PRIMERAS JORNADAS REGIONALES DE

PROFESORES DE BIOLOGA
Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales y Agrimensura

Taller: Tcnicas Zoolgicas de Laboratorio

para la Elaboracin de Recursos Didcticos.

Docentes: Dr. Enrique Rafael Laffont, Dra. Mara Celina Godoy, Lic. Juan
Manuel Coronel, Lic. Clara Etcheverry.
Asignatura: Biologa de los Invertebrados. Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales y Agrimensura. Universidad Nacional del Nordeste.

Corrientes, 30 de octubre de 2010.-

Corrientes, 29 y 30 de Octubre de 2010 .

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El estudio de los organismos, humanos y no humanos, es esencial para la

comprensin de la vida. Los docentes, y especialmente los profesores de Biologa, debemos
inculcar el respeto por la vida y ensear acerca de la interrelacin e interdependencia de
todos los seres vivos. Por ello, todas las experiencias y observaciones que involucran
animales, vivos o fijados, deben tener propsitos educacionales bien fundamentados y ser
apropiados para la asignatura y edad de los alumnos. Se recomienda siempre el estudio
prudente y responsable de los animales en los laboratorios escolares. Por ello, consideramos
adecuado que el docente elabore previamente los recursos didcticos que involucren
animales vivos o fijados y asegure su preservacin durante el mayor perodo de tiempo
posible, presentando a los alumnos las piezas ya preparadas.
Si las condiciones de conservacin son adecuadas, el material puede ser utilizado
durante muchos aos y para diferentes temas de la asignatura. En un laboratorio escolar
equipado con elementos bsicos y econmicos, es posible que el profesor de Biologa
prepare interesantes recursos didcticos para las clases prcticas, para la preparacin de
estudiantes para olimpiadas y otros eventos educativos, o para la organizacin de un museo
escolar.
Por otra parte, los invertebrados y protozoos ofrecen una amplia diversidad
morfolgica, funcional y ecolgica, lo que los hace particularmente adecuados para
ejemplificar las innumerables variaciones que existen en los Reinos Animalia y Protista
El objetivo de este taller es el de brindar algunas tcnicas zoolgicas bsicas de
observacin y elaboracin de ejemplares vivos y fijados, que permitan al docente contar con
preparados microscpicos y macroscpicos de diferentes grupos de invertebrados. Este
material biolgico, adecuadamente conservado, facilitar la realizacin de observaciones
prcticas referidas a diferentes temas de la asignatura: niveles de organizacin en animales,
biologa funcional de distintos grupos de invertebrados, adaptaciones a distintos hbitats y
modos de vida, etc.
Durante la realizacin del taller, los participantes practicarn las tcnicas propuestas,
trabajando con instrumental ptico adecuado (lupas y microscopios binoculares), elementos
de laboratorio, colorantes, lquidos conservadores, etc.
Las tcnicas a desarrollar sern:
a. Elaboracin de preparaciones microscpicas temporales con coloraciones
vitales.
b. Elaboracin de preparaciones microscpicas semipermanentes.
c. Elaboracin de preparaciones microscpicas permanentes.
d. Preparacin, fijacin y conservacin de ejemplares macroscpicos.
Asimismo se ofrecern datos acerca de distintos colorantes de fcil obtencin y las
frmulas de preparacin de varios medios de montaje y lquidos conservadores.

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Se han seleccionado ejemplares de invertebrados regionales o de fcil obtencin, a fin de

que resulte posible la realizacin de estas tcnicas en los distintos establecimientos
escolares.
a. Elaboracin de preparaciones microscpicas temporales con coloraciones vitales.
Las coloraciones vitales de protistas y otros invertebrados microscpicos como
rotferos, nemtodes, microcrustceos, etc., pueden permitir observar, de manera sencilla,
varias estructuras anatmicas externas e internas y algunos procesos vitales como la
digestin y locomocin.
Algunos colorantes vitales son de accin general, tiendo distintas estructuras y
brindando principalmente un buen contraste para observar detalles citolgicos y
anatmicos. Otros destacan estructuras u orgnulos especficos, segn sus propiedades
qumicas. Los colorantes vitales deben ser usados en soluciones muy diluidas (entre 1:5.000
a 1: 500.000), ya que eventualmente resultan txicos a los organismos. Entre los colorantes
vitales recomendados por sus buenos resultados y facilidad de obtencin se mencionan el
azul de metileno, rojo neutro, rojo congo, tinta china.
Cultivos de protozoos y otros invertebrados dulciacucolas:
A fin de contar con suficientes ejemplares para la observacin, es necesario realizar
previamente cultivos de estos animales en laboratorio. Si bien existen diferentes mtodos de
cultivo especializados para cada grupo de organismos, el que se menciona a continuacin es
muy simple y fcil de llevar a cabo en cualquier establecimiento escolar. Se obtienen buenos
resultados para la observacin de una gran diversidad de protistas y otros invertebrados.
En primer lugar, se deben extraer plantas acuticas de una laguna o charca y
trasladarlas al laboratorio en recipientes plsticos, con un poco del agua de la laguna. En el
laboratorio, se trozan las plantas (hojas, races y tallos) y se colocan en frascos de vidrio o
plstico con agua de laguna a la cual puede agregarse un poco de agua de grifo, hasta que el
material quede totalmente sumergido. Deben mantenerse destapados en un lugar
iluminado, con temperaturas de entre 10 y 20C preferentemente, durante
aproximadamente dos semanas. La exposicin a la luz solar durante algunos minutos puede
favorecer el crecimiento de flagelados y ciliados, pero podra ser perjudicial para las amebas.
Cada frasco debe ser rotulado con los datos de procedencia del material y la fecha de
realizacin del cultivo.
Elementos a utilizar:
Frascos con cultivos de invertebrados acuticos, portaobjetos, cubreobjetos, gotero, pinza
de punta fina o aguja histolgica, colorantes vitales (tinta china, azul de metileno, rojo
neutro), microscopio binocular.
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Procedimiento para realizar las preparaciones:

1) Tomar con una pinza un trozo del material vegetal contenido en el frasco de cultivo.
2) Frotar suavemente el material sobre un portaobjetos de vidrio limpio y cubrir con un
cubreobjetos.
3) Observar al microscopio, primero con objetivo de menor aumento (4 x) hasta
identificar un ejemplar y luego pasar a mayor aumento (10 x) para reconocer los
detalles estructurales.
4) Luego del anlisis de los distintos ejemplares sin coloracin, ubicar una gota del
colorante seleccionado en uno de los extremos del cubreobjetos utilizando un gotero.
5) Absorber suavemente el contenido del preparado con un trocito de papel de filtro,
desde el lado opuesto al cual se coloc el colorante.
6) Observar bajo microscopio, a fin de reconocer diversos procesos fisiolgicos y
estructuras, segn el colorante utilizado.
Algunas de las observaciones que son posibles realizar en Protistas son:
- Locomocin: Para observacin de los mecanismos de locomocin de protozoos y de los
orgnulos implicados en estos procesos (cilios, flagelos, membranelas) pueden utilizarse azul
de metileno y tinta china. El azul de metileno debe utilizarse muy diluido en agua destilada
(1: 100.000 aproximadamente), aunque la dilucin puede ajustarse si es muy dbil o muy
intensa. La tinta china no colorea realmente a los organismos sino que proporciona un
contraste en el medio acutico que rodea a los orgnulos de locomocin como cilios y
flagelos, facilitando su observacin.
- Digestin: Los procesos de formacin de vacuolas digestivas en ciliados y otros protozoos
pueden ser visualizados utilizando, entre otros colorantes: leche con rojo congo o rojo
carmn.

b. Elaboracin de preparaciones microscpicas semipermanentes.

Las preparaciones microscpicas semipermanentes o temporales se mantienen en
buenas condiciones por algunas horas o varios das, pero implican la fijacin de los
ejemplares.
Algunos de los colorantes utilizados en estos casos son el verde de metilo, solucin de Lugol,
carmn actico, rojo neutro, hematoxilina de Delafield o de Erlich, etc.
En preparaciones de protistas, puede obtenerse una buena coloracin de la
morfologa general utilizando numerosos colorantes, entre los que mencionaremos al rojo
neutro y a la solucin de Lugol. El rojo neutro, adems de proveer una tincin citolgica
general, colorea vacuolas digestivas recientemente formadas (pH cido). La solucin de
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Lugol tambin resulta til para la observacin de la morfologa gruesa de protistas. Tambin
puede utilizarse la tintura de iodo de uso medicinal, pero debe diluirse con agua destilada ya
que es una solucin alcohlica. Tambin pueden obtenerse buenas coloraciones usando
Hematoxilina de Delafield o de Erlich, las cuales tien ncleos y detalles citoplasmticos de
los protozoos. Ambas soluciones contienen glicerina, lo que permite que los preparados se
conserven por varias semanas. La utilizacin de verde de metilo o carmn actico permiten la
observacin del nmero y forma de los ncleos.
Durante esta parte del taller, adems de la realizacin de las preparaciones de protistas con
coloraciones semipermanentes, se elaborarn preparaciones de nemtodes de suelo o
fitoparsitos.
Elementos a utilizar:
Ejemplares previamente fijados de nemtodes de suelo o fitoparsitos (en F.A.A., F.S. 4:1 u
otro lquido fijador), portaobjetos, cubreobjetos, aguja histolgica o pincel fino, medios de
montaje (glicerina pura o lactofenol), gotero, esmalte para uas, etiquetas autoadhesivas,
microscopio binocular.
Procedimiento para realizar las preparaciones:
1) Colocar sobre un portaobjetos limpio una gota del mismo lquido fijador o del medio
de montaje elegido (en este caso se utilizar glicerina). La gota debe ser de tamao tal
que abarque slo la superficie del portaobjetos que ser cubierta por el cubreobjetos.
2) Tomar con una aguja histolgica o pincel fino un ejemplar de nemtode y apoyarlo
suavemente en un pequeo trozo de papel absorbente, para evitar que arrastre un
exceso de lquido fijador. Transferirlo al portaobjetos, sobre la gota de glicerina.
3) Cubrir suavemente con un cubreobjetos.
4) Sellar el preparado, rodeando los bordes del cubreobjetos con esmalte para uas.
Asegurarse que todo el permetro est totalmente cubierto para evitar la desecacin del
preparado.
5) Rotular el preparado, con los datos correspondientes a: ejemplar montado, lugar de
procedencia, fecha de realizacin, etc.
6) Observar al microscopio, primero con objetivo de menor aumento (4 x) hasta
identificar un ejemplar y luego pasar a mayor aumento (10 x) para reconocer los detalles
estructurales.

c. Elaboracin de preparaciones microscpicas permanentes.

Las preparaciones microscpicas permanentes mantienen el material biolgico en
buenas condiciones para la observacin durante muchos aos. El paso clave para lograr
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preparaciones permanentes exitosas es la correcta deshidratacin del material a montar, ya

que si quedan en el mismo algunas gotas de agua, aparecern al cabo de cierto tiempo
nubes blanquecinas en el preparado, que impedirn la observacin. Este proceso de
deshidratacin se realiza mediante el pasaje de los ejemplares por una serie de alcoholes de
concentracin creciente, hasta llegar al alcohol absoluto (100%). El material biolgico a
montar puede colorearse previamente o no.
Durante esta parte del taller, se realizarn preparaciones permanentes de pequeos
artrpodos sin tincin, como ser pseudoescorpiones, piojos, pulgones, etc.
Elementos a utilizar:
Ejemplares de artrpodos pequeos previamente fijados en alcohol 70%, portaobjetos,
cubreobjetos, aguja histolgica o pinza de punta fina, medios de montaje (blsamo de
Canad natural o sinttico, resina sinttica), serie de alcoholes etlicos de concentracin
creciente (80, 96 y 100%), xilol, etiquetas autoadhesivas, microscopio binocular.
Procedimiento para realizar las preparaciones:
1) Tomar con una aguja histolgica o pinza de punta fina un ejemplar del artrpodo a
montar.
2) Deshidratar el ejemplar pasndolo por una serie de alcoholes etlicos 80%, 96% y
alcohol etlico absoluto (100%), durante cinco minutos en cada uno.
3) Hacer un pasaje rpido (aclaracin) por xilol, de 10- 15 segundos.
4) Colocar sobre un portaobjetos limpio una gota de blsamo de Canad o resina
sinttica. La gota debe ser de tamao tal que abarque slo la superficie del portaobjetos
que ser cubierta por el cubreobjetos.
5) Transferir el ejemplar al portaobjetos, sobre la gota del medio de montaje.
6) Cubrir suavemente con un cubreobjetos.
7) Rotular el preparado, con los datos correspondientes a: ejemplar montado, lugar de
procedencia, fecha de realizacin, etc.
8) Observar al microscopio, primero con objetivo de menor aumento (4 x) hasta
identificar un ejemplar y luego pasar a mayor aumento (10 x, 40 x) para reconocer los
detalles estructurales. Los preparados permanentes pueden observarse con objetivo de
100 x, utilizando aceite de inmersin.

d. Preparacin, fijacin y conservacin de ejemplares macroscpicos.

En esta seccin del taller, se realizarn preparaciones de ejemplares macroscpicos de
algunos invertebrados (lombrices de tierra, calamares) y se efectuar la fijacin adecuada
para su conservacin.
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Elementos a utilizar:
Ejemplares de invertebrados de mayor tamao corporal (lombrices de tierra recientemente
fijadas, calamares congelados adquiridos en el comercio), bandejas plsticas, aguja
histolgica o pinza de punta fina, bistur o tijera de diseccin, portaobjetos, placas de Petri
con parafina, alfileres finos, lquidos fijadores (formol 4%, alcohol 70%), lupa binocular.
Procedimiento para realizar la preparacin de lombrices de tierra (Annelida,
Megascolescidae):
1) Para su fijacin, colocar los ejemplares en un recipiente con agua, la cual ser

entibiada por encima de los 40C, o en un recipiente con alcohol 50%. Al cabo de unos
minutos las lombrices quedarn con el cuerpo extendido, facilitando su posterior
observacin y preparacin.
2) Tomar la lombriz entre los dedos pulgar e ndice de la mano izquierda, con el extremo
posterior hacia la palma de la mano y con la superficie dorsal (ms oscura) hacia arriba.
3) Realizar un corte longitudinal con una tijera de punta curva o recta, desde la abertura
bucal hacia la regin clitelar, sin introducir demasiado la punta de las tijeras para no
daar los rganos internos.
4) Una vez realizado este corte, colocar el ejemplar sobre una placa de Petri con parafina
y fijarlo con un alfiler en el extremo anterior y con otros dispuestos en forma oblicua a
ambos lados de la pared del cuerpo.
5) Completar el corte mediodorsal utilizando tijeras de punta fina, hasta casi alcanzar el
extremo posterior del cuerpo.
6) De ser necesario, cortar los septos con bistur o tijeras.
7) Agregue agua de grifo a la placa, hasta cubrir el animal.
8) Observar bajo lupa binocular para el reconocimiento de rganos internos.
9) Conservar el ejemplar agregando a la placa formol 4% hasta cubrir el cuerpo y taparla.
Al cabo de 3- 4 das, el cuerpo adquiere cierta rigidez y pueden quitarse los alfileres y
guardar la lombriz en un recipiente plstico hermtico. Otra opcin para la conservacin
es ubicar el ejemplar entre dos cubreobjetos y atar ambos extremos con un hilo de
algodn.
10) Los ejemplares pueden fijarse y conservarse en formol 4- 5% o en alcohol 70%.

Procedimiento para realizar la preparacin de calamares (Mollusca, Cephalopoda):

1) Colocar el ejemplar fresco sobre la bandeja, con la superficie ventral hacia arriba.
2) Levantar el borde del manto y, con la tijera de punta fina, efectuar un corte
longitudinal hasta el extremo posterior del cuerpo entre ambas aletas. Mantener elevado
el manto durante el corte para no daar los rganos internos.
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3) Abrir ambos lados del manto para exponer el contenido de la cavidad paleal.
4) Desprender suavemente con las tijeras o la pinza, la delgada membrana que recubre
los rganos internos.
5) Realizar el reconocimiento de las estructuras internas a simple vista.
6) Extraer la valva interna (pluma), levantando parcialmente el cefalopodio y efectuando
un corte en el borde del manto (superficie dorsal). Tirar suavemente del extremo de la
pluma con la pinza y quitarla.
7) Extraer las mandbulas quitinosas y la rdula con la pinza de punta fina.
8) Montar la rdula entre portaobjetos y cubreobjetos con una gota de glicerina y
observar con el microscopio binocular.
9) Conservar el ejemplar dentro de un recipiente plstico hermtico, agregando formol
4% hasta cubrir el cuerpo. Al cabo de 10- 15 das, reemplazar el formol por alcohol 70%.

Frmulas de Colorantes, Lquidos Fijadores y Conservadores:

- Colorantes:
Azul de metileno, verde de metilo, rojo neutro: colorantes vitales que pueden

prepararse en soluciones acuosas de baja concentracin para observacin de pequeos

organismos vivos. Tambin se utilizan en diversas mezclas para teir diferentes tejidos.
Leche con rojo congo o rojo carmn: agregar unas gotas de solucin acuosa de rojo congo

a la leche.
Solucin de Lugol: Solucin de Lugol: tambin llamada Yodo de Lugol.

Yodo (I2) . 5g
Yoduro de potasio (KI) .10 g
Agua destilada .100 ml

Carmn actico: Mezclar ambos componentes y hervir durante 5 horas aproximadamente,

hasta obtener una solucin saturada. Enfriar y filtrar. Mantener en refrigerador o lugar
fresco.
Carmn .... 1 g
cido actico al 45% .. 100cc

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Hematoxilina de Delafield:

Es adecuado para la tincin de platelmintos parsitos,

especialmente.
Hematoxilina al 3,5% en alcohol absoluto 100 cc
Alumbre de amonio al 6,5% acuoso .. 320 cc
Glicerina . 80 cc
Hematoxilina de Erlich: Disolver la hematoxilina en alcohol y el cido. Disolver el alumbre

en agua caliente y mezclar todo. La solucin dura varios aos.

Agua destilada ... 100cc
Alcohol absoluto 100cc
Glicerina . 100cc
cido actico glacial .. 10cc
Cristales de hematoxilina 2 g
Alumbre de potasio .. 10 g
- Lquidos Fijadores, Conservadores y de Montaje:
F.A.A.: Este fijador est recomendado para la mayora de los tejidos animales y vegetales,

por los buenos resultados que se obtienen. Es excelente para la fijacin de platelmintos,
nemtodes, insectos, etc. El tiempo mnimo de accin es de alrededor de 24 hs. en la
mayora de los ejemplares.
Formol comercial (40%).10 cc
Agua destilada . 35 cc
cido actico glacial ... 5 cc
Alcohol 96% .. 50 cc
F.S. 4:1: Para fijacin de nemtodes.

Formol comercial (40%) .. 10 ml

Agua destilada ... 1 ml
cido actico glacial .. 89 ml
Lactofenol: Este medio se recomienda para el montaje de nemtodes fitoparsitos (los

que en general son difciles de montar en preparaciones permanentes). Los bordes de las
preparaciones realizadas con este medio viscoso deben sellarse para que duren varios aos.
Fenol .. 20 g
cido lctico .... 20 g
Glicerina .. 40 g
Agua destilada . 20 g

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Formol 4%: el formol comercial se adquiere en una concentracin aproximada del 40%.

Se prepara mezclando 9 partes de agua por 1 parte de formol comercial.

Alcohol 70%: el alcohol etlico usado en concentracin del 70% es uno de los lquidos

fijadores usados ms frecuentemente, tanto para ejemplares enteros como para piezas
anatmicas.
Alcohol etlico 96% .. 500 cc
Agua de grifo o destilada 127 cc
Alcohol 80%:
Alcohol etlico 96% .. 500 cc
Agua de grifo o destilada 120 cc

BIBLIOGRAFIA:
Barnes, R.S.; P. Calow; P.J.Olive; D. Golding y J.I. Spicer. 2001. The Invertebrates: a synthesis.
Third Edition. Blackwell Science.
Gavio, G.; J.C. Jurez y H. Figueroa. 1987. Tcnicas biolgicas selectas de laboratorio y de
campo. Ed. Limusa, Mxico.
Hickman, F.M. y C.P. Hickman Jr. 1991. Zoologa: Manual de Laboratorio. Ed. McGraw-Hill
Interamericana, Madrid.
Rupert, E. y R.D. Barnes. 1996. Zoologa de los Invertebrados. 6ta. Ed. en espaol. Ed.
McGraw-Hill Interamericana, Madrid.

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