico penicilina, el primer antibitico usado
como tal. ste tambin produce compuestos alergnicos capaces de provocar reacciones
mortales en personas alrgicas a la penicilina (15).

Objetivos
1) Identificar organismos microscpicos y macroscpicos, y/o sus partes, mediante
microscopa.
2) Identificar muestras de bacterias desconocidas mediante pruebas bioqumicas.
3) Aprender sobre los virus bacterifagos y sus efectos sobre bacterias ya conocidas.
4) Familiarizarse con los diferentes mtodos de transferencia de DNA entre bacterias,
sus caractersticas y sus efectos.
5) Observar y aprender de la morfologa de las levaduras, y de la anatoma y
caractersticas macro- y microscpicas de los hongos filamentosos

Mtodos
Durante los pasos prcticos tres y cinco, se siguieron los pasos de la Gua de Trabajos
Prcticos (16), a excepcin de lo siguiente:
-Durante la tercera experiencia, solo se someti la muestra nasofarngea a tests de
catalasa y coagulasa. Las otras dos, la muestra dental y la muestra lingual, no fueron
testeadas as.
-En la tercera experiencia, se realizaron tres tinciones de Gram y anlisis microscpicos
en vez de uno. Como la muestra nasofarngea tuvo dos tipos de colonias, ambos fueron
analizados microscpicamente, junto con la muestra dental. La muestra lingual no fue
sometida a tincin ni microscopa.
-En la tercera experiencia no se realiz la batera bioqumica convencional.
-En la tercera experiencia no se utiliz agar McConkey.
-Durante las tinciones, se aplicaron tanto el lavado con alcohol-acetona como ambos
lavados con agua por el lado del portaobjetos opuesto al inoculado con bacterias, con tal
de evitar que fueran arrastradas.
Para el cuarto paso prctico, se siguieron los pasos de una gua de trabajos aparte,
proveda al comienzo de la actividad.

Materiales
-Tubos de cultivo con cultivos lquidos de Salmonella typhimurium Wild-Type y 14028s
aroA::Kn, y E. coli DH5 pir::Amp.
-Placas de Petri con medios de cultivo slido: Agar corriente, agar sangre, agar
McConkey, agar Evans Blue, agar LB:Amp y agar Cm:Kn.
-Placas de Petri con cultivos de Rhodotorula, Cryptococcus, C. albicans, Mucor, A. niger y
Penicillium notatum.
-Cultivos in vivo de Mucor, A. niger y Penicillium notatum, con cubreobjetos respectivos
-Tubos de Eppendorf con cultivos lquidos de fagos P22, H5, MudJ, P22/pkkGFP y uno
desconocido.
-Tubo de Eppendorf con cultivo lquido de bacteria desconocida (para identificacin por
api 10S)
-Tubos de ensayo con Agar blando
-Tubos de caldo LB
-Asas de platino
-Pipeta de 1000 l
-Pipeta de 200 l
-Puntas de pipeta de 1000 y 200 l
-Pipetas Pasteur con gomas
-Mechero encendido
-Lpiz permanente para rotular
-Cinta adhesiva
-Aceite de Inmersin
-Catalasa
-Coagulasa
-Cartn rotulado para prueba de Coagulasa
-Microscopio
-Papel de limpieza para microscopio
-Botella de Alcohol-Acetona
-Agua
-Set de testeo api 10S
-Safranina
-Fucsina
-Portaobjetos limpios
-Microscopio
-Alcohol
-Tinta China
-Cristal Violeta
-Lugol
-Azul de Lactofenol
-Cubreobjetos

Resultados
En la tercera experiencia, se examin una serie de muestras de microorganismos,
obtenidas de distintas partes del cuerpo humano y cultivadas por dos semanas, bajo el
microscopio. De stas, se observaron las siguientes caractersticas microscpicas (Tabla
I):
Tabla I. Caracterizacin Microscpica de Muestras Corporales

Muestra
Afinidad Tintorial
Morfologa
Agrupacin

Nasofarngea
Colonias Blancas
Colonias Opacas
Gram negativo
Gram positivo
Cocceas
Cocceas
Racimos de gran Racimos de gran
tamao
tamao

Dental
Gram positivo
Cocceas
Racimos
pequeos

La caracterizacin macroscpica de los cultivos hechos durante la experiencia tres

despus de dos semanas de incubacin, junto con la caracterizacin bioqumica de las
colonias opacas de la muestra nasofarngea, se observan a continuacin en la Tabla II:
Tabla II. Caracterizacin Macroscpica de Muestras Corporales

Muestra

Nasofarngea
Colonias
Colonias
Blancas
Opacas
Tipo de Hemlisis Inobservable

en Agar Sangre
Forma de Colonia
Amorfa,
Puntiforme
redondeada y
con formacin
tubular
Elevacin
de Amorfa
Convexa
Colonia
convexa
Coloracin
de Blanco intenso, Blanco opaco,
Colonia
con formacin con tono caf
tubular
griscea
Test de Catalasa
No aplicado
Positivo
Test de Coagulasa No aplicado
Negativo

Dental

Lingual

Ninguna

Puntiforme

Puntiforme

Convexa

Convexa

Caf verdoso

Blanco con tono

caf

No aplicado
No aplicado

No aplicado
No aplicado

En la Tabla III, se pueden observar los resultados del test api 10S con la bacteria no
identificada, hecho durante la tercera experiencia:
Tabla III. Resultados del api 10S

Test
Resultado

ONPG GLU ARA LDC ODC CIT H2S URE TDA IND OX NO2
+
+
+
+
+
+
+

Los resultados de la determinacin del ttulo viral en agar blando, cultivados en la cuarta
experiencia, se pueden observar en la Tabla IV:
Tabla IV. Determinacin de Ttulo Viral

Nivel
de 10^-1
Dilucin
Presencia de Ninguna
Placas de Lisis

10^-2

10^-3

10^-4

10^-5

10^-6

Ninguna

Ninguna

Ninguna

Ninguna

Ninguna

Fago
Desconocido
Ninguna

La caracterizacin de los cultivos hechos en agar Evans Blue en la cuarta experiencia,

con tal de observar el metabolismo bacteriano bajo la influencia de virus, se observa a
continuacin en la Tabla V:
Tabla V. Prueba de Metabolismo Bacteriano con Bacterifagos

Bacterifago
Caracterizacin de Colonia

P22
H5
Puntiforme, puntos grandes Puntiforme, puntos grandes
y verdes
y verdes

Durante la cuarta experiencia, se llevaron a cabo tres pruebas relacionadas con la

transferencia de material gentico entre bacterias, y entre bacterias y virus, cuyos
resultados se pueden ver a continuacin en la Tabla VI:
Tabla VI. Pruebas de Transferencia y Modificacin de DNA

Mtodo
de Transduccin
Transferencia
de
DNA
Investigado
Agar Usado
LB:Amp
Cultivo
S. typhimurium
Wild-Type
+
fago
P22/pkkGFP
Crecimiento
Ninguno

Conjugacin

Insercin Viral de
un Transposn

Cm:Kn
S. typhimurium E.
coli Mezcla
14028s
DH5
ambos
aroA::Kn
pir::Amp
Ninguno

Ninguno

Ninguno

McConkey
de S.
typhimurium
Wild-Type + fago
MudJ
Ninguno

En la quinta experiencia, se llev a cabo una caracterizacin tanto microscpica como

macroscpica de una serie de levaduras. Los resultados de esta caracterizacin se ven a
continuacin en la Tabla VII:
Tabla VII. Caracterizacin de Levadura

Levadura
Forma de Colonias

Rhodotorula
Forma
de
lquido
derramado
y
puntiformes
pequeas
Borde de Colonia
Amorfo,
pero
definido
Elevacin
de Convexa
Colonia
Coloracin
de Rosado intenso
Colonia
Cpsulas
No
Agrupacin
Grandes
racimos

C. albicans
Puntiformes
pequeas

Cryptococcus
Puntiformes de
mayor tamao

Definido

Definido

Plana

Plana

Blanco

Blanco

No
Racimos
pequeos

Si
Racimos
pequeos

Durante la experiencia 5, se caracterizaron colonias de tres hongos filamentosos, tanto en

agar como en cultivo in vivo, y tanto macro- como microscpicamente. Los resultados de
esta caracterizacin se pueden ver en la Tabla VIII:
Tabla VIII. Caracterizacin de Hongos Filamentosos

Hongo
Color anverso
Color reverso

Aspecto de superficie al anverso

Aspecto de superficie al reverso

Tipo de hifas
Estructuras de Reproduccin

A. niger
Caf oscuro

Mucor
Blanco

P. notatum
Verde,
con
borde blanco
Amarillo,
con Blanco,
con Amarillo claro
un
punto punto
central
central negro
verde
Conjunto denso Algodonoso
Montculo
de
de pelos cortos
pelo
corto
aterciopelado
Red de pelo Algodonoso
Correoso y liso
extendindose
desde el centro
Septadas
Aseptadas
Septadas
Conidios
Esporangios
Conidios

Discusin
Para las muestras corporales, comenzando por las no-nasofarngeas, los resultados
observados (Tabla II) (se formaron colonias altamente visibles) eran esperables, ya que la
boca posee flora bacteriana particularmente activa. Los resultados microscpicos (Tabla I)
para la muestra dental tambin son esperables; las cocceas son una porcin significativa
de todas las bacterias que se pueden encontrar en la boca humana (17). Respecto a la hemlisis observada para la muestra dental, sta se puede deber a la presencia de varias
cocceas, una de las cuales es el Streptococcus sanguinis (S. sanguinis). Esta bacteria
es parte normal de la flora bacteriana bucal, y se caracteriza por formar colonias que
causan esta clase de hemlisis (18).
Para las colonias no-blancas de la muestra nasofarngea, se vuelve a aplicar lo anterior:
Parte importante de la flora bacteriana bucal sern cocceas, las cuales pudieron ser
observadas al microscopio. Sin embargo, debido al hecho que el rea nasofarngea es
compartida con las vas respiratorias, y sabiendo que la persona de la cual fue obtenida la
muestra haba sufrido una sinusitis intensa en semanas anteriores al prctico, es posible
que la bacteria observada haya sido Staphylococcus aureus (S. aureus), un conocido
patgeno respiratorio. El hecho que la hemlisis observada haya sido tipo apoya esta
posibilidad (19), junto con el hecho que el test de catalasa haya dado positivo. Sin
embargo, el test de coagulasa dio negativo, lo cual bajo condiciones normales debera
descartar el S. aureus, a menos que el test de coagulasa haya fallado (lo cual es posible,
ya que se coment durante la experiencia que los tests de coagulas rara vez funcionaban
correctamente).
Sin embargo, no se logr identificar la bacteria responsable por las colonias blancas de
mayor tamao y estructura diferente al resto. La distribucin de las bacterias observadas
(Tabla I), aparentes cocceas, es tpica de estafilococos, pero el resultado de la tincin
indic que era un microorganismo Gram-negativo, lo cual sera imposible debido a que el
gnero Staphylococcus es Gram-positivo en su totalidad (20). Por ende, existen dos
posibilidades: Ocurri un error de tincin, y esto sera un estafilococo comn (debido a lo
mencionado anteriormente, posiblemente S. aureus), o la tincin fue hecha
correctamente, y esto era en realidad una colonia de levaduras sin identificar, cuya
membrana se ti como si perteneciera a una bacteria Gram-negativa.
Los resultados del api 10S (Tabla III) fueron examinados durante el prctico, y el test en
cuestin dict que la bacteria a la que se le aplic el test era, con un 99,5% de certeza,
Klebsiella oxytoca (K. oxytoca). Esta bacteria Gram-negativa suele encontrarse en el
intestino humano sano, pero puede tener una relacin con ciertos casos de colitis
hemorrgica, enfermedad que suele ser causada por Clostridium dificile cuando sta
crece fuera de control despus de aplicacin de antibiticos (21).
Los resultados de la determinacin de ttulo viral (Tabla IV) indicaron que en ninguno de
los casos, incluyendo el fago no identificado, ocurri la infeccin viral buscada sobre S.
typhimurium. Las bacterias colonizaron el agar con tal efectividad que, en vez de colonias
observables, formaron una capa uniforme sobre toda la superficie del plato. Una posible
explicacin para esto es la alta sensibilidad de los virus a los cambios de temperatura, y a
las temperaturas altas en general. El lmite de temperatura al cual las protenas del fago
P22 usado en este experimento es de 40C (22), los cuales fcilmente pueden haber sido
alcanzados por el agar semislido todava caliente, despus de ser vertido sobre las

placas de Petri. Debido a la urgencia con que se hizo este paso, es probable que no se
haya enfriado el agar lo suficiente como para que sobrevivieran los fagos.
Los resultados de la determinacin de metabolismo bacteriano (Tabla V) ofrecieron
resultados exactamente iguales para ambos fagos. Esto no corresponde, debido a que se
utilizaron dos cepas distintas del fago P22 (una normal, y otra conocida como H5). En
agar Evans-Blue, las bacterias lisadas dejan marcas verde oscuro, que crecen en tamao
mientras ms clulas lisadas existan en la placa, por lo que un fago menos peligroso para
la bacteria llevar a marcas ms pequeas y ms claras en el agar (23). Esta
discrepancia puede ser explicada por el hecho que se dejaron cultivar ambos platos por
ms tiempo del que corresponda (tres semanas en vez de dos), por lo que el P22, que es
menos virulento y por tanto lisa menos clulas, tuvo ms tiempo para reproducirse y lisar
las clulas del agar, llevando a la ecualizacin vista.
Para las pruebas de transferencia y modificacin de DNA (Tabla VI), ninguna de las
bacterias fue capaz de crecer en las placas de Petri en las cuales fueron cultivadas. Para
el caso de la conjugacin, en teora el traspaso de plsmidos de resistencia a antibiticos
entre E. coli y S. typhimurium debera haber llevado a cepas de ambas bacterias con las
resistencias combinadas de ambas. Sin embargo, es posible que los antibiticos
presentes en las placas simplemente hayan eliminado las bacterias antes que pudieran
intercambiar plsmidos. Cabe observar que la kanamicina es un antibitico
particularmente efectivo, cuyo efecto primario sobre las clulas (unin irreversible con la
unidad ribosomal) no es el nico efecto daino que posee; los efectos secundarios
pueden haber sobrepasado la capacidad de las bacterias, y haberlas eliminado
igualmente (24).
Algo similar a lo anterior puede haber ocurrido en el caso de la transduccin
especializada, lo cual significara que la ampicilina presente en la placa elimin la
Salmonella antes que pudiera ser infectada por el fago. Sin embargo, tambin existe la
posibilidad que el que haya fallado en este caso sea el virus. ste portaba el gen de
resistencia necesario para la sobrevivencia de la bacteria, por lo que si el fago no
sobreviviese, tampoco lo hara la bacteria. Conociendo la sensibilidad del P22 a las
temperaturas altas (25), es posible que las herramientas con las cuales se sembr la
mezcla no hayan estado suficientemente fras como para que sobreviviera al proceso (el
asa de platino se desinfecta con mechero, y la pipeta usada para sembrado tipo csped
debe ser deformada con el mechero para ser usada). Sin embargo, para el caso de la S.
typhimurium y el fago MudJ, no existe esta excusa, ya que la Salmonella es capaz de
crecer en agar McConkey en su estado original. Por ende, en este caso es posible que el
sembrado simplemente haya sido hecho de manera incorrecta.
En las caracterizaciones de hongos (Tabla VII, Tabla VIII), se observaron todas las
caractersticas que se esperaban, tanto en las colonias de levadura como en los hongos
filamentosos. Para las levaduras, Rhodotorula tena las colonias de rosado intenso con las
caractersticas esperables (26), Cryptococcus y C. Albicans mostraron colonias blancas
puntiformes, Cryptococcus tena cpsulas y las tres tuvieron un perfil microscpico similar,
como corresponda (27). Por su parte, los hongos filamentosos Mucor, A. niger (28) y P.
notatum (29) mostraron las caractersticas micro- y macroscpicas esperables.

Conclusin
Los objetivos relacionados con el aprendizaje e identificacin de organismos fueron, en
general, cumplidos. Casi todas las pruebas bioqumicas fueron hechas correctamente, y
entregaron resultados realistas y precisos por ello. Todas las identificaciones de
organismos (tanto microscpicos como macroscpicos) por microscopa entregaron los
resultados esperados, y en los casos de bacterias desconocidas entregaron resultados
razonables, a excepcin del caso de las colonias blancas de la muestra nasofarngea. Sin
embargo, lo encontrado en estas colonias fue una situacin completamente fuera de
contexto a lo esperado, por lo que es natural que esta identificacin fuera de protocolo
haya fallado.
Por otro lado, todos los tests relacionados con virus y movimiento de material gentico
fracasaron, y con ellos sus objetivos relacionados. No se logr obtener ninguno de los
resultados esperados, y el nico test que inicialmente podra haber entregado resultados
utilizables perdi esta capacidad por un tiempo excesivo de incubacin. En todos los
dems casos, por errores cometidos durante la experiencia, los fagos y/o las bacterias
fueron incapaces de sobrevivir al sembrado y proliferar, y por lo tanto no ocurri ninguno
de los casos de inters.
En conclusin, la mayor parte de los objetivos se pudo cumplir de manera satisfactoria, al
haber aprendido y observado lo que se deseaba, pero los objetivos que proponan
aprender de virus y movimiento de material gentico fueron casi completamente
incumplidos debido a mltiples errores durante y despus del prctico.

Bibliografa
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