,

Osmometra
Las medidas de las propiedades coligativas (concentracin molar) de la disolucin de un
polmero involucra el clculo de las molculas de soluto (polmero) en una cantidad dada
de disolvente, la cual proporciona una medida en nmero de molculas. La nica propiedad
coligativa que se mide sin problema en los polmetros de alto peso molecular es la presin
osmtica.
La presin osmtica parte de la utilizacin de una membrana semipermeable por la cual
pasan libremente las molculas del disolvente. Las membranas reales slo brindan una
versin aproximada de la semipermeabilidad ideal, siendo la limitacin el paso por medio
de la membrana de cadenas del polmero de bajo peso molecular.
Debido a que la presin osmtica depende de las propiedades coligativas y del nmero de
partculas, la medida de esta presin (osmometra) podra aplicarse a la determinacin de la
presin osmtica de disolventes en relacin con las desilusiones de los polmeros.

Osmmetros
Los osmmetros son instrumentos creados para medir la presin osmtica entre un solvente
y una solucin, aunque en algunos casos tambin son empleados para determinar la
osmolaridad de la soluciones (la concentracin de los solutos causantes de la presin
osmtica).
Existen diferentes tipos de osmmetros:

-Osmmetro esttico
-Osmmetro dinmico
-Osmmetro de presin a vapor
-Osmmetros de descenso crioscpico

La ultracentrifugacin analtica consiste en un conjunto de mtodos (velocidad y

equilibrio de sedimentacin) que permiten la determinacin del tamao, la forma global
aproximada, y el grado de homogeneidad de protenas y otras macromolculas biolgicas
en disolucin. Estos mtodos estn especialmente adaptados para la deteccin y la
caracterizacin cuantitativa de las interacciones (proporcin de especies, estequiometra,
reversibilidad y afinidad) que dan lugar a la formacin de complejos macromoleculares,
incluyendo las interacciones protena-protena, DNA- protena y receptor-ligando [Howlett
et al. (2006) Curr. Opin. Chem. Biol. 10:430-436; Lebowitz et al. (2002) Protein Sci.
11:2067-2079; Minton (2000) Exp. Mol. Med. 32:1-5; Rivas et al. (1999) Methods 19:194212].

La Unidad posee una ultracentrfuga analtica modelo XL-I equipada con

dos sistemas pticos de deteccin: UV-VIS de longitud de onda variable e
interferencia de Raleigh. Esta ltima tcnica permite el estudio de
macromolculas en disoluciones con alta absorcin en el UV-VIS.

Desde su creacin en 1994, esta Unidad del CIB ha dado apoyo

cientfico-tcnico en la caracterizacin biofsica de protenas y sus
interacciones a un gran nmero de grupos de investigacin del CSIC,
universidades, empresas, as como a otros centros de investigacin
nacionales y extranjeros. Esta Unidad cuenta con el asesoramiento y la
colaboracin de grandes expertos internacionales en estas
metodologas. En 2009 el laboratorio consigui la certificacin
conforme a la norma ISO9001 con el cdigo ER-0286/2009.

Certificacin AENOR en ISO9001.

La dispersin de luz dinmica proporciona informacin rpida y complementaria a la

obtenida mediante ultracentrifugacin analtica, aportando dos grandes ventajas frente a
otros mtodos analticos como el bajo volumen de muestra requerido (15-45 l) y la
rapidez en la obtencin de los resultados (<10 min). La tcnica permite conocer el grado de
polidispersidad de una muestra, determinar el coeficiente de difusin traslacional de las
especies macromoleculares en disolucin y calcular su radio hidrodinmico. Este equipo
(modelo DynaPro MS/X, Wyatt Inc.) tiene un manejo muy sencillo (cubeta) con un sistema
de regulacin de la temperatura por Peltier (4-60C) y se puede utilizar para el anlisis de
diferentes tipos de macromolculas como protenas, polisacridos y micelas lipdicas.

La ultracentrifugacin

Consiste en someter una mezcla homogeneizada a una velocidad de rotacin

muy alta, de forma que, a velocidades ms lentas, sedimentan los
componentes ms grandes, y a velocidades mayores, los componentes ms
pequeos. Es decir, que aunque las masas de diferentes partculas sean muy
similares, sedimentan en tiempos distintos. El instrumento utilizado es la
ultracentrfuga.

MTODOS DE ULTRACENTRIFUGACIN ANALTICA EN EL CIB: Consideraciones

generales y aspectos prcticos.
Velocidad de Sedimentacin
Fundamentos. En un experimento de velocidad de sedimentacin las
macromolculas se someten a un campo centrfugo elevado tal que la fuerza
de centrifugacin es mayor que la de difusin, por lo que existe un transporte
neto de material hacia el fondo de la celda. Es un mtodo hidrodinmico de
transporte que permite fraccionar las macromolculas en base a las diferencias
en coeficiente de sedimentacin (una funcin de la masa, la densidad y la
forma macromolecular).
Aplicaciones. La primera informacin que estos experimentos nos darn es el
grado de homogeneidad o heterogeneidad de las especies macromoleculares
que sedimentan. Este fraccionamiento tambin puede ser muy til para
detectar y cuantificar la estequiometra y la afinidad de complejos
macromoleculares. De esta informacin podemos tambin estimar la forma
aproximada de macromolculas en disolucin.
Anlisis preliminar. Clculo de coeficientes de sedimentacin: programas
SEDFIT y SVEDBERG (accesibles en los enlaces relacionados indicados en la
pgina web del Servicio).
Aspectos prcticos.
La absorbancia de la muestra frente a su correspondiente tampn ha de ser
menor de 1,3 (unidades de absorcin a la longitud de onda de trabajo). Es
necesario poner en cada celda de la ultracentrfuga el tampn de muestra (que
se usa como referencia). Se recomienda hacer el experimento a varias
concentraciones (al menos tres). Volumen de muestra: 300-400 L. Tiempo
aproximado del experimento: 2 h.

Equilibrio de Sedimentacin
Fundamento. En la modalidad de equilibrio de sedimentacin las muestras se
someten a campos centrfugos moderados hasta que se igualan las fuerz
as opuestas de centrifugacin y difusin (condicin de equilibrio).
En estas condiciones, las especies macromoleculares se distribuyen formando
un gradiente de concentracin que se caracteriza porque a) no vara con el
tiempo, b) es independiente de las propiedades hidrodinmicas (forma) de las
macromolculas y c) depende nicamente de la masa molecular de la especie
que sedimenta. Este ltimo punto es muy importante, ya que implica que esta
tcnica permite estudiar procesos de asociacin en los que no es posible
separar fsicamente las diferentes especies moleculares presentes (por
ejemplo, interacciones dbiles). Si conocemos la dependencia con la
composicin de la masa molecular, es posible modelar dicha dependencia en el
contexto de diferentes esquemas de asociacin.
Aplicaciones. Esta tcnica permite la determinacin de la masa molecular de
las especies macromoleculares que sedimentan, as como la deteccin y el
anlisis cuantitativo (en trminos de estequiometra, afinidad y reversibilidad)
de las asociaciones que dan lugar a la formacin de complejos
macromoleculares en disolucin.
Anlisis preliminar. Clculo de masas moleculares promedio: programas
EQASSOC y XLAEQ, paquete de programas de anlisis que se suministran con
el equipo, y SEDPHAT (accesibles en el sitio RASMB, ver enlaces relacionados).
Aspectos prcticos.
La absorbancia de cada muestra en la celda, medida frente a su
correspondiente tampn, ha de estar en el intervalo de 0.1-0.6 unidades de
absorcin a la longitud de onda elegida (preferiblemente en un mximo de
absorcin, en el intervalo entre 220 y 600 nm). Es necesario poner en cada
celda de medida de la ultracentrfuga el tampn de muestra (que se usa como
referencia). La medida de la absorbancia se suele realizar en un
espectrofotmetro con una cubeta de paso ptico de 1 cm. Para correlacionar
esta medida con la seal que se detectar en las celdas de la ultracentrfuga
debe tenerse en cuenta el paso ptico de dichas celdas. A) Las piezas centrales
que se emplean ms habitualmente tienen un paso ptico de 1.2 cm. En este
caso, una absorbancia de 1.0 en el espectrofotmetro dara 1.2 en la
ultracentrfuga. B) Si las muestras dan una absorbancia superior a 0.6 pueden
emplearse celdas de paso ptico de 0.3 cm (donde una absorcin de 1.0 UA,
medida espectrofotomtricamente, dara una seal en la ultracentrfuga de
0.3). Se recomienda hacer el experimento a varias concentraciones de
muestra (al menos tres) y a varias velocidades angulares (al menos dos).
Volumen de muestra: normalmente 80 L, aunque puede ser de 60-120 L (a
mayor volumen mayor precisin en el anlisis, pero a costa de que el tiempo
necesario para alcanzar el equilibrio de sedimentacin aumenta
considerablemente). Tiempo aproximado del experimento: 15-24 h (80 L).
Muestras lbiles: se pueden reducir estos tiempos usando procedimientos
experimentales especficos.

Cromatografa de permeacin en gel

La cromatografa de permeacin en gel, tambin conocida como cromatografa
de exclusin es una variante de la CLAE que consiste en una columna
cromatogrfica empacada de tal manera que las partculas de dicho
empacamiento tienen diferentes tamaos de poros o de redes de poros con el
fin de que las molculas de soluto sean retenidas o excluidas basndose en su
forma y tamao y no en el peso molecular.
Bajo este entendido, las molculas de mayor tamao no caben dentro de los
poros y son arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son
excluidas y eluyen en el volumen de cama de vaco de la fase mvil. Por el
contrario, las partculas de menor tamao eluyen hasta el final porque tiene
ms espacio de columna que recorrer debido a un fenmeno de difusin haca
los poros que tienen accesibles. Las molculas de tamaos intermedios tardan
diferentes tiempos en eluir, debido a la cantidad de poros por los que puedan
pasar.

Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos

columna. Entre ellos estn los polmeros macromoleculares semirgidos, los
entrecruzados, las slices rgidas las de poro controlado. Los materiales
semirgidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su uso ya
que se limitan a una presin de 300psi. Las cuentas de poliestireno
parcialmente sulfonado que tienen un tamao usual de 5m, son buenas para
usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados son compatibles con
sistemas no acosos.
Otro tipo de empacamiento hidroflico poroso es preparado mediante una
polimerizacin por suspensin de metacrilato de 2-hidroxietilo con
dimetacrilato de etileno. Estos empacamientos resisten presiones de hasta
3000psi y pueden ser usados con sistemas acuosos y una amplia gama de
disolventes orgnicos polares.
Disolventes. La cromatografa de exclusin requiere un solo disolvente durante
el anlisis en el cual se pueda disolver la muestra. El nico inconveniente que
pude presentarse con los disolventes es la relacin de viscosidades. Cuando la
viscosidad de la muestra inyectada difiere mucho con la viscosidad de la fase
mvil se pueden dar, una distorsin en los picos cromatogrficos y cambios
anmalos en los tiempos de retencin.
La cromatografa de permeacin en gel (GPC) y la cromatografa de exclusin
por tamao (SEC) son tcnicas utilizadas para medir la distribucin del peso
molecular de los polmeros naturales y sintticos. Esta caracterstica in uye en
muchos de los parmetros fsicos de los materiales tales como la fuerza, la
rigidez y la resistencia qumica. La GPC y SEC son tcnicas cromatogrfi cas
que separan cadenas de polmeros individuales en funcin de su tamao en la
disolucin y no en funcin de sus caractersticas qumicas. La GPC se utiliza
para describir el anlisis de polmeros en disolventes orgnicos, tales como el
tetrahidrofurano. Por su parte, la SEC se emplea para describir el anlisis de
polmeros en agua y disolventes basados en agua, tales como disoluciones
tampn. Ambas tcnicas constituyen el nico mtodo probado para obtener
una completa comprensin de la distribucin del peso molecular de los
polmeros.
Mecanismos de GPC/SEC Las molculas de polmeros se disuelven en
soluciones para formar espirales cuyo tamao depende de su peso molecular
Espirales de polmeros introducidas al ujo de elucin a travs de una columna
Columna rellena con perlas porosas insolubles con una estructura porosa bien
defi nida Tamao de los poros similar al de las espirales de polmeros Las
espirales de polmeros se difunden dentro y fuera de los poros El resultado es
una elucin basada en el tamao: las espirales de mayor tamao primero; las
de menor tamao, despus Separacin por tamao convertida a separacin
por peso molecular mediante el empleo de una curva de calibracin formada
por el uso de patrones de polmeros

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Las tcnicas cromatogrficas estn basadas en la separacin de los
componentes de una mezcla, aprovechando la distribucin de dichos
componentes entre dos fases: la fase mvil y la fase estacionaria.
Generalmente, mediante el empleo de una columna que contiene la fase
estacionaria, los compuestos a separar son arrastrados por la fase mvil y son
analizados a su paso por el detector. Si la fase mvil es un gas, da lugar a la
cromatografa de gases, mientras que si es un lquido, se denomina
cromatografa lquida. La cromatografa de exclusin es un tipo de
cromatografa lquida en la cual la fase estacionaria es slida y la fase mvil es
lquida. Se utiliza el trmino de Cromatografa de exclusin por tamao.
Tambin se denomina cromatografa de permeabilidad sobre gel (GPC) o de
permeacin en gel. Su principal aplicacin es la separacin de las molculas en
funcin de su tamao con la finalidad de estudiar el peso molecular y
distribucin de los polmeros3). El inicio de esta tcnica se estableci a partir
de la preparacin de microesferas de geles de compuestos orgnicos y
biolgicos solubles en agua, los cuales se aplicaron a la separacin de

polmeros disueltos en disolventes orgnicos utilizando un relleno de

poliestireno. En consecuencia, la tcnica se denomin permeabilidad en gel
(GPC). Actualmente esta tecnologa es rpida y permite trabajar a presiones
elevadas mediante el empleo de nuevos rellenos con una distribucin de poros
muy precisa y una resistencia mecnica apropiada para altas presiones. Las
principales caractersticas de esta tcnica cromatogrfica son: Fase
estacionaria es inerte, por lo que la columna no se desactiva. La muestra no
interacciona qumicamente con la fase estacionaria, ni con la fase mvil. Los
solutos son generalmente sustancias de peso molecular elevado (mayores de
2000). Dependiendo de su medida y estructura, stos se retienen o se eluyen a
travs de la columna.
No se pueden emplear gradientes de elucin en la fase mvil. En la figura 1 se
muestra el esquema tpico de un equipo GPC.

El relleno de columna se comporta como un tamiz o filtro dnde se distinguen

tres tipos de molculas: - Molculas permeables: molculas pequeas que
entran el interior del relleno poroso, pasan lentamente y quedan retenidas en
el poro. - Molculas fraccionables: molculas intermedias que entran de
manera parcial en el relleno poroso. - Molculas excluidas: molculas de
medida superior al poro del relleno que no entran en el relleno y pasan
rpidamente por l. La figura 2 muestra el esquema correspondiente al relleno
de la columna.

En lo que respecta a la fase estacionaria, se utiliza un material poroso con las

siguientes caractersticas: uniformidad en la granulometra de las esferas y en
la medida de los poros; estabilidad qumica (sobre todo al pH y a la
temperatura); mxima inercia frente a los compuestos a separar; preparacin
rpida y sencilla; y resistencia mecnica a las alta presiones. Estos materiales
pueden clasificarse segn su constitucin qumica (inorgnicos u orgnicos),
exibilidad de su estructura (hinchables o rgidos), microestructura (aerosoles,
xerosoles o mixtos) y origen (natural, sintticos o combinados). Para
seleccionar la fase estacionaria hay que tener en cuenta el tipo de separacin a
efectuar (resolucin total o separacin en dos fracciones), la selectividad del
gel respecto a los productos que se quieren separar y la distribucin de pesos
moleculares de los componentes de la muestra. La caracterstica principal del
eluyente empleado como fase mvil es que debe arrastrar los diferentes
componentes, sin interaccionar ni con la muestra ni con la fase estacionaria.
Por tanto, la muestra debe ser soluble en la fase mvil para evitar
interferencias en los resultados. Adems de la estabilidad qumica, hay otros
parmetros a tener en cuenta: A mayor viscosidad, menos reproducibles son
los resultados. El aumento de la temperatura favorece la resolucin de la
muestra, ya que la difusin se produce con mayor facilidad. Los valores bajos
de fuerza inica favorecen las interacciones inicas soluto fase estacionaria,
mientras los valores altos favorecen las interacciones hidrofbicas. El pH
inuye en la ionizacin de los solutos y grupos activos de la fase estacionaria.
Al aumentar el ujo del eluyente se produce una disminucin de la eficacia de
la columna.
Las columnas pueden ser de vidrio borosilicato o de material plstico
transparente. No se utilizan columnas metlicas para evitar fenmenos de
catlisis, que pueden provocar degradaciones del gel o de la muestra. Las
columnas (figura 3) deben ser fciles de limpiar e instalar y deben tener un
dimetro de partculas uniforme. No tienen que disponer de volmenes
muertos que puedan producir fenmenos de disolucin o de difusin de la
muestra (se recomienda que el volumen muerto no supere el 0,1% del volumen
del gel).

La dispersin de luz dinmica (DLS) es una tcnica ptica utilizada para

estimar la PSD de un ltex, requirindose adems resolver un problema inverso
mal condicionado (PIMC). En general, las tcnicas pticas se caracterizan por
su baja resolucin, que impide discriminar tamaos de partcula muy cercanos.
Una forma de incrementar la resolucin de la DTP estimada es combinando
mediciones independientes. En

(Monterroso et al. (2013) Methods 59: 349362; del Castillo et al. (2011)
Biochemistry, 50: 19912003)
https://books.google.com.mx/books?
id=FOobaAs4Wp4C&pg=PA101&lpg=PA101&dq=osmometria+polimeros&source=bl&o
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ejL8bHJAhUDQCYKHaG5CMEQ6AEIGzAA#v=onepage&q=osmometria
%20polimeros&f=false
https://books.google.com.mx/books?
id=9_7xnVy4GzsC&pg=PA418&dq=QUE+ES+LA+OSMOMETRIA&hl=es&sa=X&redir_es
c=y#v=onepage&q=QUE%20ES%20LA%20OSMOMETRIA&f=false
https://books.google.com.mx/books?
id=R3UchOiLvcQC&pg=PA350&dq=OSMOMETRIA+EN+POLIMEROS&hl=es&sa=X&redir
_esc=y#v=onepage&q=OSMOMETRIA%20EN%20POLIMEROS&f=false
https://books.google.com.mx/books?
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http://tecnopolimeros.blogspot.mx/2012/01/caracterizacion-de-macromoleculas.html
https://books.google.com.mx/books?
id=FOobaAs4Wp4C&pg=PA114&dq=ULTRACENTRIFUGACION+EN+POLIMEROS&hl=es&
sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=ULTRACENTRIFUGACION%20EN
%20POLIMEROS&f=false
Introduccin a la qumica de los polmetros
Escrito por Raimond B. Seymour,Charles E. Carraher

http://iespoetaclaudio.centros.educa.jcyl.es/sitio/upload/05.ultracentrifugacion.pdf
http://www.cib.csic.es/repositorio_bd/departamento/5/html/UCA-CIB.13oct2005.pdf
http://www.agilent.com/cs/library/selectionguide/public/5990-6868ES.pdf
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf

Caracterizacin de Macromolculas
La caracterizacin de los polmeros comprende diferentes mtodos y tcnicas de
evaluacin de parmetros. De acuerdo a lo que se requiera en cada caso podemos
distribuirlas de la siguiente forma:

Tcnica o equipo

Aplicacin tpica

Composicin qumica y microestructura

Anlisis elemental.

Composicin qumica.

Resonancia magntica nuclear de alta

resolucin (HRNMR) y de carbono trece.

Microestructura (ramificaciones y
secuencia en copolmeros).

Espectroscopia de infrarrojo.

Composicin qumica. Ramificacin y

cristalinidad en algunos polmeros.
Estructura qumica
Anlisis de compuestos voltiles en
polmeros y formulaciones.

Cromatografa de gases.

Caracterizacin por degradacin

trmica, de polmeros.
Pureza de monmeros y disolventes.
Identificacin y cuantificacin de
aditivos voltiles.

Pesos moleculares y su distribucin

Osmometra de Membrana.

Promedio numrico de peso molecular

(Mn).
Promedio pesado de peso molecular
(Mw).

Dispersin de la luz.

Parmetros estadsticos de tamao

(radio de giro y distancia de extremo a
extremo).
Forma de macromolculas en solucin.
Determinacin de ramificaciones.

Ultracentrifugacin.

Promedios de peso molecular Mz y

Mz+1.
Promedio viscosimtrico de peso
molecular Mv.

Viscosimetra de soluciones

Viscosidad intrnseca.
Ramificaciones.

Cromatografa de permeacin en gel

(GPC).

Distribucin de pesos moleculares.

Correlaciones.

Diferentes promedios.

Promedio de peso molecular.

Orden en estado slido y estructura

Estructuras cristalinas.
Microscopia electrnica de barrido
(SEM).

Estructuras de fracturas.
Estructuras en perfiles y pelculas.
Estudio de inclusiones, aglomerados y
huecos en matrices polimricas.

Microscopia electrnica de transmisin

(MET).

Estudio de la forma de cristales.

Estructuras fibrilares.
Porcentajes de cristalinidad.
Medida de dimensiones de cristales.

Difraccin de rayos X (DRX).

Estudio de fases en mezclas

polimricas.
Agregados moleculares.

Comportamiento trmico
Temperaturas de transicin en
polmeros.
Calorimetra diferencial de barrido
(DSC).

Determinacin de capacidades
calorficas.
Estabilidad trmica.
Cristalinidad.
Evaluacin de antioxidantes.
Cuantificacin de sustancias voltiles.

Anlisis termogravimtrico (TGA).

Estudios de termoestabilidad.
Cuantificacin de cenizas.
Cambios de volumen en funcin de la
temperatura.

Anlisis trmico-mecnico (TMA).

Transiciones de fase.
Mdulo tensil.
Punto de reblandecimiento.

Anlisis dinmico mecnico (DMA).

Estudio de propiedades viscoelsticas

de polmeros.
Determinacin de transiciones de
segundo orden.