Alexandre Borges Murad

INSTITUTO DE TECNOLOGIA EM IMUNOBIOLGICOS
MESTRADO EM TECNOLOGIA DE IMUNOBIOLGICOS
AVALIAO DE ALTERNATIVAS DE MEIO DE CULTIVO PARA

A PRODUO DA ERITROPOETINA HUMANA
RECOMBINANTE EXPRESSA EM CLULAS CHO EM
SUSPENSO
ALEXANDRE BORGES MURAD
RIO DE JANEIRO
2015
Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiolgicos
ALEXANDRE BORGES MURAD

SUSPENSO
Dissertao apresentada ao Instituto de Tecnologia em

Imunobiolgicos como parte dos requisitos para obteno
do ttulo de Mestre em Tecnologia de Imunobiolgicos
RIO DE JANEIRO
2015
ii
Trabalho realizado no Laboratrio de

Tecnologia
Virolgica
Bio-
Manguinhos, Fundao Oswaldo Cruz,

sob a orientao do D.Sc. Rodrigo
Coelho Ventura Pinto e do D.Sc.
lvaro Paiva Braga de Sousa.
iii
Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiolgicos

SUSPENSO
ORIENTADORES: D. Sc. Rodrigo Coelho Ventura Pinto

D. Sc. lvaro Paiva Braga de Sousa
Dissertao aprovada em 03 de maro de 2015
Examinadores:
________________________________
D. Sc. Marta Cristina de Oliveira Souza
Fiocruz/Presidente
________________________________
D. Sc. Ariane Leites Larentis
Fiocruz
________________________________
D. Sc. Aldo Tonso
USP
Rio de Janeiro
2015
iv
minha famlia e amigos,

Todas as conquistas almejadas e alcanadas foram possveis pelo apoio incondicional
de todos vocs. Agradeo, de todo o meu corao, a todos pelo carinho e pela
confiana!
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a Deus que, independente de crena, f ou religio, sempre me
mostrou os melhores caminhos e os melhores desafios para vencer constantemente.
Fiocruz e Bio-Manguinhos, pela oportunidade de fazer o MPTI, pelo incentivo de
sempre buscar o conhecimento e o aperfeioamento, como ser humano e profissional.
minha famlia, em especial meu pai Paulo Eduardo Murad, minha me Rita de Cssia
Borges Murad, meu irmo Leonardo Borges Murad e minha cunhada Luana Dalben
Murad. Amo muito todos vocs! Sem vocs, eu no seria ningum!
Aos meus orientadores, D. Sc. Rodrigo Coelho Ventura Pinto e D. Sc. lvaro Paiva
Braga de Sousa que, alm de considera-los profissionais excepcionais, eu os considero
dois grandes amigos. Sou muito grato por tudo que aprendi com vocs.
coordenao e secretaria do MPTI, Dra. Sheila Farage por toda luta e defesa que fez e
sempre far em prol dos seus alunos e Zara por todo cuidado e ateno prestados.
Meus mais sinceros agradecimentos.
Aos meus queridos amigos do Projeto EPO, Alvio Cardero, Anna Carolina Marinho,
Danilo Parmera, Eduardo Ruback, Esther Gutierrez, Ethiene Corra, Luana de Souza,
Mara Pellegrini, Marina Vergne, Tnia Pato e Tiago Pereira por todas as conversas,
motivaes e por me fazer acreditar que tenho amigos sempre por perto!
Natlia Pedra Gonalves, por simplesmente tudo! Por toda amizade, desde o primeiro
dia de mestrado, por todas as conversas e, principalmente, por todo carinho. Esse
mestrado no seria o mesmo sem voc! Obrigado por estar fazendo parte deste
momento to especial da minha vida! Eu amo voc!
Aos meus amados irmos de MPTI! Andr Vincius, Ariane Barcellos, Artur Boechat,
Camila Xavier, Christina Cerqueira, Jssica Yukie, Maria Carolina Martins, Mayra
Martho, Monique Stvale, Periela Vasconcelos, Priscila Ramos Martins, Robson Cruz e
Vivian Pereira. Minha mais nova famlia! J disse uma vez e sempre direi: amo muito
vocs!
Aos amigos do LATEV, LATER, LATIM e do LECC/UFRJ, por todo apoio prestado
que foi fundamental para o desenvolvimento deste projeto.
Aos amigos da vida, Artur de Souza, Bernardo de Noronha, Caroline Moutinho, Erick
Maia, Flvio Matassoli, Gabriel Vincenzi, Gustavo Rademacher, Henrique Hatano, Jean
de Oliveira Santos, Leonardo Montanholi, Pedro Leo, Thiago Patro e Weslley de
Paiva Santos. Mais uma vez, obrigado! Vocs podem contar comigo pra tudo como eu
conto com vocs!
Ao rgo fomentador FIOTEC, pelo fornecimento da bolsa de mestrado.
vi
Os homens devem moldar seu caminho. A partir do momento em que voc vir o
caminho em tudo o que fizer, voc se tornar o prprio caminho.
Miyamoto Musashi.
vii
NDICE
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...........................................................
XI
LISTA DE FIGURAS, GRFICOS E TABELAS..............................................
XV
RESUMO................................................................................................................. XIX
ABSTRACT.............................................................................................................
XX
1 INTRODUO.................................................................................................
1.1 Produo de biofrmacos em cultivos celulares.....................................
1.2 Glicosilao................................................................................................
1.3 Sistemas de cultivo....................................................................................
10
1.3.1 Cultivo em frascos...............................................................................
10
1.3.2 Cultivo em biorreatores......................................................................
11
1.3.2.1 Biorreatores do tipo tanque agitado.............................................
12
1.4 Modos de operao...................................................................................
13
1.4.1 Batelada simples..................................................................................
14
1.4.2 Batelada alimentada............................................................................
14
1.4.3 Contnuo e contnuo com reciclo celular...........................................
15
1.5 Meios de cultivo para clulas animais.....................................................
17
1.5.1 Fatores que interferem na produo e qualidade dos

biofrmacos..........................................................................................
18
1.5.1.1 Carboidratos...................................................................................
18
1.5.1.2 Aminocidos....................................................................................
19
1.5.1.3 Sais minerais...................................................................................
21
1.5.1.4 Vitaminas........................................................................................
21
1.5.1.5 Nucleotdeos....................................................................................
22
1.5.1.6 Elementos-trao..............................................................................
22
1.5.1.7 Soro fetal bovino.............................................................................
23
1.5.1.8 Fatores fsicos-qumicos.................................................................
23
2 PROPOSTA DE TRABALHO........................................................................
26
3 MATERIAL E MTODOS.............................................................................
27
3.1 Material......................................................................................................
27
3.1.1 Linhagem celular e banco de clulas de trabalho.............................
27
viii
3.1.2 Meio de cultivo controle......................................................................
27
3.1.3 Meios de cultivo alternativos..............................................................
27
3.1.4 Sistemas de cultivo...............................................................................
29
3.2 Mtodos......................................................................................................
29
3.2.1 Quantificao celular..........................................................................
29
3.2.2 Anlise bioqumica para determinao da concentrao de

glicose e lactato.....................................................................................
3.2.3 Determinao da concentrao de Eritropoietina humana
recombinante (EPOhr)........................................................................
30
3.2.4 Criao do banco de clulas de trabalho...........................................
31
3.2.5 Descongelamento de clulas CHO para experimentao.................
32
3.2.6 Sub-cultivos das clulas CHO e cintica comparativa entre os

meios......................................................................................................
32
3.2.7 Cultivo em biorreator..........................................................................
33
3.2.8 Clculo das taxas especficas e rendimentos.....................................
35
4 RESULTADOS.................................................................................................
37
4.1 Cultivos celulares para adaptao de clulas CHO com meios

alternativos e cinticas comparativas.....................................................
4.1.1 Adaptao e cintica comparativa entre os meios SFM4CHO
Utility e SFM4CHO..........................................................................
Utility e HyCell sem HT....................................................................
Utility e CD FortiCHO......................................................................
Utility e Cellvento CHO-110 sem HT..............................................
Utility e CPCHO................................................................................
4.1.6. Integral de Clulas Viveis (ICV).....................................................
30
37
39
42
47
50
54
57
4.2. Cultivo em biorreator com meio SFM4CHO .....................................
59
5 DISCUSSO.....................................................................................................
62
6 CONCLUSO...................................................................................................
67
7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...........................................................
69
ix
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AG
AIDS
AMPK
ANVISA
Letra grega alfa

Aparelho de Golgi
Sndrome da Imunodeficincia Adquirida (do ingls Acquired
Immunodeficiency Syndrome)
Enzima quinase ativada por AMP
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria/Brasil
Asn
Aminocido Asparagina
BHK
Clulas de rim de filhotes de hamster (do ingls, baby kidney hamster)
Bio-Manguinhos
C
CDA
CHO
CIGB
CIM
CMC
COPPE
CO2
Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos

Graus Celsius
Conjugado Droga-Anticorpo
Clulas de ovrio de hamster chins (do ingls, Chinese hamster
ovary)
Centro de Engenharia Gentica de Biotecnologia/Cuba (do espanhol,
Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa)
Centro de Imunologia Molecular/Cuba (do espanhol, Centro de
Inmunologa Molecular)
Carboximetilcelulose
Instituto Alberto Luiz Coimbra de Ps-Graduao e Pesquisa de
Engenharia
Dixido de carbono
DHFR
Diidrofolato Redutase (do ingls, Dihidrofolate Reductase)
DMSO
Dimetilsulfxido
ELISA
EPO
EPOhr
Ensaio Imunoenzimtico (do ingls, Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay)
Relativo Alfaepoetina
Eritropoetina humana recombinante
[EPOhr] max
EUA
Fiocruz
Concentrao mxima de EPOhr produzida

Estados Unidos da Amrica
Fundao Oswaldo Cruz
Fuc
Fucose
Gal
Galactose
GalA
cido Galacturnico
GalN
Galactosamina
Glc
Glicose
GlcA
cido Glucurnico
GlcN
Glicosamina
GlcNac
GS
HEK293
Carboidrato N-acetilglicosamina
Glutamina Sintetase
Clulas de rim de embrio humano 293 (do ingls, Human Embryonic
Kidney)
HK
Enzima Hexoquinase
HPV
Vrus do Papiloma Humano (do ingls, Human Papiloma Virus)
HT
Hipoxantina e Timidina
ICV
Integral de Clulas Viveis
IC95%
Intervalo de Confiana com 95% de confiana
IdoA
cido Idurnico
IFA
Ingrediente Farmacutico Ativo
IFN-
IGF
IP
Kdn
Interferon-
Fator de Crescimento tipo-Insulina
Iodeto de Propdio
cido 2-ceto-3-deoxinnico
xi
LATEV
LECC
Laboratrio de Tecnologia Virolgica

Laboratrio de Engenharia do Cultivo Celular
Ln
Logaritmo Neperiano
exp
Taxa especfica de crescimento celular da fase exponencial
Man
Carboidrato Manose
ManA
cido Manurnico
ManN
Manosamina
ManNAc
N-Acetilmanosamina
MEM
Meio Essencial Mnimo
mRNA
cido ribonucleico mensageiro
MS
Ministrio da Sade
MSX
Droga Metionina Sulfoximida
MTX
Droga Metotrexato
NaHCO3
Bicarbonato de sdio
Neu5Ac
cido N-Acetilneuramnico
Neu5Gc
cido N-Glicolilneuramnico
OD
Oxignio dissolvido
OGT
Enzima N-Acetilgalactosamina transferase
OMS
Organizao Mundial de Sade
OST
Enzima Oligossacariltransferase
PAF
Programa de Assistncia Farmacutica do Ministrio da Sude
PEG
Polietileno Glicol
PBS
Tampo fosfato-salino (do ingls, Phosphate-buffered saline)
pCO2
Presso parcial de CO2
PFK/PFK1
Enzima Fosfofrutoquinase
xii
P
pH
qEPOhr
Produtividade
Potencial hidrogeninico
Taxa especfica de formao de eritropoietina
qGlic
Taxa especfica de consumo de glicose
qLact
Taxa especfica de produo de lactato
RER
Retculo Endoplasmtico Rugoso
Ser
Aminocido Serina
SFB
Soro Fetal Bovino
SUS
Sistema nico de Sade
td
Tempo de duplicao
Thr
Aminocido Treonina
tPA
TT
UFRJ
v/v
Ativador
de
Plasminognio
tecidual
(do
ingls,
Plasminogen Activator)
Transferncia de Tecnologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Volume por volume
VDTEC
Vice-Diretoria de Desenvolvimento Tecnolgico
VPROD
Vice-Diretoria de Produo
Vvd
Volume de reciclo por volume de biorreator por dia
Vvm
Volume de gs por volume de biorreator por minuto
Xaa
Denominao para qualquer aminocido
Xyl
YX/Glic
tissue-type
Mdia das clulas viveis

Xilose
Coeficiente de rendimento celular a partir da concentrao de glicose
xiii
LISTA DE FIGURAS, GRFICOS E TABELAS

Figura 1. Tipos de oligossacardeos N-ligados. Os oligossacardeos esto ligados
sempre ao resduo Asn da sequncia Asn-X-Ser/Thr e apresentam
diversas estruturas (rica em manose, hbrida ou complexa). Adaptado de
Stanley et al, 2009...............................................................................
Figura 2. Desenho esquemtico dos tipos de frascos e garrafas utilizadas para o

cultivo celular.............................................................................................
10
Figura 3. Esquema simplificado de um biorreator do tipo tanque agitado e alguns

dos seus componentes impelidor, motor, termostato, um duto para
retirada de amostra e efluentes, chicanas e duto para entrada de gases.
Adaptado de Li et al, 2009........................................................................
13
Figura 4. Esquema simplificado de um cultivo realizado em batelada simples..........
14
Figura 5. Esquema simplificado de um cultivo realizado em batelada alimentada.....
15
Figura 6. Esquema simplificado de um cultivo realizado em sistema contnuo..........
15
Figura 7. Esquema simplificado de um cultivo realizado em sistema contnuo com

perfuso........................................................................................................
16
Figura 8. Desenho esquemtico da metodologia do sub-cultivo para realizao das

cinticas. A figura mostra, de forma resumida, as etapas que precedem as
cinticas, incluindo o inculo inicial at a adaptao em garrafas
rotatrias.......................................................................................................
34
Figura 9. Clulas CHO em meio TransFx-C. Conforme foi observado e destacado

pelos crculos vermelhos, algumas clulas perderam a caracterstica de
crescimento em suspenso e voltaram ao estado de aderncia. Aumento
de 250x.......................................................................................................
40
Figura 10. Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility e

SFM4CHO, respectivamente. - Clulas viveis; - Viabilidade. No
canto inferior direito do grfico so apresentados os valores de taxa
especfica de proliferao na fase exponencial (exp) e tempo de
duplicao (td)...............................................................................................................
42
Figura 11. Produtividade e metabolismo de clulas CHO no meio SFM4CHO Utility e SFM4CHO. - Concentrao de EPOhr; - Taxa
especifica de formao de EPOhr; - Concentrao de glicose no
meio; - Taxa especfica de consumo de glicose; + - Concentrao de
lactato no meio; - Taxa especfica de produo de lactato.....................
44

HyCell sem HT, respectivamente. - Clulas viveis; Viabilidade. No canto inferior direito do grfico so apresentados os
valores de taxa especfica de proliferao na fase exponencial (exp) e
tempo de duplicao (td).............................................................................
46
xiv
Figura 13. Produtividade e metabolismo de clulas CHO nos meios SFM4CHOUtility e HyCell sem HT, respectivamente. - Concentrao de
EPOhr; - Taxa especifica de formao de EPOhr; - Concentrao
de glicose no meio; - Taxa especfica de consumo de glicose; + Concentrao de lactato no meio; - Taxa especfica de produo de
lactato.......................................................................................................
47
Figura 14. Clulas CHO em meio CD FortiCHO. Conforme foi observado e

destacado pelos crculos vermelhos, grande parte das clulas cultivadas
neste meio formaram mltiplos grumos, dificultando os processos de
contagem e adaptao no prprio meio. Aumento 250x............................
49
Figura 15. Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility e CD

FortiCHO. - Clulas viveis; - Viabilidade. No canto inferior
direito do grfico so apresentados os valores de taxa especfica de
proliferao na fase exponencial (exp) e tempo de duplicao
(td)...............................................................................................................
50
Figura 16. Produtividade e metabolismo de clulas CHO no meio SFM4CHOUtility e CD FortiCHO, respectivamente. - Concentrao de
lactato.........................................................................................................
52

Cellvento CHO-110 sem HT. - Clulas viveis; - Viabilidade. No
canto inferior direito do grfico so apresentados os valores de taxa
especfica de proliferao na fase exponencial (exp) e tempo de
duplicao (td). * Este grfico se repete para facilitar a comparao dos
resultados....................................................................................................
54
Figura 18. Produtividade e metabolismo de clulas CHO nos meios SFM4CHOUtility e Cellvento CHO-110, respectivamente. - Concentrao de
lactato.........................................................................................................
55

CPCHO. - Clulas viveis; - Viabilidade. No canto inferior
direito do grfico so apresentados os valores de taxa especfica de
proliferao na fase exponencial (exp) e tempo de duplicao (td)...........
57
Figura 20. Produtividade e metabolismo de clulas CHO nos meios SFM4CHOUtility e CPCHO. - Concentrao de EPOhr; - Taxa especifica
de formao de EPOhr; - Concentrao de glicose no meio; - Taxa
especfica de consumo de glicose; + - Concentrao de lactato no meio;
- Taxa especfica de produo de Lactato...............................................
59
Figura 21. Grfico com os valores da Integral de Clulas Viveis (ICV) ao longo
do cultivo para os meios CD FortiCHO, CPCHO, HyCell sem HT,
SFM4CHO - Utility, SFM4CHO e Cellvento CHO-110...................
60
xv
Figura 22. Clulas CHO viveis, viabilidade e produtividade em meio SFM4CHO

em biorreator. - Clulas viveis; - Viabilidade. A linha tracejada
indica o incio da troca de meio. No canto inferior direito do grfico so
apresentados os valores de taxa especfica de proliferao na fase
exponencial (exp) e tempo de duplicao (td); - Concentrao de
de glicose no meio; - Taxa especfica de consumo de glicose. No
canto inferior direito do grfico apresentada a concentrao mxima
de produto ([EPOhr]max).............................................................................
62
Tabela 1. Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabelas de

adaptao/expanso celular no meio HyCell. Cada valor est
representado com seu respectivo desvio-padro. A linha tracejada indica
a substituio do meio SFM4CHO - Utility pelo meio alternativo. GR
Garrafa Rotatria/Roller..........................................................................
39
Tabela 2. Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabelas de

adaptao/expanso celular no meio TransFx-C. Cada valor est
a substituio do meio SFM4CHO - Utility pelo meio alternativo; o
retngulo indica o cultivo feito em meio TransFx-C; GR Garrafa
Rotatria/Roller..........................................................................................
39
Tabela 3. Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabela de

adaptao/expanso celular no meio SFM4CHO. Cada valor est
41

adaptao/expanso celular no meio HyCell sem HT. Cada valor est
Garrafa Rotatria/Roller...................................................................................
45

adaptao/expanso celular no meio CD FortiCHO. Cada valor est
48

adaptao/expanso celular no meio Cellvento CHO-110 sem HT.
Cada valor apresentado est com seu respectivo desvio-padro. A linha
tracejada indica a substituio do meio SFM4CHO - Utility pelo meio
alternativo. GR Garrafa Rotatria/Roller................................................
53

adaptao/expanso celular no meio CPCHO. Cada valor apresentado
est com seu respectivo desvio-padro. A linha tracejada indica a
substituio do meio SFM4CHO - Utility pelo meio alternativo. GR
Garrafa Rotatria/Roller.............................................................................
56
xvi
Tabela 8. Resumo das taxas, concentrao e rendimentos das cinticas dos meios
testados. Td Tempo de duplicao; Xvmax Concentrao mxima de
clulas vivas; exp Taxa especfica de crescimento exponencial por dia;
[Glicose] Concentrao inicial de glicose; qGlic Taxa mdia especfica
de consumo de glicose; [Lactato] Concentrao de lactato formado;
qLact Taxa mdia especfica de formao de lactato; [EPOhr]max
Concentrao mxima de EPOhr produzida; qEPOhr Taxa mdia
especfica de formao de eritropoetina; P Produtividade do cultivo em
gerar EPOhr ao dia; YX/Glic Rendimento da formao de clulas por
glicose consumida, durante o cultivo...........................................................
60
xvii
RESUMO
Com o avano das tcnicas de biologia molecular, os cultivos celulares passaram a ser
uma importante plataforma para a produo dos biofrmacos, que so protenas
recombinantes com fins teraputicos, obtidos atravs de processos biotecnolgicos. A
manuteno das condies ideais de cultivo de grande importncia para a obteno do
produto conforme especificaes de qualidade e requisitos de segurana. Desta forma,
os meios de cultivo promovem o ambiente e fornecimento de nutrientes ideais s
clulas, garantindo o funcionamento normal do metabolismo, do crescimento celular e a
correta sntese do biofrmaco. Neste projeto foi realizada a comparao de diferentes
alternativas de meios de cultivo comerciais, livres de soro fetal bovino e componentes
animais, com o meio de cultivo atualmente utilizado para o cultivo em suspenso de
clulas CHO secretoras de EPOhr, observando-se a capacidade de promoo de
crescimento, produtividade da molcula e metabolismo. Os experimentos foram
conduzidos a partir do descongelamento de criotubos de um banco de clulas de
trabalho, com clulas CHO secretoras de EPOhr. As clulas foram adaptadas em
diferentes meios de cultivo e em sistemas de cultivo de frascos e garrafas. Ao final da
etapa de adaptao direta, foram realizadas cinticas comparativas com o meio utilizado
atualmente. As cinticas (candidato e controle) foram iniciadas a partir da ltima etapa
de adaptao, durando de quatro a nove dias, dependendo das condies de cultivo. Dos
meios testados, trs apresentaram condies melhores ou iguais ao do meio padro
SFM4CHO - Utility. Os meios SFM4CHO e Cellvento CHO-110 apresentaram
melhor capacidade de promoo de crescimento (2,42x106 clulas/mL e 4,6x106
clulas/mL, respectivamente), enquanto o meio CPCHO apresentou maior
produtividade e taxa especfica de formao da EPOhr (P = 12,16 g/dia e qEPOhr = 7,3
g/106 clulas/dia, respectivamente). Os meios de cultivo SFM4CHO e Cellvento
CHO-110 apresentaram boa capacidade de sustentar a proliferao, alcanando
concentrao mxima de clulas viveis superior ao meio de cultivo controle, indicando
possuir melhor promoo de crescimento. O meio CPCHO apresentou melhor
produo de EPOhr, em comparao ao meio de cultivo padro. Os resultados sugerem
que os trs meios mencionados acima podem ser mais estudados para embasar o seu uso
como alternativa de matria prima numa eventual substituio de meio de cultivo, como
a descontinuao do meio atualmente utilizado no processo.
Palavras-chave: Clulas CHO; Cultivo celular; Eritropoetina humana recombinante;

Meio de cultivo;
xviii
ABSTRACT
The development in the field of molecular biology allowed cell culture to play an
important role in the production of biological drugs. Biopharmaceuticals are
recombinant proteins used for therapy purposes that are obtained by biotechnological
processes. Providing the ideal cell culture conditions is extremely important for the
synthesis of a biological product that must comply with quality specifications and safety
requirements. The culture medium provides physiological environment and nutrients
required, thus it has to guarantee the normal cell metabolism, cellular growth and
correct biopharmaceutical synthesis by the cells. In the present project it was performed
an evaluation between different media free of calf serum and animal components and
the standard medium presently used in CHO cell culture for the production of hrEPO,
comparing cell growth promotion capability, productivity and cell metabolism. The
experiments were executed by thawing one vial of hrEPO producing CHO cells from
the working bank. The cells were directly adapted in different culture media and culture
systems (flasks and bottle). By the end of the adapting stage, it was performed a kinetic
evaluation (candidate media and standard medium) starting from the last adaptation
stage and its duration was variable subjected to the culture conditions. It was observed
that three tested media showed better or similar results comparing to the standard
medium (SFM4CHO-Utility). The SFM4CHO and Cellvento CHO-110 media
demonstrated good capability to promote cell growth (2.4x106 cells/mL and 4.6x106
cells/mL, respectively), while CPCHO medium showed a better product yield and
specific hrEPO production rate (PCPCHO = 12.2 g/day and qEPOhr_CPCHO_m = 7.3 g/106
cells/day, respectively). In comparison with the standard medium, SFM4CHO and
Cellvento CHO-110 media demonstrated a better capability for cell growth while the
CPCHO medium showed better product yield. The results indicate that the three
mediums stated above should be more thoroughly evaluated to support their use as
alternative raw material for an eventual medium substitution, such as the
discontinuation of the currently used in the process.
Key-words: CHO cell; Cell culture; Culture media; Human recombinant erythropoietin;
1. INTRODUO
Atualmente, a demanda internacional por medicamentos de alto valor agregado,
como os biofrmacos, vem se tornando prioridade em diversos pases e,
consequentemente, vrios governos vm reduzindo seus gastos com a compra para
atender suas demandas de medicamentos excepcionais de alto custo, incorporando a
produo atrelada a polticas de autossuficincia (Angle 2012). Em linhas gerais, os
biofrmacos so classificados como produtos teraputicos de natureza biolgica,
produzidos por processos biotecnolgicos, onde so utilizados organismos ou clulas
vivas e geralmente envolvendo bioprocessos para gera-los (Rader 2008). Nos polos
produtores de biofrmacos, como Estados Unidos e Unio Europeia, esta categoria de
medicamento cresce progressivamente. Apenas nos Estados Unidos, entre 2010 e 2014,
147 produtos farmacuticos foram aprovados, entre os quais 38 26% dos frmacos
criados so da classe dos biofrmacos. A mesma observao pode ser feita para a
Europa (Walsh 2014).
Aps a primeira aprovao de um biofrmaco para o uso em seres humanos em
1982 Humulin, Insulina humana recombinante (Eli Lilly) novos biofrmacos
entraram no mercado, tendo nas ltimas duas dcadas um crescimento exponencial,
contabilizando um nmero aproximado de 60 biofrmacos produzidos e liberados para
consumo. Com a demanda acentuada por essa nova classe de medicamentos, o mercado
farmacutico apresenta alta taxa de retorno financeiro. A exemplo, 37 produtos
farmacuticos que se enquadram nessa classe e considerados bem sucedidos atingiram
mais de US$ 1 bilho em vendas em 2013, s nos Estados Unidos (Walsh 2014).
Algumas empresas, visando o retorno garantido pelo mercado criado pelo uso do
medicamento
original,
passaram
desenvolver
medicamentos
denominados
biossimilares. Quando a patente dos biofrmacos j descritos expira, outras empresas

que no detinham os direitos de produo podem produzi-los, gerando os biossimilares.
A vantagem dos biossimilares encontrada no preo, j que estes costumam ser mais
baratos, em comparao ao produto-matriz (Walsh 2014).
Alguns exemplos podem ser citados, como os conjugados droga-anticorpo (CDA)

anticorpos monoclonais associados a medicamentos para tratamento de certas
doenas, geralmente para cncer (Mylotarg/Wyeth e Kadcyla/Genentech) os
biofrmacos que recebem uma molcula de polietileno glicol (PEG), como o PEGInterferon ou o acrscimo de uma cadeia de cido silico na molcula de eritropoetina,
como na -Darbepoetina (Elgrie & Browne 2001; Walsh 2014).
O Brasil est includo neste contexto por intermdio do Ministrio da Sade (MS)
e algumas de suas instituies federais. O Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos
(Bio-Manguinhos) da Fundao Oswaldo Cruz (Fiocruz), alinhado a sua misso,
trabalha no intuito de desenvolver e produzir novos biofrmacos que atendero as
necessidades de sade pblica da populao.
Com a nacionalizao de processos produtivos de medicamentos que eram
importados a preos elevados, grande parte da populao brasileira passou a ter acesso a
medicamentos de alto valor agregado por intermdio do Sistema nico de Sade (SUS),
que distribui gratuitamente esses itens. A partir desta estratgia, Bio-Manguinhos passa
a fazer parte do grupo de fornecedores do MS, no mbito do Componente Especializado
da Assistncia Farmacutica. Neste momento, Bio-Manguinhos/Fiocruz d um salto
tecnolgico na produo de medicamentos, o que aumenta a sua variedade produtiva e
fortalece seu posto no programa de desenvolvimento industrial e tecnolgico do
governo federal. Este fato mostra a inteno do governo federal em fortalecer a rea
tecnolgica do pas e reduzir a dependncia nacional de imunobiolgicos e biofrmacos
importados.
A deciso do governo brasileiro em obter imunobiolgicos e biofrmacos com
qualidade e distribuir gratuitamente para a populao possui como exemplo a parceria
entre Cuba e Brasil. Por intermdio da Fundao Oswaldo Cruz (Fiocruz/RJ) e de BioManguinhos os dois pases estreitaram relaes cooperativas e firmaram acordos de
transferncia de tecnologia de biofrmacos de interesse do Ministrio da Sade do
Brasil. Estes acordos foram firmados entre o Centro de Imunologia Molecular
(CIM/Cuba) e o Centro de Engenharia Gentica de Biotecnologia (CIGB/Cuba) com
Bio-Manguinhos, visando transferncia parcial ou total dos processos produtivos da
Eritropoetina humana recombinante (EPOhr), Alfaepoetina, e da Interferona alfa 2b
(Alfainterferona), respectivamente. Ao mostrar o grande valor para economia brasileira,
os acordos de transferncia de tecnologia TT levam reduo de gastos com a

compra desses medicamentos pelos cofres pblicos, fortalecendo a economia nacional.
O fornecimento gratuito dos componentes especializados (PAF Programa de
Assistncia Farmacutica/MS), representados por inmeros biofrmacos de alto custo,
resulta em gastos significativos para o governo. Aps a assinatura da TT (2004) e
obteno do registro junto Agncia Nacional Vigilncia Sanitria (ANVISA) em
2006, o Ministrio da Sade passa a adquirir esses biofrmacos de Bio-Manguinhos
(laboratrio pblico produtor), promovendo assim aes de desenvolvimento produtivo
no complexo industrial da sade, conforme disposto na portaria N 1554 de 30 de Julho
de 2013. Alfaepoetina humana recombinante (EPO), um dos biofrmacos que faz parte
do portflio de Bio-Manguinhos desde 2006 indicada para pacientes com anemia por
insuficincia renal crnica, anemia resultante do tratamento para a Sndrome da
Imunodeficincia Adquirida (AIDS) em regime teraputico com Zidovudina e pacientes
oncolgicos em tratamento quimioterpico (Alfaepoetina 2011). Aps assinado o
acordo de Transferncia de Tecnologia, Bio-Manguinhos vem se preparando
gradualmente para a incorporao de toda produo de EPOhr, desde a produo do
Ingrediente Farmacutico Ativo (IFA), baseado em sistema de cultivo de clulas
animais, at seu processamento final, culminando na completa nacionalizao da
tecnologia de produo.
1.1. Produo de biofrmacos em cultivos celulares

Os cultivos celulares so empregados para produo de compostos qumicos e
produtos de origem biolgica. Atualmente, com o avano da biotecnologia e da
engenharia gentica, os cultivos celulares foram os sistemas encontrados para a
produo dos biofrmacos, que so protenas recombinantes com fins teraputicos,
obtidos atravs de processo biotecnolgicos (Stryjewska et al 2013). A biotecnologia
industrial aplicada na rea dos biofrmacos foi inicialmente impulsionada com a
produo em larga escala da penicilina, durante a Segunda Guerra Mundial, evoluindo
com o respaldo dos avanos no campo da biologia molecular para criao de sistemas
de obteno de molculas complexas de uso teraputico (Stryjewska et al 2013).
Diversos organismos podem ser cultivados e utilizados industrialmente para
produo de inmeros metablitos primrios, como aminocidos, vitaminas e
metablitos secundrios (antibiticos, agentes antitumorais e anti-helmnticos), enzimas
e protenas recombinantes expressas por sistemas biolgicos, ao qual a protena de
interesse no nativa (Adrio & Demain 2010). Muitos micro-organismos como
Escherichia coli e Pichia pastoris so utilizados na produo de produtos biolgicos
simples que no necessitam de modificaes ps-traducionais ou apresentam
modificaes bsicas, no sendo necessria utilizao de clulas com maquinaria
enzimtica mais complexa (Rabert et al 2013; Wang et al 2014; Jappelli et al 2014).
Entretanto, quando a protena recombinante precisa de modificaes ps-traducionais
complexas para ter sua atividade biolgica completa, estabilidade funcional e a
qualidade requerida, torna-se necessrio o emprego de clulas eucariontes superiores
que so capazes de realizar as modificaes ps-traducionais necessrias (Meyer et al
2013).
A modificao ps-traducional mais comum e que ocorre em todas as clulas

animais a glicosilao, onde as protenas recombinantes recebem cadeias de
carboidratos em regies especficas da cadeia de aminocidos (Li & dAnjou 2009).
Diversas linhagens celulares so empregadas na expresso de protenas recombinantes,
dando destaque s clulas de mamferos, sendo as mais utilizadas as HEK 293 (clulas
de rim humano embrionrio), CHO (clulas de ovrio de hamster chins) e BHK
(clulas de rim de filhotes de hamster). Em alguns casos o animal trangnico, como
coelhos e cabras, podem ser utilizados obtendo-se o produto solvel no leite produzido
pelo tecido geneticamente modificado (glndulas mamrias), como o Atryn uma
antitrombina alfa recombinante secretado no leite de cabras transgnicas (Walsh
2014).
Entretanto, no s clulas de mamferos so empregadas para a expresso dessas
molculas. Atualmente, clulas de insetos e de plantas tm sido estudadas e,
consequentemente, utilizadas para a produo de biofrmacos. Clulas de inseto que
utilizam sistemas de expresso virais foram empregadas para a produo de vacinas,
como a Flublok (Sciences; Meriden/EUA) contra o vrus Influenza e a Cervarix
(GlaxoSmithKline/Gr-Bretanha) contra o HPV (Vrus do Papiloma Humano) e,
recentemente, uma protena recombinante expressa por clulas vegetais que
expressam a protena e a armazenam nos vacolos celulares Elelyso (Protalix
Biotherapeutics/Pfizer), foi aprovado para o uso em seres humanos pelos EUA (Walsh
2014).
Mesmo com novos sistemas de expresso desenvolvidos, a clula CHO a mais
utilizada em processos de produo de protenas recombinantes para uso teraputico
(Meleady et al 2011; Wuest et al 2012). Mediante o emprego das clulas CHO nos
cultivos celulares para produo de protenas recombinantes, diversas estratgias podem
ser aplicadas para o aprimoramento da expresso proteica. Desde a obteno de um
vetor mais competente na expresso da protena recombinante, sistemas de
amplificao, o emprego de genes que expressam fatores de crescimento, o controle de
apoptose e ainda a suplementao do meio de cultivo com componentes que beneficiam
o crescimento celular (Hee et al 2013; Khan 2013). Com relao aos sistemas de
amplificao, os mais empregados so os da Diidrofolato Redutase (DHFR) e
Glutamina Sintetase (GS) (Chartrain & Chu 2008). O processo comea quando o gene
da DHFR ou da GS retirado do genoma da populao de clulas CHO que ser usada
para a expresso da protena de interesse. Aps a deleo, o vetor com o gene-alvo junto
com o gene que expressa a DHFR ou a GS transfectado nas clulas CHO e d-se
incio ao processo de seleo criado pelo sistema de amplificao (Omasa et al 2010).
Para verificar a integrao do vetor no genoma das clulas transfectadas, as mesmas so
tratadas, em diferentes concentraes, com substncias inibidoras como o metotrexato
(MTX) para o sistema com DHFR ou metionina sulfoximida (MSX) para o sistema com
GS. As clulas que integraram o vetor ao seu material gentico passaro a expressar em
grande quantidade o gene da DHFR ou GS para suprir a inibio qumica e
consequentemente co-expressaro o produto do gene-alvo (Matasci et al 2009). O grau
de resistncia desejado ao inibidor vai depender das concentraes aplicadas durante a
seleo. Aps a confirmao da resistncia desejada, a populao resistente passa a
expressar a DHFR ou GS e co-expressar a protena de interesse no meio de cultivo sem
adio do MTX ou MSX (Butler 2004). O nvel de expresso no depende apenas dos
inibidores qumicos, mas de inmeras outras caractersticas, como o vetor empregado, o
local de insero do vetor no cromossoma da clula, da linhagem celular utilizada e do
meio de cultivo empregado na produo da protena recombinante (Matasci et al 2009).
A seleo feita pelos inibidores gera clulas que expressam grandes quantidades
da protena de interesse. Isso est relacionado ao fato da integrao do gene de interesse
ocorrer no mesmo stio de integrao do gene de seleo no cromossoma da clula
(Omasa et al 2010). As subpopulaes que sobreviveram ao processo de seleo so
clonadas, de acordo com seu nvel de produtividade da protena-alvo e pela taxa de
crescimento. Para garantir a constante expresso do gene de interesse, se faz necessrio
o uso de uma rotina de verificao da produo da protena, j que a produtividade pode
reduzir em cultivos de longa durao (Omasa et al 2010).
1.2. Glicosilao
A glicosilao modificao ps-traducional mais comum realizada por clulas
eucariontes e consiste na ligao enzimtica de cadeias oligossacardicas em
determinados aminocidos das protenas expressas pelas clulas. Existem dois tipos de
glicosilao, gerando os N-glicanos e os O-glicanos (Li & dAnjou 2009). Essas
ligaes so possveis na presena de enzimas situadas no aparelho de Golgi (AG) e no
retculo endoplasmtico rugoso (RER) das clulas, podendo variar de atividade de
acordo com a espcie origem da linhagem, levando formao de diferentes
glicoformas. As N-glicosilaes so as modificaes ps-traducionais mais comuns e

so realizadas por fungos e outros eucariotos superiores, como as clulas vegetais e
animais. O processo de N-glicosilao comea quando um oligossacardeo precursor
composto de trs resduos de glicose na poro no reduzida da sequncia manose-9-NAcetilglicosamina-2 (Man9GlcNAc2) gerado pela adio de monossacardeos
associados a nucleotdeos e fica ancorado em uma molcula lipdica denominada
dolicol-pirofosfato, formando a estrutura glicose-3-manose-9-N-Acetilglicosaminadolicol pirofosfato (Glc3Man9GlcNAc2-P-P-dolicol) (Butler 2008). A transferncia da
estrutura central Glc3Man9GlcNAc2 para a cadeia polipeptdica ocorre durante a
traduo do mRNA no RER e catalisada pela enzima oligossacariltransferase (OST),
formando uma ligao N-glicosdica. No caso dos N-glicanos, a estrutura central
liberada do dolicol-fosfato ancorada em resduos de Asparagina presentes na
sequncia consenso asparagina-Xaa-Serina/Treonina (Asn-Xaa-Ser/Thr) da protena
recombinante, onde Xaa pode ser qualquer aminocido, exceto Prolina (Helenius &
Aebi 2004). Os oligossacardeos so aparados por glicosidases, como a -manosidase 1,
residentes na membrana do RER antes da protena ser transportada para o aparelho de
Golgi e, dependendo da linhagem de clula animal utilizada, novos padres de
glicosilao podem ocorrer, diferenciando as glicoformas produzidas (Butler 2008).
Em clulas animais como a clula CHO e clulas HEK 293, por exemplo, existem
variedades de exoglicosidases e glicosiltransferases presentes no AG capazes de
remodelar o core Man9GlcNAc2, criando uma gama de glicoformas heterogneas com
regies antenrias variadas, como as antenas ricas em resduos de Manose, hbridas,
complexa com ou sem resduos de Fucose e estruturas multiantenrias, conforme
mostrado na figura 1 (Li & dAnjou 2009; Hossler et al 2009; Butler 2008; Stanley et al
2009). Uma caracterstica interessante o fato de oligossacardeos ancorados com
galactose terminal possurem uma taxa maior de sialilao (insero de cido silico no
core oligossacardico). A sialilao das protenas recombinantes torna-se importante no
mbito de muitas glicoprotenas utilizadas como biofrmacos, pois este fenmeno
garante caractersticas fundamentais, como a sua atividade biolgica, maior tempo de
circulao da protena no organismo (previne a remoo de protenas pelo fgado) e
baixa antigenicidade (Durocher & Butler 2009). Os nveis de sialilao podem variar, de
acordo com a linhagem celular, protena recombinante e condies de cultivo, como
concentrao de nutrientes e fatores fsico-qumicos (Durocher & Butler 2009). As
diferentes vertentes citadas acima so estudadas com certa frequncia. Em especial,

estudos sobre a disponibilidade e diferentes concentraes de nutrientes e metablitos
esto entre os assuntos mais pesquisados (Aghamohseni et al 2014; Borys et al 2010;
Liu et al 2014).
Hbrida
Origem de
estruturas
multinatenrias
Complexa
Complexas
Rica em manose
Figura 1. Figura ilustrativa dos tipos de sacardeos e oligossacardeos N-ligados que podem ser ligados
protena de interesse. Os oligossacardeos esto ligados sempre ao resduo Asn da sequncia Asn-XSer/Thr e apresentam diversas estruturas (rica em manose, hbrida ou complexa). Adaptado de Stanley et
al 2009.
Esta grande variedade de estruturas pode ser definida pelos termos macroheterogeneidade e micro-heterogeneidade (Butler 2008). A macro-heterogeneidade
caracterizada pela possibilidade de ocupao das sequncias consenso ao longo da
cadeia polipeptdica pelos N-glicanos, mesmo em pontos de baixa acessibilidade (Butler

2008). Como a formao de pontes dissulfeto nos polipeptdeos tambm ocorre ao
mesmo tempo da traduo do mRNA, algumas sequncias consenso podem no receber
o N-glicano. Devido a este fato, a mesma protena pode apresentar glicoformas
diferentes no mesmo organismo. J a micro-heterogeneidade caracterizada pela
diversidade dos N-glicanos ancorados na mesma protena. Este fato acontece quando
nem todas as reaes catalisadas pelas transferases do AG so executadas corretamente
na estrutura final do N-glicano, podendo criar diferentes estruturas, principalmente nas
estruturas complexas (Butler 2008).
Existe outro tipo de glicosilao, a O-glicosilao, onde o N-acetil-galactosamina
(GalNAc) ligado covalentemente pela ao da N-Acetilgalactosamina transferase
(OGT) em resduos de Ser ou Thr da protena, gerando O-glicanos (Li & dAnjou 2009;
Brockhausen et al 2009). Os resduos de Ser e Thr podem apresentar trs estados:
intactas sem a presena de qualquer molcula acoplada fosforilada ou com Oglicanas ligadas (Hart et al 1996; Lubas et al 1997). Os O-glicanos so estruturas
menores do que os N-glicanos e so inseridos aps a etapa de traduo no aparelho de
Golgi, quando a protena est totalmente enovelada. Aps a insero do GalNAc nos
resduos de Ser ou Thr, at oito estruturas centrais podem ser formadas, devido ao
grande nmero de transferases que agem aps a insero da estrutura principal (Butler
2008; Hart & Akimoto 2009). Atualmente, j se sabe que as O-glicanas tm a funo de
regular a conformao proteica, facilitar a montagem da estrutura multimrica da
protena, assim como a estabilidade estrutural da mesma e que as modificaes nos Oglicanos so dinmicas e podem ter o propsito regulatrio da molcula (Bektas &
Rubenstein 2011).
Como previamente citado, a linhagem de clulas CHO so as mais empregadas
nos cultivos celulares para a produo de protenas recombinantes de uso teraputico.
Este fato explicado pela alta produtividade, robustez, biossegurana, facilidade na
manipulao gentica e pela habilidade em criar padres de glicosilao similares aos
padres humanos (Meleady et al 2011; Rahimpour et al 2013), alm disso, por ser a
clula mais utilizada, apresenta maior quantidade de informao disponvel. Rahimpour
e colaboradores (2013) discutem que apesar da clula CHO apresentar um baixo nvel
de produo, em comparao clula procaritica ou eucaritica inferior, os nveis e
10
complexidade da glicosilao que a clula CHO possui compensa a relativa baixa

produtividade.
1.3. Sistemas de cultivo
Para a realizao da produo de biofrmacos, dois sistemas de cultivo so
bastante explorados: o cultivo de clulas em frascos (estticos, em garrafas rotatrias e
frascos spinner em pequena escala) e o cultivo de clulas em biorreatores para obteno
de um maior volume produtivo para obter uma maior massa do produto de interesse. Os
cultivos de clulas em frascos e em garrafa, geralmente, so utilizados para expanso da
linhagem celular, como preparao do inculo para o cultivo em biorreatores ou
adaptao das clulas ao cultivo em suspenso. O biorreator utilizado para aumentar a
escala do cultivo e, por consequncia, empregado na produo, tanto experimental
quanto industrial (Vliz et al 2008).
1.3.1. Cultivo em frascos
Os cultivos realizados em frascos e garrafas, exemplificados na figura 2, so
muito utilizados como propagador do inculo. Nos frascos estticos T-25 e T-75, o
inculo costuma ser basal para dar incio propagao do cultivo celular, no sendo
inferior a 105 clulas por mililitro, devido ao volume do frasco e necessidade de
concentrao mnima tima para a propagao (Lu et al 2007).
Garrafa Roller
Frasco T-25
Frasco Spinner
Frasco T-75
Figura 2. Desenho esquemtico dos tipos de frascos e garrafas utilizadas para o cultivo celular.
O escalonamento do cultivo celular realizado para se obter maior superfcie ou

volume, possibilitando a obteno de mais biomassa e, consequentemente, maior
produtividade. Tal processo pode ser empregado em garrafas rotatrias do tipo Roller.
As garrafas rotatrias so garrafas cilndricas que ficam em constante movimento em
uma base que apresenta rolamentos, permitindo que as clulas ali presentes entrem em
contato constantemente com o meio de cultivo. Apesar da iminente substituio das
garrafas rotatrias por novas tecnologias frascos spinner e frasco shakers
11
(Amanullah et al 2010; Bleckwein et al 2005), vacinas com base na utilizao destas

garrafas se encontram em fase de desenvolvimento, onde importantes resultados foram
obtidos (Chou et al 2012).
Outra opo de frasco que pode ser utilizado no escalonamento de cultivos
celulares so os frascos do tipo spinner (Kallel et al 2002). um frasco que apresenta,
ligada tampa, uma barra magntica com uma hlice que se estende at o fundo do
frasco (Bleckwein et al 2005), ou um pndulo com a mesma funo de agitao. Este
sistema j foi muito utilizado nos ltimos 10-20 anos, mas atualmente est sendo
substitudo pelos sistemas de frascos agitados do tipo shakers, que, como principal
caracterstica, apresentam maior facilidade de manipulao (Amanullah et al 2010).
1.3.2. Cultivo em biorreatores
Os biorreatores permitem o cultivo apropriado de micro-organismos e clulas
tanto animais quanto clulas vegetais permitindo o monitoramento e controle dos
parmetros de processo e com a vantagem de poderem alcanar maiores volumes de
cultivo (escalonamento), visando escala industrial (Vliz et al 2008). Os biorreatores
possuem algumas classificaes, porm uma bastante utilizada em relao
homogeneidade da distribuio celular.
Os biorreatores possuem, pelo menos, duas fases dentro dos seus vasos: a fase
lquida referente ao meio de cultivo e a fase slida (referente s clulas cultivadas).
Os equipamentos que conseguem uniformizar a fase lquida com a fase slida, ou seja,
as clulas encontram-se difundidas no meio, so considerados biorreatores homogneos.
Os equipamentos que apresentam uma diviso de fases e no apresentam clulas
difundidas na fase lquida, so denominados biorreatores heterogneos (Vliz et al
2008). O enfoque dado neste trabalho foi aos biorreatores homogneos devido ao
escalonamento dos cultivos celulares e futuras produes de EPOhr em biorreatores
homogneos de tanque agitado.
Biorreatores homogneos: so os mais empregados no desenvolvimento e na
indstria, pela facilidade que eles apresentam para monitorar o ambiente do cultivo e
permitem realizar correes que no alterem a fisiologia celular (Vliz et al 2008). Os
biorreatores homogneos mais utilizados so os biorreatores de tanque agitado, do tipo
wave e air-lift.
12
Biorreatores heterogneos: so assim denominados por apresentarem duas fases

em seu interior, uma onde as clulas utilizadas para a produo do produto de interesse
ficam imobilizadas em compartimentos contendo superfcies ou em leito biocompatvel,
simulando o tecido de origem da clula e a outra sendo a circulao de meio de cultivo
para nutrir essas clulas aderidas. Estes biorreatores foram desenvolvidos para atender
ao uso de clulas com caractersticas aderentes, o que representa uma desvantagem no
que se refere ao monitoramento das condies de cultivo, pois no possvel realizar
uma amostragem homognea da populao celular presente no biorreator. Devido
caracterstica do crescimento celular (semelhante a um tecido), nem todas as clulas tm
o aporte necessrio de nutrientes e oxignio, criando diferentes nveis de crescimento e
fases metablicas em um mesmo cultivo e a dificuldade no escalonamento da matriz
aderente (Vliz et al 2008).
1.3.2.1. Biorreatores do tipo tanque agitado
Os biorreatores em ao inox do tipo tanque agitado so os mais utilizados na
indstria, mesmo j existindo novas alternativas para o cultivo celular como os
biorreatores single use (Eibl et al 2010; Hsu et al 2012). Os sistemas de tanque agitado
apresentam como vantagem a sua simplicidade operacional, a facilidade no
monitoramento, controle e escalonamento da produo do biofrmaco (Warnock & AlRubeal 2006; Jain & Kumar 2008). Porm, a formao de bolhas e as tenses de
cisalhamento que podem danificar as clulas durante o cultivo so desvantagens que
este biorreator apresenta (Kunas & Papoutsakis 2009).
Basicamente, este tipo de biorreator composto por um vaso (geralmente feito de
vidro borossilicato) resistente ao calor, quando o uso do biorreator voltado para a
pesquisa em pequenos volumes e de ao inoxidvel, quando utilizado escala industrial
(50 L 15.000 L) (Vliz et al 2008). Este biorreator possui diversos componentes
ilustrados na figura 3 (tubulaes, vlvulas, bombas, motores e sensores), que esto
envolvidos nas operaes necessrias para a conduo do cultivo, como a injeo de
meio e suplementos, agitao, aerao, exausto, monitoramento, colheita e etc. Esses
perifricos podem ser feitos de diversos materiais (silicone, polmeros e ao inox)
dependendo da escala em questo. O sistema que caracteriza este tipo de biorreator o
de agitao, apresentando impelidores movidos por um motor, de acoplagem mecnica
ou magntica. Os biorreatores tambm apresentam chicanas que so estruturas presentes
13
nas paredes internas do vaso que evitam o fenmeno de vrtice, favorecendo a

homogeneizao ideal do contedo do biorreator (Sauid et al 2013).
Termostato
Motor
Entrada de
gases
Entrada de gases
Chicanas
Tanque de alimentao
Bomba
Efluentes
Impelidor
Nvel de gua
Figura 3. Esquema simplificado de um biorreator do tipo tanque agitado e alguns dos seus componentes
impelidor, motor, termostato, um duto para retirada de amostra e efluentes, chicanas e duto para entrada
de gases. Adaptado de Li et al 2009.
O biorreator de tanque agitado pode ser operado em diversos modos, devido a sua
simples caracterstica operacional, sendo possvel realizar ajustes e modificaes nas
suas correntes de entrada e sada, resultando na sua supremacia como sistema de
produo de biofrmacos em grande escala. Desde a produo de clulas-tronco (Olmer
et al 2012), produo de biomassa para produzir a vacina da gripe (Hundt et al 2011),
anticorpos (Tuvesson et al 2008) e protenas recombinantes, como a Eritropoetina
humana recombinante (Chuan et al 2006) e a Isoflavona (Kokotkiewicz et al 2013) em
quantidades relevantes para comercializao em massa.
1.4. Modos de operao
Os quatro principais modos de operao de cultivo em biorreatores so: cultivo
descontnuo (conhecido como batelada ou batch), cultivo descontnuo alimentado
(caracterizado como batelada alimentada ou fed-batch), cultivo contnuo e contnuo com
reteno de clulas, tambm denominado como contnuo com perfuso (Vliz et al
2008). Cada modo de operao empregado de acordo com as caractersticas que o
processo apresenta, como caractersticas da linhagem celular empregada (estabilidade
gentica para expresso da protena de interesse, capacidade da linhagem em suportar
concentraes elevadas de metablitos txicos e resistncia s condies fsicoqumicas do biorreator) e a necessidade do mercado pelo produto gerado, determinando
a capacidade produtiva do sistema (Vliz et al 2008).
14
1.4.1. Batelada simples

Este o modo mais simples de cultivo em biorreatores. Como esquematizado na
figura 4, este sistema consiste no cultivo realizando-se um inculo em um volume
determinado de meio que ser coletado ao final do processo. Neste processo, no ocorre
acrscimo de nutrientes ao longo da corrida nem reciclo celular ou do meio
metabolizado. Durante este processo, ocorre heterogeneidade metablica, exposio
prolongada do biofrmaco a condies que podem deterior-lo, alm de esgotamento
dos nutrientes e acmulo de metablitos txicos para a clula (Vliz et al 2008).
Perodo
Inculo
Colheita
Cultivo
Figura 4. Esquema simplificado de um cultivo realizado em batelada simples.
Mediante tais fatos, muito utilizado para produo de biolgicos e compostos

resistentes a eventuais degradaes, tendo como base celular micro-organismos ou
clulas eucariticas. Estudos mais recentes mostram o uso da batelada simples como
padro para definir parmetros experimentais para a aplicao de outros modos de
operao, como a batelada alimentada (Vanz et al 2014; Moreno et al 2013).
1.4.2. Batelada alimentada
Em bioprocessos utilizando o modo de conduo do cultivo celular denominado
de batelada alimentada, ocorre suplementao de nutrientes ao meio de cultivo inicial e
o volume de operao varia de acordo com a capacidade do vaso do biorreator, como
mostrado na figura 5. O cultivo comea com um volume inicial padro e ao longo do
processo, novas quantidades de meio de cultivo ou determinados nutrientes so
adicionados ao volume inicial, viabilizando uma sobrevivncia mais longa do cultivo
celular e uma maior produtividade relativa do biolgico, porm o problema do acmulo
de metablitos txicos permanece, alm do maior tempo de exposio do produto alvo a
condies desfavorveis, o que prejudica a produo de produtos mais lbeis (Vliz et al
2008).
15
Alimentao
Perodo
Perodo
Cultivo
Cultivo
Colheita
Inculo
Figura 5. Esquema simplificado de um cultivo realizado em batelada alimentada.
O emprego da batelada alimentada auxilia na extenso da viabilidade celular e,

consequentemente, aumenta os nveis de produo da protena de interesse (Ren et al
2013), assim como possvel aperfeioar a produo de certos compostos alternativos
com o uso da batelada alimentada (Zhang et al 2014).
1.4.3. Contnuo e contnuo com reciclo celular (perfuso)
O modo contnuo baseia-se, conforme figura 6, na troca constante de meio
metabolizado por meio de cultivo novo, a fim de prolongar a durao da corrida. Ao
retirar o meio metabolizado, clulas presentes no cultivo tambm so retiradas,
juntamente com os metablitos txicos e o produto de interesse, permitindo a
recuperao constante do mesmo. Esta troca e retirada, quando feita de forma racional,
ou seja, vinculada velocidade especfica de crescimento das clulas, evita a lavagem
do biorreator retirada em excesso de clulas do cultivo proporcionando um maior
tempo de corrida e uma maior viabilidade celular, o que favorece a produo da
protena recombinante. J o processo contnuo com reciclo celular mais complexo e
mais eficaz, ao se tratar de produo de biofrmacos (Vliz et al 2008).
Alimentao
Colheita
Perodo
Inculo
Cultivo
Figura 6. Esquema simplificado de um cultivo realizado em sistema contnuo.
O modo contnuo com perfuso segue a mesma linha do modo contnuo, porm
com a vantagem de reter as clulas durante a troca do meio, no sendo necessrio o
vnculo entre a taxa de perfuso e a taxa especfica de crescimento, conforme figura 7.
16
Este processo permite a troca constante de meio metabolizado por meio de cultivo
novo e uma corrida prolongada que gera um alto ndice de viabilidade celular e
concentrao celular, consequentemente, maior produo do biolgico. Diversos
dispositivos podem ser usados com o objetivo de reter as clulas durante o modo
contnuo com perfuso. Podem ficar externamente ao biorreator, igual ao da figura 7, ou
podem ficar dentro do biorreator. Normalmente, eles so baseados em separao por
campo gravitacional ou centrfugo e filtrao, mas todos dependentes do tamanho e
densidade da clula a ser retida e separada do meio retirado. Estes dispositivos tm
algumas desvantagens, os baseados em filtrao podem apresentar entupimento e os
dispositivos baseados em centrifugao podem sofrer com a adeso celular nas paredes
do dispositivo e entupimento dos dutos de sada. Para amenizar os problemas, algumas
estratgias so adotadas como sistemas de refrigerao que induzem a formao de
agregados celulares, facilitando a sedimentao das clulas retidas e estruturas pulsantes
que previnem a adeso celular nos compartimentos de drenagem (Castilho & Medronho
2002).
Reciclo Celular
Alimentao
Perodo
Inculo
Dispositivo
Reteno Celular
Colheita
Cultivo
Figura 7. Esquema simplificado de um cultivo realizado em sistema contnuo com reciclo celular.
A grande vantagem dos modos contnuos, de uma forma geral, a homogeneidade

das condies de cultivo, garantindo a produo de produtos com baixa variabilidade.
Gorenflo e colaboradores (2004) j haviam documentado a vantagem do modo contnuo
com reteno de biomassa que garantia nveis altssimos de densidade celular e taxas de
produtividade superiores a uma ordem de grandeza, em comparao com o modo de
batelada simples. Um fator muito importante que garante os elevados nveis descritos
pelo modo em perfuso a capacidade de manter os metablitos txicos a nveis noletais, favorecendo a longevidade do cultivo (Petiot et al 2011; Yeo et al 2013).
17
1.5. Meios de cultivo para clulas animais

Os meios de cultivo so compostos por componentes que oferecem nutrientes e
condies ambientais ideais s clulas presentes no cultivo, possibilitando o
funcionamento normal do metabolismo e do crescimento celular. Os primeiros relatos
de meios de cultivo datam do sculo XIX, onde estes eram compostos de diferentes sais
em suas concentraes timas com o propsito de cultivar e manter vivas clulas
animais. Desde ento, pouca coisa foi estudada at Harry Eagle que, em 1955,
desenvolveu o meio basal MEM (Meio Essencial Mnimo), servindo de base para o
desenvolvimento de outros meios mais completos. O desenvolvimento do MEM foi o
marco inicial para a pesquisa na rea e hoje existem diversas linhas de desenvolvimento
com base na criao de novos meios de cultivo (Van der Valk et al 2010; Jordan et al
2013). A partir dos meios basais, os meios de cultivo podem ser classificados como
meios complexos por apresentarem componentes de proporo no definida (extratos e
hidrolisados) e meios definidos, que apresentam a proporo de todos os componentes
da sua formulao em concentraes conhecidas. Os meios livres de soro (meios que
no necessitam da suplementao com soro, podendo conter extratos e hidrolisados), os
meios livres de protena (no apresentam protenas de alto peso molecular, mas
apresentam peptdeos na sua composio) e os meios livres de componentes de origem
animal (no apresentam nenhum componente de origem animal ou humana, porm
podem apresentar componentes no-definidos, como extratos de levedura ou de
plantas), em essncia, so considerados meios complexos (Van der Valk et al 2010). Os
meios quimicamente definidos no apresentam protenas, hidrolisados ou extratos de
composio desconhecida, s contendo componentes conhecidos, como hormnios e
fatores de crescimentos purificados. Os novos meios de cultivo estudados e
desenvolvidos so baseados na unio dos diferentes tipos de meios de cultivo, visando
melhor resposta da clula e melhoria do processo e do produto de interesse (Van der
Valk et al 2010).
Conforme Van der Valk e colaboradores (2010) e Jordan e colaboradores (2013)
discutem em seus trabalhos, atualmente a grande maioria das pesquisas voltadas para
este campo visa criao de meios quimicamente definidos (meio de cultivo que no
contm protenas, hidrolisados ou qualquer outro componente de composio
desconhecida) e livres de soro fetal bovino. O motivo dessa padronizao no processo
se d pelo fato de que algumas substncias ou fatores podem alterar os perfis de
18
expresso e de glicosilao de certas protenas recombinantes e prejudicar sua produo

(Gawlitzek et al 2009). A busca por meios quimicamente definidos impulsionada por
questes regulatrias (retirada de componentes de origem animal) e de homogeneidade
de insumos para a produo (quimicamente definidos, eliminando a variao lote-a-lote)
(Van der Valk et al 2010).
1.5.1. Fatores que interferem na produo e qualidade do biofrmaco
Inmeros fatores ou compostos presentes nos meios de cultivo podem alterar o
perfil metablico celular, impactando na proliferao, expresso da protena e processo
de glicosilao, refletindo assim na qualidade da protena recombinante. A seguir, foram
listados alguns destes fatores e como eles podem afetar o produto de interesse, alm de
fatores fsico-qumicos referentes s condies de cultivo, como faixa de pH,
temperatura, osmolalidade, concentrao de gases e tenses de cisalhamento. Nos dois
ltimos casos, importante destacar que, apesar de no serem fatores ligados
diretamente composio do meio, existem elementos e caractersticas especficas da
sua formulao que podem amortizar os efeitos negativos de estresses hidrodinmicos
causados pela aerao intensa e a agitao.
1.5.1.1. Carboidratos
Os carboidratos exercem diversos papis no cultivo celular. Os sacardeos so
importantes fontes de energia e tambm possuem funo estrutural, como no processo
de glicosilao (Wang et al 2010). Exercendo seu papel de principal fonte de energia do
meio, a concentrao ideal de glicose necessria para a manuteno do cultivo celular
em condies adequadas. Estudos mostram que nveis aceitveis de glicose no meio
influenciam diretamente o crescimento celular e a produtividade da protena
recombinante (Dowd et al 2001).
O correto balano da quantidade de componentes presentes no meio de extrema
importncia, uma vez que a presena de altas concentraes de glicose acarreta na
produo de altos nveis metablitos, como o lactato at 50 mM ou 4,5 g/L que
podem ser txicos para o cultivo, inibindo o crescimento celular (Zhou et al 2011).
Zhou e colaboradores (2011) ainda citam a necessidade de adio de compostos
alcalinos para regular o pH do meio que tende a acidificar por causa do lactato e, como
consequncia da adio de mais compostos, a osmolaridade do meio tambm alterada.
19
O conjunto destes fatores pode inibir o crescimento celular e levar a uma produo
reduzida da protena recombinante (Cruz et al 2000; Lao & Toth 1997).
Devido ao grande consumo de glicose pelas clulas e, em consequncia, o alto
nvel de lactato no meio de cultivo, estratgias de controle do consumo de glicose e
produo de lactato vm sendo estudadas para aprimorar a produtividade e a
longevidade celular, durante o perodo de cultivo (Mulukutla et al 2010). A regulao
de certas enzimas metablicas como a hexoquinase (HK) e fosfofrutoquinase (PFK ou
PFK1) e a regulao metablica por protenas sinalizadoras e elementos de controle de
crescimento, como insulina, fator de crescimento do tipo-insulina (IGF), o protooncogene cMyc e protena quinase ativada por AMP (AMPK) so possveis gene-alvos
que podem ser transfectados e favorecer o cultivo, aumentando a produtividade da
linhagem celular que expressa a protena de interesse (Mulukutla et al 2010).
Alm da funo energtica, os carboidratos apresentam a funo de integrar as
cadeias laterais de oligossacardeos ancoradas nas protenas pelo processo da
glicosilao. Inmeras glicoformas podem ser geradas com grande variabilidade de
estruturas de glicanos ancoradas em regies especficas do esqueleto proteico como
efeito da composio de acares do meio de cultivo, que influencia nas estruturas
antenrias adicionadas protena (Butler 2008) e a grande quantidade de enzimas da
clula relacionada neste processo, onde, por exemplo, para ocorrer a sialilao, diversas
sialiltransferases precisam estar presentes (Murphy et al 2013).
1.5.1.2. Aminocidos
Os aminocidos so nutrientes para o desenvolvimento da linhagem celular no
cultivo e para a expresso da protena recombinante de interesse. Todo meio de cultivo
precisa ter todos os vinte aminocidos, tanto os essenciais quanto os no essenciais, para
que possam exercer suas funes estruturais e energticas na clula e secreo da
protena recombinante (Kyriakopoulos et al 2013). Os aminocidos so as unidades
primordiais que formam as protenas recombinantes. Alm da funo estrutural, os
aminocidos servem como pontos de ancoragem para a ocorrncia das modificaes
ps-traducionais e sua disposio estrutural pode interferir na mesma, promovendo ou
inibindo stios de glicosilao (Ben-Dor et al 2004).
20
Em termos energticos, a glutamina o aminocido mais importante e est

presente nos meios de cultivo por sua versatilidade (Hossler et al 2009). Este
aminocido pode ser usado para integrar as protenas recombinantes expressas pelas
clulas, na sntese de nucleotdeos e como fonte de energia. Apesar das funes que a
glutamina desempenha, o aminocido quimicamente instvel, o que no permite a
estocagem do meio em temperaturas acima de 4C e a sua esterilizao por meio de
calor (Butler & Christie 1994).
Uma consequncia desfavorvel do uso da glutamina o fato da liberao de
amnio no meio de cultivo, resultado da degradao do aminocido pelas clulas e da
molcula ser quimicamente instvel. A liberao do on amnio pela clula decorre do
processo de utilizao da glutamina no ciclo do cido tricarboxlico, principal rota
metablica para a alta gerao de energia celular aerbica (Butler & Christie 1994). A
glutamina pode ser utilizada pela clula para retroalimentar o ciclo do cido
tricarboxlico, gerando intermedirios do ciclo, contribuindo para a manuteno do
mesmo e preservando a respirao aerbica da clula no cultivo (Alberts et al 2010).
Concentraes de amnio acima de 5,1 mM podem ser txicas para a clula e
interferem no pH intracelular, afetando as modificaes ps-traducionais realizadas no
aparelho de Golgi, que so dependentes do pH (Chen & Harcum 2005; Xing et al 2008).
Uma alternativa que pode diminuir a concentrao de amnio no meio a troca da
glutamina por glutamato (Van der Valk et al 2010). A vantagem do uso do glutamato
a liberao de uma molcula de amnio para cada molcula de glutamato, o que no
ocorre com a glutamina que tem a taxa de duas molculas de amnio para cada
molcula de glutamina. Assim, menos amnio liberada no meio, diminuindo a sua
influncia inibitria e aumentando a longevidade do cultivo (Huang et al 2006).
Outra estratgia que vem sendo explorada a utilizao de um dipeptdeo, mais
especificamente, L-alanil-L-glutamina (Imamoto et al 2013). Este dipeptdeo mais
estvel e mais solvel do que a L-glutamina livre. Apesar da reduo da taxa de
crescimento celular, os nveis de produtividade da protena de interesse aumentaram
quando a L-glutamina foi totalmente substituda pelo dipeptdeo. Alm do aumento na
produtividade, ficou evidenciada uma reduo de amnio no meio de cultivo, devido
estabilidade da molcula e o consumo mais equilibrado do dipeptdeo (Imamoto et al
2013).
21
1.5.1.3. Sais minerais

Alm dos nutrientes orgnicos, as clulas animais necessitam do aporte de sais
minerais presentes no meio de cultivo (Gong et al 2006), em especial os ons clcio
(Ca2+) e magnsio (Mg2+). O on Ca2+ considerado um dos mais importantes ctions
metlicos por sua participao ativa em mecanismos intracelulares, regulando a
transcrio de genes, a mitose celular e apoptose (Crabtree 2001).
O on Mg2+ est envolvido no co-transporte de outros ons pelas membranas
celulares e ajuda na regulao de, no mnimo, trezentas enzimas presentes no
metabolismo celular, sntese de cidos graxos, estabilizao ribossomal e sntese
proteica (Gong et al 2006). Devido importncia dos sais minerais na manuteno
celular, a presena no meio de cultivo de vital importncia, onde a disponibilidade
pode interferir no crescimento e na produo da protena recombinante de interesse.
1.5.1.4. Vitaminas
As vitaminas contidas nos meios de cultivo desenvolvidos para as clulas animais
costumam estar presentes em pequenas concentraes e apresentam importante
influncia no crescimento celular e na secreo de protenas heterlogas. A sua
participao no controle da mitose celular e apoptose garantem s vitaminas grande
importncia na formulao dos meios de cultivo e necessidade de um balano muito
bem afinado com as demandas metablicas da linhagem celular empregada (Ishaque &
Al-Rubeai 2002).
O grupo de vitaminas da famlia do complexo B costuma estar presente em
diversos meios de cultivo para clulas animais atuando como cofatores e coenzimas no
metabolismo de carboidratos, lipdeos, protenas e cidos nuclicos. Na ausncia de
determinadas vitaminas do complexo B, altos nveis de apoptose foram detectados,
demonstrando a sua importncia na suplementao do meio. Outras vitaminas devem
ser adicionadas, como as vitaminas lipossolveis (E, D, A e K) e o cido ascrbico
(vitamina C) (Moraes et al 2008).
A vitamina E ajuda a combater as espcies reativas de oxignio geradas no
cultivo. A vitamina D regula o transporte de ons clcio do meio pela clula. A vitamina
A tem papel fundamental na diferenciao e no crescimento celular, a vitamina K
22
importante no processamento proteico realizado pela clula e o cido Ascrbico

essencial na sntese de colgeno pela clula animal (Moraes et al 2008).
1.5.1.5. Nucleotdeos
Os precursores de nucleotdeos modulam as concentraes intracelulares dos
prprios nucleotdeos, resultando em diferentes nveis de sialilao e estruturas
antenrias (Hossler et al 2009). Baker e colaboradores (2001) mostraram que
suplementando o meio de cultivo com Glicosamina e uridina, os nveis de N-acetilhexosamina intracelular foram elevados, aumentando a presena de estruturas antenrias
no cultivo de clulas CHO secretoras de inibidores de metaloproteinases teciduais 1,
porm reduzindo os nveis de sialilao da protena.
Entretanto, Gu & Wang (1998) usaram de mesma tcnica e suplementaram um
cultivo de clulas CHO produtoras de Interferon- (IFN-) com N-Acetilmanosamina
(precursor do cido silico) com o intuito de aumentar a sialilao nas molculas de
IFN- e o resultado foi positivo, resultando em um aumento da sialilao das cadeias de
carboidratos. A suplementao aumentou os nveis de cido silico circulante em at
trinta vezes comparado ao cultivo-controle. Estes resultados mostraram que os nveis de
acares
nucleotdicos
interferem
diretamente
na
glicosilao
das
protenas
recombinantes e sua suplementao no meio de cultivo importante fator para a

qualidade da glicosilao e consequentemente da glicoprotena.
1.5.1.6. Elementos-trao
Os elementos-trao so elementos inorgnicos, em sua grande maioria compostos
por metais, e servem como cofatores para ativao completa de certas protenas
essenciais no metabolismo celular (Merchant et al 2006). Alguns metais, como ferro,
cobre, mangans, molibdnio e vandio existem em diversos estados oxidados estveis
em meio aquoso e representam metais importantes para as reaes redox do organismo.
Devido sua importncia metablica, os elementos-trao precisam fazer parte do meio
de cultivo para serem utilizados como nutrientes pelas clulas.
Contudo, as mesmas propriedades essenciais dos elementos-trao podem ser
prejudiciais e causar danos celulares. Alguns elementos tm seu potencial citotxico
exacerbado quando entram em contato com o oxignio (Imlay 2003). Em metais como o
ferro e o selnio, a dose letal e a dose recomendada para consumo humano so muito
23
prximas e o mesmo acontece com outros animais, o que requer uma homeostase por
parte dos organismos para no ocorrer o desequilbrio (Merchant et al 2006).
1.5.1.7. Soro Fetal Bovino (SFB)
O soro fetal bovino uma mistura complexa formada de diversos fatores de
crescimento, vitaminas, protenas e outros compostos que so considerados essenciais
para a proliferao e manuteno celular e para a correta sntese do biofrmaco/protena
recombinante (Van der Valk et al 2010). No entanto, o SFB possui desvantagens que
desencorajam a continuidade do seu uso nas aplicaes biotecnolgicas para a produo
de insumos para sade falta de padronizao dos soros, ocorrendo variao nos
cultivos e no produto final de acordo com o lote de insumo utilizado, contaminao por
vrus, prons e um maior nmero de etapas de purificao da protena recombinante
(Berlec & Strukelj 2013).
Apesar dos cultivos celulares apresentarem resultados melhores com o uso do
SFB, como descrito por Grillberger e colaboradores (2009), as autoridades regulatrias
no mbito da vigilncia sanitria vm encorajando a busca de alternativas para a
substituio do SFB. Dado este motivo, sugere-se o uso de substncias definidas que
exeram as mesmas funes do SFB, como protenas e hormnios sintticos, para
alcanar os mesmo efeitos no processo de produo. A preocupao em substituir os
meios com soro por meios livres de soro no recente. Alternativas para o SFB so
estudadas desde a dcada de 90. Por exemplo, Keen & Rapson (1995) desenvolveram
um meio de cultivo livre de soro fetal bovino para a produo, em grande escala de um
anticorpo monoclonal produzido por clulas CHO, o CAMPATH-1H. Entretanto, a
melhor opo para a substituio do SFB o uso dos meios quimicamente definidos.
Devido aos avanos na rea de meio de cultivo, diversos processos biotecnolgicos j
empregam os meios livres de soro para cultivar suas respectivas linhagens celulares e
obter boas taxas de produtividade celular (Chu & Robinson 2001; Rodrigues et al 2012;
Zhang et al 2013).
1.5.1.8. Fatores fsico-qumicos
Diversos
fatores
fsico-qumicos
podem
interferir
na
produo
do
biofrmaco/protena recombinante. Um fator de grande relevncia a temperatura de

cultivo que tem impacto no crescimento celular e, consequentemente, na expresso da
24
protena recombinante. Dependendo da linhagem celular, as variaes de temperatura

podem interferir na produo e nas modificaes ps-traducionais (Vergara et al 2012).
Em clulas de mamferos, que tem a temperatura tima de crescimento
estabelecida em 37C, as variaes trmicas podem ser benficas ou prejudiciais (Yoon
et al 2006a). Estudos mostram que uma diminuio na temperatura do cultivo (de 37C
para 32C) pode levar a um aumento na produtividade da protena recombinante, porm
interferir nos padres de glicosilao gerados pelo sistema biolgico, como no caso da
EPOhr que tem nveis de sialilao menores em temperaturas mais baixas que 37oC
(Bollati-Fogoln et al 2005; Trummer et al 2006).
Se a temperatura considerada um fator importante na expresso da protena, o
pH dentro do reator tambm exerce importante papel. De acordo com Yoon e
colaboradores (2006b), uma pequena variao na faixa de pH (de 7,0 a 7,2) pode
intensificar a produo sem prejudicar as modificaes ps-traducionais sofridas pela
protena. Entretanto, uma maior variao na faixa de pH pode causar alteraes nos
perfis de glicosilao (Muthing et al 2003), salientando a importncia de se manter as
condies de cultivo constante/homogneas, onde o modo de operao escolhido tem
grande influncia.
As concentraes de gases dentro do biorreator e o valor de saturao de oxignio
oxignio dissolvido (OD) tambm tm papel importante na glicosilao. Com
relao concentrao de gases, a presso parcial de CO2 (pCO2) tem ligao direta
com a sialilao, onde quanto maior a pCO2, menor o nvel da glicosilao (Zanghi
1999). J em relao ao oxignio dissolvido, o efeito nas modificaes ps-traducionais
varia de acordo com a linhagem celular e a protena expressa. Em uma faixa de 10 a
100% de saturao, a linhagem consegue realizar suas modificaes sem alteraes
relevantes (Butler 2006; Restelli et al 2006).
Com relao s tenses de cisalhamento foras vetoriais que as clulas esto
expostas dentro do biorreator devido agitao para homogeneizar o meio elas podem
provocar alteraes no tamanho das ramificaes de carboidratos gerados durante a
glicosilao no seu stio especfico de ancoragem. Estudos mostram que altos nveis de
danos provocados pelas tenses de cisalhamento so suficientes para reduzir o tamanho
da cadeia polissacardica localizada na posio Asn 184 na protena tPA (ativador de
plasminognio tecidual) (Senger & Karim 2003).
25
A osmolaridade um importante parmetro no processo de cultivo celular. Este

fenmeno causa alteraes no rendimento, glicosilao e sialilao da protena
recombinante (Konno et al 2012). Diferentes nveis de osmolaridade j foram testados
em diversas linhagens celulares, onde a faixa tima de crescimento celular encontra-se
entre 280 a 320 mOsm miliosmol (Takagi et al 2001). As clulas CHO, por exemplo,
quando entram em situao de hiperosmolaridade, podem alterar sua conformao
celular. As clulas CHO nessa condio apresentam um maior volume e reduo no seu
crescimento, porm a produtividade da protena recombinante pode apresentar
incremento significativo, em comparao com a mesma linhagem em condies
normais (Takagi et al 2001; Zhang et al 2010). Outro motivo para a necessidade do
controle da osmolaridade a capacidade de altos nveis de presso osmtica causar
apoptose
nas
linhagens
celulares,
como
foi
observado
em
clulas
CHO,
independentemente de qualquer outro fator que tambm leva apoptose, como a

depleo de nutrientes (Han et al 2009).
26
2. PROPOSTA DE TRABALHO
Direcionado pela necessidade de alternativas para o insumo meio de cultivo
utilizado atualmente no processo de transferncia de tecnologia, antecipando uma
eventual descontinuao do mesmo, o presente projeto busca analisar o comportamento
dos cultivos de clulas de ovrio de hamster chins (CHO) e o padro de secreo da
EPOhr, em sistemas de frascos do tipo T25cm2, T75cm2, garrafas rotatrias e em
biorreator de tanque agitado, utilizando diferentes meios de cultivo, afim de encontrar
meios alternativos que apresentam caractersticas semelhantes s encontradas no meio
de cultivo atualmente utilizado (SFM4CHO Utility).
Objetivo principal:
Comparar diferentes alternativas de meios de cultivo comerciais livres de soro
fetal bovino e componentes animais com o meio de cultivo atualmente utilizado para o
cultivo em suspenso de clulas CHO secretoras de EPOhr.
Objetivos especficos:
i)
Estudar o comportamento dos cultivos das clulas CHO secretoras de EPOhr em
frascos estticos e garrafas rotatrias utilizando diferentes meios de cultivo livres de

soro fetal bovino e componentes de origem animal, em relao ao meio atualmente
utilizado no processo;
ii)
Avaliar o perfil metablico das culturas das clulas CHO secretoras de EPOhr,
utilizando como parmetro as taxas de crescimento celular, de produo de EPOhr e

consumo de nutrientes nos cultivos celulares realizados com os diferentes meios
testados;
iii)
Avaliar o comportamento de crescimento e o consumo de glicose das clulas
CHO secretoras de EPOhr em biorreator do tipo tanque agitado em modo contnuo;
27
3. MATERIAL E MTODOS
Os experimentos foram realizados em Bio-Manguinhos, no Laboratrio de
Tecnologia Virolgica (LATEV), na Vice-Diretoria de Desenvolvimento Tecnolgico
(VDTEC), sob o escopo do Projeto de Transferncia de Tecnologia da Alfaepoetina, da
Vice-Diretoria de Produo (VPROD).
3.1. Material
3.1.1. Linhagem celular e Banco de Clulas de Trabalho
Clulas de ovrio de hamster chins (CHO Chinese Hamster Ovary)
recombinantes adaptadas ao crescimento em suspenso expressando a molcula da
Eritropoetina humana recombinante (EPOhr), oriundas da transferncia de tecnologia
com Cuba foram utilizadas neste presente trabalho.
3.1.2. Meio de cultivo controle
O meio SFM4CHO Utility (Thermo Hyclone GE) foi utilizado como
parmetro de controle nestes experimentos por se tratar do meio de cultivo empregado
para o cultivo da linhagem em questo para produo, em larga escala, da EPOhr. Tratase de um meio livre de SFB, onde foram misturados os componentes fornecidos nas
propores de 49,0g/L do Base Powder e 30g/L do Medium Powder. O meio necessitou
de suplementao de 2mM/L de L-glutamina (Sigma-Aldrich), 11,0g/L de Bicarbonato
de sdio (NaHCO3) (Merck) e 5g/L de Pluronic F 68 (Thermo Hyclone GE).
3.1.3. Meios de cultivo alternativos
Ao todo, sete meios de cultivo alternativos foram utilizados, alm do meio de
cultivo controle. Destaca-se que os meios de cultivo testados so meios comerciais,
protegidos por patentes e grande parte das informaes sobre sua composio no so
disponibilizadas para o consumidor:
28
SFM4CHO (Thermo Hyclone GE): meio livre de protenas e soro fetal

bovino, onde seus componentes foram misturados na proporo de 19,83g/L do
meio pronto com de suplementao de 4mM/L de L-glutamina (SigmaAldrich), 2,2g/L de NaHCO3 (Merck) e 1,0g/L de Pluronic F68 (Thermo
Hyclone GE);
HyCell (Thermo Hyclone GE): meio livre de soro fetal bovino e de protenas
de origem animal, onde seus componentes foram misturados na proporo de
25,4g/L do meio pronto com suplementao de 4mM/L de L-glutamina (SigmaAldrich) e 2,2g/L de NaHCO3 (Merck);
HyCell sem HT (Thermo Hyclone GE) apresenta o mesmo preparo do

HyCell convencional, sendo apenas diferente pela ausncia de Hipoxantina e
Timidina (HT);
HyCell TransFx-C (Thermo Hyclone GE): meio livre de protenas e soro fetal
bovino, onde seus componentes foram misturados na proporo de 19,25g/L de
meio pronto com suplementao de 4mM/L de L-glutamina (Sigma-Aldrich) e
3,2g/L de NaHCO3 (Merck);
CD FortiCHO (Gibco): meio livre de protenas de origem animal e soro fetal

bovino, aonde seus componentes j vieram misturados no possui
apresentao em p no volume de 1 (um) litro. Necessitou de suplementao
de 4mM/L de L-glutamina (Sigma-Aldrich) e no precisa de adio de
Pluronic F68 (Thermo Hyclone GE);
Cellvento CHO-110 (Merck Millipore): meio quimicamente definido, livre

de componentes de origem animal e soro fetal bovino. Seus componentes foram
misturados na proporo de 27,5g/L de meio pronto com suplementao de
4mM/L de L-glutamina (Sigma-Aldrich), 2,0g/L de NaHCO3 (Merck) e 3mL/L
de soluo de Citrato de Ferro (III) Amoniacal 10 mM (Merck). O meio no
necessitou da suplementao de nenhum surfactante e, segundo, instruo dos
fabricantes, no foi feita suplementao com HT;
CPCHO (Diagnovum): meio livre de protenas de origem animal e soro fetal

bovino. Apresenta, em sua composio, extrato de levedura para enriquecimento
do meio para atingir um melhor desempenho. Seus componentes foram
misturados na proporo de 15,89g/L de meio pronto em p com suplementao
de 2g/L de NaHCO3 (Merck), 1,0g/L de Pluronic- F68 (Thermo Hyclone GE),
29
20mg/L de Citrato Frrico micron (Merck) e 5mg/L de rInsulina/Insulina

recombinante (Merck). O meio j vem suplementado com L-Glutamina.
3.1.4. Sistemas de cultivo
As clulas CHO descongeladas do banco de clulas de trabalho foram cultivadas e
propagadas, inicialmente, em frascos estreis para cultivo de clulas de poliestireno do
tipo T25 cm2 e T75 cm2 (Corning). Aps sucessivos sub-cultivos e com densidade
celular suficiente, as clulas foram transferidas para garrafas de maior volume at
300mL do tipo rotatrias (Corning), para o incio dos experimentos. As garrafas
rotatrias foram mantidas sob agitao por agitadores apropriados para o sistema em
estufa a 37C sem a necessidade de atmosfera controlada de CO2.
3.2. Mtodos
3.2.1. Quantificao celular
As clulas pr-cultivadas foram quantificadas pelo mtodo de excluso do corante
vital Azul de Trypan a 0,5% v/v (Gibco Invitrogen) para identificao de clulas
mortas (Kuchler 2000) e por colorao com Cristal Violeta (Sanford et al 1950) na
proporo de Cristal Violeta 0,1% + cido Ctrico 2,1% + Triton X-100 0,01% para
identificao de clulas totais. O mtodo de excluso do Azul de Trypan se baseia na
colorao das clulas que perderam a sua permeabilidade seletiva de membrana,
adicionando 50L da soluo de Azul de Trypan em 50L de suspenso celular recmaliquotada. A contagem foi manual e feita em hemocitmetro Bright-line (Reichert) ao
microscpio ptico Leica MPS 60 (Leica).
A quantificao de clulas totais foi realizada pela tcnica de contagem de ncleos
corados com soluo cida de Cristal Violeta. Por se tratar de uma linhagem celular
adaptada ao cultivo em suspenso, as clulas presentes no cultivo tendem a formar
grumos, o que impossibilitou o uso de tcnicas de contagem direta como o mtodo de
excluso por Azul de Trypan unicamente. Para realizar a contagem, 1mL de suspenso
celular foi retirado do cultivo e centrifugado a 1500xg por quatro minutos. O
sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em 1mL de soluo cida de
Cristal Violeta. A mistura foi agitada vigorosamente em agitador do tipo vrtice e a
contagem dos ncleos corados foi feita em hemocitmetro Bright-line (Reichert) em
microscpio ptico Leica MPS 60 (Leica).
30
Para quantificar o total de clulas viveis do cultivo, calculou-se a diferena entre

o total de clulas totais e o total de clulas mortas. Aps os referentes clculos e
contagens, avaliou-se a viabilidade celular pela diviso entre o total de clulas viveis
pelo nmero de clulas totais. Todas as contagens em hemocitmetro foram feitas em
duplicata tcnica, onde cada garrafa de cultivo foi contada duas vezes para fazer a
quantificao celular.
3.2.2. Anlise bioqumica para determinao da concentrao de glicose e
lactato
Todos os meios de cultivo e suas respectivas amostragens foram analisadas tanto
para concentrao de glicose quanto para de lactato pelo analisador bioqumico YSI
2700 Analyser (Yellow Springs Instruments, EUA) do laboratrio LECC/COPPE UFRJ. A anlise consiste em uma pequena amostragem do sobrenadante das alquotas
retiradas diariamente, ao longo dos cultivos. Essa amostragem passa por membranas
sensibilizadas com enzimas que reconhecem, separadamente, a concentrao de glicose
e de lactato.
3.2.3. Determinao da concentrao de Eritropoetina humana recombinante
(EPOhr)
A eritropoetina humana recombinante presente nos sobrenadantes dos cultivos
realizados foi quantificada por tcnica de Imunoensaio Enzimtico direto/indireto
(ELISA). O kit utilizado na quantificao da EPOhr foi o Human Erythropoietin
Quantikine IVD ELISA kit (R&D Systems), onde todos os reagentes utilizados em
cada etapa do experimento foram fornecidos no kit.
Para realizar a quantificao de EPOhr presente nos sobrenadantes, segundo
orientao do fabricante, foi feita uma diluio seriada das amostras testadas para achar
a faixa ideal de deteco do kit de ELISA. Aps a diluio, a placa j sensibilizada com
o anticorpo anti-EPO foi preparada com 100L do reagente EPO Assay Diluent em
cada poo, 100L dos EPO Standard 0 200 mUI, 100L dos controles positivo e
negativo e 100L das amostras diludas. Ao fim desta etapa, a placa ficou incubando
por duas horas na bancada em temperatura ambiente.
Com o passar da primeira incubao, todo o contedo dos poos da placa foi
retirado e seco com a ajuda de papel absorvente. Com os poos secos, foi adicionado
200L EPO Conjugate o segundo anticorpo, anti-EPO conjugado a uma enzima
31
Peroxidase e a placa foi levada incubao por mais duas horas na bancada em
temperatura ambiente. Aps a segunda incubao, todo o contedos dos poos foi
retirado e cada poo foi lavado com EPO Wash Buffer 1x por quatro vezes. Depois
das lavagens, foi adicionado 200L da Substrate Solution (Reagent A + Reagent B)
em cada poo e a placa ficou incubando por vinte minutos na bancada em temperatura
ambiente, evidenciando a colorao azul nos poos onde ocorreu a ligao entre a
EPOhr do sobrenadante e os anticorpos do kit ELISA.
Decorrido o tempo da terceira incubao, foi adicionado 100L da Stop
Solution em cada poo para revelao do teste. A intensidade da colorao de
revelao foi medida em leitor de micro-placa no comprimento de onda de 450nm com
correo para 600nm para aumentar a preciso da leitura. Com a adio da Stop
Solution, os poos que antes eram azuis apresentaram colorao amarelada. Os
resultados obtidos foram transferidos para uma planilha virtual, onde foram analisados
por intermdio de comparao com a curva padro do teste, de acordo com a orientao
do fabricante do kit ELISA.
3.2.4. Criao do banco de clulas de trabalho
As clulas CHO utilizadas neste trabalho foram preservadas em criotubos
mantidos em nitrognio lquido a -196C. Para realizar o congelamento e posterior
formao do banco de clulas de trabalho, as clulas pr-cultivadas de um banco mestre
de clulas e que se encontravam no nono sub-cultivo foram quantificadas pelos mtodos
descritos no item 4.2.1, concentradas em um tubo Falcon e centrifugadas 750xg por
dez minutos. Aps centrifugao, foi feito o descarte do sobrenadante e as clulas foram
ressuspendidas em meio de congelamento contendo 91,5% (v/v) do meio SFM4CHO Utility, 7,5% (v/v) de Dimetilsulfxido (DMSO) e 1% (v/v) de CMC a 3%. O
contedo do cultivo foi distribudo em criotubos de 1mL com um total de 33 criotubos,
a uma concentrao celular de 1,7x107 clulas viveis/mL e viabilidade de 95,4%. Os
criotubos foram mantidos em freezer -70C por 24 horas dentro de um recipiente
chamado Mr. Frosty Freezing Container (Thermo Hyclone GE) que contm
Isopropanol, ajudando no congelamento lento das alquotas.
Passadas 24 horas, os criotubos foram transferidos para o tanque de nitrognio
lquido a -196C e assim, criando um banco de trabalho que foi utilizado nos
experimentos deste trabalho.
32
3.2.5. Descongelamento de clulas CHO para experimentao

Para realizar os experimentos, os criotubos do banco de clulas de trabalho foram
descongelados, mediante necessidade do uso das clulas. A cada meio de cultivo novo
testado, um criotubo foi descongelado para o incio da adaptao e cintica comparativa.
Os criotubos usados foram retirados do tanque de nitrognio e descongelados
rapidamente em banho-maria a 37C. De um Falcon de 50mL (Corning) com 15mL
de meio SFM4CHO - Utility tambm a 37C, foram retirados 3mL de meio
SFM4CHO Utility do tubo Falcon e com a mesma pipeta, o contedo de 1mL do
criotubo foi retirado para ser homogeneizado com contedo da pipeta e o meio presente
no tubo Falcon. Aps a homogeneizao, retirou-se uma alquota do homogeneizado e
foi feita a contagem de clulas mortas e vivas. Aps as contagens, as clulas foram
mantidas em estufa a 37C por quatro dias at o prximo sub-cultivo.
3.2.6. Sub-cultivos das clulas CHO e cintica comparativa entre os meios
Para a realizao dos experimentos, as clulas descongeladas utilizadas foram
cultivadas, seguindo as orientaes dos fabricantes. Inicialmente, as clulas foram
cultivadas em dois frascos T25 cm2, na concentrao inicial que varia de 2,0x105 a
4,0x105 clulas viveis/mL e com viabilidade sempre acima de 80,0% em meio
SFM4CHO - Utility, mediante mtodos descritos no item 4.2.1. Concomitantemente
ao descongelamento, uma terceira garrafa gerada oriunda do mesmo criotubo e
cultivada nos mesmos parmetros das outras duas para servir de reserva para eventuais
problemas.
Para propagar o inculo, o mesmo procedimento foi realizado com os cultivos em
T25 cm2, aumentando o volume do frasco e concentrao celular de T25 cm2 para T75
cm2. Um passo adicional foi feito, onde em um dos frascos T75 cm2 o meio
SFM4CHO Utility foi trocado pelo meio alternativo a ser testado, durante o subcultivo. Esta etapa crucial, podendo ser necessria repeti-la, caso a clula no
apresente uma boa adaptao ao meio testado.
Foram realizados mais dois sub-cultivos com cada frasco T75 cm2 pr-inoculado,
perante os moldes do item 4.2.1. O primeiro consistiu no aumento de frascos T75 cm2
de um para trs frascos para ter densidade celular suficiente para o segundo sub-cultivo
que foi a adaptao das clulas s garrafas rotatrias. Na segunda passagem, o contedo
33
dos trs frascos deve ser suficiente para gerar um inculo de 2,0x105 a 4,0x105 clulas
viveis para 100mL de volume de meio dentro de uma garrafa rotatria mantida em
estufa a 37C sob agitao de 2,75 rpm por quatro dias. No ltimo sub-cultivo antes do
incio da cintica comparativa, o contedo presente na garrafa rotatria foi passado para
outras duas garrafas rotatrias com 150mL de meio alternativo em cada uma das duas
garrafas necessrias para o experimento. A figura 8 demonstra, de maneira simplificada,
todas as etapas de adaptao at o primeiro dia da cintica. O tempo de durao da
cintica variou entre cinco a nove dias. Todo o protocolo aqui descrito foi realizado com
meio SFM4CHO Utility em paralelo para realizao da cintica-controle em cada
experimento. Levando em considerao apenas a primeira cintica-controle como
parmetro de comparao com os demais meios de cultivo alternativos, todas as outras
cinticas em SFM4CHO- Utility foram realizadas para avaliar as condies de cultivo,
verificando se algum fator externo ao meio foi responsvel por variao na sua
performance (por exemplo, problemas com estufa ou agitador).
As cinticas consistiram em retiradas de alquotas de 3mL dirias das garrafas
rotatrias. Os resultados obtidos foram provenientes de duplicatas biolgicas, mdia de
dois cultivos em condies idnticas. Um dos trs mililitros retirados foi empregado
para quantificao de clulas mortas, totais, viveis e viabilidade. Os outros dois
mililitros foram centrifugados e o sobrenadante foi congelado para posterior anlise
bioqumica e mensurao da produo da EPOhr, via Imunoensaio Enzimtico
(ELISA).
3.2.7. Cultivo em Biorreator
Aps as cinticas comparativas em cultivo em garrafas rotatrias, foi realizado o
cultivo em biorreator do tipo tanque agitado da Bioengineering (RALF). Seguindo o
mesmo protocolo dos itens 4.2.5 e 4.2.6, realizaram-se duas cinticas onde foram
inoculadas 2,0x105 clulas viveis/mL em 2,0L de meios de cultivo suplementados com
4mM de L-Glutamina (SFM4CHO e Cellvento CHO-110 sem HT) em um vaso com
capacidade de 3,7 L com a taxa de aerao entre 0,002 a 0,005vvm, com agitao a
150rpm, pH controlado na faixa de 7,2 a 7,4 e saturao de oxignio a 50% . As clulas
foram cultivadas em batelada simples at o quarto dia. A partir do quarto dia, foi dado
incio ao cultivo no biorreator operando em modo contnuo com a taxa de troca de
0,5vvd de meio de cultivo. Os mtodos de quantificao celular e de produo de
EPOhr foram os mesmos descritos nos itens 4.2.1., 4.2.2. e 4.2.3. aplicados nas cinticas
34
em garrafas rotatrias. O ltimo meio que poderia ser testado no biorreator seria o
CPCHO. Tal fato no ocorreu por problemas de logstica, onde no foi fornecida
quantidade suficiente de meio para a realizao do experimento.
Banco de clulas de trabalho
Cintica com meio alternativo
Cintica-controle
Inculo
Frasco
T25
cm
clulas viveis
com
T25
Frasco
T25
T25
cm
com
SFM4CHO Utility
SFM4CHO Utility
Inculo
3/4 Dias
3/4 Dias
clulas viveis
Frasco T75 cm com

meio alternativo
Frasco
T75
T75
T75
cm
com
SFM4CHO Utility
Inculo
3/4 Dias
3/4 Dias
Frasco T75 cm
meio alternativo
com
clulas viveis
T75
3x
3x
Inculo
3/4 Dias
Frasco
T75
T75
cm
com
SFM4CHO Utility
3/4 Dias
clulas viveis
Garrafa Roller com
Garrafa Roller com

meio alternativo
100 mL
100 mL
SFM4CHO Utility
Inculo
3/4 Dias
3/4 Dias
clulas viveis
150 mL
150/100 mL
2x
Cintica de 8 a 10 dias
Figura 8. Desenho esquemtico da metodologia do sub-cultivo para realizao das cinticas. A figura
mostra, de forma resumida, as etapas que precedem as cinticas, incluindo o inculo inicial at a
adaptao em garrafas rotatrias.
35
3.2.8. Clculo das taxas especficas e rendimentos

A partir dos resultados obtidos das anlises realizadas nos sobrenadantes das
cinticas foram calculados a taxa especifica de crescimento celular da fase exponencial
(exp), o tempo de duplicao celular (td), os valores de integral de clulas viveis (ICV),
taxa especfica de formao de eritropoietina (qEPOhr), taxa especfica de consumo de
glicose (qGlic), taxa especfica de formao de lactato (qLact), o coeficiente de rendimento
celular a partir da concentrao de glicose (YX/Glic) e a produtividade (P).
A taxa especfica de crescimento celular determinada na fase exponencial de
crescimento (exp) foi gerada por meio do coeficiente angular da regresso exponencial
dos valores de concentrao de clulas viveis do cultivo pelo tempo.
O tempo de duplicao (td) na fase exponencial do cultivo foi calculado segundo a
Equao 2, a partir do exp.
Equao 2
A integral de clulas viveis (ICV) foi calculada segundo a Equao 3. Para
avaliar a equao, foi empregado o mtodo dos trapzios, onde n corresponde ao
nmero de amostras experimentais utilizadas.
Equao 3
A taxa especfica de formao de eritropoetina (qEPOhr) foi calculada pela Equao

4a (modo batelada) e Equao 4b (modo contnuo).
Equao 4a
(
Equao 4b
Onde, [EPOhr] corresponde diferena dos valores da concentrao de

eritropoetina no sobrenadante no tempo i e i+1 e
, mdia dos valores da
concentrao de eritropoetina no sobrenadante no tempo i e i+1.

A taxa especfica de consumo de glicose (qGlic) foi calculada pela Equao 5a
(modo batelada) e 5b (modo continuo).
36
Equao 5a
((
Equao 5b
Onde, [Glic] corresponde diferena dos valores da concentrao de glicose no

sobrenadante no tempo i e i+1,
e[
concentrao de glicose na alimentao
mdia da concentrao de glicose no sobrenadante no tempo i e i+1. Os
resultados das equaes 5a e 5b levaram em considerao o mdulo do valor numrico,

uma vez que o consumo seria expresso por um valor negativo.
A taxa especfica de formao de lactato (qLact) foi calculada pela Equao 6a
(modo batelada) e 6b (modo continuo).
Equao 6a
(
Equao 6b
Onde, [Lact] corresponde diferena dos valores da concentrao de glicose no

sobrenadante no tempo i e i+1 e [
mdia da concentrao de lactato no
sobrenadante no tempo i e i+1. .

O rendimento celular a partir da concentrao de glicose foi calculado de acordo
com a equao 7.
Equao 7
A produtividade (P) foi calculada dividindo o valor mximo de concentrao da
EPOhr pelo tempo de cultivo.
37
4. RESULTADOS
O trabalho analisou diversos meios de cultivo quanto ao desempenho do cultivo e
da expresso da protena EPOhr, em comparao ao meio de cultivo padro utilizado
para a produo da protena.
4.1. Cultivos celulares para adaptao de clulas CHO com os meios alternativos
e cinticas comparativas
Os resultados obtidos a seguir foram provenientes de sub-cultivos realizados com
o intuito de saber se as clulas CHO utilizadas neste estudo seriam capazes de crescer e
se adaptar rapidamente aos novos meios de cultivo testados. Todas as adaptaes foram
originadas a partir do descongelamento de um criotubo do banco de trabalho mantido
em nitrognio lquido. Foram realizados os cultivos de adaptao com os meios
alternativos, juntamente com o meio padro SFM4CHO - Utility como controle.
Os meios HyCell e TransFx-C (ambos da Thermo Hyclone GE) apresentaram
resultados abaixo do esperado durante a etapa de adaptao. Como visto na tabela 1, a
adaptao ao meio HyCell no foi bem sucedida. Aps a substituio dos meios, entre
as passagens 2 e 3, ocorre uma queda de 2,10,30x106 clulas viveis/mL para
1,40,06x106 clulas viveis/mL e de 86,5% para 77,3%, na viabilidade do cultivo. Ao
longo da observao o cultivo no consegue recuperar concentraes e viabilidades
celulares ideais, terminando o perodo de adaptao em 53,6%.
Conforme citado anteriormente, o meio de cultivo TransFx-C tambm no foi
considerado apto para a sequncia dos experimentos. Apesar de apresentar uma
concentrao celular dentro dos valores esperados apresentados na tabela 2 2,3x106
clulas totais e 95,2% de viabilidade as clulas demonstraram um comportamento
anormal ao serem cultivadas nesse meio.
38
Tabela 1. Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabelas de adaptao/expanso
celular no meio HyCell. Cada valor est representado com seu respectivo desvio-padro. A linha
tracejada indica a substituio do meio SFM4CHO - Utility pelo meio alternativo. GR Garrafa
Rotatria/Roller.
Clulas
Clulas
Clulas
Passagem
Frasco/
Viabilidade
Totais/mL
Mortas/mL
Viveis/mL
(Dia)
Garrafa
(%)
6
5
6
(x10 )
(x10 )
(x10 )
Criotubo
0,70,06
0,60,06
0,60,17
90,30,03
1 (4)
T-25
2,10,80
1,20,11
1,90,72
94,70,03
2 (7)
3 (11)
T-75
2,10,04
0,90,03
2,00,01
96,30,02
T-75
2,50,40
1,10,31
2,40,41
95,30,01
4 (14)
T-75
2,10,13
0,80,32
2,00,11
96,00,01
5 (18)
T-75
2,00,27
1,10,52
1,80,18
94,30,02
6 (21)
GR
2,10,19
1,30,18
2,00,17
94,00,00
Passagem
(Dia)
Frasco/
Garrafa
Clulas
Totais/mL
(x106)
Clulas
Mortas/mL
(x105)
Clulas
Viveis/mL
(x106)
Viabilidade
(%)
(0)
Criotubo
1,90,12
2,50,74
1,70,04
87,30,03
1 (4)
T-25
1,70,03
1,30,14
1,60,01
92,80,01
2 (8)
3 (11)
T-75
2,50,30
3,30,08
2,10,30
86,50,02
T-75
1,90,06
4,20,00
1,40,06
77,30,01
4 (15)
T-75
0,20,08
1,30,08
0,10,09
42,50,23
5 (18)
GR
0,30,00
1,60,20
0,20,15
53,60,10
HyCell
SFM4CHO-Utility
(0)
HyCell sem HT
TransFx-C
SFM4CHO-Utility
Tabela 2. Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabelas de adaptao/expanso

celular no meio TransFx-C. Cada valor est representado com seu respectivo desvio-padro. A linha
tracejada indica a substituio do meio SFM4CHO - Utility pelo meio alternativo; o retngulo indica o
cultivo feito em meio TransFx-C; GR Garrafa Rotatria/Roller.
Passagem
(Dia)
Frasco/
Garrafa
Clulas
Totais/mL
(x106)
Clulas
Mortas/mL
(x105)
Clulas
Viveis/mL (x106)
Viabilidade
(%)
(0)
Criotubo
0,70,06
0,60,06
0,60,17
90,30,03
1 (4)
T-25
2,10,80
1,20,11
1,90,72
94,70,03
2 (7)
T-75
2,10,04
0,90,03
2,00,01
96,30,02
3 (11)
T-75
2,50,40
1,10,31
2,40,41
95,30,01
4 (14)
T-75
2,10,13
0,80,32
2,00,11
96,00,01
5 (18)
T-75
2,00,27
1,10,52
1,80,18
94,30,02
6 (21)
GR
2,10,19
1,30,18
2,90,17
94,00,00
Passagem
(Dia)
Frasco/
Garrafa
Clulas
Totais/mL
(x106)
Clulas
Mortas/mL
(x105)
Clulas
Viveis/mL (x106)
Viabilidade
(%)
(0)
Criotubo
0,50,02
0,70,28
0,50,05
86,56,01
1 (3)
T-25
2,60,19
0,50,11
2,50,20
97,90,57
2 (6)
T-75
1,50,10
0,50,18
1,40,11
96,41,41
3 (10)
T-75
2,30,31
1,40,21
2,10,29
95,22,48
4 (13)
T-75
2,40,11
0,50,04
2,30,11
98,00,21
5 (17)
T-75
1,90,29
2,20,07
1,60,30
88,00,07
6 (20)
GR
1,40,07
1,80,11
1,30,06
87,60,07
39
O comportamento anormal das clulas em meio TransFx-C pde ser visto na

figura 9, onde as clulas voltaram ao seu estado aderente, dificultando a contagem
manual. Outro fator avaliado que contribuiu para no dar prosseguimento aos
experimentos com este meio foi o propsito do mesmo, no qual foi desenvolvido para
ajudar no processo de transfeco da clula pelo vetor de expresso do gene de interesse
e no para o crescimento em um bioprocesso.
Figura 9. Clulas CHO em meio TransFx-C. Conforme foi observado e destacado pelos crculos
vermelhos, algumas clulas perderam a caracterstica de crescimento em suspenso e voltaram ao estado
de aderncia. Aumento de 250x.
Aps o perodo de adaptao e amplificao celular aos meios testados, as clulas

foram transferidas para garrafas rotatrias partindo de concentraes de 2,0x105 a
4,0x105 clulas viveis/mL pelo perodo de at nove dias. Os meios SFM4CHO,
HyCell sem HT, CD FortiCHO, Cellvento CHO-110 sem HT e CPCHO foram
escolhidos para realizar os experimentos por apresentarem condies ideais para
adaptao celular e tiveram cinticas realizadas em paralelo com o meio SFM4CHO
Utility. As cinticas foram interrompidas quando o nmero de clulas mortas foi maior
que o nmero de clulas viveis e, consequentemente, a viabilidade atingia nveis
abaixo de 50%. O objetivo da cintica foi comparar o crescimento celular, taxa
especfica de proliferao, taxa especfica de produo da EPOhr, consumo de glicose e
produo de lactato. A partir dos dados gerados, grficos foram montados para facilitar
a comparao da resposta celular em diferentes meios com o meio padro SFM4CHO
Utility.
40
4.1.1. Adaptao e cintica comparativa entre os meios SFM4CHO Utility e

SFM4CHO
De acordo com a tabela 3, foi possvel adaptar as clulas CHO no meio
SFM4CHO. Apesar de no manter os mesmos nveis de viabilidade (acima de 90%) o
cultivo de adaptao com SFM4CHO apresentou concentrao de clulas mais alta, ao
longo da adaptao, alcanando seu valor mximo na 4 passagem aps
descongelamento (2 passagem aps troca do meio) 5,40,01x106 clulas viveis/mL,
em comparao ao meio controle.
SFM4CHO
SFM4CHO-Utility
Tabela 3. Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabela de adaptao/expanso

celular no meio SFM4CHO. Cada valor est representado com seu respectivo desvio-padro. A linha
Rotatria/Roller.
Clulas
Clulas
Clulas
Passagem
Frasco/
Viabilidade
Totais/mL
Mortas/mL
Viveis/mL
(Dia)
Garrafa
(%)
6
5
6
(x10 )
(x10 )
(x10 )
(0)
Criotubo
0,70,06
0,60,06
0,60,17
90,30,03
1 (4)
T-25
2,10,80
1,20,11
1,90,72
94,70,03
2 (7)
3 (11)
T-75
2,10,04
0,90,03
2,00,01
96,30,02
T-75
2,50,40
1,10,31
2,40,41
95,30,01
4 (14)
T-75
2,10,13
0,80,32
2,00,11
96,00,01
5 (18)
T-75
2,00,27
1,10,52
1,80,18
94,30,02
6 (21)
GR
2,00,19
1,30,18
2,00,17
94,00,00
Passagem
(Dia)
Frasco/
Garrafa
Clulas
Totais/mL
(x106)
Clulas
Mortas/mL
(x105)
Clulas
Viveis/mL
(x106)
Viabilidade
(%)
(0)
Criotubo
1,10,03
0,80,07
1,00,04
93,00,01
1(4)
T-25
1,50,00
0,50,21
1,50,02
96,70,01
2 (8)
3 (11)
T-75
2,90,01
2,30,50
2,70,06
92,10,02
T-75
2,60,10
0,40,02
2,20,13
84,10,01
4 (15)
T-75
6,40,01
9,91,59
5,40,15
84,50,03
5 (18)
GR
1,40,00
1,90,40
1,20,04
86,20,03
Aps a adaptao, o meio de cultivo SFM4CHO apresentou uma maior

densidade celular. Conforme visto na figura 10, a densidade de clulas viveis
alcanada no meio SFM4CHO foi de 2,40,1x106 clulas viveis/mL, enquanto o
maior valor alcanado pelas clulas cultivadas no meio controle foi de 1,80,1x106
clulas viveis/mL, onde o desvio-padro dos valores citados revela uma diferena
significativa entre eles. Entretanto, o cultivo em SFM4CHO no conseguiu manter a
mesma faixa de viabilidade, mantendo-se entre 80% e 90% na maior parte do cultivo e
baixando de 80% aps o 6 dia, em relao ao meio controle SFM4CHO Utility, que
41
apresentou viabilidade superior a 90% at o 4 dia, entre 80% e 90% entre o 5 e 7 dia e
inferior a 80% aps o 7 dia. Em relao ao crescimento na fase exponencial, a taxa
especfica de proliferao (exp) e tempo de duplicao (td) observados no meio
alternativo apresentou melhores valores (expSFM4CHO = 0,97d-1 e expUtility = 0,8d-1) e de
td (tdSFM4CHO = 0,71d e tdUtility = 0,87d), indicando uma maior capacidade de promover a
proliferao celular do meio SFM4CHO.
Cintica Meio Utility

6,0E+06
100%
90%
80%
70%
4,0E+06
60%
3,0E+06
50%
40%
2,0E+06
Viabilidade
Clulas/mL
5,0E+06
Clulas Viveis
Viabilidade
30%
20%
1,0E+06
10%
0,0E+00
0%
0
5
Dias
exp = 0,80d-1
td = 0,87d
Cintica Meio SFM4CHO

6,0E+06
100%
90%
80%
70%
4,0E+06
60%
3,0E+06
50%
40%
2,0E+06
30%
Viabilidade
Clulas/mL
5,0E+06
Clulas Viveis
Viabilidade
20%
1,0E+06
10%
0,0E+00
0%
0
5
Dias
exp = 0,97d-1
td = 0,71d
Figura 10. Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility e SFM4CHO,
respectivamente. - Clulas viveis; - Viabilidade. No canto inferior direito do grfico so
apresentados os valores de taxa especfica de proliferao na fase exponencial (exp) e tempo de
duplicao (td).
42
Juntamente com as anlises de crescimento celular, foram analisados parmetros

metablicos entre os dois meios de cultivo, como o consumo de glicose, produo de
lactato e secreo de EPOhr no meio de cultivo, ao longo da cintica. Os resultados
esto presentes na figura 11. O meio alternativo SFM4CHO apresentou maior
concentrao de glicose inicial, em comparao ao meio padro SFM4CHO Utility
([Glicose]SFM4CHO = 7,0g/L e [Glicose]Utility = 3,5g/L). A taxa especfica mdia de
consumo deste nutriente foi maior no meio alternativo quando comparado com o
controle (qGlic_SFM4CHO_m = 0,82g/106clulas/dia e qGlic_Utility_m = 0,40g/106clulas/dia).
Mesmo apresentando um qGlic maior, a produo de lactato no meio SFM4CHO,
medida pelo (qLact), relativamente menor que o qLact do meio SFM4CHO Utility,
quando comparados com o meio controle (qLact_SFM4CHO_m = 0,45g/106 clulas/dia e
qLact_Utility_m = 0,29g/106 clulas/dia). Por apresentar maior concentrao de glicose, o
rendimento celular a partir do consumo de glicose (YX/Glic) no meio SFM4CHO
tambm foi maior, quando comparado ao meio SFM4CHO Utility (YX/Glic_SFM4CHO =
0,95x106 clulas/g e YX/Glic_Utility = 0,37x106 clulas/g).
Apesar de garantir uma maior densidade celular, a mdia da taxa especfica de
formao da eritropoietina (qEPOhr_m), a produtividade (P) e a concentrao mxima de
produto ([EPOhr]max) secretado ao fim da cintica no meio SFM4CHO
(qEPOhr_SFM4CHO_m = 3,9g/106clulas/dia, PSFM4CHO = 4,0g/dia e [EPOhr]max_SFM4CHO =
36,2g/mL) foram menores, em comparao aos valores apresentados no meio
SFM4CHO Utility (qEPOhr_Utility_m = 5,7g/106 clulas/dia, PUtility = 6,6g/dia e
[EPOhr]max_Utility = 59,0 g/mL).
HyCell sem HT.
Em substituio ao meio TransFx-C, a partir do terceiro sub-cultivo, foi
utilizado o meio HyCell sem HT e fez-se o uso do cultivo reserva em SFM4CHO
Utility para dar sequncia ao sub-cultivo e adaptao ao novo meio. As clulas CHO
cultivadas no meio HyCell sem HT apresentaram resultados satisfatrios
concentrao mxima de clulas totais de 1,9x106 e viabilidade de 88,0% - e, a partir
deste meio, foi dada sequncia cintica, como exemplificado na tabela 4.
O meio de cultivo HyCell sem HT apresentou uma densidade celular semelhante
ao meio controle, Apesar da semelhana dos valores de concentrao celular, o cultivo
43
em meio HyCell sem HT no conseguiu manter a mesma faixa de viabilidade,

mantendo-se entre 80% e 90% at o 4 dia e baixando de 80% aps o 5 dia, em relao
ao meio controle SFM4CHO Utility, que apresentou viabilidade superior a 90% at
o 4 dia, entre 80% e 90% entre o 5 e 7 dia e inferior a 80% aps o 7 dia.
100
9,0
90
8,0
80
7,0
70
6,0
60
5,0
50
4,0
40
3,0
30
20
2,0
10
1,0
EPO
Concentrao Glicose (g/L)
qGlic (g/106clulas/dia)
Concentrao Lactato (g/L)
qLact (g/106clulas/dia)
Concentrao EPO (g/mL)

qEPO (g/106clulas/dia)
Produtividade e Metabolismo Utility

qEPO
Glicose
qGlic
Lactato
qLact
0,0
0
5
Dias
100
9,0
90
8,0
80
7,0
70
6,0
60
5,0
50
4,0
40
3,0
30
20
2,0
10
1,0
EPO

Produtividade e Metabolismo SFM4CHO

qEPO
Glicose
qGlic
Lactato
qLact
0,0
5
Dias
Figura 11. Produtividade e metabolismo de clulas CHO no meio SFM4CHO - Utility e SFM4CHO.
- Concentrao de EPOhr; - Taxa especifica de formao de EPOhr; - Concentrao de glicose
no meio; - Taxa especfica de consumo de glicose; + - Concentrao de lactato no meio; - Taxa
especfica de produo de lactato.
Conforme visto na figura 12, a densidade de clulas viveis alcanada no meio

HyCell sem HT foi de 1,70,2x106 clulas viveis/mL no quarto dia, enquanto o
44
maior valor alcanado pelas clulas cultivadas no meio controle foi de 1,80,1x106
clulas viveis/mL no stimo dia, no apresentando diferena significativa quando o
desvio-padro de cada valor mximo analisado. No entanto, o meio controle manteve
uma concentrao celular superior a 1,5x106 clulas viveis/mL por um perodo de 5
dias.
celular no meio HyCell sem HT. Cada valor est representado com seu respectivo desvio-padro. A
linha tracejada indica a substituio do meio SFM4CHO - Utility pelo meio alternativo. GR Garrafa
Rotatria/Roller.
Clulas
Clulas
Clulas
Passagem
Frasco/
Viabilidade
Totais/mL
Mortas/mL
Viveis/mL
(Dia)
Garrafa
(%)
6
5
6
(x10 )
(x10 )
(x10 )
Criotubo
0,70,06
0,60,06
0,60,17
90,30,03
1 (4)
T-25
2,10,80
1,20,11
1,90,72
94,70,03
2 (7)
3 (11)
T-75
2,10,04
0,90,03
2,00,01
96,30,02
T-75
2,50,40
1,10,31
2,40,41
95,30,01
4 (14)
T-75
2,10,13
0,80,32
2,00,11
96,00,01
5 (18)
T-75
2,00,27
1,10,52
1,80,18
94,30,02
6 (21)
GR
2,10,19
1,30,18
2,00,17
94,00,00
Passagem
(Dia)
Frasco/
Garrafa
Clulas
Totais/mL
(x106)
Clulas
Mortas/mL
(x105)
Clulas
Viveis/mL
(x106)
Viabilidade
(%)
(0)
Criotubo
0,50,02
0,70,28
0,50,05
86,56,01
1 (3)
T-25
2,60,19
0,50,11
2,50,20
97,90,57
2 (6)
T-75
1,50,10
0,50,18
1,40,11
96,41,41
3 (10)
4 (13)
T-75
2,30,31
1,40,21
2,10,29
95,22,48
T-75
2,40,11
0,50,04
2,30,11
98,00,21
5 (17)
T-75
1,90,29
2,20,07
1,60,30
88,00,07
6 (20)
GR
1,40,07
1,80,11
1,30,06
87,60,07
HyCell sem HT
SFM4CHO-Utility
(0)
Em relao ao crescimento na fase exponencial, a taxa especfica de proliferao

(exp) e tempo de duplicao (td) observados no meio alternativo apresentou valores
(expHyCell = 0,48d-1 e expUtility = 0,80d-1) e de td (tdHyCell = 1,44d e tdUtility = 0,87d),
indicando que o meio no teve capacidade de promover a proliferao celular como o
meio controle.
esto presentes na figura 13. O meio alternativo HyCell sem HT apresenta maior
45
concentrao de glicose, em comparao ao meio padro SFM4CHO Utility

([Glicose]SFM4CHO = 8,3g/L e [Glicose]Utility = 3,5g/L). A taxa especfica de consumo
deste nutriente foi maior no meio alternativo quando comparado com o controle
(qGlic_HyCell_m = 0,57g/106clulas/dia e qGlic_Utility_m = 0,40g/106clulas/dia). Mesmo
apresentando um qGlic maior, a produo de lactato no meio HyCell sem HT, medida
pelo (qLact), similar ao qLact do meio SFM4CHO Utility, quando comparados com o
meio controle (qLact_HyCell_m = 0,35g/106 clulas/dia e qLact_Utility_m = 0,29g/106
clulas/dia).

6,0E+06
100%
90%
80%
70%
4,0E+06
60%
3,0E+06
50%
40%
2,0E+06
Viabilidade
Clulas/mL
5,0E+06
Clulas Viveis
Viabilidade
30%
20%
1,0E+06
10%
0,0E+00
0%
0
5
Dias
exp = 0,80 d-1

td = 0,87 d
Cintica HyCell
6,0E+06
100%
90%
80%
70%
4,0E+06
60%
3,0E+06
50%
40%
2,0E+06
Viabilidade
Clulas/mL
5,0E+06
Clulas Viveis
Viabilidade
30%
20%
1,0E+06
10%
0,0E+00
0%
0
3
Dias
exp = 0,48 d-1

td = 1,44 d
Figura 12. Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility e HyCell sem HT,
respectivamente. - Clulas viveis; - Viabilidade. No canto inferior direito do grfico so
apresentados os valores de taxa especfica de proliferao na fase exponencial (exp) e tempo de
duplicao (td).
46
Apesar de apresentar maior concentrao de glicose, o rendimento celular a partir

do consumo de glicose (YX/Glic) no meio HyCell sem HT foi similar ao do meio
SFM4CHO Utility (YX/Glic_HyCell = 0,33x106 clulas/g e YX/Glic_Utility = 0,37x106
clulas/g).
100
9,0
90
8,0
80
7,0
70
6,0
60
5,0
50
4,0
40
3,0
30
20
2,0
10
1,0
EPO


qEPO
Glicose
qGlic
Lactato
qLact
0,0
0
5
Dias
9,0
90
8,0
80
7,0
70
6,0
60
5,0
50
4,0
40
3,0
30
20
2,0
10
1,0
EPO

Produtividade e Metabolismo HyCell

100
qEPO
Glicose
qGlic
Lactato
qLact
0,0
0
3
Dias
Figura 13. Produtividade e metabolismo de clulas CHO nos meios SFM4CHO- Utility e HyCell sem
HT, respectivamente. - Concentrao de EPOhr; - Taxa especifica de formao de EPOhr; Concentrao de glicose no meio; - Taxa especfica de consumo de glicose; + - Concentrao de
lactato no meio; - Taxa especfica de produo de lactato.
47
Como apresentou menor densidade celular, a mdia da taxa especfica de

formao da eritropoietina (qEPOhr_m) e a produtividade (P) (qEPOhr_HyCell_m =
1,5g/106clulas/dia e PHyCell = 5,9g/dia) foram menores, em relao ao meio
SFM4CHO - Utility (qEPOhr_Utility_m = 5,7g/106 clulas/dia e PUtility = 6,6 g/dia). A
concentrao mxima de produto ([EPOhr]max) secretado ao final da cintica no meio
HyCell sem HT ([EPOhr]max_HyCell = 35,2 g/mL) foi maior, em relao aos valores
apresentados no meio SFM4CHO Utility no sexto dia do experimento
([EPOhr]max_Utility = 27,0 g/mL).
CD FortiCHO.
Na adaptao ao meio de cultivo fornecido pela Gibco, o CD FortiCHO, fez-se
necessrio o uso da garrafa reserva, a partir do terceiro sub-cultivo para continuar com a
adaptao e foi preciso aumentar o nmero de passagens para dar continuidade ao
processo, conforme demonstrado na tabela 5.
celular no meio CD FortiCHO. Cada valor est representado com seu respectivo desvio-padro. A linha
Rotatria/Roller.
Passagem
Frasco/
Clulas Totais
Clulas Mortas
Clulas Viveis
Viabilidade
(Dia)
Garrafa
(x106)
(x105)
(x106)
(%)
T-25
0,70,06
0,60,06
0,60,17
90,30,03
1 (4)
T-75
2,10,80
1,20,11
1,90,72
94,70,03
2 (7)
T-75
2,10,04
0,90,03
2,00,01
96,30,02
3 (11)
3x T-75
2,50,40
1,10,31
2,40,41
95,30,01
4 (14)
3x T-75
2,10,13
0,80,32
2,00,11
96,00,01
5 (18)
GR
2,00,27
1,10,52
1,80,18
94,30,02
6 (21)
GR
2,10,19
1,30,18
2,00,17
94,00,00
Passagem
(Dia)
Frasco/
Garrafa
Clulas
Totais (x106)
Clulas Mortas
(x105)
Clulas Viveis
(x106)
Viabilidade
(%)
(0)
1 (4)
Criotubo
0,80,02
0,60,32
0,80,05
93,10,04
T-25
3,10,16
1,80,14
2,90,014
94,40,00
2 (7)
T-75
2,10,39
0,50,00
2,00,39
97,60,01
3 (11)
T-75
2,60,32
1,00,07
2,50,33
96,20,01 Passagem
4 (14)
T-75
1,90,33
0,50,12
1,80,33
5 (18)
T-75
2,60,48
1,30,04
2,50,48
97,10,01 SFM4CHO 95,10,01 Utility
6 (21)
GR
1,60,09
1,30,11
1,50,08
91,70,00
CD FortiCHO
SFM4CHO-Utility
(0)
48
Este fato ocorreu devido ao grande nmero de clulas grumadas presentes nos
cultivos com o meio CD FortiCHO, inclusive no estgio de expanso para garrafas
rotatrias como pode ser visto na figura 14. Por isso, a terceira e quarta passagens
destacadas por um retngulo foram feitas em meio SFM4CHO - Utility para tentar
uma nova adaptao no meio testado. Durante a adaptao, a concentrao mxima de
clulas atingida foi de 2,60,48x106 clulas/mL e 97,6% de viabilidade.
Figura 14. Clulas CHO em meio CD FortiCHO. Conforme foi observado e destacado pelos crculos
vermelhos, grande parte das clulas cultivadas neste meio formaram mltiplos grumos, dificultando os
processos de contagem e adaptao no prprio meio. Aumento 250x.
Com relao cintica, o meio de cultivo CD FortiCHO apresentou resultados

similares ao meio padro SFM4CHO - Utility. Entretanto, no foi dada sequncia
cintica devido formao de grumos que impossibilitaram o andamento do
experimento, a partir do quarto dia de crescimento em garrafas rotatrias. Conforme
visto na figura 15, a densidade de clulas viveis alcanada no meio CD FortiCHO foi
de 2,60,4x106 clulas viveis/mL no quarto dia, enquanto o maior valor alcanado
pelas clulas cultivadas no meio padro foi de 1,80,1x106 clulas viveis/mL com
viabilidade entre 80% e 90% durante toda a cintica. Em relao ao crescimento na fase
exponencial, a taxa especfica de proliferao (exp) e tempo de duplicao (td)
observados no meio alternativo apresentou valores (expFortiCHO = 0,40d-1 e expUtility =
0,80d-1) e de td (tdFortiCHO = 1,73d e tdUtility = 0,87d), indicando que o meio no teve
capacidade de promover a proliferao celular como o meio controle.
49

esto presentes na figura 16.

6,0E+06
100%
90%
80%
70%
4,0E+06
60%
3,0E+06
50%
40%
2,0E+06
Viabilidade
Clulas/mL
5,0E+06
Clulas Viveis
Viabilidade
30%
20%
1,0E+06
10%
0,0E+00
0%
0
5
Dias
exp = 0,80 d-1

td = 0,87 d
Cintica FortiCHO
6,0E+06
100%
90%
5,0E+06
80%
Clulas/mL
60%
3,0E+06
50%
40%
2,0E+06
Viabilidade
70%
4,0E+06
Clulas Viveis
Viabilidade
30%
20%
1,0E+06
10%
0,0E+00
0%
0
exp = 0,40 d-1

td = 1,73 d
2
3
4
Dias
Figura 15. Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility e CD FortiCHO. Clulas viveis; - Viabilidade. No canto inferior direito do grfico so apresentados os valores de taxa
especfica de proliferao na fase exponencial (exp) e tempo de duplicao (td). * Este grfico se repete
para facilitar a comparao dos resultados.
50
O meio alternativo CD FortiCHO apresenta maior concentrao de glicose

inicial, em comparao ao meio padro SFM4CHO Utility ([Glicose]FortiCHO =
5,8g/L e [Glicose]Utility = 3,5g/L). A taxa especfica de consumo deste nutriente foi
maior no meio alternativo quando comparado com o controle (qGlic_FortiCHO_m =
1,1g/106clulas/dia e qGlic_Utility_m = 0,4g/106clulas/dia). Por apresentar um qGlic maior,
a produo de lactato no meio CD FortiCHO, medida pelo (qLact), maior que o qLact
do meio SFM4CHO Utility (qLact_FortiCHO_m = 0,6g/106 clulas/dia e qLact_Utility_m =
0,3g/106 clulas/dia). Apresentando maior concentrao de glicose, o rendimento celular
a partir do consumo de glicose (YX/Glic) no meio CD FortiCHO foi maior que o do
meio SFM4CHO Utility (YX/Glic_FortiCHO = 1,48x106 clulas/g e YX/Glic_Utility =
0,37x106 clulas/g).
Apesar de apresentar maior densidade celular, a mdia da taxa especfica de
formao da eritropoietina (qEPOhr_m) e a produtividade (P) (qEPOhr_FortiCHO_m =
1,9g/106clulas/dia e PFortiCHO = 6,0g/dia) foram menores, em relao ao meio
SFM4CHO - Utility (qEPOhr_Utility_m = 5,7g/106 clulas/dia, PUtility = 6,6 g/dia). A
concentrao mxima de produto ([EPOhr]max) secretado no meio CD FortiCHO ao
final da cintica ([EPOhr]max_FortiCHO = 23,9 g/mL) foi maior em relao aos valores
apresentados no meio SFM4CHO Utility no quarto dia do experimento
([EPOhr]max_Utility = 15,1g/mL).
4.1.4. Adaptao e cintica comparativa entre os meios SFM4CHO
Utility e
Cellvento CHO-110 sem HT.

O meio de cultivo Cellvento CHO-110 sem HT apresentou melhores resultados, em
comparao ao meio padro SFM4CHO - Utility. Durante a etapa de adaptao,
ambos os cultivos apresentaram caractersticas semelhantes, desde o nmero mximo de
clulas 2,30,07 x106clulas/mL em meio Cellvento CHO-110 sem HT e
2,50,40x106 clulas/mL em meio SFM4CHO - Utility a uma faixa tima de
viabilidade celular, sempre acima dos 90% de viabilidade, como demonstrado na tabela
6.
Cellvento CHO-110 foi de 4,60,4x106 clulas viveis/mL, enquanto o maior valor
alcanado pelas clulas cultivadas no meio padro foi de 1,80,1x106 clulas
viveis/mL, onde os desvios-padro dos valores apresentados mostraram uma diferena
51
significativa entre eles. A viabilidade se manteve entre 90% e 100% at o quinto dia e
reduzindo para abaixo de 80% no stimo dia, em comparao ao meio controle
SFM4CHO Utility, que apresentou viabilidade superior a 90% at o 4 dia, entre
80% e 90% entre o 5 e 7 dia e inferior a 80% aps o 7 dia.
100
9,0
90
8,0
80
7,0
70
6,0
60
5,0
50
4,0
40
3,0
30
20
2,0
10
1,0
EPO


qEPO
Glicose
qGlic
Lactato
qLact
0,0
0
5
Dias
100
9,0
90
8,0
80
7,0
70
6,0
60
5,0
50
4,0
40
3,0
30
20
2,0
10
1,0


Produtividade e Metabolismo FortiCHO

EPO
qepo
Glicose
qGlic
Lactato
qLact
0,0
0
Dias
Figura 16. Produtividade e metabolismo de clulas CHO no meio SFM4CHO- Utility e CD
FortiCHO, respectivamente. - Concentrao de EPOhr; - Taxa especifica de formao de EPOhr;
- Concentrao de glicose no meio; - Taxa especfica de consumo de glicose; + - Concentrao de

(expCHO-110 = 0,82d-1 e expUtility = 0,80d-1) e de td (tdCHO-110 = 0,80d e tdUtility = 0,87d),
52
indicando que o meio teve capacidade de promover a proliferao celular semelhante ao

encontrado no meio controle.
adaptao/expanso celular no meio Cellvento CHO-110 sem HT. Cada valor apresentado est com seu
respectivo desvio-padro. A linha tracejada indica a substituio do meio SFM4CHO - Utility pelo meio
alternativo. GR Garrafa Rotatria/Roller.
Frasco/
Garrafa
Clulas Totais
(x106)
Clulas Mortas
(x105)
Clulas Viveis
(x106)
Viabilidade
(%)
Criotubo
0,70,06
0,60,06
0,60,17
90,30,03
1 (4)
T-25
2,10,80
1,20,11
1,90,72
94,70,03
2 (7)
T-75
2,10,04
0,90,03
2,00,01
96,30,02
3 (11)
T-75
2,50,40
1,10,31
2,40,41
95,30,01
4 (14)
T-75
2,10,13
0,80,32
2,00,11
96,00,01
5 (18)
T-75
2,00,27
1,10,52
1,80,18
94,30,02
6 (21)
GR
2,10,19
1,30,18
2,00,17
94,00,00
Passagem
(Dia)
Frasco/
Garrafa
Clulas
Totais (x106)
Clulas Mortas
(x105)
Clulas Viveis
(x106)
Viabilidade
(%)
(0)
1 (3)
Criotubo
0,60,04
0,70,14
0,50,06
90,70,01
T-25
1,20,10
0,50,11
1,10,09
96,00,01
2 (7)
T-75
2,30,07
1,00,07
2,20,06
95,90,00
3 (10)
T-75
1,90,05
1,20,46
1,80,10
93,50,03
4 (14)
T-75
2,10,04
1,50,32
2,00,01
93,00,01
5 (17)
GR
1,30,11
0,80,21
1,20,29
94,00,00
Cellvento
CHO-110
SFM4CHO-Utility
Passagem
(Dia)
(0)

esto presentes na figura 18. O meio alternativo Cellvento CHO-110 sem HT
apresenta maior concentrao de glicose inicial, em comparao ao meio padro
SFM4CHO Utility ([Glicose]CHO-110 = 7,5g/L e [Glicose]Utility = 3,5g/L). A taxa
especfica de consumo deste nutriente foi maior no meio alternativo quando comparado
com
controle
(qGlic_CHO-110_m
0,51g/106clulas/dia
qGlic_Utility_m
0,40g/106clulas/dia). Mesmo apresentando um qGlic maior, a produo de lactato no

meio Cellvento CHO-110 sem HT, medida pelo (qLact), foi menor que o qLact do meio
SFM4CHO Utility (qLact_CHO-110_m = 0,3g/106 clulas/dia e qLact_Utility_m = 0,3 g/106
clulas/dia). Apresentando maior concentrao de glicose, o rendimento celular a partir
do consumo de glicose (YX/Glic) no meio Cellvento CHO-110 sem HT foi maior que o
53
do meio SFM4CHO Utility (YX/Glic_CHO-110 = 1,10x106 clulas/g e YX/Glic_Utility =

0,37x106 clulas/g).

6,0E+06
100%
90%
80%
70%
4,0E+06
60%
3,0E+06
50%
40%
2,0E+06
Viabilidade
Clulas/mL
5,0E+06
Clulas Viveis
Viabilidade
30%
20%
1,0E+06
10%
0,0E+00
0%
5
Dias
exp = 0,80 d-1

td = 0,87 d
Cintica CHO-110
6,0E+06
100%
90%
80%
70%
4,0E+06
60%
3,0E+06
50%
40%
2,0E+06
Viabilidade
Clulas/mL
5,0E+06
Clulas Viveis
Viabilidade
30%
20%
1,0E+06
10%
0,0E+00
0%
4
5
6
7
8
Dias
Figura 17. Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility e Cellvento CHO-110
sem HT. - Clulas viveis; - Viabilidade. No canto inferior direito do grfico so apresentados os
valores de taxa especfica de proliferao na fase exponencial (exp) e tempo de duplicao (td). * Este
grfico se repete para facilitar a comparao dos resultados.
0
Alm de apresentar maior densidade celular, a mdia da taxa especfica de

formao da eritropoietina (qEPOhr_m) e a produtividade (P) (qEPOhr_CHO-110_m =
4,7g/106clulas/dia e PCHO-110 = 11,9g/dia) foram maiores, com exceo do qEPO, em
relao aos valores apresentados pelo meio SFM4CHO - Utility (qEPOhr_Utility_m =
54
5,7g/106 clulas/dia, PUtility = 6,6g/dia). A concentrao mxima de produto

([EPOhr]max) secretado no meio Cellvento CHO-110 sem HT ao fim do cultivo
([EPOhr]max_CHO-110 = 95,1 g/mL) foi maior em relao aos valores apresentados pelo
meio SFM4CHO Utility no oitavo dia de cultivo ([EPOhr]max_Utility = 43,7 g/mL).
90
8,0
80
7,0

9,0
70
6,0
60
5,0
50
4,0
40
3,0
30
20
2,0
10
1,0


100
EPO
qEPO
Glicose
qGlic
Lactato
qLact
0,0
0
5
Dias
100
9,0
90
8,0
80
7,0
70
6,0
60
5,0
50
4,0
40
3,0
30
20
2,0
10
1,0
Glicose (g/L)

Produtividade e Metabolismo CHO-110

EPO
qepo
Glicose
qGlic
Lactato
qLact
0,0
4
5
6
7
8
Dias
Figura 18. Produtividade e metabolismo de clulas CHO nos meios SFM4CHO- Utility e Cellvento
CHO-110, respectivamente. - Concentrao de EPOhr; - Taxa especifica de formao de EPOhr;
- Concentrao de glicose no meio; - Taxa especfica de consumo de glicose; + - Concentrao de
0
55
CPCHO.
O ltimo meio de cultivo testado, CPCHO apresentou resultados similares, em
comparao ao meio padro SFM4CHO - Utility. Conforme a tabela 7 foi possvel
realizar a adaptao das clulas no meio CPCHO. Apesar de no alcanar os mesmos
ndices de clulas totais que o meio SFM4CHO Utility, 1,90,14x106 de clulas em
meio CPCHO em comparao com 2,50,40x106 em meio SFM4CHO Utility, a
viabilidade sempre se manteve alta com valores prximos ou acima de 90% de
viabilidade.
SFM4CHO-Utility

celular no meio CPCHO. Cada valor apresentado est com seu respectivo desvio-padro. A linha
Rotatria/Roller.
Clulas
Clulas
Clulas
Passagem
Frasco/
Viabilidade
Totais/mL
Mortas/mL
Viveis/mL
(Dia)
Garrafa
(%)
6
5
6
(x10 )
(x10 )
(x10 )
(0)
Criotubo
0,70,06
0,60,06
0,60,17
90,30,03
1 (4)
T-25
2,10,80
1,20,11
1,90,72
94,70,03
2 (7)
3 (11)
T-75
2,10,04
0,90,03
2,00,01
96,30,02
T-75
2,50,40
1,10,31
2,40,41
95,30,01
4 (14)
T-75
2,10,13
0,80,32
2,00,11
96,00,01
5 (18)
T-75
2,00,27
1,10,52
1,80,18
94,30,02
6 (21)
GR
2,10,19
1,30,18
2,00,17
94,00,00
Frasco/
Garrafa
Clulas
Totais (x106)
Clulas Mortas
(x105)
Clulas Viveis
(x106)
Viabilidade
(%)
(0)
Criotubo
0,60,01
0,70,18
0,50,01
87,80,03
1 (4)
T-25
2,00,11
1,20,11
1,80,10
93,80,00
2 (7)
3 (11)
T-75
1,50,15
0,60,07
1,40,16
96,30,01
T-75
1,90,14
1,90,04
1,70,14
90,10,01
4 (13)
T-75
1,90,06
1,90,11
1,70,07
89,90,01
5 (17)
GR
1,80,12
1,20,07
1,70,13
93,60,01
CPCHO
Passagem
(Dia)

CPCHO foi de 1,80,2x106 clulas viveis/mL no quarto dia, enquanto o maior valor
alcanado pelas clulas cultivadas no meio controle foi de 1,80,1x106 clulas
viveis/mL no stimo dia, onde os desvios-padro dos valores mximos apresentados
no indicam diferena significativa entre eles. A viabilidade se manteve entre 80% e
90% at o quarto dia e reduzindo para abaixo de 80% no quinto dia, em comparao ao
meio controle SFM4CHO Utility, que apresentou viabilidade superior a 90% at o 4
56
dia, entre 80% e 90% entre o 5 e 7 dia e inferior a 80% aps o 7 dia. Entretanto, as
clulas grumaram durante a cintica, o que prejudicou tanto a contagem quanto a
sobrevivncia das clulas no meio de cultivo.
(expCPCHO = 1,10d-1 e expUtility = 0,80d-1) e de td (tdCPCHO = 0,63d e tdUtility = 0,87d),
indicando que o meio teve capacidade de promover a proliferao celular superior ao do
meio controle.

6,0E+06
100%
90%
80%
70%
4,0E+06
60%
3,0E+06
50%
40%
2,0E+06
Viabilidade
Clulas/mL
5,0E+06
Clulas Viveis
Viabilidade
30%
20%
1,0E+06
10%
0,0E+00
0%
0
5
Dias
exp = 0,80 d-1

td = 0,87 d
Cintica meio CPCHO

6,0E+06
100%
90%
80%
70%
4,0E+06
60%
3,0E+06
50%
40%
2,0E+06
Viabilidade
Clulas/mL
5,0E+06
Clulas Viveis
Viabilidade
30%
20%
1,0E+06
10%
0,0E+00
0%
0
3
Dias
exp = 1,1 d-1

td = 0,63 d
Figura 19. Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility e CPCHO. - Clulas
viveis; - Viabilidade. No canto inferior direito do grfico so apresentados os valores de taxa
especfica de proliferao na fase exponencial (exp) e tempo de duplicao (td).
57

esto presentes na figura 20. O meio alternativo CPCHO apresenta maior
concentrao de glicose inicial, em comparao ao meio padro SFM4CHO Utility
([Glicose]CPCHO = 4,5 g/L e [Glicose]Utility = 3,5g/L). A taxa especfica de consumo deste
nutriente foi maior no meio alternativo quando comparado com o controle
(qGlic_CPCHO_m = 0,95g/106clulas/dia e qGlic_Utility_m = 0,40g/106clulas/dia). Por
apresentar um qGlic maior, a produo de lactato no meio CD FortiCHO, medida pelo
(qLact), foi maior que o qLact do meio SFM4CHO Utility (qLact_CPCHO_m = 1,46g/106
clulas/dia e qLact_Utility_m = 0,29g/106 clulas/dia). Mesmo apresentando maior
concentrao de glicose, o rendimento celular a partir do consumo de glicose (YX/Glic)
no meio CD FortiCHO foi menor que o do meio SFM4CHO Utility (YX/Glic_CPCHO
= 0,23x106 clulas/g e YX/Glic_Utility = 0,37x106 clulas/g).
Apesar de no apresentar maior densidade celular, a mdia da taxa especfica de
formao da eritropoietina (qEPOhr_m) e a produtividade (P) (qEPOhr_CPCHO_m =
7,3g/106clulas/dia e PCPCHO = 12,2g/dia) foram maiores, em relao aos valores
apresentados pelo meio SFM4CHO - Utility (qEPOhr_Utility_m = 5,7g/106 clulas/dia e
PUtility = 6,6g/dia). A concentrao mxima de produto ([EPOhr]max) secretado no meio
CPCHO ao fim do experimento ([EPOhr]max_CPCHO = 72,9g/mL) tambm foi maior,
em relao aos valores apresentados no meio SFM4CHO Utility no sexto dia de
cultivo [EPOhr]max_Utility = 27,0g/mL).
Os dados de todas as cinticas tempo de duplicao, concentrao mxima de
clulas viveis, taxa especfica de crescimento exponencial por dia, concentrao inicial
de glicose, taxa mdia especfica de consumo de glicose, concentrao mdia de lactato
formado, taxa mdia especfica de formao de lactato, concentrao mxima de EPOhr
produzida, taxa mdia especfica de formao de eritropoetina, produtividade do cultivo
e rendimento da formao de clulas por glicose consumida no ltimo dia de cultivo
foram resumidos na tabela 8.
4.1.6. Integral de Clulas Viveis
A partir dos dados gerados, ao longo das cinticas, foi criado o grfico com a
integral de clulas viveis (ICV) (figura 21). O meio Cellvento CHO-110 sem HT
58
apresentou o maior valor de ICV ao final do cultivo (2,2x107 clulas.dia/mL), seguido

dos meios SFM4CHO-Utility e o SFM4CHO (1,1x107 clulas.dia/mL e 1,2 x107
clulas.dia/mL, respectivamente). Os testes com os meios CPCHO e HyCell sem
HT, que apresentaram menor tempo de cultivo (6 dias), alcanaram valores semelhantes
entre si (5,9x106 clulas.dia/mL e 5,7x106 clulas.dia/mL, respectivamente) no entanto,
uma ordem de grandeza menor do que os meios SFM4CHO- Utility e SFM4CHO. O
meio CD FortiCHO foi o que apresentou menor perodo de cultivo (4 dias),
alcanando ICV de 3,9x106 clulas.dia/mL.
9,0
90
8,0
80
7,0
70
6,0
60
5,0
50
4,0
40
3,0
30
20
2,0
10
1,0



100
EPO
qEPO
Glicose
qGlic
Lactato
qLact
0,0
0
5
Dias
100
9,0
90
8,0
80
7,0
70
6,0
60
5,0
50
4,0
40
3,0
30
20
2,0
10
1,0


Produtividade e Metabolismo CPCHO

[EPO]
qepo
[Glicose]
qGlic
Lactato
qLact
0,0
0
3
Dias
Figura 20. Produtividade e metabolismo de clulas CHO nos meios SFM4CHO- Utility e CPCHO.
- Concentrao de EPOhr; - Taxa especifica de formao de EPOhr; - Concentrao de glicose no
meio; - Taxa especfica de consumo de glicose; + - Concentrao de lactato no meio; - Taxa
especfica de produo de Lactato.
59
Tabela 8. Resumo das taxas, concentrao e rendimentos das cinticas dos meios testados no ltimo dia
de cultivo. Td Tempo de duplicao; Xvmax Concentrao mxima de clulas vivas; exp Taxa
especfica de crescimento exponencial por dia; [Glic0] Concentrao inicial de glicose; qGlic Taxa
mdia especfica de consumo de glicose; [Lactmax] Concentrao mxima de lactato formado; q Lact
Taxa mdia especfica de formao de lactato; [EPOhr]max Concentrao mxima de EPOhr produzida;
qEPOhr Taxa mdia especfica de formao de eritropoetina; P Produtividade do cultivo em gerar
hrEPO ao dia; YX/Glic Rendimento da formao de clulas por glicose consumida, durante o cultivo.
Xvmax
qEPOhr
exp [Glic0] qGlic (g/106 [Lactmax] qLact (g/106 [EPOhr]max
P
YX/Glic (106
(106
(g/106
-1
(d ) (g/L) clulas/dia) (g/L) clulas/dia) (g/mL)
(g/dia) clulas/g)
cls/mL)
clulas/dia)
Meios
Td (d)
SFM4CHO
Utility
SFM4CHO
0,87
1,8
0,80
3,50
0,40
1,45
0,29
58,98
5,70
6,55
0,37
0,71
2,4
0,97
7,00
0,82
1,77
0,45
36,19
3,94
4,02
0,95
1,44
1,7
0,48
8,33
0,57
1,54
0,35
35,16
1,53
5,86
0,33
1,73
2,6
0,40
5,78
1,06
0,91
0,63
23,93
1,93
5,98
1,48
0,85
4,6
0,82
7,50
0,51
1,01
0,28
95,11
4,68
11,89
1,10
0,63
1,8
1,10
4,53
0,95
1,03
1,46
72,93
7,32
12,16
0,23
HyCell
CD
FortiCHO
Cellvento
CHO-110
CPCHO
Integral de Clulas Viveis (ICV)

2,50E+07
Clulas.dia/mL
2,00E+07
1,50E+07
1,00E+07
5,00E+06
0,00E+00
0
5
Dias
CD FortiCHO
CPCHO
HyCell
Utility
SFM4CHO
9
Cellvento CHO-110
Figura 21. Grfico com os valores da Integral de Clulas Viveis (ICV) ao longo do cultivo para os
meios CD FortiCHO, CPCHO, HyCell sem HT, SFM4CHO - Utility, SFM4CHO e Cellvento
CHO-110.
4.2. Cultivo em Biorreator

Aps os cultivos realizados em garrafas rotatrias, os melhores meios de cultivo
foram testados no biorreator em modo contnuo. O primeiro meio testado foi o
60
Cellvento CHO-110 sem HT, porm, no se obteve crescimento aps inculo do

biorreator. O meio SFM4CHO tambm foi utilizado no biorreator de tanque agitado
em modo contnuo por apresentar, entre todos, as condies de cultivo mais parecidas
com o meio SFM4CHO - Utility. Aps o inculo, a cultura celular foi cultivada em
batelada simples at o quarto dia. A partir do quarto dia, foi iniciado o cultivo em modo
contnuo a uma taxa de 0,5vvd de troca de meio de cultivo. O SFM4CHO apresentou
baixa concentrao de clulas viveis, no mantendo a mesma faixa de viabilidade da
cintica em garrafa rotatria. Conforme observado na figura 22, a densidade de clulas
viveis alcanada no meio SFM4CHO em modo contnuo foi de 1,80,2x106clulas
viveis/mL. A viabilidade se manteve entre 80% e 90% at o terceiro dia e reduzindo
para abaixo de 80% no quarto dia. Em relao ao crescimento na fase exponencial, a
taxa especfica de proliferao (exp) observado no meio alternativo foi de 0,84d-1,
obtendo um td de 0,83d, semelhante aos valores obtidos no perodo de operao
contnua (0,70d-1 e 0,91d-1). Conforme observado na figura 22, a partir de uma
concentrao inicial de glicose de 7,0g/L, houve um consumo deste nutriente at
alcanar uma concentrao de 4g/L, quando foi iniciado o modo contnuo com uma taxa
de troca de 0,5vvd (1L/dia). Durante esta fase do cultivo a taxa especfica mdia de
consumo de glicose foi de 1,2g/106clulas/dia. A produo de EPO (figura 22) alcanou
ttulo mximo de 8,8g/mL, mantendo-se relativamente estvel ao redor neste valor
durante a fase de operao contnua. A taxa especfica mdia de formao do produto
durante a fase contnua foi de 2,92g/106clulas/dia, semelhante mdia desta taxa na
fase inicial do cultivo (batelada), 2,83g/106clulas/dia.
61
Cintica SFM4CHO - Biorreator

6,0E+06
100%
90%
80%
70%
4,0E+06
60%
3,0E+06
50%
40%
2,0E+06
Viabilidade
Clulas/mL
5,0E+06
Clulas Viveis
Viabilidade
30%
20%
1,0E+06
10%
0,0E+00
0%
0
3
Dias
exp = 0,84 d-1

td = 0,83 d
100
9,0
90
8,0
80
7,0
70
6,0
60
5,0
50
4,0
40
3,0
30
20
2,0
10
1,0
qEPO (g/106 clulas/dia)

qGlic (g/106 clulas/dia)
Produtividade SFM4CHO - Biorreator
EPO
qEPO
Glicose
qGlic
0,0
0
3
Dias
6
[EPOhr]max = 8,80 g/mL
Figura 22. Clulas CHO viveis, viabilidade e produtividade em meio SFM4CHO em biorreator. Clulas viveis; - Viabilidade. A linha tracejada indica o incio da troca de meio. No canto inferior
direito do grfico so apresentados os valores de taxa especfica de proliferao na fase exponencial (exp)
e tempo de duplicao (td); - Concentrao de EPOhr; - Taxa especifica de formao de EPOhr; Concentrao de glicose no meio; - Taxa especfica de consumo de glicose. No canto inferior direito
do grfico apresentada a concentrao mxima de produto ([EPOhr]max).
62
5. Discusso
O trabalho em questo testou sete meios de cultivo comerciais diferentes e os
comparou com o meio de cultivo controle, onde as clulas utilizadas no trabalho esto
adaptadas, o SFM4CHO Utility (Thermo Hyclone GE). A principal motivao do
trabalho se baseia na importncia de se qualificar diferentes fornecedores para insumos
chaves do processo produtivo. Em caso de desabastecimento de um insumo por motivos
diversos (insumo descontinuado, problemas na linha de produo, aquisies
corporativas, entre outros) necessrio que o produtor tenha uma alternativa de
fornecedor qualificado e que o insumo esteja de acordo com as caractersticas do
registro do produto junto agncia reguladora (Johnson 2006).
Por se tratarem de meios de cultivo comerciais, muitas informaes dos insumos
testados so proprietrias dos fornecedores e no so liberadas ao pblico, dificultando
o esclarecimento correto das funes dos componentes dos meios. A maioria dos meios
testados (exceo do meio CPCHO) quimicamente definido, onde, geralmente, estes
meios so idealizados e desenvolvidos para aprimorar o crescimento celular e expresso
da protena recombinante, atravs do melhor controle do metabolismo celular e melhor
aproveitamento dos nutrientes presentes no meio (Altamirano et al 2000; Huang et al
2010).
A estratgia de comparao dos meios partiu de uma adaptao direta, onde o
meio de cultivo inicial substitudo completamente pelo meio alternativo e mantido por
um nmero limitado de passagens. Esta estratgia foi adotada com a inteno de se
identificar meios que tivessem o desempenho semelhante ao meio original, evitando a
seleo
de
subpopulaes
da
linhagem
e,
consequentemente,
sem
alterar
significativamente as caractersticas do cultivo e produto (Van der Valk et al 2010;

Jayme 1991). Apesar de pequena variao no nmero de sub-cultivos entre as diferentes
adaptaes, as mesmas foram feitas de modo a manter o mesmo perfil para assegurar a
padronizao nesta. Dos sete meios testados, dois no obtiveram sucesso na etapa de
adaptao HyCell (Thermo Hyclone GE) e TransFx-C (Thermo Hyclone GE).
63
No primeiro meio de cultivo citado anteriormente, as clulas no alcanaram

concentraes (1,100,09x105 clulas viveis/mL) e viabilidade celular (42,5% de
viabilidade) satisfatrias, impossibilitando o incio da cintica comparativa. Em relao
ao segundo meio de cultivo citado, as clulas apresentaram um comportamento atpico
durante a etapa de adaptao. Conforme as figuras 9 e 10 muitas clulas perderam a
capacidade de crescimento em suspenso, apresentando caractersticas de crescimento
aderente que impossibilitaram os mtodos de contagem e, consequentemente, a
continuidade da adaptao no meio TransFx-C. De acordo com as instrues
fornecidas pela empresa responsvel pela fabricao do meio, algumas linhagens
celulares no conseguem crescer de maneira direta, sendo necessrio realizar a
adaptao sequencial (Van der Valk et al 2010; Sinacore et al 2000).
Os outros cinco meios de cultivo conseguiram resultados satisfatrios nas etapas
de adaptao celular direta e foi possvel iniciar as cinticas comparativas. Os meios de
cultivo testados foram o SFM4CHO (Thermo Hyclone GE), HyCell sem HT
(Thermo Hyclone GE), CD FortiCHO (Gibco), Cellvento CHO-110 sem HT
(Merck) e CPCHO (Diagnovum). Em todos os meios, as clulas obtiveram uma boa
adaptao (5,4x106 clulas viveis/mL e 96,7% de viabilidade SFM4CHO; 2,5x106
clulas viveis/mL e 98,0% de viabilidade HyCell sem HT; 2,9x106 clulas
viveis/mL e 97,6% de viabilidade CD FortiCHO; 2,2x106 clulas viveis e 96,0%
de viabilidade Cellvento CHO-110 sem HT; 1,8x106 clulas viveis e 96,3% de
viabilidade CPCHO).
Importante fator a ser mantido durante os testes a capacidade de promoo da
proliferao celular. Assim como comentado anteriormente, a manuteno das
caractersticas no meio testado serve como um indicativo aparente da influncia do meio
sobre o metabolismo celular e, consequentemente, sobre as caractersticas do produto
(Dowd et al 2001; Huang et al 2010). Desta forma, em comparao com o meio
controle, alguns meios conseguirem alcanar concentraes mximas de clulas viveis
semelhantes (SFM4CHO, HyCell sem HT, CPCHO, na faixa de 1,5 2,0x106
clulas viveis/mL). No entanto, os meios HyCell sem HT e CPCHO no
mantiveram a fase estacionria por perodo semelhante ao do meio padro
(aproximadamente 5 dias), que durou cerca de 1 dia para ambos os meios.
64
Antagonicamente, esses dois meios apresentaram taxas especficas de crescimento

bem diferentes ao meio SFM4CHO - Utility (exp_utility = 0,80d-1), onde o HyCell
sem HT apresentou um valor significativamente baixo (exp_HyCell = 0,48d-1) e o
CPCHO, significativamente alto (exp_CPCHO = 1,10d-1). O meio SFM4CHO,
apresentou concentrao celular superior ao Utility, mantendo o cultivo na faixa de 2,0
2,5x106 clulas viveis/mL por cerca de 4 dias. A taxa especfica de crescimento
observada foi de 0,97d-1, no se diferenciando muito da taxa do meio padro, no entanto
a viabilidade celular sustentada por este meio se manteve abaixo de 80% aps o
primeiro dia de cultivo. Apesar das diferenas observadas para os meios citados, as
faixas observadas so compatveis com os valores observados na literatura para
processos em batelada utilizando geraes semelhantes aos dos meios utilizados (Vliz
et al 2008; Fenge & Lllau 2006).
Os resultados no foram considerados como indicativos de uma mudana
relevante no perfil de proliferao celular e gerao de biomassa, como pode ser
observado na figura 31, onde a ICV apresenta o mesmo comportamento at o 6 dia para
os meios citados acima. O meio Cellvento CHO-110 sem HT pode ser considerado um
exceo ao comportamento descrito anteriormente, onde as concentraes celulares
alcanaram a faixa 3,0 - 4,5x106 clulas viveis/mL e com viabilidade celular
semelhante ao meio controle, assim com a sua taxa especfica de crescimento na fase
exponencial (exp_CHO-110 = 0,82d-1). Devido baixa desempenho do meio CD
FortiCHO, este no foi considerado na discusso, pois apresentou a formao de
muitos grumos conforme descrito anteriormente.
As diferenas observadas entre os meios podem ser atribudas disponibilidade
de glicose inicialmente em cada formulao. O meio SFM4CHO apresenta alta
concentrao de glicose em sua composio ([Glicose]SFM4CHO = 7,0g/L), aumentando a
fonte de carboidrato livre, em comparao ao meio controle ([Glicose]Utility = 3,5g/L).
Comparativamente, os cultivos apresentaram um aproveitamento semelhante da glicose
nos dois meios SFM4CHO, considerando que a disponibilidade de glicose est
diretamente relacionada ao incremento do seu consumo, o que resulta em um
incremento na proporo de duas vezes na taxa de consumo (qGlic_SFM4CHO_m =
0,82g/106clulas/dia e qGlic_Utility_m = 0,40g/106clulas/dia), compatvel com o dobro de
disponibilidade de glicose no meio testado. No entanto, o mesmo incremento no foi
observado na taxa de formao do metablito lactato, alcanando um incremento na
65
ordem 1,5 vezes (qLact_SFM4CHO_m = 0,45g/106clulas/dia e qLact_Utility_m =

0,29g/106clulas/dia) (Gdia & Cair 2006).
Assim como o SFM4CHO, o meio HyCell sem HT tambm apresenta alta
concentrao de glicose em sua composio ([Glicose]HyCell = 8,3g/L), no entanto no
resulta em incremento proporcional na sua taxa de consumo (qGlic_HyCell_m =
0,57g/106clulas/dia) e formao de lactato (qLact_HyCell_m = 0,35g/106clulas/dia). O
meio Cellvento CHO-110 sem HT tambm apresenta alta concentrao de glicose em
sua composio e, assim como o HyCell sem HT, este incremento no tem impacto
significativo nas taxas especficas de consumo de glicose (qGlic_HyCell_m =
0,51g/106clulas/dia) e formao de lactato (qLact_CHO-110_m = 0,28g/106clulas/dia),
sugerindo que se tratam de meios que proporcionam um melhor balano metablico
para a clula (Altamirano et al 2000; Huang et al 2010). O meio CPCHO, apesar de
conter glicose em concentrao semelhante ao padro (4,5g/L), apresentou maiores
taxas especficas de consumo do nutriente (qGlic_CPCHO_m = 0,95g/106clulas/dia) e
formao de lactato (qLact_CPCHO_m= 1,46g/106clulas/dia). Correlacionando o consumo
de glicose com a formao de biomassa, utilizando o YX/Glic, possvel observar que os
meios SFM4CHO e Cellvento CHO-110 sem HT apresentaram prximos as
1,00x106 clulas/g de nutriente, enquanto os demais apresentaram valores abaixo de
0,37x106 clulas/g, inclusive o meio controle.
A produtividade dos meios testados foi comparada utilizando a concentrao
mxima de produto ao final do cultivo, sua taxa especfica de formao e a
produtividade, em relao aos mesmos dados fornecidos pelo meio SFM4CHO Utility, nos respectivos dias de cultivo. Os meios que obtiveram maiores produtividades
ao fim da cintica foram os Cellvento CHO-110 sem HT (oitavo dia) e CPCHO
(sexto dia), alcanando concentraes mximas acima de 72g/mL, comparado ao meio
controle (prximo a 59g/mL, no ltimo dia de cintica). Em relao aos dias de
trmino de cada cintica citada, o meio SFM4CHO - Utility apresentou concentraes
menores de EPOhr (43,7g/mL e 27,0g/mL, no oitavo e sexto dia, respectivamente),
mostrando um desempenho maior dos meios alternativos. Os outros meios testados
apresentaram concentraes finais de EPOhr inferiores a 37 g/mL. Observando a taxa
especfica de produo da molcula, o meio CPCHO foi o que apresentou maior valor
mdio (7,32g/106clulas/dia), enquanto o HyCell sem HT apresentou a menor taxa
66
(1,53g/106clulas/dia). Os outros meios apresentaram taxas mdias prximas ao valor

do meio padro (5,70g/106clulas/dia).
O teste realizado em biorreator de 2L, em cultivo contnuo, foi possvel somente
em dois meios (por motivos de disponibilidade do equipamento). O primeiro meio
testado foi o Cellvento CHO-110 sem HT, que no foi bem sucedido, pois no houve
proliferao aps o seu inculo. De acordo com o fabricante, existe disponvel no
mercado uma verso apropriada para o cultivo em biorreatores. Este fato levanta a
hiptese de que a formulao testada no apresenta protetores contra as tenses de
cisalhamento geradas pelo ambiente hidrodinmico do biorreator (Chisti 2001; GodoySilva et al 2009). O meio SFM4CHO, por apresentar caractersticas mais semelhantes
ao meio padro em garrafas rotatrias, foi escolhido para ser utilizado no cultivo em
biorreator. Apesar da semelhana observada nas garrafas rotatrias, o meio testado no
conseguiu sustentar concentraes celulares semelhantes verso SFM4CHO - Utility
(Pinto 2007; Vliz 2007). O processo produtivo utilizando o meio SFM4CHO - Utility
capaz de alcanar concentraes celulares na ordem de 5-10x106 quando operado em
modo contnuo. Neste processo a troca de meio iniciada quando a concentrao celular
alcana 1x106 clulas viveis/mL (Pinto 2007).
A mesma estratgia foi adotada no experimento com o meio alternativo, no
entanto mesmo aps a operao em modo contnuo por trs dias consecutivos (baseado
em uma troca de meio de 1L/dia 0,5vvd), a concentrao celular se manteve estvel
em torno 1,0 - 1,3x106 clulas viveis/dia, com viabilidade inferior a 80%. A
produtividade no teste (8,8ug/mL no sobrenadante da fase contnua) tambm foi inferior
observada no processo industrial, que alcana ttulos aproximados de 40ug/mL no
sobrenadante durante a fase contnua. Esses ttulos alcanados esto provavelmente
relacionados baixa densidade celular conseguida na escala de bancada. Apesar de
mantidas as mesmas condies operacionais (aerao e troca de meio), outros
importantes fatores como a geometria do biorreator e velocidade de agitao podem
interferir no crescimento celular, sendo necessrio maior aprofundamento esses aspectos
(Fenge & Lllau 2006; Godoy-Silva et al 2006; Vliz et al 2008; Godoy-Silva et al
2009).
67
6. Concluso
Sete meios de cultivo comerciais (SFM4CHO, HyCell, HyCell sem HT e
TransFx-C - Thermo Hyclone GE; CD FortiCHO - Gibco; Cellvento CHO-110
sem HT Merck; e CPCHO - Diagnovum/Merck) foram testados em comparao ao
meio controle SFM4CHO Utility, ao longo deste trabalho. Do total, dois no
apresentaram resultados positivos no perodo de adaptao e escalonamento, no sendo
dada sequncia s cinticas comparativas HyCell (Thermo Hyclone GE) e
TransFx-C (Thermo Hyclone GE).
Aps a realizao dos experimentos necessrios, os meios de cultivo que
apresentaram resultados iguais ou melhores que o meio controle SFM4CHO Utility
foram os meios SFM4CHO (Thermo Hyclone GE), Cellvento CHO-110 sem HT
(Merck) e CPCHO (Diagnovum/Merck), os quais permitiram um melhor crescimento
celular, melhor aproveitamento dos recursos e uma maior taxa de produo e secreo
de EPOhr no meio metabolizado.
Considerando os resultados descritos, possvel sugerir que o meio SFM4CHO
mantm o cultivo com um perfil metablico e proliferativo mais semelhante ao
SFM4CHO- Utility, provavelmente porque se trata de uma verso aprimorada do meio
controle, sendo o candidato mais provvel a ser utilizado como alternativa no processo
produtivo. Os meios Cellvento CHO-110 sem HT e CPCHO obtiveram desempenho
superior quanto aos aspectos estudados, o que pode ter impacto no processo de sntese
da glicoprotena. No entanto, para se determinar a real influncia das diferentes
frmulas dos meios, necessria uma abordagem analtica mais aprofundada,
principalmente no que se refere ao perfil glicobiolgico da Eritropoetina sintetizada.
Em decorrncia dos resultados obtidos no presente trabalho, sugere-se que os
seguintes aspectos sejam estudados em trabalhos futuros:
O estudo comparativo em garrafas rotatrias entre o meio de cultivo controle

SFM4CHO - Uitlity e novos meios de cultivo comerciais para o cultivar
linhagens celulares de CHO;
68
Cultivo em biorreator em diferentes modos de operao (batelada, batelada

alimentada, contnuo e contnuo com perfuso) dos meios que apresentarem
melhores condies de crescimento e produo da EPOhr;
Anlise bioqumica dos meios de cultivo testados no somente glicose e lactato,

como glutamina e amnio;
Estudos para avaliao do comportamento celular no meio de cultivo alternativo

anlise de ciclo celular e apoptose celular;
Estudos para avaliao das caractersticas fsico-qumicas e bioqumicas da EPOhr

expressa e secretada no meio de cultivo, atravs de focalizao isoeltrica e
mtodos cromatogrficos.
69
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