Tema 15

Modificacin de los genes para

su estudio

Anlisis funcional
Anlisis transcripcional
Determinacin de elementos de control de la transcripcin
Geles de retardo
Aislamiento de factores de transcripcin
Un hbrido
Anlisis del producto gnico
Construccin de mutantes nulos
Mutagnesis dirigida y al azar
ARN antisentido o ARN de interferencia
Sobreexpresin
Interaccin entre protenas
Factores de transcripcin: DBD y AD
Dos-hbridos

Modificacin de genes
Preparacin de una situacin base para el anlisis:
Eliminacin total o parcial del gen o de su expresin (mutantes
nulos)
Reversin de la mutacin por el propio gen

Mutagnesis de la regin codificante

Mutagnesis puntual
Anlisis de deleciones

Modificacin de promotores

Eliminacin/substitucin de regiones de control

Bsqueda de nuevas y/o mejoradas funciones del gen

Construccin de nuevos genes
Bsqueda de interacciones entre protenas

Integracin por recombinacin homloga

Reemplazamiento gnico

Mutagnesis mediante la extensin de un

oligonucletido

Mutagnesis mediante la extensin de un

oligonucletido

Transform E. coli
Again, most colonies
contain wild-type
DNA. Others, a mix
of wild- type and
mutant DNA, and
only a few, mutant
DNA

Most colonies
contain wild-type
DNA
Others, a mix of wildtype and mutant
DNA

Transform E. coli

Qu tenemos en el tubo de reaccin?

Una gran cantidad de molculas originales a las que no se ha unido el

oligo
Otra gran cantidad en las que se ha unido el oligo, pero no la
polimerasa
Otra gran cantidad en las que la polimerasa se ha detenido antes de
completar la reaccin

En todos estos casos E. coli va a degradar la copia mutante y va a

utilizar la silvestre como molde para sintetizar la doble cadena

Y una pequea cantidad de molculas con una cadena silvestre y otra

mutante, que en E. coli van a dar lugar (al menos en teora) a una
mezcla equitativa de plsmidos silvestres y mutantes

Mutagnesis mediante la extensin de un

oligonucletido
Problemas:

El ADN de nuestro gen tiene que ser clonado en M13

La eficiencia de la mutagnesis es baja, y depende de:

La capacidad de unin del oligonucletido

La actividad de la polimerasa
La actividad de la ligasa

El ADN sintetizado in vitro no va a estar metilado, y

ser ms susceptible a los mecanismos de reparacin
de E. coli, convirtindolo en ADN tipo silvestre
Necesitamos analizar individualmente muchos clones
para encontrar nuestro ADN mutante

Mutagnesis mediante la extensin de un

oligonucletido
Soluciones:

Seleccin de la hebra mutante: uso de fosforotioato

dCTPS

Digestin con PstI + degradacin por Exonucleasa III

Transformacin de E. coli

Mutagnesis mediante la extensin de un

oligonucletido
Soluciones:
Contraseleccin de la hebra tipo silvestre: (mtodo
Kunkel)
Estirpes dut, ung

dut: dUTPasa: degrada el dUTP

dentro de la clula
ung: uracil N-glicosilasa: elimina
el uracilo del ADN

Mutagnesis mediante casetes

Mutagnesis al azar
Minigenotecas de oligonucletidos modificados

Mutagnesis al azar
Minigenotecas de oligonucletidos modificados

Mutagnesis al azar
PCR proclive al error:

Incremento de Mg
Adicin de Mn
Concentracin de dNTPs
Concentracin de polimerasa
Adicin de dITP

Los productos de PCR tienen que ser analizados

funcionalmente

La tecnologa antisentido

ARNi y silenciamiento gnico

Rnasa III (Dicer) especfica de ARN de doble cadena genera fragmentos de
21-23 nucletidos (siRNAs) que se unirn al ARNm
RNA polimerasa dependiente de ARN (RdRp) crea ms moleculas de ARN de
doble cadena
RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) degrada los dplex
mRNA-siRNA

Sobreexpresin
Promotores fuertes
Promotores controlados

Anlisis funcional
Anlisis transcripcional
Determinacin de elementos de control de la transcripcin
Geles de retardo
Aislamiento de factores de transcripcin
Un hbrido
Anlisis del producto gnico
Construccin de mutantes nulos
Mutagnesis dirigida y al azar
ARN antisentido o ARN de interferencia
Sobreexpresin
Interaccin entre protenas
Factores de transcripcin: DBD y AD
Dos-hbridos

Factores de transcripcin

Estructura de Gal4p

Dominio de unin a ADN

Dos-hbridos

Plsmidos ms habituales

Resultado dos-hbridos

Controles

Diferentes Genes

Diferentes Promotores

Tres-hbridos

Tres-hbridos

Anlisis de interacciones entre protenas