1.

INTRODUCCION:
En el presente trabajo explicaremos los conceptos bsicos sobre el tema
Cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC) , empezando desde sus inicios,
hasta llegar alta cromatografa liquida de alta resolucin , luego veremos sus
principales componentes sus aplicaciones y terminaremos el trabajo con unas
pequeas conclusiones.
Esta tcnica permite la separacin de componentes estrechamente relacionados
en mezclas complejas. La cromatografa en sus orgenes era exclusivamente
una tcnica de separacin que se transform en tcnica de anlisis cuando se
acoplo con un dispositivo para monitorear las especies qumicas que se iban
separando. As la cromatografa se ha convertido en un mtodo analtico de
primer orden para separar, identificar y cuantificar los compuestos presentes en
muestras liquidas o gaseosas (para muestras solidas se requiere una etapa de
disolucin o extraccin).

2. Objetivos

Aprender y dar a conocer los procesos de una cromatografa liquida de

alta resolucin y sus diferentes tipos.

Conocer la funcionalidad de las diferentes partes del equipo.

Analizar las ventajas y desventajas que tiene el uso de un Cromatgrafo

y ver cules son sus respectivas aplicaciones.

3. Antecedentes:
La cromatografa de lquidos de alta resolucin, es un modo de cromatografa
en la cual el proceso de separacin y transferencia de masa es entre la fase
estacionaria y la fase mvil y una temperatura dada.
3.1 Invencin:

Mijal Tsvet emple por primera vez en 1906 el

trmino "cromatografa". A comienzos del ao 1903,
Mijal Tsvet, botnico ruso, logr separar una mezcla
de pigmentos de plantas (clorofilas) en una columna
de carbonato de calcio. Ms tarde, en 1910,
cromatografi un extracto de yema de huevo en una
columna
embargo,

de

inulina.

no

fueron

Sus

investigaciones,

utilizadas

por

sin
otros

investigadores hasta 1931. Esta demora quiz se

debi al hecho de que los trabajos de Tsvet fueron
publicados en ruso y en una revista que no tena
amplia circulacin.

3.2 Avances:
En 1959, introdujeron una nueva tcnica llamada cromatografa de
filtracin de gel. Esta se ha convertido en una poderosa y nueva
herramienta para la separacin de sustancias de alto peso
molecular, particularmente las protenas, y ha encontrado muchas
aplicaciones en los campos de la bioqumica, la medicina, la
fisiologa yla biologa. La mayora de las tcnicas de filtracin en gel
utilizan columnas y recientemente se han hecho trabajos con una
combinacin de filtracin en gel y materiales de intercambio inico,
logrando que las separaciones complejas sean extremadamente
rpidas y eficientes.

3.3. Aparicion
Los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en
el Mercado a mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografa
lquida de alta resolucin (HPLC High Performance Liquid
Chromatography, en ingls) comenz a desarrollarse en los
aos 1960, aumentando su importancia en las dcadas
siguientes, hasta convertirse en la tcnica cromatogrfica ms
empleada. Sin embargo esto se ir modificando con el paso de
los aos.

4.

Cromatografa:

La cromatografa es esencialmente un mtodo fsico de separacin en el que los

componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una inmvil (lecho
estacionario), y otra mvil (fase mvil) la cual percola a travs de la primera. El
proceso cromatogrfico se da como resultado de repetidos procesos de sorcindesorcin durante el movimiento de los componentes de la mezcla arrastrados
por la fase mvil a lo largo del lecho estacionario (elucin), producindose la
separacin debido a las diferencias en las constantes de distribucin de los
componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la mvil. A la distribucin
final de los componentes en funcin de su posicin sobre el lecho estacionario,
o del tiempo en que eluyen se le denomina cromatograma.
Prcticamente no existen restricciones sobre la naturaleza de las fases a utilizar,
siempre que la fase estacionaria sea slida o lquida y la fase mvil lquida o
gaseosa, por lo que es posible, en principio, realizar por medio de estas tcnicas
3

la separacin de los componentes de cualquier mezcla. Por otra parte, la

utilizacin de las tcnicas cromatogrficas no esta exenta de dificultades,
debido fundamentalmente a la gran cantidad de parmetros que pueden influir
en el proceso de separacin, lo cual dificulta la eleccin de las condiciones
ptimas de separacin y en muchas ocasiones implica la irreproducibilidad de
los resultados. Por ello la cromatografa no es una tcnica de rutina que pueda
aplicarse sin ms a cualquier mezcla, sin invertir en muchos casos gran cantidad
de esfuerzo y tiempo.

5.

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION

La cromatografa liquida de alta resolucin se encuadra dentro de la

cromatografa de elucin. En esta, un lquido (fase mvil) circula en intimo
contacto con un slido u otro liquido inmiscible ( fase estacionaria); al introducir
una mezcla en substancias (analitos) en la corriente e fas mvil, cada analito
avanzara a lo largo el sistema con una velocidad diferente que depender e su
afinidad por cada una de las fases. Esto supone que despus de terminado el
recorrido de la muestra por la columna, cada una de las substancias introducidas
en el sistema eluiria con un tiempo diferente, es decir estarn separadas.

5.1

TIPOS

DE

CROMATOGRAFIA

LIQUIDA

DE

ALTA

RESOLUCION
5.1.1 Cromatogrfica de particin:
Se trata probablemente del tipo ms usado de cromatografa lquida de alta
resolucin. En ella se considera tanto el uso de fases lquidas retenidas sobre un
soporte slido como el de fases enlazadas unidas qumicamente al soporte
slido. La separacin de los solutos se basa en la diferente solubilidad entre las
fases mvil y estacionaria. En general la fase estacionaria debe tener polaridad
semejante a la de los analitos y la fase mvil se escoge de diferente polaridad
(aunque no tan diferente que el tiempo de retencin sea excesivamente largo).
Suele hablarse de dos tipos de cromatografa de particin:
a) Cromatografa en fase normal:
Emplea fases estacionarias polares y la mvil es poco polar.
4

b) Cromatografa en fase inversa:

La fase estacionaria es apolar y la fase mvil polar. En ella los compuestos
polares son eludo ms rpido que los apolares, al contrario que en
cromatografa en fase normal. Actualmente es la ms utilizada.
La fase estacionaria ms usada es gel de slice (polar) modificado para variar
sus caractersticas, reteniendo lquidos o fases enlazadas de diferente polaridad.
Una vez fijada la fase estacionaria las caractersticas de la fase mvil son el
factor clave de la separacin cromatogrfica. Las fases mviles se caracterizan
por los su capacidad de desplazamiento y selectividad. En fase normal los
disolventes polares eluyen ms rpidamente (tienen mayor capacidad de
desplazamiento) mientras que en fase inversa es al revs. La selectividad se
basa en las interacciones especficas entre el soluto y la fase mvil. Puede
emplearse elucin isocrtica o en gradiente.
La aplicacin tpica de la cromatografa de reparto es la separacin y
determinacin de compuestos orgnicos. En medio ambiente son especialmente
destacables las determinaciones de residuos de plaguicidas (herbicidas,
fungicidas e insecticidas), fenoles, e hidrocarburos (PCBs, PAHs, etc). Un tipo
particular de cromatragrafa de reparto en fase inversa es la:
c) Cromatografa de pares inicos.
Se emplea para la separacin y determinacin de especies inicas voluminosas.
La fase mvil est formada por una disolucin acuosa que contiene cierta
proporcin de un disolvente orgnico miscible (ej: acetonitrilo o metanol) y un
compuesto inico que aporta un contrain de carga opuesta a los analitos. Este
in se combina con los analitos formando un par inico, que es una especie
neutra que puede interaccionar y ser retenida por la fase estacionaria
apolar.Suele emplearse, para la determinacion de iones grandes como los
surfactantes.Tambien ha ofrecido buenos resultados para iones como Nitrato
(NO3) y clorato (CO3).

5.1.2 Cromatografa de adsorcin

En la cromatografa de adsorcin el relleno slido de la columna acta como
fase estacionaria. Las fases estacionarias tpicas son slice y almina ambas
polares. Como la fase estacionaria es polar suelen emplearse fases mviles
apolares o moderadamente polares. Para seleccionar la fase mvil suele
considerarse no slo la polaridad sino tambin la fuerza eluyente, que es un
parmetro relacionado con la energa de adsorcin del disolvente por unidad de
superficie (parmetro que tambin depende del adsorbente). Las fases tpicas
son hexano, isooctano y diclorometano. La seleccin es emprica y es frecuente
el empleo de mezclas. Esta cromatografa es menos usada que la de reparto.

5.1.3 Cromatografa de exclusin por tamaos

Se denomina tambin cromatografa en geles permeables, de filtracin en geles
o de exclusin molecular. Los rellenos estn constituidos por pequas
partculas polimricas que contienen una red de poros en la que pueden
difundir las molculas de soluto y disolvente. La base de la separacin es la
capacidad del soluto para penetrar en los poros de la fase estacionaria. Las
molculas con un tamao significativamente menor que el de los poros
atraviesan la columna entera sin ser retenidos. Los solutos demasiado grandes
como para penetrar en los poros tampoco resultan retenidos. En cambio las
molculas de tamao intermedio se separan en funcin de su tamao. Este tipo
de cromatografa se aplica para la separacin de especies de elevado peso
molecular (polmeros y biomolculas como las protenas).

5.1.4 Cromatografa inica

En cromatografa inica se emplean cambiadores de iones como fases
estacionarias. Los cambiadores de iones son redes tridimensionales de
macromolculas con ciertas cargas electrostticas fijas por unidad estructural.
Pueden tomar iones de una disolucin electroltica y ceder otros de la misma
carga en cantidad equivalente. Por lo tanto, los procesos de intercambio inico
se basan en los equilibrios de intercambio entre los iones de una disolucin y
los iones del mismo signo que se encuentran retenidos sobre la superficie de
un slido insoluble de elevada masa molecular (cambiador de iones):

Se trata de un equilibrio heterogneo. La constante que rige este equilibrio se

B

llama coeficiente de selectividad y se suele representar como EA . Cuanto

B

mayor es el valor de EA tanto mayor ser la afinidad de B por el cambiador

inico comparada con la de A. Para facilitar la comparacin entre distintos
iones suele usarse En general los iones de mayor carga y menor radio
hidratado son ms fuertemente retenidos.
Los rellenos de cambio inico empleados como fases estacionarias suelen ser
polmeros activados introduciendo en su estructura grupos funcionales
cargados, generalmente cidos o bsicos. Son frecuentes por ejemplo los
cambiadores con grupos -SO3-, -COO-, -NR4+.
La fase mvil en cromatografa de cambio inico suele ser una disolucin
acuosa (con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico
miscible con agua) que contiene especies inicas en forma, generalmente, de
disolucin reguladora del pH (variable clave en la elucin). Los iones de la fase
mvil compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria. Por
ello, la fuerza eluyente y la selectividad de la fase mvil dependen del tipo y
concentracin de iones aadidos.
La cromatografa inica tiene importantes aplicaciones en anlisis de aguas. La
determinacin de cationes funciona bien para alcalinos y alcalinoterros. Para
otros cationes la diferencia en los coeficientes de selectividad no es suficiente
para permitir la separacin directa y son necesarios otros mtodos como la
formacin de especies que si presenten ms diferencia. En cambio, para la
determinacin de aniones en aguas resulta uno de los mejores mtodos
posibles. Con cromatografa inica pueden determinarse los iones ms
habituales de forma mucho ms rpida que empleando mtodos individuales de
anlisis para cada uno.

a)

b)

VENTAJAS:
Ampliamente utilizado.
Fcil adaptacin alas determinaciones cuantitativas exactas.
Determinacin de compuestos no voltiles( alto peso molecular, iones
metlicos).
Aplicabilidad a sustancias de inters general (industria salud
medioambiente).
DESAVENTAJAS:
Instrumentacin costosa.
Dificultades en lo que se refiere a un anlisis cualitativo.
Elevado costo de operacin.
Requiere de una alta experiencia y conocimiento para su
funcionamiento.

6. Partes del cromatografo:

6.1.

Solventes

a) Eleccin del solvente

El solvente debe tener las siguientes caractersticas:
-

No degradar o disolver la fase estacionaria.

Tener baja viscosidad para reducir las cadas de presin.

Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia ptica (cuando se

usan detectores UV).

Se prefieren solventes de punto de ebullicin intermedio.

NOMBRE

MW

BP

I.R.

[C]

UV
[nm]

Viscosidad
[cP]

[Debye]

Acetonitrilo

41

82

1.341

195

0.358

3.37

Dioxina

88

101

1.421

215

1.26

0.45

Etanol

46

78

1.359

205

1.19

1.68

Metanol

32

65

1.326

205

0.584

1.66

Isopropanol

60

82

1.375

205

2.39

1.68

Tetrahidrofurano

72

66

1.404

215

2.20

1.70

Agua

18

100

1.333

185

1.00

1.84

10

b) Filtracin de solventes
Las partculas pueden ocasionar costosos daos a la bomba HPLC, al guarda
columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes
de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre
(0.45 o 0.22 micras) y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.
Se utilizan tres mtodos para la filtracin
-

Filtro a la Entrada del Solvente.

Filtracin al Vaco.

Filtracin en Lnea.

c) Desgasificacin de solventes
Su principal es erradicar los problemas que puedan causar.
-

El Oxgeno Disuelto puede producir mayor interferencia en los detectores

de fluorescencia y electroqumicos.

El Nitrgeno Disuelto es el otro componente de la atmsfera que puede

producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al
detector produce picos falsos y desviaciones de la lnea base.

El Dixido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los

cambios de pH en el sistema de solvente

Y para su desgasificacin se utiliza

-

Zonificacin.

Burbujear Helio.

Desgasificacin Electrnica en la Lnea del Flujo.

Desgasificacin al Vaco en Lnea.

Temperatura.

6.2.

Bombas

La misin de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos

de la fase mvil a travs de la columna, sin que el flujo sea influido por la presin
en cabeza de columna, ya que sta puede variar por obstruccin de las lneas
11

de conduccin, del filtro de la cabeza de la columna, etc.

Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes caractersticas:
-

Estar construido con materiales qumicamente inertes frente a la fase mvil.

Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.

Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un amortiguador

de stas, ya que las pulsaciones, aunque no afectan a la separacin en s,
pueden contribuir al ruido de fondo del detector y por lo tanto disminuir la
sensibilidad.

Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas. El rango

de caudales para las columnas que se utilizan habitualmente vara desde los
10 l/min hasta los 10 ml/min (columnas microbore, analticas y
semipreparativas).

El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que
de l depende la reproducibilidad de los tiempos de retencin.

6.2.1. Tipos de bombas

Una primera clasificacin de las bombas utilizadas en CLAE, se puede realizar

atendiendo a la fuerza motriz, as se tendrn:

a) Bombas neumticas:
Bombas

de

desplazamiento

directo.
Bombas

amplificadoras

de

aire

12

Bombas neumticas: (A) Bomba amplificadoras de aire. (B) Bomba de

desplazamiento directo.

b) Bombas de motor elctrico.

Bombas de jeringa.
Bombas alternantes (pistn o membrana).

13

En la actualidad las bombas ms utilizadas habitualmente son las de tipo

alternante y, por lo tanto, se har, en este caso, una breve descripcin de su
funcionamiento.
En toda bomba alternante se distinguen tres partes:
El motor.
El mecanismo de transmisin.
La cabeza de bomba.

El motor utilizado en este tipo de bombas es de tipo paso a paso, con lo que se
consigue un perfecto control de su velocidad, y del desplazamiento que ejerce
sobre el pistn.
14

El mecanismo de transmisin consiste en una excntrica, que transforma el

movimiento rotatorio del motor a un movimiento de va-y-ven del pistn.
La cabeza de la bomba es el compartimiento donde el pistn impulsa el lquido;
la direccin de flujo del lquido se controla por medio de vlvulas de direccin
nica (vlvulas de control).
Las variantes posibles de este tipo de bombas son muchas, as se pueden
encontrar bombas en las que el pistn es substituido por una membrana, bombas
que tienen doble pistn con funcionamiento recproco, bombas con dos pistones
en serie, etc.
En todos los casos, las bombas alternantes suministran un flujo pulsado de fase
mvil que, segn su diseo, sern de mayor o menor intensidad y que
normalmente ser necesario eliminar. Existen varios sistemas de amortiguacin
de los pulsos ("dmper") que proporcionan un caudal constante a travs de la
columna; en general, todos ellos se basan en situar a la salida de la bomba un
recipiente cerrado y elstico con capacidad para amortiguar los pulsos de presin
originados por el funcionamiento de la bomba.

6.2.2. Sistemas de mezcla de fase mvil

En cromatografa de lquidos, es posible trabajar en dos modalidades; isocrtico,
cuando la fase mvil mantiene la misma composicin durante la elucin, y en
gradiente, cuando la composicin de la fase mvil cambia segn una funcin
dependiente del tiempo.
Para trabajar en la modalidad de gradiente, es necesario que el equipo
cromatogrfico tenga un dispositivo capaz de realizar mezclas de disolventes
con un control preciso y reproducible.
Los dos principales mtodos de mezclado de los componentes de la fase mvil
se conocen como mezclado a alta presin y mezclado a baja presin.

a) Mezclado a alta presin

Este sistema de mezclado utiliza una bomba para cada uno de los disolventes
que se van a mezclar, estando la salida de cada bomba conectada a una
conexin en "T" o a una pequea cmara de mezcla. La denominacin de mezcla
15

en alta presin es debida a que la mezcla se realiza una vez que los disolventes
han pasado la bomba y, por lo tanto, han adquirido la presin de trabajo.
El mayor inconveniente de este sistema de mezcla, es el alto coste de las
bombas si se requieren mezclas con un porcentaje inferior a un 5 % de uno de
los componentes, ya que en este caso deben utilizarse bombas de alta precisin
y, adems, se necesita una bomba para cada uno de los disolventes a mezclar.
Como ventajas, se pueden sealar una buena reproducibilidad de las mezclas,
una rpida respuesta en los cambios de concentracin y, adems, la posibilidad
de utilizar cada una de las bombas por separado para trabajar con sistemas
isocrticos independientes.

b) Mezclado a baja presin

En los equipos de mezcla en baja presin, el mezclado de los diferentes
componentes se lleva a cabo antes de stos entren en la bomba (en la zona de
baja presin del sistema), controlndose el caudal del sistema cromatogrfico
por medio de una sola bomba. El mezclado de los componentes se realiza por
medio de vlvulas porcentuales controladas por rels, que estn calibradas para
dar la mezcla adecuada. El dispositivo de control simplemente abre cada vlvula
durante un perodo de tiempo adecuado, que ser funcin del porcentaje de cada
componente que se precise en la mezcla (figura 6).

La principal ventaja de este tipo de mezclado, es que el coste del equipo se

reduce considerablemente. El mezclado en baja permite la mezcla de dos o ms
componentes de la fase mvil con una buena reproducibilidad, aunque con unos
16

tiempos de retardo algo mayores respecto a la mezcla en alta presin. Como

principal desventaja, se tiene la baja reproducibilidad que se obtiene en mezclas
donde uno de los componentes se encuentra en una proporcin de menos del
5%.

6.3.

Sistemas de inyeccin

El mtodo de introduccin de la muestra en CLAE, es de importancia capital,

pues un mal sistema de inyeccin puede dar lugar a ensanchamientos de la
banda cromatogrfica que deterioren la eficacia del sistema cromatogrfico.
Un inyector ideal debe tener las siguientes caractersticas:
Introducir la muestra en la columna como una banda lo ms estrecha
posible.
Ser de fcil manejo.
Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra
inyectada como en el ensanchamiento que origina en la banda
cromatogrfica.
Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales:
a) Inyectores de jeringa

17

En este tipo de inyectores, la introduccin de la muestra en la columna se realiza

por medio de una jeringa cuya aguja entra en el sistema cromatogrfico a travs
de una membrana ("septum"), lo que permite depositar la muestra en la cabeza
de la columna.
Las ventajas de este tipo de inyector, radican en su facilidad de construccin y
en que permiten sacar todo el partido a la eficacia ofrecida por la columna; por
el contrario, son inyectores que presentan una gran falta de reproducibilidad,
tienen una presin de trabajo limitada y son de gran dificultad de manejo.

b) Inyectores de vlvula
Este sistema de inyeccin consiste en una vlvula de seis vas, dos de las cuales
estn conectadas entre s por medio de una espira ("loop"). Esta espira es un
tubo de volumen conocido, cuya misin es la de contener la muestra antes de
efectuarse la inyeccin.
La introduccin de la muestra en la columna se lleva a cabo en dos etapas; la
primera se realiza a presin atmosfrica, y consiste en cargar la muestra en la
espira con ayuda de una jeringa; en la segunda, mediante un giro de la vlvula,
se hace pasar el eluyente a travs de la espira hacia la columna.

18

7. La Columna
La columna es el elemento fundamental de un cromatgrafo de lquidos, puesto
que es en ella donde tiene lugar la separacin; por lo tanto, resulta fundamental
una correcta eleccin de la columna adecuada para cada separacin, ya que con
una columna inadecuada o de mala calidad se nunca se obtendrn buenos
resultados aunque se disponga del mejor instrumental.
Las columnas ms utilizadas en cromatografa de lquidos son las de relleno;
estas columnas consisten en un tubo, generalmente de acero, relleno de una
fase estacionaria adecuada al tipo separacin que se pretende llevar a cabo. El
dimetro interno vara entre 2 y 60 mm dependiendo su utilizacin, a escala
analtica o semipreparativa, y su longitud vara entre 5 y 30 cm. Tambin se
encuentran hoy en da en el mercado columnas de pequeo dimetro
(microbore), con dimetros comprendidos entre 2 y 0,5 mm y longitudes entre 25
y 100 cm. Este tipo de columnas permite reducir el consumo de disolventes y,
por lo tanto, facilitan la posibilidad de acoplar la cromatografa lquida a otras
tcnicas analticas (fundamentalmente espectrometra de masas). Por otro lado,
se empieza a introducir la denominada cromatografa de lquidos capilar, en la
que se utilizan como columnas tubos (de slice fundida generalmente) de un
dimetro interno muy pequeo (entre 200 y 500 :m) y de gran longitud (varios
metros); en este tipo de columnas, la caracterstica ms importante es que la
19

fase estacionaria se encuentra ligada qumicamente a las paredes del tubo, por
lo que se hace innecesaria la utilizacin de partculas de fase estacionaria como
en los dos casos anteriores.
Las caractersticas de la columna que influyen sobre su capacidad de separacin
son:
Dimetro interno.
Longitud.
Conexiones (reducciones).
Relleno.
Tamao de partcula del relleno

7.1.

Dimetro de la columna

La eleccin del dimetro interno de la columna se realiza en funcin de la

cantidad de muestra a separar. Para las separaciones a escala analtica (algunos
microgramos de muestra por inyeccin) se suelen usar columnas de pequeos
dimetros (1 a 6 mm) mientras que en los trabajos a escala preparativa se
superan los 10 mm de dimetro interno. Esta seleccin de dimetros se debe a
la prdida de eficacia, por sobrecarga de la columna, cuando se inyecta una
masa excesiva de solutos a separar. Se ha comprobado empricamente que en
fase normal, la sobrecarga comienza a partir de 50 g de muestra por gramo de
relleno, mientras que en fase reversa es necesario sobrepasar los 100 ug/gr de
relleno; parece lgico, por tanto, pensar que mayores dimetros de columna,
manteniendo iguales los restantes parmetros, permitan separar mayores
cantidades de muestra sin variacin de la eficacia del sistema. El inconveniente
de las columnas de gran dimetro consiste en el elevado consumo de
disolventes, puesto que se necesitan flujos elevados para conseguir la misma
velocidad lineal de eluyente que en las de pequeo dimetro. Las columnas
analticas de ms amplio uso suelen tener 4,6 mm de dimetro interno.
7.2.

Longitud de la columna

Como se puede comprobar en las ecuaciones que rigen los procesos

cromatogrficos, la eficacia de la columna depende, entre otros factores, de la
20

longitud de la columna y, a igualdad de otros parmetros, mayores longitudes de

la columna permitirn obtener mayores eficacias. Por otra parte, debe tenerse
en cuenta que, a mayor longitud de la columna, la presin en cabeza se eleva
considerablemente, por lo que hay que alcanzar un compromiso, a la hora de 34
seleccionar la columna, entre eficacia y cada de presin. Las columnas de
cromatografa lquida en ningn caso pueden tener longitudes extremadamente
grandes; se ha comprobado que para tamaos de partcula de 10 a 5 um, resulta
difcil conseguir empaquetar buenas columnas de longitud superior a 30 cm; para
tamaos de partcula de 3 um, la longitud de la columna no podr ser superior a
20 cm sin riesgo de que la presin en cabeza de columna sea excesivamente
elevada.
7.3.

Conexiones

En los extremos de la columna se montan los sistemas de conexin para

poderlas unir al detector y a los sistemas de inyeccin y bombeo de eluyentes.
La conexin, en este caso, es realmente una unin reductora de compresin
radial, que permite una perfecta unin del tubo de la columna con el capilar que
la conecta a los restantes dispositivos del cromatgrafo. Estas uniones no deben
presentar volumen muerto, deben permitir el paso de secciones anchas de tubo
a capilares, y deben ser fcilmente montables y desmontables. Por otra parte, y
como cierre del tubo que contiene el relleno se colocan los llamados fritados, que
son mallas con un tamao de poro inferior al dimetro de la partcula de relleno;
de esta forma, se deja pasar al eluyente evitando que el relleno se salga de la
columna.
7.4.

Relleno

Todas las separaciones cromatogrficas tienen lugar sobre la fase estacionaria.

Las fases estacionarias en cromatografa de lquidos, estn constituidas
generalmente por partculas de materiales rgidos o semirgidos, y en la gran
mayora de los rellenos se suele utilizar slice con este fin, aunque tambin es
posible encontrar rellenos basados en polmeros sintticos. En la mayora de los
rellenos de columnas de cromatografa lquida, la slice utilizada realiza una de
las tres funciones siguientes:
21

 Superficie adsorbente: En este caso los propios grupos activos de la

superficie de la slice (grupos silanol) son los responsables de la separacin.
Soporte de la fase estacionaria: Esta o no bien impregna la superficie de la
slice, o 35 bien se encuentra ligada qumicamente a ella (slice modificada
qumicamente).
Actuacin como substrato microporoso: En este caso, la slice permite la
seleccin de molculas en funcin de su tamao.
Los grandes avances tcnicos en la preparacin de slices de estructura
conocida, con modificaciones qumicas en la superficie, con poros y formas
controladas y con una buena granulometra, han permitido que este material, en
multitud de formas de presentacin, sea el relleno ms utilizado en las columnas
de cromatografa de lquidos. La slice ha terminado por desplazar como relleno
a los polmeros sintticos que, debido principalmente a su gran inercia qumica
y a la facilidad de modificar qumicamente su superficie, estaban tomando un
cierto auge en cromatografa lquida. En este sentido, la slice se est
introduciendo en campos de la cromatografa lquida en los que la base del
relleno era por excelencia polimrica, como es los casos de la cromatografa de
exclusin molecular y la cromatografa de intercambio inico.
Las propiedades de la slice que propician su utilizacin como soporte se pueden
resumir en:
Gran resistencia mecnica. Lo que permite a las columnas empaquetadas
con slice resistir mayores presiones de trabajo. En general, los polmeros
sintticos no permiten trabajar a presiones por encima de los 18 Bar (1.800
psi).
Amplia gama de formas, tamaos y dimetros de poro, lo que permite
conseguir una gran variedad de estructuras. En la actualidad, es posible
preparar una slice prcticamente a conveniencia; as, es posible encontrar
slices esfricas, irregulares o poligonales, lo que puede tener gran
importancia en el empaquetado de la columna (presiones resultantes y
permeabilidad del relleno al paso del eluyente) y en la posterior eficacia de
sta.

22

 Gran variedad de slices en cuanto a superficie especfica. Este hecho,

permite encontrar slices de gran reactividad o de relativa inercia y, por lo
tanto, es posible tener una amplia gama de capacidades de separacin y de
posibilidades

7.5.

de

ligar

qumicamente

molculas

su

superficie.

Tamao de partcula

El tamao de partcula juega un papel importantsimo en la calidad y eficacia de

la columna. Como se puede ver en la ecuacin de Van Deemter, la altura
equivalente de plato terico es funcin del dimetro de la partcula de relleno:

Donde dp es el dimetro de las partculas y u la velocidad lineal de la fase mvil.

De la ecuacin anterior se desprende la importancia del dimetro de partcula,
ya que a dimetros menores se obtendr una menor altura equivalente de plato
terico y, por lo tanto, una mayor eficacia del sistema. Las partculas utilizadas
inicialmente para rellenos en cromatografa lquida, eran bastante grandes (de
ms de 40 um) y totalmente porosas. Este tipo de partculas presentan una gran
superficie especfica y, por lo tanto, las columnas preparadas con ellas presentan
una gran capacidad de carga (admiten gran cantidad de muestra) pero, como
contrapartida, dan lugar a un gran ensanchamiento de la banda cromatogrfica
ya que influyen significativamente sobre los trminos de transferencia de masa
de la ecuacin de Van Deemter.
23

Como solucin parcial a este problema, se comenzaron a utilizar los

recubrimientos de estas partculas por capas de fase estacionaria (adsorbente o
intercambiadora de iones). Este tipo de rellenos (rellenos peliculares) dan lugar
a picos ms estrechos, aunque no son la solucin ptima.
Los mayores avances se han realizado al reducir los tamaos de las partculas
del relleno a unos niveles en los que se consiguen grandes incrementos en la
eficacia de la columna sin que por ello se tengan unas presiones tan
excesivamente elevadas en cabeza de columna que hagan inviable el anlisis.
En la actualidad, los tamaos de partcula habituales se encuentran
comprendidos entre 10 y 3 um de dimetro, aunque en la gran mayora de los
casos, los anlisis se estn realizando con rellenos de 10 o 5 um.

8. Detectores
Un detector para cromatografa es un dispositivo que permite medir, a la salida
de la columna, una propiedad fsica del eluyente, que deber depender de la
composicin de ste. La deteccin en cromatografa se realiza, habitualmente,
en continuo, aunque es posible la utilizacin de colectores de fracciones para la
identificacin y cuantificacin de pequeas fracciones del eluyente.
8.1.

Las caractersticas de un detector para cromatografa, son principalmente:

24

8.1. Caractersticas que no afectan a la eficacia de la separacin.

Es la seal ofrecida por el detector ante una determinada variacin de la
propiedad fsica del eluyente que es medida. Esta propiedad debe ser
proporcional a la variacin de masa del soluto que sale de la columna o a su
concentracin. La respuesta de un detector suele ser lineal (en un rango ms o
menos ancho segn el tipo de detector), lo que implica que la seal generada
por el detector vara linealmente con la concentracin o la masa de soluto que,
por unidad de tiempo, sale de la columna.
a) Ruido.
Es cualquier perturbacin de la seal generada por el detector y que no es
originada por la salida de un soluto de la columna.
El ruido de fondo del detector se compone a su vez de otros dos tipos de ruido:
ruido de corto alcance (perturbaciones de una frecuencia mayor que la inversa
del ancho del pico de soluto) y ruido de largo alcance (perturbaciones con una
frecuencia del mismo orden que la inversa del ancho del pico del soluto).
b) Deriva
Es la variacin de la seal de base a lo largo del tiempo, que origina una
variacin lenta y progresiva de la lnea de base
c) Sensibilidad
La sensibilidad se define como la mnima concentracin o cantidad de soluto
que debe pasar por el detector para que la seal a que ste da lugar sea dos
veces mayor que la del ruido de fondo. Este parmetro indica la cantidad mnima
de soluto que es posible detectar, y es dependiente del ruido del detector.
d) Rango dinmico
Es el rango de concentraciones de soluto entre las cuales el detector produce
una respuesta dependiente de la concentracin de soluto a la salida de la
columna. El valor mnimo, se corresponde con la sensibilidad del detector, y el
mximo, con la concentracin de soluto a partir de la cual la respuesta del
detector es constante (saturacin). El rango dinmico lineal, es la zona del
anterior en el que la respuesta del detector es lineal frente a la concentracin de
soluto.

25

Ruido y deriva de la seal de un detector

8.2.

Caractersticas que afectan a la eficacia de la separacin.

a) Volumen de la cubeta
El volumen de la cubeta puede provocar una prdida considerable de la
eficacia del sistema, ya que volmenes grandes de clula originan un efecto de
dilucin exponencial del soluto que sale de la columna, deformndose el pico y
pudindose mezclar dos solutos que salen separados de la columna.
El volumen mximo de la cubeta es funcin del porcentaje de prdida de eficacia
admisible para el sistema y, en general, se utilizan volmenes inferiores a 8 L para
evitar prdidas de eficacia.
b) Constante de tiempo
La constante de tiempo del detector indica el tiempo que necesita la electrnica
del detector para asumir la seal instantnea originada por el soluto. Constantes
de tiempo elevadas, dan origen a que picos que salen rpidamente de la columna
se vean ensanchados, y por lo tanto, dan origen a una prdida de la eficacia del
sistema. Para anlisis convencionales, son apropiadas constantes de tiempo
inferiores a 100 ms.

26

Clula tpica de flujo en Z

Se puede hacer una divisin de los detectores en dos grandes grupos: los que
aportan informacin estructural sobre las substancias eluidas (son aquellos
detectores que permiten la obtencin de espectros de las sustancias que salen
de la columna, tales como IRTF, UV-VIS de matriz de diodos, EM) y aquellos
que no la aportan. Los pertenecientes al primer grupo no son detectores de
cromatografa de lquidos de uso frecuente, aunque en la actualidad alguno de
ellos se est imponiendo a los detectores que no aportan informacin
estructural.
Los detectores que no aportan informacin estructural, han sido hasta el
momento los de uso ms extendido; entre ellos deben mencionarse:
Detector ndice de refraccin.
- Detector de ultravioleta y/o visible.
- Detector de fluorescencia.
- Detector de conductividad elctrica.
- Detector electroqumico.

8.3.

Tipos de refractmetros

En la actualidad se suelen utilizar dos tipos bsicos de detectores de ndice de

27

refraccin. Ambos requieren el uso de una cubeta de doble paso, en la que el

lado que contiene la muestra se compara constantemente con el lado de
referencia que contiene fase mvil.
a) Detector de ndice de refraccin
Fundamentos
El detector de ndice de refraccin, es el detector de uso corriente de respuesta
ms universal.
El ndice de refraccin es una caracterstica fsica definida de todos los
compuestos. La deteccin se basa en equilibrar el detector, a caudal constante,
con fase mvil pura y medir el cambio de ndice de refraccin cuando aparece la
muestra eluida junto con la fase mvil. Resulta obvio que cuanto mayor sea la
diferencia entre los ndices de refraccin de la muestra y de la fase mvil, mayor
ser el desequilibrio, por tanto, la mxima sensibilidad se obtendr cuando
exista una diferencia mxima entre los respectivos ndices de refraccin. Sin
embargo, aparecen ocasionalmente algunos problemas al efectuar la eleccin
de un sistema de fase mvil, que sea compatible con el tipo de separacin y con
los componentes del instrumento, para que su ndice de refraccin sea diferente
del de la muestra. Por otra parte, en mezclas complejas, los ndices de
refraccin de los componentes de la mezcla pueden cubrir un amplio intervalo
de valores y algunos de ellos pueden ser muy cercanos al de la fase mvil, con
lo que resultarn invisibles para el detector.
Otro inconveniente de la deteccin por ndice de refraccin, es la necesidad de
reequilibrar el detector cada vez que se produce un pequeo cambio en la
composicin de la fase mvil. Este factor resulta muy limitativo, puesto que
convierte al detector de ndice de refraccin en inutilizable en las separaciones
con elucin por gradiente, en las que la composicin de la fase mvil cambia
durante el anlisis; por supuesto, es posible intentar la preparacin de mezclas
de disolventes de alta y baja polaridad, mezclados cuidadosamente para
mantener igual el ndice de refraccin a lo largo de todo el anlisis, pero resulta
sumamente difcil de realizar a menos que se trabaje solamente a baja
sensibilidad.
b) Detector de desviacin
28

En la figura siguiente, se presenta un esquema de la parte ptica del detector de

desviacin, que obedece a la ley de Snell. Este detector utiliza el principio de
la desviacin; en l se mide la desviacin de un haz luminoso al variar la
composicin del lado de la muestra en relacin con la del lado de referencia a
medida que eluye la muestra a travs del detector. Cuando no hay muestra
presente, la luz que pasa a travs de ambas partes de la cubeta se enfoca en la
fotoclula; a medida que eluye la muestra, vara el ngulo de refraccin, por lo
que el haz luminoso se desva. Esto se traduce en un cambio en la intensidad
de luz que llega la fotoclula, siendo registrada la intensidad del cambio, que
puede relacionarse con la concentracin de la muestra.

Refractmetro de desviacin de haz ptico

Las ventajas de este tipo de detector son su baja sensibilidad frente a las
partculas slidas y a las burbujas de aire que puedan penetrar en la cubeta y la
posibilidad de cubrir el intervalo completo de ndices de refraccin (desde 1,000
hasta 1,75), con una nica cubeta fcilmente equilibrable. Sus desventajas, son
su alto coste y, como consecuencia del crtico emplazamiento de la cubeta en el
centro de la ptica, su difcil manejo, lo que impide limpiar, quitar o reemplazar
fcilmente la cubeta cuando se forma en ella una pelcula o se atasca.
c) Detector de reflexin (Fresnel).
El segundo tipo de detector de ndice de refraccin utiliza el principio de Fresnel.
En la prxima, se muestra el esquema ptico de este tipo de detector. En l, el
29

haz luminoso se enfoca tanto a las interfaces prisma-lquido de la cubeta como

a una lmina pulimentada que forma la superficie trasera de las cubetas de la
muestra y de la referencia, reflejndose desde ellas a la fotoclula de deteccin.
Al entrar la muestra en una de las cubetas la luz se refracta con un ngulo
diferente, con lo cual a la salida hacia la fotoclula habr variado su intensidad
(no su direccin). El consiguiente desequilibrio del detector generar un cambio
en la energa elctrica de su seal de salida. Tambin en este caso, la diferencia
entre la seal de la cubeta de la muestra y la de la referencia se transmite a un
registrador o a un sistema de tratamiento de datos en forma de variacin del
voltaje de salida.

Refractmetro de reflexin Fresnel

La principal ventaja de este tipo de detector es su gran sensibilidad potencial,

puesto que su ptica permite una mayor concentracin de la seal en un
determinado intervalo de ndice de refraccin de lo que es posible en los
detectores de intervalo amplio. Presenta tambin otras ventajas, como son la
posibilidad de operar a caudales sumamente bajos con cubetas de muy
pequeo volumen, un fcil acceso a la cubeta y, adems, su bajo coste. Sus
desventajas son la necesidad de cambiar los prismas para adaptarse al ndice
de refraccin de los disolventes (que pueden tenerlo muy elevado o bien muy
bajo) as como la necesidad de ajustar manualmente el camino ptico al cambiar
de disolvente.
30

-Factores que influyen en la sensibilidad.

El ndice de refraccin de un compuesto es funcin de su densidad molecular.
Una variacin en la densidad se traduce en un cambio en el ndice de refraccin,
por lo que un refractmetro es sensible a los cambios en la concentracin de la
muestra o del eluyente, a los cambios de presin y a los de temperatura, ya que
todos ellos dan lugar a cambios en la densidad. Un detector de ndice de
refraccin apropiado para su uso en CLAE debe ser sensible a un cambio del
ndice de refraccin del orden de 10-7 unidades (correspondiente a un cambio
en la concentracin de 1 ppm). La presencia de aire disuelto, los cambios en la
composicin del disolvente, un mezclado incorrecto o el arrastre de fase
estacionaria de la columna, provocan deriva de la lnea de base. Un lquido
orgnico de los normalmente utilizados como fase mvil, sufre una variacin de
1 x 10-6 unidades de ndice de refraccin al variar la presin en 1 atm (15 psi), y
de 6 x 10-8 unidades de ndice de refraccin al variar la temperatura en 1 C; por
tanto, es evidente que estas condiciones deben controlarse con precisin, en
especial la temperatura. Para trabajar a gran sensibilidad, un detector de ndice
de refraccin debe estar termostatizado en 0,01C, mediante un bao de agua
conectado a la cabeza del detector, o bien, alternativamente, debe poseer una
camisa de gran volumen que estabilice la temperatura. Los detectores
comerciales normalmente llevan un tubo de pequeo calibre en su entrada que
permite estabilizar la temperatura del material que eluye antes de que penetre
en la cubeta.
d) Detectores de ultravioleta/visible
Fundamentos
Cuando se hace pasar una radiacin electromagntica a travs de compuestos
que presentan determinados grupos funcionales, stos experimentan una
excitacin electrnica a causa de la absorcin de energa, a una longitud de
onda que ser especfica para cada grupo funcional. Esta energa, provoca el
paso de un electrn desde el estado fundamental hasta un nivel de energa
superior. La absorcin de energa, se traduce en una disminucin de la intensidad
del haz luminoso que se ha hecho pasar a travs de la muestra, pudindose
31

medir esta disminucin de intensidad haciendo incidir el haz sobre una

fotoclula.
En los detectores de absorcin ultravioleta, la lnea de base representa la
mxima transmisin de luz, y cualquier desviacin de ella indicar prdida o
absorcin de radiacin.
La utilizacin de la absorcin de luz ultravioleta o visible para el control de una
corriente lquida y analizar los distintos componentes que lleva en disolucin, es
una extensin natural de la espectrofotometra. Al contrario de lo que ocurre con
el ndice de refraccin, la absorcin UV o visible es un parmetro especfico para
cada compuesto, ya que ste debe presentar una absorcin adecuada en alguna
regin del espectro o, en su caso, debe combinarse con un reactivo adecuado para
formar un derivado que presente absorcin.
La posibilidad de realizar el control de una corriente lquida por medio de su
absorcin a una determinada longitud de onda es muy sencilla de evaluar, ya
que las caractersticas de la absorcin UV de una determinada muestra se
pueden conocer por medio de trabajos previos en este tipo de detectores, o bien
pueden obtenerse fcilmente registrando su espectro de absorcin en un
espectrofotmetro. Cuando la muestra no absorbe la radiacin por s misma, el
hallar un reactivo adecuado que d lugar a un derivado coloreado para poder
medir la absorcin en visible, requiere mucho ms trabajo qumico, aunque el
procedimiento final de evaluacin sea el mismo.
En la tabla siguiente se dan las absortividades molares de diversos grupos
funcionales a determinadas longitudes de onda. El conocimiento de estos valores
es importante, ya que indican las longitudes de onda que es necesario utilizar
para obtener una respuesta mxima del detector.

Coeficiente

de

extincin

molar

(,)

de

varios

compuestos

TIPO DE COMPUESTO
Amina
Instauracin aliftica

CROMFORO
-NH2
-C=C-

LONGITUD DE ONDA

(nm)
195

2800

190

8000
32

210-230

21000

230-260

6000

Benceno

202

6900

Bifenilo

246

20000

Quinoleina

270
314

3600
2750

Antraceno

252

199000

Instauracin alicclica

-(C=C)2-(C=C)2-

La mayora de los compuestos orgnicos pueden analizarse por cromatografa

lquida utilizando detectores de UV-visible. Se considera que, por lo menos, el
65 % de las muestras analizadas por CLAE presentan alguna absorcin en la
zona de 254 nm (longitud de onda con la que trabajan la mayora de los
detectores de longitud de onda fija de uso general), y ms del 90% absorben en
algn punto del espectro que cubren los algo ms sofisticados detectores de
longitud de onda variable. Este hecho, junto con la relativa sencillez de su
manejo, hace que el detector de UV sea el ms til y el ms ampliamente
utilizado de los detectores de CLAE.
e) Tipos de detectores UV/VIS
a. Detectores de longitud de onda fija.
La fuente luminosa ms corrientemente utilizada en los detectores de UV, emite
la mayor parte de la energa a una longitud de onda fija de 253,7 nm. Es posible
seleccionar, por medio de filtros adecuados, una de las longitudes de onda,
retirando las de emisin ms dbil. La mayora de los detectores que trabajan
con longitud de onda fija, utilizan la lnea de 254 nm, que presenta una gran
estabilidad y de emisin y permite obtener una alta sensibilidad, pudindose
medir incluso cantidades por debajo del nanogramo en sustancias que
presenten una gran absorcin.
El espectrofotmetro de 254 nm, ha sido el detector de bajo coste ms
ampliamente utilizado en CLAE, ya que la mayora de los compuestos que
absorben en UV presentan cierta absorcin esta longitud de onda.
Muchos detectores de longitud de onda fija tambin ofrecen la posibilidad de
utilizar otros filtros, lo que permite una utilizacin limitada del detector a otras
33

longitudes de onda para la deteccin de aquellos compuestos que no presentan

absorcin a 254 nm, pero que si absorben en algn otro punto del espectro
ultravioleta; sin embargo, la estabilidad de la lnea de base y la intensidad de la
seal que se obtiene al trabajar con estas lneas ms dbiles, no suelen ser
nunca comparables a las que se obtienen con la lnea de 254 nm.
b. Detectores de longitud de onda variable.
Los detectores de longitud de onda variable son particularmente tiles en tres
casos:
En el caso de que pueda obtenerse una mejor sensibilidad a una longitud de
onda distinta de 254 nm o de otras longitudes de onda para las que existen
filtros.
En el caso de que los distintos componentes de la muestra presenten gran
absorcin a diferentes longitudes de onda y, por tanto, el trabajo a una nica
longitud de onda reduzca la sensibilidad e incluso pueda resultar imposible
la deteccin de algunos de los componentes de la muestra.
En el caso de que se desee una operacin con paro del flujo combinado con
un registro del espectro completo de los picos.

Detector UV/VIS de longitud de onda variable

En algunos detectores, el cambio de longitud de onda se efecta manualmente,
34

mientras que en otros puede programarse la longitud de onda de trabajo en

funcin del tiempo por medio de la memoria del instrumento; esto permite trabajar
a diferentes longitudes de onda sin atencin por parte del personal. Los aparatos
ms sofisticados, tambin permiten un registro automtico de todo el espectro,
parando automticamente el flujo cuando la cubeta contiene una determinada
fraccin del efluente de la columna.
Otro tipo de detector ultravioleta, cuya importancia en CLAE se hace cada vez
mayor, ya que permite en tiempo real conocer el espectro de UV/Vis en
cualquier instante del cromatograma, es el llamado detector de matriz de
diodos. La base del funcionamiento de los espectrofotmetros de matriz de
diodos es simple; el haz de radiacin que ha atravesado una cubeta de flujo
continuo, a travs de la que circula la fase mvil procedente de la columna
cromatogrfica, es dispersado por medio de una red de difraccin fija, siendo
recogidas simultneamente todas las longitudes de onda dispersadas mediante
una matriz de fotodiodos.

Detector UV de matriz de fotodiodos

Por supuesto, debe tenerse en cuenta que este tipo de espectrofotmetro no
presenta nunca un diseo de doble haz, por lo que en los espectros obtenidos
aparecern siempre las bandas de absorcin propias de la fase mvil, aunque
este problema puede minimizarse mediante una substraccin de las seales
espectrales de la lnea de base; debe destacarse tambin que la tcnica de
35

deteccin mediante espectrofotmetros de matriz de diodos, presenta la

desventaja de ser ligeramente menos sensible que la deteccin por ultravioleta
convencional.
f) Detectores de fluorescencia.
Fundamentos
El fenmeno de fluorescencia tiene lugar cuando compuestos que poseen
determinados grupos funcionales especficos, se excitan con la energa de ciertas
longitudes de onda y emiten radiacin de mayor longitud de onda que la
absorbida.
En fluorescencia, la radiacin emitida se mide normalmente, con objeto de
evitar interferencias, en direccin perpendicular a la de incidencia del haz de
excitacin. Naturalmente la posibilidad real de detectar por fluorescencia grupos
qumicos especficos, es funcin de las longitudes de onda seleccionadas, tanto
la de excitacin como la de emisin.
Los detectores de fluorescencia representan el tercer tipo de detectores ms
comnmente utilizados en la moderna CL. Para los compuestos que presentan
fluorescencia natural, as como para los que pueden convertirse en
fluorescentes por medio de una derivatizacin simple, es el tipo de deteccin
ms sensible que se puede aplicar de rutina a la CL; normalmente la
sensibilidad del detector de fluorescencia es 1.000 veces mayor que la del
detector UV, para compuestos con absorcin UV intensa, y la sensibilidad del
detector UV es, por su parte, 1.000 veces mayor que la del detector de ndice
de refraccin. En la tabla I se recogen algunos compuestos que presentan
fluorescencia natural.

Compuestos con fluorescencia natural

LONGITUD DE ONDA

LONGITUD DE ONDA

(nm)

(nm)

COMPUESTO

EXCITACIN

EMISIN

Benceno

270

310
36

Tolueno

270

320

Clorobenceno

275

345

Fenol

285

365

Anilina

210

405

Acido benzoico

310

390

Benzonitrilo

280

360

g) Detectores electroqumicos.
Fundamentos
Este tipo de detectores, estn basados en la oxidacin del analito eludo
mediante un electrodo adecuado, registrndose la intensidad de la corriente,
mantenida mediante la electrolisis de los analitos, a lo largo del cromatograma. La
deteccin en este caso est basada en el conocido polargrafo de gota de
mercurio; este instrumento consta de un par de electrodos a los que se aplica
un potencial de oxidacin (potencial de semionda) suficiente para crear una
corriente de difusin. Puesto que la cantidad de corriente es una medida directa
de la concentracin de analito en un momento dado, el proceso es cuantitativo.
Para poder aplicar esta tcnica a la deteccin en cromatografa lquida, se han
desarrollado nuevos materiales para los electrodos y se han diseado cubetas
de electrolisis de escaso volumen y con geometras muy eficaces. Como
electrodos de medida, se utilizan los de pasta de carbn, carbn pulimentado y
amalgama de oro y mercurio, normalmente con un contraelectrodo de platacloruro de plata.

37

Clula de flujo de un detector amperomtrico

El campo de aplicacin de la deteccin electroqumica no es tan extenso como
el de la deteccin por ndice de refraccin, UV/VIS o fluorescencia, pero entre los
compuestos a los que puede aplicarse se encuentran algunos de compuestos
de la mayor importancia. Para estos compuestos, su gran especificidad y su
elevada sensibilidad (de 50 a 100 veces mayor que en los otros tipos de
detectores) convierte a esta tcnica de deteccin en un medio muy til para el
anlisis de mezclas complejas, tales como los fluidos biolgicos y los extractos
de muestras naturales. La sensibilidad de estos detectores para compuestos
tales como el fenol, las nitrosaminas y muchos cidos orgnicos es del orden
del picomol (nanogramo).
A pesar de sus ventajas, los detectores electroqumicos presentan tambin una
serie de limitaciones; bsicamente, estas son:
La fase mvil debe ser conductora de la corriente elctrica, lo cual
normalmente se consigue por adicin de una sal adecuada. Esto limita o
impide la realizacin de muchas separaciones en fase normal, en las que se
utiliza hexano u otras fases mviles apolares. Las cromatografas de
intercambio inico y de fase reversa, son dos buenos campos de aplicacin
para estos detectores. Sin embargo, no debe olvidarse que la adicin de
sales a la fase mvil puede provocar cambios en la cromatografa.
La fase mvil debe ser purgada de oxgeno, contaminantes metlicos y
38

haluros, para reducir la corriente de fondo y, por tanto, el ruido y la deriva

de la lnea de base.
Los componentes de las muestras deben ser oxidables, a un valor de
potencial que no d lugar tambin a electrolisis en la fase mvil o en los
restantes componentes de la muestra.
h) Detector de conductividad electroltica
En los detectores de conductividad electroltica se mide de manera continua la
conductividad de la fase mvil que eluye de la columna, indicndose la
presencia de un analito por medio de un cambio en la conductividad.
Para la utilizacin de esta tcnica como sistema de deteccin cromatogrfico,
la clula de inmersin utilizada normalmente para medir conductividad, se
substituye por una clula de flujo de pequeo volumen, registrndose
continuamente las variaciones en la conductividad de la fase mvil. La respuesta
de los detectores conductimtricos es lineal frente a la concentracin en un
intervalo muy amplio, de manera que es posible cuantificar la seal de salida
por medio de una correcta calibracin preliminar. Los mejores resultados con
este detector se obtienen en los anlisis isocrticos, ya que los gradientes dan
lugar a una deriva proporcional en la lnea base.

Clula de flujo de un detector de conductividad

Uno de los inconvenientes de los detectores de conductividad electroltica, es

su inestabilidad debido a variaciones trmicas de la cubeta, por lo que son
necesarios buenos sistemas de termostatizacin. Estos detectores se han
utilizado con xito en cromatografa de intercambio inico.

39

9. Aplicaciones de la cromatografa hplc

La cromatografa liquida de alta presin a pesar de ser una tcnica relativamente
nueva, tiene numerosas aplicaciones en la qumica. En la mayora de los casos,
estas consisten en determinaciones de sustancias cuyo anlisis por otra tcnica
cromatografa resulta muy difcil.
a) Campos de Aplicacin de HPLC
Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos
Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos
Productos

de

alimentacin:

Edulcorantes

artificiales,

antioxidantes,

aflatoxinas, aditivos
Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos,
propulsores, colorantes
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos
Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,
estrgenos.
b) Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa

Separacin y purificacin de metabolitos

Separacin y purificacin de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras

de orina

Purificacin de compuestos naturales

Purificacin y caracterizacin de enzimas y protenas

Tiene grandes aplicaciones en lo que se refiere a la contaminacin ambiental la

HPLC se utiliza para analizar la capacidad que tienen algunos pesticidas
(insecticidas, larvicidas, herbicidas, etc.)

40

El anlisis de medicamentos constituye la aplicacin ms grande de la

cromatografa HPLC que nos sirve para determinar los componentes activos de
diferentes productos usados en la industria farmacutica como por ejemplo en
tabletas analgsicas.

9.1. Problemas normalmente encontrados en hplc, sus posibles causas

posibles, y cmo solucionarlos.
41

a) presin alta
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o Guarda Columna por
partculas.

Solucin: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna

desconectada del detector. Si esto no funciona reemplace el fritado a la entrada de
la columna. Si la presin sigue alta reemplace la columna.

Solucin a largo plazo: Asegurase que todas las fases mviles se filtren
apropiadamente antes que entren a la bomba de HPLC. Tambin filtre todas las
muestras antes de inyectarlas.

a) Prdida de la resolucin

Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC del Guarda Columna por

partculas.

Solucin: vea la seccin de Presin Alta

Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes de que se introduzcan las fases mviles en
el sistema de HPLC.

b) Picos hendidos

Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por

partculas.

Solucin: La columna se desatornilla. Si es necesario reemplazar la columna.

Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles
en el sistema de HPLC.

c) Variacin en los tiempos de retencin

Posible causa: Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase

mvil.

Solucin: Desgasificacin de la Bomba

Solucin a larga plazo: Asegurase fase

mvil este propiamente y

adecuadamente des gasificada. Si usa desgasificacin electrnica en la lnea

asegurarse de que la cadencia del flujo no es demasiado alto.
d) Variaciones de la lnea base

Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una
mala desgasificacin de los solventes de la fase mvil.

42

Solucin: Asegrese que todas las fases mviles estn debidamente

desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la presin a toma de
corriente del detector.

e) Lnea base con mucho ruido

Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba.

Solucin: Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC . Use Solventes

desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo
de la fase mvil del sistema.

f) Picos falsos (detectores electroqumicos y de fluorescencia)

Posible causa: Oxgeno Disuelto

Solucin: Desgasificar adecuadamente las fases mviles para reducir la

concentracin de oxgeno disuelto.

Solucin a largo plazo: Agregar un sistema de filtracin al vaco en lnea.

Peridicamente chequear el nivel de oxgeno disuelto.

g) Baja o ninguna presin

Posible causa: Trabajar con bombas, sellos pistones expuestos por mucho
tiempo a partculas en suspensin en la fase mvil.

Solucin: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.

10. CONCLUSIONES
Una de las principales ventaja de esta tcnica frente a otras metodologas
analticas clsicas es su especificidad, permitiendo la separacin, identificacin
y cuantificacin de los componentes orgnicos ms complejos.
La
el

HPLC
campo

analtica
de

ha
la

adquirido

una

investigacin

especial
y

importancia

desarrollo

en

cientfico,

encargndose del control de calidad farmacutico y el anlisis medioambiental.

Concluimos
resaltantes

que
del

unas
HPLC

de
es

las
su

caractersticas
alta

resolucin,

ms
su

reproducibilidad, alta velocidad, y la capacidad de automatizacin que presentan; lo

cual la hace ser una de las tcnicas ms empleadas en el anlisis de diversas
formulaciones cosmticas y alimentarias.

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11. RECOMENDACIONES
Filtrar, filtrar, filtrar!!! (tanto disolventes como muestra). Pues estas Partculas son
las que producen obstrucciones que pueden venir de fuera y dentro del sistema:
Solventes, tampones, Crecimiento bacteriano en las botellas de disolvente, La
muestra, desgaste de los componentes, etc. El Mantenimiento Preventivo es la
clave!

Intentar limpiar o cambiar los filtros regularmente o cada 3 meses. Si es posible, use
botellas de disolventes estriles o de color mbar, para retardar aparicin de algas.
Evite exposicin de la botella de disolvente directamente a la luz del sol (use papel
de aluminio, proteja de las ventanas).

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12. BIBLIOGRAFIA

Annimo. (2010). tipos de cromatografa. Annimo, 1, 40

Annimo. (2010). cromatografa liquida de alta eficacia. 2016, Sitio web:
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatogr
afia/cromatografia_liquida_de_alta_eficacia.pdf
Annimo. (2008). conceptos fundamentales de cromatografia. 2016, Sitio
web:
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatogr
afia/principios_de_cromatografia.pdf

45