Chaya - SIRVE PARA PDF

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
Centro de Investigacin en Ciencia Aplicada y Tecnologa Avanzada
Unidad Quertaro
POSGRADO EN TECNOLOGA AVANZADA
TESIS
EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA

CHAYA (Cnidoscolus chayamansa) EN UN MODELO
EXPERIMENTAL DE DIABETES EN RATAS WISTAR
PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRA EN TECNOLOGA AVANZADA
PRESENTA
GIOVANNA MARA DEL ROSARIO PALOS SUREZ
DIRECTORES:
DRA. EVA GONZLEZ JASSO y

DR. REYNALDO CARLOS PLESS ELLING
SANTIAGO DE QUERTARO, QRO. NOVIEMBRE DEL 2007
INDICE
ABREVIATURAS.......................................................................................................................................... 10
RESUMEN.................................................................................................................................................... 11
SUMMARY ................................................................................................................................................... 12
1
INTRODUCCIN ................................................................................................................................. 13
ANTECEDENTES ................................................................................................................................ 14
2.1
Diabetes ............................................................................................................................. 14
2.1.1
Epidemiologa..................................................................................................................... 14
2.1.2
Diagnstico......................................................................................................................... 14
2.1.3
Factores de riesgo.............................................................................................................. 15
2.1.4
Complicaciones .................................................................................................................. 15
2.2
Insulina ............................................................................................................................... 16
2.2.1
Metabolismo de la glucosa................................................................................................. 16
2.2.2
Metabolismo lipdico........................................................................................................... 16
2.2.3
Metabolismo proteico ......................................................................................................... 17
2.2.4
Metabolismo de las lipoprotenas....................................................................................... 17
2.3
Modelos experimentales en animales para el estudio de la diabetes ............................... 17
2.3.1
Modelos experimentales .................................................................................................... 17
2.3.2
Induccin qumica .............................................................................................................. 17
2.4
Tratamientos para la diabetes............................................................................................ 18
2.4.1
Terapia farmacolgica........................................................................................................ 18
2.4.2
Plantas medicinales ........................................................................................................... 18
2.4.3
Cnidoscolus chayamansa .................................................................................................. 19
2.5
Dao oxidativo.................................................................................................................... 20
2.6
Radicales libres .................................................................................................................. 21
2.6.1
Generalidades .................................................................................................................... 21
2.7
Actividad Antioxidante ........................................................................................................ 24
2.7.1
Generalidades de los antioxidantes ................................................................................... 24
2.7.2
Clasificacin de los antioxidantes ...................................................................................... 26
2.7.3
Estrs oxidativo .................................................................................................................. 34
2.7.4
Mtodos para determinar la capacidad antioxidante ......................................................... 34
JUSTIFICACIN .................................................................................................................................. 37
OBJETIVO GENERAL ......................................................................................................................... 38

4.1
OBJETIVOS ESPECFICOS .............................................................................................. 38
MATERIAL Y MTODOS..................................................................................................................... 39
5.1
5.1.1
5.2
5.2.1
5.3
Animales............................................................................................................................. 39
Induccin de diabetes a ratas Wistar ................................................................................. 39
Materiales........................................................................................................................... 39
Equipo ................................................................................................................................ 39
Mtodos para determinacin de Capacidad Antioxidante ................................................. 40
5.3.1
Mtodo de la Capacidad antioxidante total (TAC) con crocin (Lussignoli y col., 1998)..... 40
5.3.2
Mtodo del potencial antioxidante de reduccin del fierro (FRAP; Liu y col., 1982). ........ 41
5.3.3
Mtodo del ABTS (Mariken y col., 2004) ........................................................................... 42
5.3.4
Determinacin de Fenoles totales (Singleton, 1965) ......................................................... 43
5.3.5
Determinacin de Flavonoides (Liu y col., 2002)............................................................... 43
5.3.6
Determinacin sangunea de Glucosa ............................................................................... 44
5.3.7
Determinacin sangunea de Triglicridos......................................................................... 44
5.3.8
Determinacin sangunea de Colesterol ............................................................................ 44
5.3.9
Determinacin en orina de Creatinina y Microalbmina .................................................... 45
5.4
Diseo experimental........................................................................................................... 45
5.4.1
Composicin proximal, fenoles totales y flavonoides ........................................................ 45
5.4.2
Primera fase (experimento subcrnico) ............................................................................. 45
5.4.3
Segunda fase (experimento subcrnico) ........................................................................... 46
5.4.4
5.5
6
Anlisis estadstico............................................................................................................. 47
RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................................................ 48

6.1
Composicin proximal, fenoles totales y flavonoides ........................................................ 48
6.2
Primera fase del experimento subcrnico.......................................................................... 49
6.3
Segunda fase experimento subcrnico.............................................................................. 56
6.4
Tercera fase ....................................................................................................................... 63
6.4.1
6.5
Tercera fase (experimento agudo)..................................................................................... 46
Curvas hipoglucmicas ...................................................................................................... 63

Determinacin de capacidad antioxidante ......................................................................... 70
6.5.1
Determinacin de la capacidad antioxidante total por la tcnica TAC por crocin.............. 71
6.5.2
Determinacin de la capacidad antioxidante total por la tcnica ABTS ............................ 74
CONCLUSIONES ................................................................................................................................ 84
RECOMENDACIONES ................................................................................................................................ 85
SUGERENCIAS PARA TRABAJOS FUTUROS.......................................................................................... 85
BIBLIOGRAFA............................................................................................................................................. 86
ANEXO I (REACTIVOS)............................................................................................................................... 95
ANEXO II (PREPARACIN DE SOLUCIONES) ........................................................................................ 97
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Contenido nutracutico (Kuti y col., 1996) ..................................................................................... 19
Tabla 2 Las principales especies reactivas de oxgeno en el organismo (Castillo y col., 2001) ................. 22
Tabla 3 Funcin fisiolgica de los antioxidantes no enzimticos (Zamora, 2007)....................................... 26
Tabla 4 Localizacin y funcin de antioxidantes enzimticos (Zamora, 2007)............................................ 33
Tabla 5 Composicin nutrimental de la hoja de chaya ............................................................................... 48
Tabla 6 Concentracin de fenoles totales y flavonoides en la hoja, extracto y licuado de chaya .............. 49
Tabla 7 Correlaciones entre grupos de diabticas con t de chaya, diabticas agua y sanas con t de
chaya ............................................................................................................................................................ 53
Tabla 8 Correlacin entre glucosa, peso corporal, triglicridos, colesterol total y colesterol de alta
densidad ....................................................................................................................................................... 58
Tabla 9 Correlacin peso-glucosa de experimento agudo ......................................................................... 66
Tabla 10 Concentracin de colesterol total y colesterol de alta densidad en suero de ratas sanas y
diabticas tratadas con licuado y extracto de hoja de chaya al 6% al final del experimento de 11 das. ... 68
Tabla 12 Cantidades para preparar curva estndar de cido glico para determinacin de fenoles totales
...................................................................................................................................................................... 99
Tabla 13 Cantidades para preparar curva estndar de catequina para determinacin de flavonoides .... 100
Tabla 11 Resultados comparativos de las tcnicas TAC, ABTS Y FRAP ............................................... 105
INDICE DE GRAFICAS
Grfica 1 Consumo de alimento de ratas sanas y diabticas tratadas con t de chaya durante el
experimento subcrnico. .............................................................................................................................. 50
Grfica 2 Consumo de lquido de ratas sanas y diabticas tratadas con t de chaya durante el
Grfica 3 Concentracin de Glucosa de ratas sanas y diabticas tratadas con t de chaya durante el
Grfica 4 Cambio en los niveles de triglicridos sanguneos, en las ratas diabticas tratadas con t de
chaya y agua durante el experimento subcrnico........................................................................................ 53
Grfica 5 Volumen (ml) de orina en 12 horas de las ratas diabticas y sanas, tratadas con t de chaya y
agua.............................................................................................................................................................. 54
Grfica 6 Cambio en los niveles de microalbmina en orina, de las ratas diabticas y sanas tratadas con
t de chaya y agua durante el experimento subcrnico. ............................................................................. 55
Grfica 7 Cambio en los niveles de creatinina en la orina, de las ratas diabticas y sanas tratadas con t
de chaya y agua durante el experimento subcrnico................................................................................... 55
Grfica 8 Consumo de lquido de ratas sanas y diabticas tratadas con t de chaya, antioxidante y agua.
...................................................................................................................................................................... 56
Grfica 9 Niveles de glucosa sangunea en las ratas diabticas y sanas tratadas con t de chaya,
antioxidante y agua. ..................................................................................................................................... 57
Grfica 10 Concentracin de Glucosa sangunea al final del experimento en ratas sanas y diabticas
tratadas con agua, antioxidante y t de chaya, durante 49 das. ................................................................ 59
Grfica 11 Concentracin de Triglicridos al final del experimento en ratas sanas y diabticas tratadas
con agua, antioxidantes y t de chaya, durante 49 das.............................................................................. 60
Grfica 12 Concentracin de Colesterol al final del experimento en ratas sanas y diabticas tratadas con
agua, antioxidantes y t de chaya, durante 49 das..................................................................................... 61
Grfica 13 Concentracin de Colesterol de alta densidad (HDL) al final del experimento en ratas sanas y
diabticas tratadas con agua, antioxidantes y t de chaya, durante 49 das. ............................................. 62
Grfica 14 Curvas hipoglucmicas de glucosa sangunea en ratas diabticas y sanas. ........................... 64
Grfica 15 Concentracin de glucosa en ratas sanas y diabticas, tratadas con licuado y extracto al 6%
durante 11 das............................................................................................................................................. 65
Grfica 16 Registro de peso de ratas sanas y diabticas, tratadas con licuado y extracto al 6% durante 11
das............................................................................................................................................................... 66
Grfica 17 Concentracin de glucosa sangunea al final del experimento en ratas sanas y diabticas,
tratadas con licuado y extracto de chaya al 6% y agua............................................................................... 67
Grfica 18 Concentracin de triglicridos en suero de ratas sanas y diabticas, tratadas con licuado y
extracto al 6% y agua al final del experimento de 11 das........................................................................... 68
Grfica 19 Concentracin de colesterol total en suero de ratas sanas y diabticas, tratadas con licuado y
extracto al 6% y agua durante 11 das......................................................................................................... 69
Grfica 20 Concentracin de colesterol de alta densidad en suero de ratas sanas y diabticas, tratadas
con licuado y extracto al 6% y agua durante 11 das. ................................................................................. 69
Grfica 21 Curvas de % de inhibicin de l de plasma de diferentes muestras de tratamientos por TAC . 71
Grfica 22 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por TAC del experimento
subcrnico de la segunda fase..................................................................................................................... 72
Grfica 23 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por TAC del experimento subcrnico
de la segunda fase ....................................................................................................................................... 73
Grfica 24 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por TAC de la tercera fase
...................................................................................................................................................................... 73
Grfica 25 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por TAC de la tercera fase ............. 74
Grficas 26 Curvas de plasma de diferentes muestras de tratamientos por ABTS ................................... 75
Grfica 27 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por ABTS del experimento
Grfica 28 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por ABTS del experimento
Grfica 29 Comparativo Capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por ABTS de la tercera
fase............................................................................................................................................................... 76
Grfica 30 Comparativo Capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por ABTS correspondiente a la

tercera fase................................................................................................................................................... 77
Grfica 31 Curvas de plasma de diferentes muestras de tratamientos por FRAP ..................................... 78
Grfica 32 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por FRAP del experimento
Grfica 33 Comparativo capacidad antioxidante en M eq de FeSO4 por FRAP del experimento
Grfica 34 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por FRAP de la tercera
fase............................................................................................................................................................... 80
Grfica 35 Comparativo capacidad antioxidante en M/L de FeSO4 por FRAP de la tercera fase ............ 80
Grfica 36 Comparativo entre tcnicas para el grupo de diabticas con extracto ..................................... 82
Grfica 37 Comparativo de sensibilidad de las tcnicas utilizadas para determinacin de antioxidantes.
SE= sana extracto, DE= diabtica extracto, SL= sana licuado, DL= diabtica licuado DAOx, SA= sana con
agua, DA= diabtica con agua, ST= sana con te, DT= diabtica con te, SAOx= sana con AOx, DAOx=
diabtica con AOx ........................................................................................................................................ 82
Grfica 38 Curva estndar de cido glico para la determinacin de fenoles totales en la hoja de chaya. 99
Grfica 39 Curva estndar de catequina en mg/ml para determinar flavonoides en la hoja de chaya. ... 100
Grfica 40 Cintica de TAC por crocin para cido ascrbico (mg/ml) ...................................................... 101
Grfica 41 Curva estndar de cido ascrbico por la tcnica de TAC ...................................................... 101
Grfica 42 Curva estndar de Trolox por la tcnica de TAC .................................................................... 102
Grfica 43 Curva de % de inhibicin de cido ascrbico por la tcnica de ABTS.................................... 103
Grfica 44 Curva de % inhibicin de TROLOX por la tcnica ABTS ........................................................ 103
Grfica 45 Curva de % de inhibicin de cido ascrbico por la tcnica de FRAP .................................. 104
Grfica 46 Curva de % de inhibicin de FeSO4 por la tcnica de FRAP................................................... 104
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Hoja de Cnidoscolus chayamansa................................................................................................ 20
Figura 2 Desbalance redox (Caldern, 2007) ............................................................................................. 23
Figura 3 El sitio en la clula donde participan los principales mecanismos antioxidantes (Caldern, 2007)
...................................................................................................................................................................... 24
Figura 4 Sistema antioxidante (Caldern, 2007)......................................................................................... 25
Figura 5 cido rico de antioxidante a prooxidante (Rosa y col., 2006) ..................................................... 28
Figura 6 Mecanismos de defensa contra los daos producidos por las ERO (Castillo y col., 2001). ......... 31
ABREVIATURAS
ABAP
2,2-Azobis-(2-amidinopropano) dihidrocloruro
ABTS
cido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfnico
ADP
Difosfato de adenosina
AOx
Antioxidantes
ATP
Trifosfato de adenosina
DPPH
2,2-difenil-1-piperihidracil
DMPO
5,5-dimetilpirrolina-N-xido
ERN
Especies reactivas de nitrgeno
EROs
Especies reactivas de oxgeno
FRAP
Potencial antioxidante de reduccin del fierro
GSH
Glutatin reducido
GSH Px
Glutatin peroxidasa
MDA
Malonaldehdo
OMS
Organizacin Mundial de la Salud
ORAC
Capacidad de absorbancia del radical de oxgeno
RL
Radicales libres
SOD
Superxido dismutasa
STZ
Estreptozotocina
TAC
Capacidad antioxidante total
TBARs
Sustancias reactivas al cido tiobarbitrico
TEAC
Capacidad antioxidante en equivalentes de trolox
TRAP
Parmetro antioxidante de captura de radicales totales
TROLOX
6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylic acid
10
RESUMEN
La Organizacin Mundial de la Salud considera que la diabetes est alcanzado proporciones de epidemia
en todo el mundo. Mxico ocupa el noveno lugar a nivel mundial con 6,8 millones de casos
diagnosticados, sin embargo es la primera causa de mortalidad a nivel nacional debido a las
complicaciones cardiovasculares. Los radicales libres (RL) juegan un rol crucial en la patologa de varias
enfermedades crnico-degenerativas como el cncer y la diabetes entre otras, debido a la alta reactividad
generada por tener uno o ms electrones no apareados y que se combinan rpidamente con alguna
molcula susceptible de ataque ocasionando una reaccin en cadena y la formacin de otros RL.
Los
antioxidantes protegen de los RL, debido a la incapacidad de los organismos biolgicos de neutralizar a
los RL por si solos, los cuales se pueden obtener por medio de la dieta alimenticia y de la herbolaria.
En nuestro pas se conocen alrededor de 150 plantas para el tratamiento de la diabetes, destaca la
Chaya (Cnidoscolus chayamansa) empleada principalmente como hipoglucemiante, diurtico y
antihipertensivo; sin embargo, existen pocos estudios cientficos que la respalden. En el presente trabajo
se evalu el efecto de la hoja de Chaya en un modelo de diabetes inducida. Se utilizaron ratas Wistar
(280-330 g) que recibieron una dosis de estreptozotocina (45 mg/kg/ip); despus de 72 h se confirm la
hiperglucemia (glucosa 180 mg/dL). Se administr ad libitum la chaya en t, licuado y extracto de
manera aguda y subcrnica; se realiz: registro semanal de peso, consumo de alimento y lquidos;
niveles sanguneos de glucosa, triglicridos y colesterol. Los resultados indicaron que la administracin
del t de Chaya no modific el consumo de alimento y lquido, ni los niveles sanguneos de glucosa ni
perfil de lpidos. La administracin de la chaya cruda en licuado al 6% y extracto acuoso al 6% si
disminuy los niveles de glucosa en la sangre. En el anlisis proximal presenta propiedades similares a la
espinaca. La capacidad antioxidante total se
Por lo que su empleo durante la diabetes probablemente puede resultar adecuado al reducir
complicaciones cardiovasculares generadas por los altos niveles de lpidos durante esta patologa.
Palabras clave: Antioxidantes, chaya, diabetes
11
SUMMARY
Evaluate the antioxidant activity of Chaya (Cnidoscolus Chayamansa) on streptozotocin induced diabetic
Wistar rats.
Key worlds: Antioxidants, chaya, diabetes.
12
INTRODUCCIN
La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crnico-degenerativa con una prevalencia del 6% en los
adultos, a nivel mundial; en Mxico es del 9-10% y en el estado de Quertaro del 7-8% de la poblacin
padece la diabetes (INEGI, 2002; Velsquez y col., 2003). A nivel nacional, representa uno de los
principales problemas de salud pblica, por el impacto econmico y social que generan las
complicaciones crnicas de tipo microvascular como la retinopata, nefropata y neuropata perifrica que
afecta nervios de pies y manos, y de tipo macrovascular como la enfermedad cerebro-vascular y la
cardiopata isqumica, esta ltima considerada la primera causa de mortalidad en nuestro pas (Dorantes
y Martnez, 2004; Barquera y col., 2003).
La diabetes es resultado de las alteraciones metablicas en la glucosa, lpidos y protenas;
manifestndose con niveles elevados de glucosa, colesterol y triglicridos en sangre. Esta alteracin
metablica es generada por el desequilibrio entre su produccin por el hgado y la utilizacin por los
tejidos dependientes e independientes de insulina, y por una secrecin deficiente o una resistencia a la
insulina (Becker, 2001; Islas, y Revilla, 2005).
Asociado a estas alteraciones, se tiene el papel del estrs oxidativo en el desarrollo de la diabetes, el cual
se caracteriza por el desequilibrio entre la produccin constante de las especies reactivas de oxgeno
(ERO) y la capacidad de defensa antioxidante de las clulas. Diversos estudios indican que los procesos
crnicos de hiperglicemia conducen a un incremento en la produccin de sustancias oxidantes como las
EROs y los radicales libres (RL) los cuales causan dao a las protenas celulares, lpidos de membrana y
cidos nucleicos (Halliwell, 1994).
Inicialmente la diabetes es una enfermedad silenciosa, acompaada por alteraciones bioqumicas y
manifestaciones clnicas que se caracterizan por hiperglicemia, poliuria (orina excesiva), polidipsia (sed
anormal), polifagia (hambre exagerada) y prdida de peso. La gravedad de las complicaciones genera
gastos elevados para la poblacin y el sector salud, por las discapacidades, terapias de rehabilitacin y
medicamentos que se requieren (Islas y Revilla, 2005).
En la bsqueda de nuevas alternativas que eleven la calidad de vida del enfermo diabtico y reduzcan los
efectos secundarios de los medicamentos alopticos, se recurre a la medicina tradicional. En Mxico, se
conocen alrededor de 150 plantas para el tratamiento de la diabetes (Alarcn-Aguilera, 1998), entre stas
sobresale la Chaya (Cnidoscolus chayamansa), por su alto valor nutricional: es rica en protena, calcio,
potasio, hierro, vitamina C y beta-carotenos (Kuti y Torres, 1996; Molina y col., 1997; Ross y Molina,
2002). Sin embargo, existe controversia y escasa evidencia cientfica sobre su efecto antidiabtico y su
papel en las complicaciones derivadas de la diabetes y del estrs oxidativo (Ross y Molina, 2004). En el
presente trabajo se evalu el efecto antioxidante de la hoja de Chaya sobre los niveles de glucosa,
colesterol y triglicridos, as como en las manifestaciones clnicas caractersticas de la diabetes y su
actividad antioxidante en un modelo experimental de diabetes en ratas Wistar.
13
ANTECEDENTES
2.1
Diabetes
La diabetes mellitus (DM) se caracteriza por una hiperglicemia generada por una alteracin en el
metabolismo de carbohidratos, lpidos y protenas. Esto es debido a una deficiencia o carencia de
insulina. Lo que afecta la captacin y entrada de glucosa en el msculo y clulas grasas.
La diabetes Tipo 1 es conocida como diabetes juvenil ya que se desarrolla principalmente en la niez o
adolescencia, abarcando el 10% del total de los casos. El sistema inmunolgico destruye las clulas
del pncreas, las cuales producen la insulina que regula la concentracin de glucosa en la sangre.
La diabetes Tipo 2 comienza con resistencia a la insulina, un trastorno en el cual las clulas no utilizan la
insulina de manera adecuada. A medida que aumenta la necesidad de insulina, el pncreas pierde
gradualmente su capacidad de producir insulina. En ausencia de insulina, las clulas del tejido adiposo
intentan proveer combustible movilizando las reservas grasas. Los cidos grasos libres se utilizan
inicialmente para la produccin de energa, generando como producto de su metabolismo cuerpos
cetnicos. Estos cidos son excretados por el rin junto con bicarbonato de sodio, ocasionando una
cada en el pH del plasma, cuyo resultado es una acidosis (cetoacidosis diabtica), lo que genera dao
renal progresivo (Greenspay y Gardner, 2005).
La diabetes, especialmente la de tipo 2, afecta ahora al 5,9% de la poblacin adulta del mundo con casi
un 80% del total en los pases en desarrollo. Las regiones con las tasas ms altas son el Mediterrneo
oriental y el Oriente Medio, donde el 9,2% de la poblacin adulta se ve afectada, y Norteamrica (8,4%).
Las cifras ms elevadas, sin embargo, se encuentran en el Pacfico occidental, donde unos 67 millones
de personas tienen diabetes, seguido de Europa, con 53 millones (IDF, 2006).
2.1.1
Epidemiologa
La India encabeza la lista de los diez pases del mundo con el mayor nmero de personas con diabetes
diagnosticada, con una cifra actual de 40,9 millones, seguida de China con 39,8 millones. Por detrs
estn EE.UU., Rusia, Alemania, Japn, Pakistn, Brasil, Mxico y Egipto. La Federacin Internacional de
Diabetes (IDF 2006) estima que en el mundo habr 246 millones de personas con diabetes en este 2007.
La prevalencia (proporcin de la poblacin que padece la enfermedad) es variable en distintas
comunidades, siendo muy alta en algunos grupos tnicos como en los Polinsicos y en los indgenas
Pima de EE.UU., donde el 25% de su poblacin presentan DM tipo 2. Mxico es uno de los pases con
mayor prevalencia de diabetes tipo 2, se calcula que ocupa el noveno lugar a nivel mundial de nmero de
diabticos (Islas y Revilla, 2005).
2.1.2
Diagnstico
Para el diagnstico definitivo de diabetes mellitus y otras categoras de la regulacin de la glucosa, se usa
el nivel
de glucosa en plasma o suero. En ayunas de 10 a 12 horas, las glicemias normales se
14
caracterizan por valores < 110 mg/dL. La intolerancia a la glucosa se diagnostica cuando el sujeto
presenta un valor de glucosa en ayuno < 126 mg/dL y a los 120 minutos post sobrecarga oral de glucosa
entre 140 y 199 mg/dL.
En la prueba de tolerancia a la glucosa oral (curva de tolerancia a la glucosa), la medicin en plasma se
hace dos horas posteriores a la ingesta de 75 g de glucosa en 30 ml de agua; la prueba es positiva con
cifras mayores o iguales a 200 mg/dL, adems de los sntomas caractersticos de la diabetes como son:
poliuria, polidipsia, polifagia y prdida de peso (Greenspay y Gardner, 2005).
2.1.3
Factores de riesgo
Los factores ms importantes en la aparicin de una diabetes tipo 2 son, adems de una posible
resistencia a la insulina o intolerancia a la glucosa, el exceso de peso y la falta de ejercicio. Para la
diabetes tipo 1 principalmente influye la herencia gentica, o bien, alguna patologa que influya en el
funcionamiento del pncreas. La actividad fsica mejora la administracin de las reservas de azcares del
cuerpo y acta como reguladora de las glucemias. Las reservas de glucgeno aumentan y se dosifican
mejor cuando el cuerpo est en forma, ya que las grasas se queman con ms facilidad, reservando ms
los hidratos de carbono para esfuerzos intensos o en caso de que la actividad sea muy larga que las
reservas aguanten ms tiempo. Dos factores a destacar son la alteracin en la glucosa de ayuno mayor o
igual a 110 mg/dL (pero < 126 mg/dL), y la intolerancia a la glucosa de 140 mg/dL (pero < 200 mg/dL)
medida a las 2 horas de ingerir una solucin glucosada (Dorantes y Martnez, 2004).
2.1.4
Complicaciones
Independiente del tipo de diabetes mellitus, un nivel elevado de azcar en la sangre conduce a las
siguientes enfermedades (Gill y col., 2002):
Dao de los pequeos vasos sanguneos (microangiopata),
Dao de los nervios perifricos (polineuropata).
Sndrome del pie diabtico (heridas difcilmente curables y la mala irrigacin sangunea de los
pies, puede conducir a laceraciones y eventualmente a la amputacin de las extremidades
inferiores).
Dao de la retina (retinopata).
Dao renal (nefropata).
Hgado graso o hepatitis de hgado graso (adipohepata).
Dao de los vasos sanguneos grandes (macroangiopata): trastorno que conduce a infartos,
apoplejas y trastornos de la circulacin sangunea en las piernas.
Hiperglucemia es la elevacin del nivel de glucosa en sangre por encima de los 110 mg/dL en
ayunas o 180 mg/dL en valor postprandial.
Hipoglucemia es la disminucin del nivel de glucosa en sangre por debajo de los 50 mg/dL.
Puede ser consecuencia de ejercicio fsico no habitual o sobreesfuerzo, sobredosis de insulina,
15
cambio en el lugar habitual de inyeccin, ingesta insuficiente de hidratos de carbono, diarreas,

etc.
Coma diabtico es la consecuencia ms grave de la diabetes, pueden presentarse valores de

glucosa en la sangre de 1000 mg/dL (los valores normales de glucosa en la sangre son de 80 a
120 mg/dL), generando una sobre acidificacin de la sangre (acidosis metablica). Este coma es
ocasionado por infecciones, errores en la alimentacin (demasiados carbohidratos) o por una
dosificacin errnea de la insulina.
2.2
Insulina
En los islotes pancreticos se secretan algunas hormonas, las clulas producen la insulina; las clulas
son productoras de glucagn (hormona hiperglucemiante o de contrarregulacin), y clulas delta
secretan somatostatina (hormona que inhibe tanto la secrecin de insulina como la de glucagn),
mientras que un pequeo nmero de clulas pancreticas (denominadas clulas F) se encargan de la
produccin del polipptido pancretico. La insulina es una hormona hipoglucemiante, se sintetiza a partir
de una larga cadena precursora, o preproinsulina, la cual se fracciona para dar lugar a la molcula de
proinsulina, que tiene 86 aminocidos. Esta ltima, a su vez, es procesada por enzimas de conversin,
generando insulina y una pequea fraccin peptdica (pptido C). La insulina es un polipptido constituido
por dos cadenas de aminocidos denominadas A y B, que estn unidas por dos puentes de disulfuro
conteniendo en total 51 aminocidos (Figueroa, 1997; Dorantes y Martnez, 2004).
La insulina acta sobre el metabolismo de los hidratos de carbono, los lpidos y las grasas.
Facilita el
transporte de glucosa a travs de la membrana celular, promueve su transformacin en glucosa -6fosfato, favorece la sntesis del glucgeno heptico y muscular; y disminuye la gluconeognesis
(Figueroa, 1997; Dorantes y Martnez, 2004).
2.2.1
Metabolismo de la glucosa
A nivel heptico la glucosa no requiere de transportador, pero la menor actividad de la glucocinasa

(esencial para la fosforilacin) y de la glucgeno sintetasa, limitan la sntesis de glucgeno. A nivel
muscular, la menor actividad de la hexocinasa y del glucgeno sintetasa, tienen igual efecto sobre la
limitada cantidad de glucosa transportada. Se presenta menor captacin de la glucosa por el tejido
muscular y adiposo debido al decremento de la activacin del transportador de la glucosa (Glut 4) en los
tejidos dependientes, reduciendo su sntesis o interfiriendo con su translocacin desde el citosol a la
membrana. Se manifiesta por un menor nmero de molculas en la membrana y por una menor captacin
y transporte de glucosa (Dorantes y Martnez, 2004; Greenspay y Gardner, 2005).
2.2.2
Metabolismo lipdico
La insulina favorece la disminucin de cidos grasos libres circulantes (aumenta el catabolismo de los
triglicridos en el tejido adiposo y del transporte de cidos grasos hacia el hgado al reducir la produccin
de la lipasa del tejido adiposo), a consecuencia de cuatro mecanismos (Dorantes y Martnez, 2004;
Greenspay y Gardner, 2005):
a) Induccin de la lipognesis,
16
b) inhibicin de la liplisis,
c) disminucin de la cetognesis
d) disminucin de la acidosis.
2.2.3
Metabolismo proteico
Esta relacionado con la reduccin del efecto de la insulina a nivel transcripcional y post-transcripcional de
enzimas involucradas en el metabolismo de las protenas. Existe una reduccin de su sntesis e
incremento de su catabolismo especialmente a nivel heptico y muscular. Esto ltimo est ligado a una
mayor actividad lisosomal y de proteasas no lisosomales. El resultado es un balance nitrogenado negativo
(Dorantes y Martnez, 2004; Greenspay y Gardner, 2005).
2.2.4
Metabolismo de las lipoprotenas
El dficit insulnico reduce la actividad del sistema lipasa lipoproteico perifrico, ya sea por defecto de su
sntesis, translocacin o activacin. Esto se traduce en una reduccin del catabolismo de las lipoprotenas
ricas en triglicridos; las de muy baja densidad (VLDL) y los quilomicrones; y se detecta por incremento
de los niveles de triglicridos sricos en ayunas y postprandiales (Greenspay y Gardner, 2005)
2.3
2.3.1
Modelos experimentales en animales para el estudio de la diabetes

Modelos experimentales
Los modelos experimentales de diabetes en animales se utilizan tanto para el estudio de la etiologa de la
diabetes mellitus como para el estudio de los mecanismos involucrados en las complicaciones diabticas
a largo plazo, ya que las caractersticas generales de la diabetes en animales son similares a las de la
diabetes humana (Fuster, 2004).
Los diferentes modelos experimentales utilizados son cuatro: los modelos que utilizan agentes qumicos
para la induccin de la diabetes (diabetes qumica); los modelos en los que se induce la diabetes
mediante procedimientos quirrgicos (diabetes quirrgica); aquellos en los que la diabetes se induce por
infecciones vricas (diabetes vrica); y, por ltimo, los modelos de diabetes espontnea.
Para este trabajo se utiliz el modelo de induccin qumica.
2.3.2
Induccin qumica
Se ha demostrado que la administracin de diferentes sustancias qumicas en animales provoca

situaciones experimentales similares a la diabetes. Entre estos agentes qumicos, el alloxano y la
estreptozotocina (STZ) parecen ser los ms efectivos y son los ms comnmente utilizados. Ambas
sustancias actan destruyendo las clulas -pancreticas por lo que provocan los dos tipos de diabetes;
ambas sustancias pueden administrarse va intravenosa, intraperitoneal o subcutnea.
La administracin de estreptozotocina (STZ) o alloxano, en dosis altas induce severa insulinodeficiencia y
hasta cetoacidosis, mientras que las bajas dosis causan una parcial reduccin de la masa de clulas , lo
17
cual puede aprovecharse para producir un estado diabtico sin tendencia a la cetoacidosis. La STZ es
ms utilizada por su mayor accin citotxica, pero la sensibilidad vara segn la especie animal, la lnea,
el sexo, la edad y el estado nutricional. En los recin nacidos, ambas sustancias pueden ser inyectadas
alternativamente. Cuando se administran durante la primera semana de vida, provocan la enfermedad
tardamente generando normalmente diabetes tipo 2, si la STZ es inyectada por va intravenosa (100
mg/kg) el primer da del nacimiento, las clulas se destruyen aunque aproximadamente la mitad se
regenera gradualmente (Szkudelski, 2001; Hugus y col.., 2002; Fisher, 2003).
Frecuentemente se usa una sola dosis va intravenosa en ratas adultas aplicando entre 40 a 60 mg/kg de
peso corporal (PC); para aplicaciones va intraperitonial se da una dosis nica de 40 a 50 mg/kg de PC.
Dos horas despus de la inyeccin se observa la hiperglicemia con bajos niveles de insulina en la sangre
y seis horas despus de la induccin se presenta una hipoglicemia junto con un incremento en los niveles
de insulina en sangre. Finalmente se desarrolla la hiperglicemia y los niveles de insulina en sangre
decrecen debido a las anormalidades que se generan en la funcin de las clulas (Szkudelski, 2001).
Los animales tratados tanto con alloxano como con STZ presentan la mayora de las complicaciones
asociadas a la diabetes como son las cardiomiopatas, las neuropatas, las disfunciones arteriales
coronarias, las alteraciones hepticas, traqueales, del tejido conectivo, gastrointestinales, etc. (Fuster,
2004).
2.4
Tratamientos para la diabetes
La diabetes mellitus es un proceso crnico-degenerativo que se puede controlar, los tratamientos para su
control estn basados en cuatro factores: la educacin e informacin concerniente a la enfermedad,
ejercicio fsico, dieta y frmacos. As como, la vigilancia constante de los niveles de glucemia del paciente
para evitar complicaciones.
2.4.1
Terapia farmacolgica
El tratamiento farmacolgico para la diabetes tiene como objetivo principal disminuir la hiperglicemia,
aunque el mecanismo a travs del cual ejerce su accin vara dependiendo de la naturaleza qumica.
Estos se clasifican en insulina e hipoglucemiantes orales, entre estos se encuentran (Alpizar, 2001):
Sulfonilureas que estimulan al pncreas a producir ms insulina,
Biguanidinas que disminuyen la cantidad de azcar producida en el hgado,
Inhibidores de la alfa-glucosidasas que retardan la absorcin de glucosa del intestino,
Tiazolidinedionas que producen mayor sensibilidad a la insulina.
2.4.2
Plantas medicinales
Considerando el alto costo de los tratamientos farmacolgicos, los efectos secundarios y las
complicaciones derivadas del empleo crnico de los frmacos, se est recurriendo a la medicina
alternativa mediante el empleo de la herbolaria, en donde la utilizacin de plantas con propiedades
medicinales constituye un recurso para complementar los tratamientos alopticos y mejorar la calidad de
18
vida. Se conocen a nivel mundial aproximadamente 800 plantas usadas para el control de la diabetes, de
las cuales se encuentran entre 150 a 269 plantas en Mxico y entre estas destaca la Chaya; sin embargo
hay muy pocos estudios cientficos que soporten sus efectos antidiabticos (Alarcn y Aguilera, 1998;
Hernndez y col., 2002).
2.4.3
Cnidoscolus chayamansa
La chaya es una verdura cultivada en la regin Maya de Guatemala, Belice, el Sureste de Mxico,
pennsula de Yucatn y partes de Honduras. Aunque es poco conocida afuera de esta regin, la evidencia
sugiere que la chaya era una planta importante para los antiguos Mayas de la pennsula de Yucatn, y tal
vez en otras partes de la regin Maya. Las hojas son amplias y pueden consistir en 3 o ms lbulos, sus
flores son blancas. Las semillas y la fruta madura son raras y desconocidas (McVaugh, 1994). Dada la
facilidad de cultivarla, su productividad potencial, y sobre todo su alto valor nutritivo, se ha propuesto a la
chaya como cultivo potencial para regiones afuera de Mesoamrica (Kuti y Torres, 1996; Molina y col.,
1997; Ross y Molina, 2002).
En la siguiente Tabla 1 se puede observar que la chaya presenta mayor contenido nutrimental que la
espinaca a excepcin del contenido de humedad, por lo que representa una fuente alimenticia importante.
Tabla 1 Contenido nutracutico (Kuti y col., 1996)
Componente
Chaya
Espinaca
Agua (%)
85.3
90.7
Protenas (%)
5.7
3.2
Grasa (%)
0.4
0.3
Fibra (%)
1.9
0.9
Calcio (mg/100 g)
199.4
101.3
Fsforo (mg/100 g)
39.0
30.0
Potasio (mg/100 g)
217.2
146.5
Hierro (mg/100 g)
11.4
5.7
Ac. Ascrbico (mg/100 g)
164.7
48.1
Las partes comestibles de la planta de la chaya son las hojas (ver Figura 1), que se consumen en forma
similar a la espinaca. Es una fuente alimenticia importante por su alto contenido de protenas, minerales
como calcio, potasio, hierro, fsforo, vitaminas (A, C y E), adems de riboflavina y tiamina; por lo que en
trminos nutricionales es superior a la acelga, lechuga, berros y col, as como con la espinaca (Kuti y
Torres, 1996; Ventura, 2004).
19
Figura 1 Hoja de Cnidoscolus chayamansa

La chaya se ha recomendado tradicionalmente para diversos padecimientos incluyendo la diabetes, la
obesidad, las piedras del rin, hemorroides, acn, problemas visuales y de encas (Daz-Bolio, 1975).
Las hojas de chaya se han tomado como laxante, diurtico, para la circulacin, para mejorar la digestin,
para estimular la lactancia y endurecer las uas. Pero como otras plantas alimenticias como las habas y
mandioca, las hojas crudas contienen glucsidos cianognicos, los cuales son txicos por formar cido
cianhdrico (HCN), un compuesto txico el cual es destruido fcilmente por medio de la coccin (Molina y
col., 1999; Gonzlez y col., 2003).
A la chaya se le ha atribuido un efecto hipoglucemiante de acuerdo a estudios realizados por Kuti y Torres
en 1996, en donde fue administrado de forma intragstrica el t de chaya a conejos diabticos inducidos
con estreptozotocina, los cuales presentaron un decremento en los niveles de glucosa.
2.5
Dao oxidativo
Una gran cantidad de estudios epidemiolgicos han demostrado que las personas que consumen una
dieta rica en frutas y verduras presentan un menor riesgo de desarrollar enfermedades crnicas
degenerativas como son la ateroesclerosis, hipertensin, diabetes, isquemia, artritis, colitis ulcerativa,
hipoxia, fibrosis qustica y cncer. Esto ha conducido a intentos para identificar los compuestos
especficos responsables de los efectos positivos en la salud por el consumo de alimentos ricos en
sustancias antioxidantes como vitamina C y E, carotenoides, compuestos fenlicos, flavonoides, selenio y
otros, que previenen o disminuyen el dao oxidativo (Avello y Suwalsky, 2005; Fernndez y col., 2006).
El dao oxidativo se genera por cambios en los sistemas de defensa ocasionando:
Disminucin en la entrada de las molculas antioxidantes.
Aumento en el metabolismo de antioxidantes.
Falla en los sistemas de reparacin.
Disminucin de afinidad y concentracin de molculas que secuestran metales de transicin.
20
Aumento de enzimas oxidantes y blancos celulares
Isoformas de enzimas que generan mas oxidantes
Estados patolgicos derivados de la generacin de radicales libres (RL).
En la diabetes mellitus el incremento de RL reduce la capacidad antioxidante al activar la va de los

polioles, que disminuyen el NAPDH, e inhiben las enzimas NADPH dependientes como la glutation
reductasa (Atalay y Laaksonen, 2002). Se habla de estrs oxidativo cuando la produccin de radicales
libres supera la capacidad antioxidante del organismo (Dorantes y Martnez, 2004; Caldern, 2007).
2.6
2.6.1
Radicales libres
Generalidades
El dao oxidativo en los sistemas biolgicos se debe a la generacin de radicales libres (RL) los cuales
son molculas o tomos con un electrn desapareado en su orbital externo, que lo vuelve muy inestable,
reactivo y de vida muy corta; con gran capacidad para combinarse inespecficamente con diversas
molculas de la clula (Halliwell, 1994).
Los RL se pueden formar en el interior o exterior de las clulas, o incluso diseminados por todo el
organismo, como producto de sus actividades fisiolgicas normales, a partir de procesos como la hipoxia,
y de fuentes exgenas como radiaciones, frmacos, contaminantes ambientales y la dieta, entre otros.
Los RL pueden lesionar algunos componentes celulares, entre los cuales estn los lpidos que presentan
peroxidacin de los cidos grasos poliinsaturados en membranas y organelos; los carbohidratos sufren
despolimerizacin de los polisacridos; las protenas se oxidan en los puentes sulfhidrilos de las enzimas
y los cidos nuclicos modifican sus bases, generando mutaciones (Gonzlez-Torres, 2000).
Los RL pueden provocar la acumulacin de reacciones oxidativas en las molculas de vida larga como el
colgeno y la elastina, pueden despolimerizar los mucopolisacridos, favorecer la acumulacin de
materiales como el pigmento de envejecimiento, alterar las membranas de las mitocondrias y lisosomas,
provocar una fibrosis arteriolocapilar y disminuir la actividad de algunas enzimas.
Cuando los radicales, especialmente OH
.-
.-
y O2
producen radicales alquilperxido, facilitan la
perpetuacin de la cadena de reacciones de oxidacin de los lpidos, con daos similares sobre las
protenas y los cidos nucleicos. En el proceso de captacin de un electrn o la formacin de una pareja
de electrones, se produce una reaccin entre molculas y una de las molculas puede convertirse en otro
RL y perpetuar el proceso. Aunque los radicales libres son de vida muy corta (del orden de una milsima
de segundo), son tremendamente reactivos; por ejemplo un RL puede daar un milln de molculas
mediante ste proceso de auto-perpetuacin (Zamora, 2007).
Las mitocondrias son la fuente principal de radicales libres, son responsables de ms del 90% del
consumo de oxgeno celular. En los sistemas biolgicos los RL proceden principalmente del metabolismo
del oxgeno. Una consecuencia directa de este proceso es que entre los
nutrientes iniciales y la
generacin de energa al final del proceso, se forman varias molculas con diferente grado de oxidacin.
Este fenmeno se efecta a nivel de la cadena de transporte de electrones, que es la ltima etapa de
21
produccin de protones de alta energa, y cuyo pasaje a travs de la membrana interna mitocondrial
genera un gradiente elctrico que aporta la energa necesaria para formar el ATP o adenosina trifosfato
(Rodrguez y col., 2001). Otras fuentes de RL son los peroxisomas, organelos del citosol, muy ricos en
oxidasas,
generan H2O2 el cual es depurado por enzimas especficas como la catalasa, y es
transformado en agua.
NADPH + 2O2
NADP+ + H+ + 2O2.-
NADH+ + 2O2
NAD+ + H+ + 2O2.-
NADH+ + 1/2O2 + ADP + P
NAD+ + H+ + 2H2O + ATP
La reduccin del oxgeno da lugar a tres formas incompletas reducidas del oxgeno entre este y el agua,
.-
el radical anin superxido (O2 ), el perxido de oxgeno (H2O2), que no es un radical pero puede
generarlos y el radical hidroxilo (OH). El O2 necesita del H2O2 para producir la especie oxidante (OH),
mientras que el H2O2 no necesita al O2 para poder hacerlo. Esto, junto con la presencia del H2O2 a
concentraciones superiores del O2, convierte al perxido de hidrgeno en una especie muy reactiva capaz
de generar dao oxidativo aunque no sea un RL. Se ha demostrado la generacin de O2 y H2O2 por parte
de enzimas y mediante la autooxidacin de molculas biolgicas en casi todas las fracciones celulares
incluyendo la citoslica, mitocondrial, peroxismica, microsmica, membrana plasmtica y nuclear. La
presencia de estos dos radicales puede generar OH en la mayora de los rincones celulares (Cspedes y
Snchez, 2000).
Las especies reactivas de oxgeno (EROs) pueden tener en nuestro organismo un origen endgeno
relacionado con el metabolismo del oxgeno y con distintas reacciones de defensa de nuestro sistema
inmunolgico. Se describen a continuacin en la Tabla 2.
Tabla 2 Las principales especies reactivas de oxgeno en el organismo (Castillo y col., 2001)
ERO
PARTICULARIDAD EN EL ORGANISMO
-
Anin superxido ( O 2)
Formado en reacciones de autoxidacin (flavoprotenas, ciclo redox)
Radical hidroxilo (OH)
Formado en las reacciones de Fenton o en la de Haber-Weiss catalizada

por metales (hierro). Es la especie de vida media ms corta y el ms
reactivo de todos. Puede captar los electrones de los tioles, por lo que
interacta con las bases nitrogenadas de los cidos nucleicos, alterando
la informacin gentica de las clulas. Tambin estimula la peroxidacin
lipdica, afectando a los fosfolpidos de las membranas celulares
Radical peroxilo (ROO)
Formado a partir de hidroperxidos orgnicos o del ROOH por prdida de

H+
O2 o puede proceder
Perxido de hidrgeno
Formado a partir de la dismutacin del
(H2O2)
directamente del O2. Al no contener electrones despareados no puede
22
ser considerado como un autntico radical libre

Acido hipocloroso (HOCl)
Producido por accin del estallido respiratorio de las clulas defensivas.

Se origina a partir del H2O2 por accin de la mieloperoxidasa. Tampoco
puede ser considerado estrictamente como un radical libre
Oxido ntrico (NO)
Producido por la unin del oxgeno con el nitrgeno, induciendo

lipoperoxidacin lipdica
Iones Fe+++ y Cu++
Actan como catalizadores en la formacin de radicales hidroxilo, de ah

la importancia que adquieren las protenas encargadas de transportar
estos iones, mantenindolos "secuestrados"
Oxgeno singlete ( O2)
Es el oxgeno molecular simple, el primer estado excitado. Se forma por

la activacin del O2 (luz solar, radiaciones)
Tambin pueden provenir de fuentes externas: tabaco, contaminacin del aire, radiacin ultravioleta y de
alta energa, ozono y ciertos medicamentos. Al elevarse o disminuir las concentraciones fisiolgicas de
las EROs pueden acarrear importantes alteraciones funcionales como la aterosclerosis, el envejecimiento,
Parkinson, cncer o diabetes por nombrar algunas. En la enfermedad diabtica se ha encontrado una
relacin directa entre el mal control metablico y la
presencia de hiperglucemia con respecto al
incremento de estrs oxidativo del organismo, con elevados niveles de EROs en todos los sistemas
estudiados. Un desbalance redox provoca el envenenamiento y alteracin de todos los compuestos y
procesos enzimticos expuestos, en la Figura 2 se muestra un ejemplo (Chihuailaf y col., 2002;
Fernndez y col., 2006; Caldern, 2007).
NADH +
1/2O2
Piruvato + NADH
+ 2H+ + 2e-
H2O
H2O
Lactato
NAD+ + H+ + 2e-
NADH
Piruvato + H+ + e-
Negativo
1/2O2
Lactato
-0.19
+0.32
+0.82 Positivo
Figura 2 Desbalance redox (Caldern, 2007)
23
Tambin se tienen radicales de tioles, que se caracterizan por contener azufre como grupo reactivo. Otros
radicales contienen carbono, fsforo o nitrgeno como centro reactivo, conocido este ltimo como
especies reactivas de nitrgeno; otros como el hidrgeno atmico (H ), tetraclorometilo (CCl3 ) y metales
de transicin como el Fe, Cu, Co, Se, Zn y Hg.
2.7
2.7.1
Actividad Antioxidante
Generalidades de los antioxidantes
El organismo dispone de mecanismos de defensa antioxidante frente a las especies reactivas de oxgeno,
que comprenden sistemas enzimticos y no enzimticos. Las fuentes principales son las enzimas
asociadas al metabolismo del cido araquidnico, como la cicloxigenasa, la lipoxigenasa y la citocromo
P-450 (Cspedes y Snchez, 2000), ver Figura 3 .
Figura 3 El sitio en la clula donde participan los principales mecanismos antioxidantes (Caldern, 2007)
Las enzimas como superxido dismutasa, catalasa, glutation peroxidasa o glutation reductasa, neutralizan
las especies reactivas, como los aniones superxidos y el perxido de hidrgeno que son productos
24
secundarios importantes del metabolismo oxidativo. Los sistemas defensivos no enzimticos abarcan una
serie de compuestos antioxidantes como albmina, transferrina, glutatin, bilirrubina, cido rico,
ubiquinona o melatonina. En ciertas situaciones extremas, estas defensas no son suficientes y las
especies reactivas producen dao oxidativo, tanto en biomolculas como en componentes celulares
(Fernndez y col., 2006).
En los sistemas antioxidantes defensivos, un primer grupo trabaja sobre la cadena del radical inhibiendo
los mecanismos de activacin y un segundo grupo neutraliza la accin de los radicales libres ya
formados, por tanto detiene la cadena de propagacin. En este grupo pueden encontrarse enzimas
destoxificadoras
notables como la superxido dismutasa y la catalasa, que producen peroxidasas
particularmente importantes como la glutatin peroxidasa. Las enzimas utilizan en su mayora elementos
trazas como cofactores para sus reacciones. Muchas de estas molculas las podemos encontrar en la
fase lipdica, otras por el contrario son lipofbicas. El la Figura 4 se encuentra el sistema antioxidante a
nivel celular, el cual protege de los efectos de los radicales libres (Cspedes y Snchez, 2000; Caldern,
2007).
Figura 4 Sistema antioxidante (Caldern, 2007)
25
2.7.2
Clasificacin de los antioxidantes
Los antioxidantes (AOx) se pueden clasificar en enzimticos y no enzimticos.

Los no enzimticos constituyen un grupo heterogneo de molculas lipoflicas e hidroflicas que capturan
RL y originan especies qumicas menos nocivas para la integridad celular. El mecanismo de accin
involucrado es la donacin de un electrn a un RL con el fin de estabilizarlo.
A continuacin se pueden ver de manera general en la
Tabla 3 su funcin fisiolgica.
Tabla 3 Funcin fisiolgica de los antioxidantes no enzimticos (Zamora, 2007).
ANTIOXIDANTES
FUNCION FISIOLOGICA
NO ENZIMTICOS
Vitamina E
Principal antioxidante presente en la membrana celular, neutraliza el oxgeno

singlete, captura radicales libres hidroxilos y anin superxido; neutraliza
perxidos.
Vitamina C
Efecto eliminador de radicales, neutraliza el oxgeno singlete, captura radicales

hidroxilos, anin superxido; y regenera la forma oxidada de la vitamina E.
Acido rico
Su efecto es eliminar los radicales hidroxilo
Glutation
Tiene varios efectos en la defensa antioxidante celular
cido lipoico
Antioxidante eficaz y es un sustituto eficaz del glutatin
Carotenoides
Antioxidante de lpidos
Bilirrubina
Producto del metabolismo del grupo hem de la hemoglobina, tiene un efecto

antioxidante a nivel extracelular
Ubiquinonas
Derivado de quinonas lipdicas solubles, cuyas formas reducidas tienen efectos

eficaces como antioxidantes
2.7.2.1
Antioxidantes no enzimticos hidroflicos
Los AOx no enzimticos hidroflicos se ubican principalmente en el citosol, matriz mitocondrial y nuclear y
en fluidos extracelulares; stos incluyen vitamina C, glutatin, cido rico, bilirrubina, albmina y
flavonoides polifenlicos (Chihuailaf y col., 2002).
2.7.2.1.1
Vitamina C (cido Ascrbico)
Se encuentra bajo la forma de ascorbato, distribuido intra y extracelularmente. Reacciona en forma

directa con los RL superxido, hidroxilo y varios hidroperxidos lipdicos. Este proceso transforma el
ascorbato en el RL deshidroascorbato. El retorno a su forma nativa es por accin enzimtica o por
sustratos celulares tilicos. A pesar de su manifiesta propiedad AOx, el ascorbato puede desempearse
26
como un potente prooxidante en presencia de excesivas concentraciones de iones Fe+3 y Cu+2(Rodrguez

y col., 2001; Chihuailaf y col., 2002; Bentez, 2006). Hay estudios que sugieren que su accin antioxidante
contra el estrs oxidativo de la mucosa gstrica puede deberse a la vitamina C, al ser un potente
antioxidante soluble en agua atrapa y neutraliza una variedad de especies reactivas del oxgeno, como
hidroxilo, alcoxilo, peroxilo, anin superxido, radicales hidroperxilo y radicales reactivos del nitrgeno a
concentraciones muy bajas; adems puede regenerar otros antioxidantes como el alfa-tocoferoxilo y el
beta-caroteno a partir de sus especies radicales. Otros estudios han demostrado que el cido ascrbico
es adems inhibidor de la nitrosacin con potencial importancia como eliminador de nitritos in vivo,
permite disminuir los riesgos de aparicin de cncer de estmago y esfago, aumenta la funcin
inmunolgica al aumentar las clulas killer naturales y la funcin de los linfocitos T y B, inhibe el
crecimiento de distintas clulas de melanoma humano e induce apoptosis en clulas leucmicas
promielocticas HL-60 y en fibroblastos de seres humanos, combate el cncer al promover la sntesis de
colgeno y prevenir as que los tumores invadan otros tejidos; y se ha sugerido que un complemento
diario de 1 g de vitamina C podra proteger a las personas contra la mutagnesis inducida por la
quimioterapia (Zamora, 2007).
2.7.2.1.2
Glutatin
Su forma reducida (GSH) es un tripptido ((-glutamil-cisteinil-glicina), que presenta una distribucin

tisular variable y constituye el compuesto tilico de bajo peso molecular ms abundante en las clulas de
mamferos. Sus propiedades qumicas le permiten actuar frente a numerosos compuestos oxidantes, tales
como perxido de hidrgeno, superxido, hidroxilo y especies reactivas de carbono, adems reduce el
RL tocoferoxilo y el RL deshidroascorbato y los reconvierte a su forma original.
Las alteraciones en el
metabolismo del glutatin juegan un papel importante en la defensa antioxidante.
La reduccin del
glutatin destoxifica el efecto de las especies reactivas de oxgeno como son el perxido de hidrgeno y
la peroxidacin lipdica directamente o en el metabolismo catalizado de la glutatin peroxidasa.
El
glutatin tambin regenera a los antioxidantes en fase lipdica y acuosa como el cido ascrbico y el
tocoferol. El glutation reducido cataliza el NADPH dependiendo de la reduccin u oxidacin del glutatin,
dando mantenimiento intracelular al almacenamiento de glutatin y favoreciendo al estado de reduccin.
En los pacientes diabticos tipo 2 decrece el glutatin reducido y se incrementan los niveles del glutatin
S transferasa (Atalay y Laaksonen, 2002).
2.7.2.1.3
cido rico
Aunque se ha considerado un producto terminal del metabolismo de las purinas, su funcin como AOx
biolgico, intra y extracelular, ha comenzado a reconocerse. Su mecanismo de accin aparentemente
sera prevenir la oxidacin de la Vitamina C y formar complejos con los metales Fe y Cu (Rodrguez y col.,
2001). Es uno de los AOx biolgicos ms abundante en el organismo, por lo mismo el cido rico puede
cambiar su actividad qumica de antioxidante a prooxidante cuando penetra en la placa aterosclertica,
contribuyendo en ese medio a oxidar las lipoprotenas en pacientes con sndrome metablico y diabetes
27
mellitus tipo 2; esto ha conducido a proponer que la concentracin de cido rico mayor de 4 mg/dL en
plasma es un signo de alerta en pacientes con elementos de riesgo cardiovascular, en la Figura 5 se
puede observar el ciclo en donde el cido rico pasa a ser un prooxidante (Rosa y col., 2006).
Figura 5 cido rico de antioxidante a prooxidante (Rosa y col., 2006)

2.7.2.1.4
Compuestos fenlicos
Los compuestos fenlicos son sustancias que poseen un anillo aromtico unido a uno o ms
constituyentes hidroxilo, incluyendo sus derivados funcionales (steres, metil steres, glucsidos, etc.).
Los compuestos fenlicos (catequinas, cianidinas, quercetinas) protegen a las plantas contra los daos
oxidativos y tienen el mismo efecto en el organismo humano. Estos actan bloqueando la accin de
enzimas especficas que generan inflamacin, adems actan como potentes quelantes de metales y
capturadores in vitro de EROs y especies reactivas del nitrgeno (ERN). Pueden ser liposolubles o
hidrosolubles y se localizan intra y extracelularmente. Los fenoles tambin modifican la aglomeracin de
las plaquetas e inhiben la activacin de carcinognesis (Tunalier, 2004; Pourmorad, 2006).
2.7.2.1.5
Flavonoides
Los flavonoides contienen en su estructura qumica un nmero variable de grupos hidroxilo fenlicos y
excelentes propiedades de quelacin del hierro y otros metales de transicin, lo que les confiere una gran
capacidad antioxidante.
Sus propiedades anti-radicales libres se dirigen fundamentalmente hacia los
radicales hidroxilo y superxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de
28
peroxidacin lipdica y se ha descrito su capacidad de modificar la sntesis de eicosanoides (con

respuestas anti-prostanoide y anti-inflamatoria), de prevenir la agregacin plaquetaria (efectos
antitrombticos) y de proteger a las lipoprotenas de baja densidad de la oxidacin (prevencin de la placa
de ateroma).
Se han identificado ms de 5.000 flavonoides, entre los que se pueden destacar: Citroflavonoides
(quercitina,
hesperidina,
rutina,
naranjina
limoneno),
isoflavonoides
(genistena,
daidzeina),
proantocianidinas, antocianidinas, cido elgico, catequiza, kaemferol.

El creciente inters en los flavonoides se debe a la apreciacin de su amplia actividad farmacolgica.
Pueden unirse a los polmeros biolgicos, tales como enzimas, transportadores de hormonas, y ADN;
quelar iones metlicos transitorios, tales como Fe2+, Cu2+, Zn2+, catalizar el transporte de electrones, y
depurar radicales libres. Debido a este hecho se han descrito efectos protectores en patologas tales
como diabetes mellitus, cncer, cardiopatas, infecciones vricas, lcera estomacal y duodenal, e
inflamaciones (Martnez y col., 2002; Prez, 2003).
Por otra parte, se ha podido conocer que tambin inhiben enzimas involucradas indirectamente en los
procesos oxidativos, como la fosfolipasa A, al mismo tiempo que estimulan otras con reconocidas
propiedades antioxidantes, la catalasa (CAT) y la superxido dismutasa (SOD). De esta forma los
flavonoides interfieren en las reacciones de propagacin de RL y en la formacin del radical en s (Prez,
2003).
2.7.2.2
Antioxidantes no enzimticos lipoflicos
Los AOx no enzimticos de naturaleza lipoflica se ubican en membranas y, generalmente, bloquean la

formacin de hidroperxidos, o interrumpen la propagacin de la peroxidacin de lpidos (PL) (Chihuailaf y
col., 2002), stos incluyen:
2.7.2.2.1
Vitamina E
Su nombre genrico hace referencia a sus ocho ismeros estructurales de tocoferol, de los cuales el tocoferol es el ismero de mayor potencia AOx y, junto el -tocoferol, se le considera esencial en la
defensa celular. La captura de RL superxido, hidroxilo y peroxilos lipdicos la desarrolla en membranas
celulares y subcelulares (mitocondria y retculo endoplsmico liso) y detiene la propagacin de la PL.
Para estabilizar un RL, el tocoferol se convierte en el RL tocoferoxilo, este retorna a su estado original a
travs de reacciones mediadas por la coenzima Q y en menor grado por las vitaminas C y A. Algunos
investigadores sostienen que una sobreproduccin de ERO puede llevar a una disminucin significativa
de la concentracin tisular de vitamina E (Chihuailaf y col., 2002, Benitez, 2006).
Las partculas de colesterol LDL oxidadas contribuyen al desarrollo de la placa aterosclertica, adems de
que estas partculas pueden inducir la apoptosis directamente. Tambin las partculas LDL oxidadas
pueden modificar la inflamacin y los mediadores trombognicos; por lo que la prevencin de la oxidacin
de las LDL con antioxidantes podra usarse para inhibir la progresin de la enfermedad. En base a lo
anterior se tienen estudios sobre la oxidacin de las LDL y la capacidad protectora de la vitamina E sobre
29
los lpidos que se transportan en estas lipoprotenas. Dos componentes alimentarios que inhiben el
potencial de oxidacin del colesterol LDL son el nivel de cido linoleco en las partculas y la
disponibilidad de antioxidantes, siendo la vitamina E el nutriente ms importante. Se ha comprobado que
la vitamina E es el antioxidante ms concentrado que se encuentra en las LDL, en una cantidad 20 a 300
veces mayor que cualquier otro antioxidante.
In vitro la vitamina E inhibe la oxidacin de las LDL y su
accin es superior si la suplementacin combina sta vitamina con la vitamina C y el beta caroteno
(Zamora, 2007).
2.7.2.2.2
Vitamina A
Es un trmino genrico que abarca a los compuestos de origen animal que presentan actividad biolgica
de vitamina A. En los vegetales, existe como provitamina llamada -caroteno. Por su conformacin
estructural son excelentes capturadores de RL. Protegen contra la PL, sobre todo la inducida por el
sistema de la xantina oxidasa, y elimina el in superxido y radicales peroxilo. Al igual que la vitamina C,
tiene un comportamiento dual al actuar como prooxidante en condiciones de altas presiones parciales de
oxgeno (Chihuailaf y col., 2002).
2.7.2.2.3
Ubiquinona
Tambin llamada coenzima- Q, es un derivado de la quinona. Su estructura es semejante al tocoferol y se

le ha identificado como un portador adicional en la cadena respiratoria. Aproximadamente 50% de la
ubiquinona celular se encuentra en la mitocondria. Aunque su funcin antioxidante in vivo est en
discusin, su forma reducida, el ubiquinol, tiene una fuerte actividad AOx, comparada con su forma
oxidada, llegando a consumirse antes que la vitamina E frente a una situacin de exposicin a RL. El
ubiquinol impide que las EROs desencadenen la PL y tambin participa en el reciclaje de la vitamina E en
la mitocondria.
Otros compuestos sugeridos con actividad AOx son la albmina, el fibringeno, la
bilirrubina y la glucosa (Chihuailaf y col., 2002).

2.7.2.3
Antioxidantes Enzimticos
La funcin antioxidante desempeada por las enzimas puede presentar ventajas frente a los compuestos
AOx en el sentido de que su actividad es regulada de acuerdo a los requerimientos celulares: pueden ser
inducidas, inhibidas o activadas por efectores endgenos. El grupo de AOx enzimticos cataliza la
transferencia de electrones desde un sustrato hacia los RL. Los sustratos o agentes reductores
empleados en estas reacciones se regeneran para ser nuevamente activos y lo hacen a expensas del
NADPH producido en las diferentes vas metablicas. Frente a una situacin de exposicin prolongada a
ERO puede ocurrir una disminucin en las concentraciones del NADPH necesario en otros procesos
fisiolgicos importantes, a pesar de que algunos AOx enzimticos no consumen cofactores (Rodrguez y
col, 2001; Chihuailaf y col., 2002).
En la Figura 6 se observan los mecanismos en donde las enzimas superxido dismutasa (SOD) junto con
la catalasa (CAT) o la glutatin peroxidasa (GSH-Px) eliminan muchos de estos compuestos. La
30
lactoferrina (que atrapa el hierro) u otros antioxidantes como la vitamina E, disminuyen los daos
producidos (Castillo y col., 2001).
Figura 6 Mecanismos de defensa contra los daos producidos por las ERO (Castillo y col., 2001).
2.7.2.3.1
Superxido dismutasa (SOD)
La enzima superxido dismutasa (SOD, superxido -superxido oxidorreductasa), es del grupo de las
metaloenzimas presentes frecuentemente en organismos aerbicos, aerotolerantes y algunos anaerobios
obligados. Son esenciales para su defensa contra la toxicidad producida por los metabolitos parcialmente
reducidos, generados durante la reduccin biolgica normal del oxgeno molecular. Se conocen 3 formas
de SOD segn el metal que utilizan como cofactor. Estas a su vez pueden dividirse en 2 familias
filogenticas diferentes: CuZn-SOD y Fe/Mn-SOD.
Entre ellas no existe homologa de secuencias ni de
estructuras de orden superior, lo que indica que evolucionaron independientemente en respuesta a una
presin evolutiva comn: la presencia del oxgeno y la amenaza de su toxicidad (Garca y col., 1996).
-
Esta enzima cataliza la conversin del radical superxido (O2 ) en perxido de hidrgeno (H2O2) y oxgeno
molecular (O2), en una de las reacciones catalizadas por enzimas ms rpida que se conoce (K= 2 x 109
31
M/s-1 para la CuZn-SOD), la funcin de esta consiste en eliminar el radical superxido antes de que ste
reaccione con molculas biolgicas susceptibles u origine otros agentes txicos. El perxido de hidrgeno
generado por la accin de la enzima, es eliminado por la catalasa y/o la glutatin peroxidasa. (Garca y
col., 1996).
2.7.2.3.2
Catalasa (CAT)
Una de las enzimas que interviene en la proteccin y el mantenimiento del balance oxidante/antioxidante
es la catalasa (CAT). La catalasa (perxido de hidrgeno: perxido de hidrgeno oxidorreductasa) es una
de las enzimas ms abundantes en la naturaleza y se encuentra ampliamente distribuida en el organismo
humano, aunque su actividad vara en dependencia del tejido; sta resulta ms elevada en el hgado y los
riones, ms baja en el tejido conectivo y los epitelios, y prcticamente nula en el tejido nervioso. A nivel
celular se localiza en las mitocondrias y los peroxisomas, excepto en los eritrocitos, donde se encuentra
en el citosol. Esta enzima es una metaloprotena tetramrica, cuyo peso molecular se encuentra en el
rango de 210-280 kD. Consta de 4 subunidades idnticas que se mantienen unidas por interacciones no
covalentes. En algunas especies la CAT contiene molculas de nicotinamn adenn dinucletido fosfatado
en su forma reducida (NADPH) ligadas estrechamente a la enzima; as se ha demostrado que la CAT
humana y la de res estn ligadas a 4 molculas de NADPH, 1 en cada subunidad y que no existe
interaccin directa entre el grupo hemo y el NADPH. El NADPH unido a la enzima no est involucrado en
su actividad cataltica o peroxidativa. Esta molcula puede intervenir en la prevencin y reversin parcial
de la inactivacin de la CAT por su propio sustrato txico y estabiliza a la enzima. Adems, la CAT
constituye un reservorio de NADPH, lo cual juega un importante papel durante el estrs oxidativo
(Cspedes y col., 1996).
Cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Esta funcin es compartida con
la enzima glutatin peroxidasa que no requiere de cofactores. En general las bajas concentraciones de
perxido de hidrgeno estimulan la actividad de peroxidasas, mientras que las altas concentraciones de
perxido son preferentemente catalizadas por la catalasa (Cspedes y col., 1996).
H 2 O 2 + H 2 O 2H 2 O + O 2
2.7.2.3.3
Glutatin peroxidasa (GSH-Px)
Es una selenoprotena que, en las clulas animales, se ubica en la matriz mitocondrial y en el citosol. En
presencia de GSH como agente reductor, cataliza la reduccin del perxido de hidrgeno y otros
hidroperxidos orgnicos en agua y alcohol, respectivamente. Al igual que otras selenoprotenas, el sitio
activo de GSH-Px contiene selenio (Se) bajo la forma de residuos de selenocistena incorporada a una
cadena polipeptdica conformada por 21 aminocidos. Se han descrito cuatro isoformas de GSH-Px que
32
difieren tanto en su ubicacin como en la especificidad de sustrato, tres de las cuales presentan
estructura tetramrica. La primera de ellas, GSH-Px celular o clsica, est prcticamente en todas las
clulas, puede reducir el perxido de hidrgeno e hidroperxidos orgnicos libres y convertirlos en agua y
alcoholes. La alta correlacin existente entre su actividad sangunea y la concentracin plasmtica del
selenio, ha permitido emplearla como indicador para evaluar el balance metablico nutrimental de este
mineral en diferentes especies, principalmente bovinos lecheros y ovinos. La segunda isoforma es la
GSH-Px plasmtica o extracelular, es una glicoprotena purificada, caracterizada a partir de plasma
humano que se sintetiza en las clulas tubulares proximales del rin. El tercer tipo es la GSH-Px
fosfolpido hidroperxido, cuya funcin biolgica primaria es proteger contra la PL reduciendo
hidroperxidos de cidos grasos en las membranas celulares y previniendo la oxidacin de lipoprotenas
de baja densidad. Es la nica isoforma cuya estructura es monomrica; es decir, contiene un solo residuo
de selenocistena.
El ltimo tipo se denomina GSH-Px gastrointestinal y representa la principal
peroxidasa dependiente de glutatin en el tracto gastrointestinal. Es importante en la reduccin de

hidroperxidos de colesterol y en la proteccin contra la toxicidad por ingestin de hidroperxidos lipdicos
(Cisneros y col., 1997).
(Glutatin-peroxidasa)
2GSH + H 2 O 2 GSSG + 2H 2 O
GSH=glutatin reducido
GSSG = glutatin oxidado
La ingesta de alimentos ricos en sustancias antioxidantes como vitaminas C y E, carotenoides o
compuestos fenlicos, previene o disminuye el desarrollo de estas enfermedades. Se cree que la dieta
aumenta la defensa antioxidante del organismo evitando el dao oxidativo (Cisneros y col., 1997).
En la Tabla 4 se presenta un resumen de la localizacin y su funcin fisiolgica que tiene los
antioxidantes enzimticos.
Tabla 4 Localizacin y funcin de antioxidantes enzimticos (Zamora, 2007).
ANTIOXIDANTES
LOCALIZACIN
FUNCIN FISIOLGICA
ENZIMTICOS
Superxido
Dismutasa
Glutation
Peroxidasa
Catalasa
Citoplasma y mitocondria
Disminuye los radicales superxido

Elimina el perxido de hidrgeno y los
hidro-perxidos orgnicos
Elimina perxido de hidrgeno
33
2.7.3
Estrs oxidativo
El desbalance entre la produccin de EROs y la defensa antioxidante provoca un dao orgnico conocido
como estrs oxidativo, que lleva a una variedad de cambios fisiolgicos y bioqumicos los cuales
ocasionan el deterioro y muerte celular. No podemos precisar si la alteracin es por incremento de los RL
(prooxidantes) o por una disminucin en la respuesta homeosttica de los tejidos (defensa AOx). El
estrs oxidativo se desencadena cuando los prooxidantes exceden a la capacidad AOx de un organismo
(Rodrguez y col., 2001).
Se puede medir este dao mediante mtodos directos e indirectos.
Entre los primeros se tiene la
medicin de agentes antioxidantes, lo cual es muy difcil por su vida media muy corta y el empleo de
equipos costosos; lo que obliga a medirlos indirectamente mediante:
a. Determinacin de productos terminales de la accin oxidante sobre biomolculas: los mtodos
para medir perxidos lipdicos son el patrn de oro cuando se trata de probar el papel de los
oxidantes en algn tipo de dao celular.
b. Medicin de la concentracin de antioxidante: se puede realizar por HPLC (cromatografa lquida
de alta resolucin), sobre material biolgico que puede ser plasma, orina o tejido. Para fines
prcticos solo se determinan niveles plasmticos de los antioxidantes siguientes: vitaminas E,
coenzima Q (ubiquinol), glutatin y vitamina C.
c.
Medicin del estado oxidativo: este refleja el balance entre el sistema oxidante y prooxidante y es
beneficioso en muchas enfermedades (Rodrguez y col., 2001).
Existen diversos mtodos para evaluar la actividad antioxidante de manera sencilla y prctica, ya sea in
vitro o in vivo, los cuales se describen a continuacin (Rodrguez y col., 2001; Andresen y col., 2006).
Romay demostr en 1996 que personas con diabetes mellitus tienen concentraciones ms altas de
lipoperxidos, un marcador de dao oxidativo a los lpidos y menor actividad de las enzimas antioxidantes
superxido dismutasa, glutatin peroxidasa y catalasa, asociados con factores prooxidantes tales como
tabaquismo,
ingesta excesiva de alcohol, sedentarismo y nmero reducido de horas de sueo, sin
embargo los resultados no son del todo concluyentes (Rodrguez y col., 2001; Andresen y col., 2006).
2.7.4
Mtodos para determinar la capacidad antioxidante
Una de las estrategias ms aplicadas en las mediciones in vitro de la capacidad antioxidante total de un
compuesto, mezcla o alimento, consiste en determinar la actividad del antioxidante frente a sustancias
cromgenas de naturaleza radical; la prdida de color ocurre de forma proporcional con la concentracin,
estas determinaciones nos dan tan slo una idea aproximada de lo que ocurre in vivo (Kuskoskie y col.,
2005).
Diversos compuestos cromgenos (ABTS, DPPH, DMPD, ABAP, DMPO y FRAP) son utilizados
para determinar la capacidad de los compuestos fenlicos que contienen los frutos para captar los
radicales libres generados, operando as en contra los efectos perjudiciales de los procesos de oxidacin,
que implican a especies reactivas de oxgeno (EROs). Los mtodos ms utilizados son ABTS y DPPH en
donde ambos presentan una buena estabilidad. El DPPH es un radical libre que puede obtenerse
34
directamente sin una preparacin previa y solo puede disolverse en medio orgnico; mientras que el
ABTS tiene que ser generado tras una reaccin que puede ser qumica (dixido de manganeso,
persulfato de potasio, ABAP), enzimtica (peroxidasa, mioglobulina), o eletroqumica y con este se puede
medir la actividad de compuestos de naturaleza hidroflica y lipoflica; el DMPD solo se usa en medio
acuoso. El radical ABTS+
tiene, adems, la ventaja de que su espectro presenta mximos de
absorbancia a 414, 654, 754 y 815 nm en medio alcohlico, mientras que el DPPH presenta un pico de
absorbancia a 515 nm (Kuskoskie y col., 2005).
La capacidad antioxidante del plasma representa el balance antioxidante del organismo y valora tanto los
antioxidantes endgenos como exgenos. Se ha usado como marcador indirecto de la biodisponibilidad
de los antioxidantes presentes en los alimentos en estudios de intervencin, tanto para evaluar el efecto
aislado de un alimento a corto plazo como su influencia mediante su suplementacin en la dieta a largo
plazo.
Ningn compuesto fenlico excede una concentracin de 1 mM en el plasma tras el consumo de 10-100
mg de alimentos con altos contenidos de antioxidantes. Estos niveles tan bajos en el plasma humano
constituyen una dificultad para su identificacin y cuantificacin, ya que la mayora estn por debajo de
los lmites de deteccin de las tcnicas cromatogrficas actuales. Sin embargo, el incremento observado
en la capacidad antioxidante del plasma en los estudios indica que la proporcin absorbida de estos
compuestos s es suficiente para desempear su papel antioxidante y presentar actividad en el
organismo.
Hay autores que ofrecen las concentraciones que resultan efectivas para algunos
compuestos: 0,75 mM para (-)-epigalocatequina, 1,2 mM para cido glico, 0,25-0,38 mM para (-)epicatequina, (+)-catequina, (-)-galato de epicatequina y (-)-galato de epigalocatequina, con respecto a la
inhibicin de la oxidacin de lipoprotenas de baja densidad (LDL) al 50 %. Liu y col. en el 2002 reportaron
que la ingesta diaria de 375 mL de vino tinto durante 2 semanas produjo un aumento significativo de la
capacidad antioxidante del plasma medida con el mtodo TBARs y en la concentracin plasmtica de
compuestos fenlicos y sus metabolitos glucuronidados y metilados. Por otra parte, los compuestos
antioxidantes endgenos (albmina, bilirrubina, cido rico, glutatin) podran influir en la capacidad
antioxidante del plasma, si modifican su concentracin tras el consumo de vino (Fernndez y col., 2006).
Los mtodos ORAC-PE, FRAP, TRAP, ABTS y DPPH miden la capacidad antioxidante del compartimento
hidroflico o acuoso del plasma donde se localizan los compuestos antioxidantes solubles en agua (cido
ascrbico, cido rico y protenas). La actividad antioxidante de los compuestos liposolubles que se
encuentran en las lipoprotenas del plasma, tales como carotenoides y tocoferoles, no influyen en las
medidas realizadas con estos mtodos, y han de estimarse mediante otros ensayos.
Se ha estudiado el porcentaje de contribucin de los distintos compuestos endgenos a la capacidad
antioxidante total del plasma determinada por los mtodos de uso ms frecuente. As, el cido rico (60 y
58 % de contribucin para FRAP y TRAP respectivamente) y la albmina (27,8 y 28 % de contribucin
para ORAC-PE y ABTS respectivamente), son los compuestos que ms contribuyen a la capacidad
antioxidante del plasma (Fernndez y col., 2006).
35
En el estudio de la capacidad antioxidante, se ha reportado el uso del plasma como del suero sanguneo,
sin mostrar diferencias significativas. El suero se obtiene despus de la eliminacin del cogulo de fibrina
de la sangre a temperatura ambiente. La muestra se somete as a una mayor exposicin a la luz, por lo
que posiblemente se pierden antioxidantes que son inestables en tales condiciones. Por otra parte,
durante la agregacin, las plaquetas liberan EROs que pueden disminuir la capacidad antioxidante de la
muestra de suero. Esto hace aconsejable trabajar con muestras de plasma en lugar de suero para evitar
prdidas de compuestos. La determinacin clnica de compuestos endgenos que influyen
potencialmente en la capacidad antioxidante (albmina, bilirrubina, cido rico) se realiza con mayor
frecuencia en muestras de plasma (Fernndez y col., 2006).
36
JUSTIFICACIN
Debido al incremento de la Diabetes no solo en nuestro pas sino en el mundo se deben buscar
alternativas para prevenir y mejorar la calidad de vida de las personas.
Mxico cuenta con una
diversidad de plantas que son empleadas con fines teraputicos entre las cuales se encuentra la Chaya
(Cnidoscolus chayamansa), por lo que es importante contar con estudios cientficos que evalen las
propiedades antioxidantes de esta planta, en un modelo de diabetes experimental inducida qumicamente
en ratas Wistar.
37
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antioxidante de la chaya (Cnidoscolus chayamansa) en un modelo experimental de

ratas diabticas inducidas qumicamente.
4.1
OBJETIVOS ESPECFICOS
Cuantificar los niveles de fenoles y flavonoides en las preparaciones de la hoja de chaya cruda y
cocida empleada para los tratamientos de ratas sanas y diabticas.
Evaluar el efecto subcrnico del t de chaya sobre los niveles de glucosa, perfil lipdico y
parmetros de dao renal en ratas sanas y diabticas.
Evaluar el efecto agudo del t de chaya sobre los niveles de glucosa, perfil lipdico en ratas sanas
y diabticas.
Determinar la capacidad antioxidante mediante las tcnicas TAC, ABTS y FRAP en plasma de
ratas sanas y diabticas tratadas con chaya de forma subcrnica y aguda.
38
MATERIAL Y MTODOS
5.1
Animales
Se utilizaron ratas macho Wistar, provenientes del bioterio del CINVESTAV Mxico, DF. Los animales
fueron sometidos a un periodo de adaptacin de una semana en el bioterio del Posgrado en Tecnologa
de alimentos de la Universidad Autnoma de Quertaro, bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y con
acceso libre a comida y agua.
5.1.1
Induccin de diabetes a ratas Wistar
Los animales se sometieron a un ayuno de 15 horas, se inyect por va intraperitoneal una dosis nica de
de 45 mg estreptozotocina (STZ) por Kg de peso corporal, disuelta en un buffer de citrato al 0.1 M a pH
4.5. Despus de 72 horas, se verificaron los niveles de glucosa en ayuno en los animales. Se
consideraron dentro del grupo experimental de diabetes a los animales que tenan un nivel de glucosa en
sangre en ayuno superior a 180 mg/dL.
5.2
Materiales
Las hojas de chaya (Cnidoscolus chayamansa) fueron colectadas frescas todos los das para su
preparacin en t, licuado o extracto, de un rbol de los jardines de
la Universidad Autnoma de
Quertaro.
a. Preparacin del t: se prepar todos los das en una concentracin del 2% (p:v)en agua, se dej
hirviendo 10 minutos dejando consumir el 10% del volumen total, se afor para llegar al volumen
original con agua fra, se filtr y se mantuvo a temperatura ambiente.
b. Preparacin de extracto: se prepar todos los das a una concentracin de 6% (v:v) en solucin
acuosa sin filtrar, se utiliz un extractor de jugos para las hojas crudas, posteriormente se
disolvieron 60 ml del extracto por cada en 1000 ml de agua.
c.
Preparacin del licuado: se prepar todos los das a una concentracin de 6% (p:v) en agua, se
agregaron 60 g por cada 1000 ml de agua y se licu todo en una licuadora casera y
posteriormente se filtr con coladera de plstico.
d. Reactivos qumicos (ver anexo I).

e. Preparacin de soluciones (Ver anexo II).
5.2.1
Equipo
Para las determinaciones de glucosa, perfil de lpidos y determinacin de capacidad antioxidante se utiliz
un Aparato Versamax
TM
Tunable Absorbance microplate reader Marca Molecular Devices con intervalo
de longitud de onda 340 850 nm y compatibilidad con microplaca de 96 pozos (0,3 ml), utilizando el
softMax Prox como mtodo de anlisis fotomtrico.
39
5.3
5.3.1
Mtodos para determinacin de Capacidad Antioxidante

Mtodo de la Capacidad antioxidante total (TAC) con crocin (Lussignoli y col., 1998)
Este mtodo est basado en la competencia de una reaccin en paralelo, donde el donador de radicales
peroxilo, como el ABAP, inhibe al carotenoide crocin. Al mismo tiempo los antioxidantes inhibidos son
blanqueados al atrapar y neutralizar a los radicales. Este mtodo ha sido empleado para la evaluacin de
la capacidad antioxidante de alimentos y mezclas complejas, pero se modific al efectuar diluciones en
serie para poder determinar la actividad antioxidante en plasma humano (Lussignoli y col., 1999; Kampa y
col., 2002; Pitsavos y col., 2005). Esta tcnica se efecta en microplaca de 96 pozos, con fondo plano,
teniendo un volumen total de 250 l por pozo; se mide la absorbancia a 450 nm.
La capacidad
antioxidante es el inverso de la capacidad de inhibicin al 50% (IC50). Los resultados se expresan en

g/ml o mol/L y se comparan contra los estndares de cido ascrbico, cido rico y Trolox.
Preparacin de soluciones y muestras:
Todas las soluciones y muestras se colocaron en frascos color mbar para que se protegen de la luz y
evitar su degradacin.
Preparacin de soluciones y estndares ver anexo II.
Preparacin de la muestra: Los alimentos plantas deben ser tratados previamente para ser analizados y
se colocan en dos o tres concentraciones, utilizando PBS para disolver la muestra y llegar al volumen
correspondiente, para poder realizar el clculo del % de inhibicin. Para fluidos biolgicos se debe
disolver previamente la muestra, para plasma se toman 35 l de muestra y se disuelven en 200 l de
PBS; de esta solucin se toman varias alcuotas para colocarlas en cada pozo completando a un volumen
de 50 l con PBS (el volumen de las alcuotas vara dependiendo de la actividad antioxidante de la
muestra), todas los estndares y muestras se evalan por triplicado.
Mtodo:
Se colocan 100 l de Crocin 100 M y 50 l de muestra/ estndar/ PBS. La reaccin se inicia con la
adicin de 100 l precalentados de ABAP (6,25 mg/ml) a 37C y se incuba la placa en un horno
humificado por 60 min a 37C, se toma la lectura a tiempo cero y a los 60 min, se calcula la diferencia de
absorbancias.
La absorbancia especfica es calculada por el correspondiente valor del blanco y la actividad antioxidante
como la proporcin (% de inhibicin) = 100*(Abs0-Absmuestra)/ Abs0; donde Abs0 es la diferencia de
absorbancia en ausencia de antioxidantes y Absmuestra es la diferencia de absorbancia en presencia de la
muestra.
Se deben de realizar a la par, las curvas estndar del cido ascrbico y del trolox, los cuales son las
referencias comparativas.
Concentraciones mayores a 6 mg/ml de ABAP se pierde la sensibilidad
(concentracin en placa). En la siguiente tabla se muestra de manera condensada las cantidades que se
deben usar para la tcnica de TAC.
La capacidad antioxidante es TAC= (1/IC50)
40
5.3.2
Crocin (l)
ABAP (l)
Buffer (l)
Muestra/Std (l)
Blanco sin/ABAP
100
150
Blanco con/ABAP
100
100
50
Estndar
100
100
50
Muestra
100
100
50
Mtodo del potencial antioxidante de reduccin del fierro (FRAP; Liu y col., 1982).
Este mtodo se basa en medir la potencia plasmtica de reducir iones frricos, utilizando como agente
cromgeno un complejo colorimtrico de 2,4,6-tripiridil-s-triazinaferroso (TPTZ), el cual da una coloracin
azul verdosa y se leen por espectrofotometra a 595 nm, se determina en microplaca de 96 pozos de
fondo plano con un volumen total por pozo de 200 l. La reaccin se lleva a cabo durante 30 min (Liu y
col., 1982; Benzie y Strain, 1996; Bahr y Basalto, 2004; Gliszczynska Swiglo, 2006).
Para la preparacin de las soluciones ver el anexo II.
Preparacin del estndar:
Se elaboran la curva con soluciones acuosas de FeII en concentraciones entre 1 50 g/ml (FeII
=FeSO47H2O; Riedel-de Haen) para generar la grfica.
Se elaboran soluciones acuosas como estndares con concentracin conocida de cido ascrbico, cido
rico, de 1-15 g/ml. (Se pueden diluir con agua o con solucin buffer acetato), se dejan reposar a
temperatura ambiente durante 30 min y despus se centrifugan por 10 min a 3000 rpm, se toma el
sobrenadante.
Preparacin de la muestra:
Las muestras se diluyen a concentraciones conocidas con buffer de acetato, se dejan reposar por 30 min,
posteriormente se centrifugan por 10 min y se toma el sobrenadante.
El plasma se coloca a una concentracin entre 1 a 5 l disolviendo con buffer de acetato hasta completar
el volumen de 25 l.
El trolox se diluye en etanol o PBS, se preparan concentraciones entre 1- 25 g/ml
Se prepara la microplaca con muestras, blanco y estndares, el reactivo FRAP se entibia a 37C; la
reaccin comienza al agregar la solucin de FRAP.
Para calcular el % de inhibicin se toman los valores de absorbancia a los 30 min ( 595 nm), se expresa
como % de inhibicin = 100*(Abs0-Absmuestra)/ Abs0; donde Abs0 es la absorbancia del blanco, Se calcula
por interpolacin el 50% de inhibicin y se correlaciona contra el 50% de inhibicin del estndar de Fe II.
Se reporta como mg equivalentes de FeSO4 M de FeSO4. En la siguiente tabla se muestra de manera
condensada las cantidades que se deben de usar para la tcnica FRAP.
41
Etanol (l)
5.3.3
Solucin de FRAP (l)
Muestra/Std (l)
Blanco sin/FRAP
200
Blanco con/FRAP
25
175
Estndar
175
25
Muestra
175
25
Mtodo del ABTS (Mariken y col., 2004)
Este mtodo se basa en atrapar aniones de vida larga como el cido 2,2-azino-bis(3etilbenzotiazolin)-6-sulfnico
(ABTS), el cual es generado por la actividad de la peroxidasa de la
metamioglobina en presencia del perxido de hidrgeno y puede detectarse a 734 nm. Al encontrar un
antioxidante en el medio se retarda la formacin del radical libre, resultando en una disminucin de la
absorbancia. En esta tcnica se utiliza al cido (+/-)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman 2 carboxlico
(Trolox), el cual es un anlogo acuoso de la vitamina E. El radical ABTS+ se obtiene tras la reaccin de
ABTS (7 mM en etanol o PBS) con persulfato potsico (2,45 mM en agua) incubados a temperatura
ambiente ( 25C) y en la oscuridad durante 16 horas. Una vez formado el radical ABTS+ se diluye con
etanol o buffer fosfato salino a pH 7.4 (PBS), hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre
0,70 ( 0,1) a 754 nm, queda entre 50 a 70 M. Esta solucin debe utilizarse inmediatamente porque se
degrada rpidamente (Mariken y col., 2004; Kuskoskie y col., 2005; Gliszczynska Swiglo, 2006). La
reaccin se lleva a cabo al agregar el reactivo ABTS, a una temperatura de 30C. Las muestras se filtran
y se disuelven con etanol o PBS.
La placa se debe tapar de la luz durante toda la preparacin. Se disuelve previamente el plasma en PBS
y se toman varias concentraciones de alcuotas para realizar la deteccin, se toma como blanco el etanol.
Se coloca primero el estndar o muestra o blanco y solo hasta que ya se disolvi el ABTS se agrega
rpidamente y se lee inmediatamente por 10 minutos a 734 nm; la lectura final es la que se toma para el
clculo de % de inhibicin = 100*(Abs0-Absmuestra)/ Abs0; donde Abs0 es la absorbancia del blanco. el 50%
de inhibicin se calcula por interpolacin. La capacidad antioxidante es el inverso del 50% de inhibicin.
En la siguiente tabla se muestra de manera condensada las cantidades que se deben de usar para la
tcnica ABTS.
Etanol (l)
ABTS (l)
Buffer/metanol(l)
Muestra/std (l)
Blanco sin/ABTS
230
20 metanol
Blanco con/ABTS
20
230
Estndar
230
20
Muestra
230
20
42
5.3.4
Determinacin de Fenoles totales (Singleton, 1965)
El mtodo espectrofotomtrico emplea el reactivo de Folin y Ciocalteu, para la determinacin de fenoles

totales, se fundamenta en su carcter reductor y es el ms empleado. El reactivo de Folin-Ciocalteu es
una mezcla de cidos fosfowolfrmico y fosfomolbdico en medio bsico, que se reducen al oxidar los
compuestos fenlicos, originando xidos azules de wolframio (W8O23) y molibdeno (Mo8O23). La
absorbancia del color azul se mide a 750 a 760 nm (Kuskoskie y col., 2005). Los resultados se expresan
en mg equivalentes de cido glico por gramo de muestra. Para la evaluacin, las muestras se hicieron
reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteu 1N, carbonato de sodio al 7%, en microplaca de fondo plano,
colocando 200 l por pozo, se incuba a temperatura ambiente por 30 min (Singleton, 1965; Javanmardi y
col., 2003; Tunalier, 2004).
Para realizar la curva estndar con cido glico se adicionan por triplicado en el siguiente orden: l de
cido glico, l de agua HPLC, l de la solucin de Folin y por ltimo el carbonato de sodio al 7%; se
mezclan y se incuba a temperatura ambiente por 30 min y se lee a una longitud de onda de 750 nm. En
la tabla del anexo III se muestra de manera condensada las cantidades que se deben de usar para la
determinacin de fenoles totales.
Para las muestras se deben de preparar previamente las diluciones, colocando en tubos para poder
centrifugar, posteriormente tomar el sobrenadante para colocar en el pozo correspondiente.
Muestra
Muestra (l)
Agua HPLC (l)
Folin 1N (l)
Na2CO3 7% (l)
Blanco
50
25
125
Muestra/std
50
25
125
El contenido de fenoles totales en equivalentes de cido glico se toma con la interpolacin o

extrapolacin de la absorbancia de las muestras a la curva de estndar previamente elaborada de cido
glico. Se expresan en mg equivalentes de cido glico por gramo o ml de muestra.
5.3.5
Determinacin de Flavonoides (Liu y col., 2002)
La determinacin de flavonoides se efecta por el mtodo espectrofotomtrico en microplaca de 96

pozos, fondo plano, a una longitud de onda de 510 nm. Se realiza curva estndar con catequina y los
resultados se reportan como mg equivalentes de catequina por gramo de muestra. Se prepara una
solucin de catequina a 1 mg/ml disuelta en metanol. Se agrega nitrito de sodio al 5%, cloruro de
aluminio al 10% y por ltimo hidrxido de sodio al 1 M. Para preparar la curva estndar de catequina ver
el anexo III.
Las muestras se preparan realizando varias diluciones de acuerdo a la cantidad que tenga de flavonoides.
43
Muestra/blanco
Catequina (l)
Agua HPLC
(l)
NaNO2 (l)
AlCl3 (l)
(l)
NaOH 1 M
Agua HPLC
(l)
(l)
Blanco
50
7,5
15
50
127,5
Muestra
50
7,5
15
50
127,5
El llenado de la placa debe hacerse a resguardo de la luz. Se adicionan en el siguiente orden: muestra/
std, solucin de catequina, agua HPLC y la solucin de NaNO2 al 5%, se deja reposar a temperatura
ambiente por 6 min, posteriormente se adiciona la solucin de AlCl3 al 10% dejando reposar por 5 min,
transcurrido este tiempo se adiciona NaOH 1 M y el agua HPLC correspondiente, se lee inmediatamente,
se deja incubar por 30 min y se lee la absorbancia final.
El contenido de flavonoides en equivalentes de catequina se obtiene extrapolando la absorbancia de las
muestras en la curva de estndar previamente elaborada de catequina. Se expresan en mg equivalentes
de catequina por gramo o ml de muestra.
5.3.6
Determinacin sangunea de Glucosa
La sangre obtenida de la vena caudal de las ratas en ayuno, es depositada en las tiras reactivas (Roche)
especficas para glucosa, y ledas en un glucmetro Accutrend GCT cuyo intervalo de sensibilidad para la
glucosa es 20-600 mg/dL. Al final del estudio las determinaciones se realizaron por medio del kit para
Glucosa de la marca Randox para determinacin por espectrofotometra.
La medicin de la prueba se realiza por bioamperometra, que mide la corriente generada por la reaccin
de la enzima glucosa deshidrogenasa de la tira reactiva al convertir la glucosa de la muestra sangunea
en gluconolactona (Roche Diagnostics).
5.3.7
Determinacin sangunea de Triglicridos
especficas para triglicridos, y ledas en un glucmetro Accutrend GCT cuyo intervalo de sensibilidad es
de 70-600 mg/dL. Al final del estudio las determinaciones se realizaron por medio del kit para Triglicridos
marca Randox para determinacin por espectrofotometra.
Los triglicridos son desdoblados en primer lugar por una esterasa en glicerina y cidos grasos libres. En
dos pasos enzimticos ms se forman de glicerina hidroxiacetonafosfato y perxido de hidrgeno. Este
ltimo oxida, en presencia de peroxidasa, a un indicador en un colorante cuya concentracin es
determinada por fotometra de reflexin.
5.3.8
Determinacin sangunea de Colesterol
especficas para colesterol, y ledas en un glucmetro Accutrend GCT cuyo intervalo de sensibilidad es de
44
150-300 mg/dL. Al final del estudio las determinaciones se realizaron por medio de los kits para colesterol
total y colesterol de alta densidad (HDL) y ledos por espectrofotometra.
5.3.9
Determinacin en orina de Creatinina y Microalbmina
Se recolect de manera individual por espacio de 12 hr y se analiz general de orina (por medio de tiras
reactivas multistix 10 sh, marca Bayer), y microalbmina y creatinina (por medio de tiras reactivas para
Microalbmina en orina, marca Bayer); se leyeron en un analizador Clinitek.
En la relacin de albmina/creatinina, la albmina est presente normalmente en la orina en
concentraciones inferiores a 30 mg de albmina /g de creatinina (3,4 mg de albmina/mmol de creatinina).
La microalbmina se indica con un resultado de la relacin de 30-300 mg/g (3,4 33,9
mg/mmol)(Anormal) y albmina clnica con un resultado de la relacin de >300 mg/g (>33,9
mg/mmol)(Altamente anormal).
Los principios qumicos de estas pruebas se basan para la albmina, en el enlace a colorantes, usando
un colorante de sulfoneftalena de gran afinidad. A un pH constante, el desarrollo de cualquier color azul
se debe a la presencia de albmina. El color resultante va de verde claro a azul aguamarina. Para la
creatinina se basa en la actividad del tipo peroxidasa de un complejo de cobre-creatinina que cataliza la
reaccin del dihidroxiperxido de disopropilbenceno y la 3,3,5, 5-tetrametilbencidina. El color resultante
va de anaranjado a verde o azul.
5.4
Diseo experimental
5.4.1
Composicin proximal, fenoles totales y flavonoides
Se realiz la determinacin bromatolgica, fenoles totales y flavonoides de la hoja de chaya, t, extracto y

licuado en las concentraciones administradas en los tratamientos.
5.4.2
Primera fase (experimento subcrnico)
Las ratas diabticas fueron repartidas en 2 grupos y 1 de sanas:

-
Grupo 1. Diabticas control recibieron agua ad libitum. n=6
Grupo 2. Diabticas tratadas recibieron el t de chaya 2% ad libitum n=7
Grupo 3. Sanas tratadas recibieron el t de chaya 2% ad libitum. n= 6
Todos los grupos recibieron el tratamiento 7 semanas. Cada semana se registro el control de peso
corporal, consumo de alimento y lquido; as como niveles sanguneos de glucosa, colesterol y
triglicridos en ayuno. Las muestras de sangre en ayuno para el control semanal, fueron tomadas de la
vena caudal, y depositadas para su anlisis en un glucmetro triple (GCT- Roche).
Al final de las 7 semanas, todas las ratas fueron sacrificadas bajo anestesia con ter, la sangre fue
tomada por puncin cardiaca, depositadas en tubos para la separacin del suero y plasma; y este fue
congelado a -20C (en varias alcuotas) hasta el anlisis de glucosa, colesterol, triglicridos y
antioxidantes.
45
5.4.3
Segunda fase (experimento subcrnico)
Las ratas fueron repartidas en 6 grupos, cada grupo formado por 7 animales:
-
Grupo 1. Diabticas control, recibieron agua ad libitum.
Grupo 2. Diabticas tratadas, recibieron el t de chaya 2% ad libitum
Grupo 3. Diabticas tratadas, recibieron complejo vitamnico especial para diabticos de nombre
Diabon (150 mg/kg de peso corporal (PC)).
Grupo 4. Sanas control, recibieron agua ad libitum.
Grupo 5. Sanas tratadas recibieron el t de chaya 2% ad libitum.
Grupo 6. Sanas tratadas recibieron complejo vitamnico especial para diabticos (150 mg/kg de
peso corporal (PC)).
Todos los grupos recibieron el tratamiento por 7 semanas. En cada semana se registro el control de peso
corporal, consumo de alimento y lquido; as como niveles sanguneos de glucosa en ayuno. Se verific
colesterol y triglicridos por medio de tiras reactivas en la semana 4. Las muestras de sangre para
control semanal fueron tomadas de la vena caudal, y depositadas para su anlisis en un glucmetro triple
(GCT- Roche).
Al final de las 7 semanas, todas las ratas fueron sacrificadas bajo anestesia con ter, la sangre fue
tomada por puncin cardiaca, depositadas en tubos para la separacin del suero y plasma; y este
antioxidantes. Se colect la orina de 12 hr antes del sacrificio para la determinacin del examen general
de orina, microalbmina y creatinina.
De las muestras de plasma se determin por tres tcnicas la capacidad antioxidante de los tratamientos
(TAC por crocin, ABTS y FRAP) en el lector de microplaca.
5.4.4
5.4.4.1
Tercera fase (experimento agudo)

Determinacin de curvas hipoglucmicas
Se evalu el efecto de diferentes preparaciones y concentraciones (2, 6, 10 %) de t (hoja cocida), del

extracto de la hoja fresca de chaya y del licuado de hoja fresca de chaya, sobre la actividad
hipoglucemiante, para definir la concentracin ptima para la administracin ad libitum del tratamiento
agudo de 11 das.
Cada grupo de ratas sanas o diabticas se dej en ayuno de 8 horas, posteriormente por medio de una
cnula se le administra; por va intragstrica, la preparacin (agua, t, licuado o extracto); a diferentes
dosis se tom muestra de sangre de la vena caudal para medir la glucosa en intervalos de tiempo (0, 30,
90, 150, 210, 270 y 330 min).
46
5.4.4.2
Tratamiento agudo
Se determinan las dosis ptimas para la administracin de la preparacin de la hoja de chaya del estudio
agudo. Se determino una preparacin de licuado al 6% (p:v) de hoja de chaya cruda y de extracto al 6%
(v:v) de hoja de chaya, para el estudio agudo ad libitum por 11 das.
Las ratas fueron repartidas en 4 grupos, 2 grupos de diabticas y 2 grupos de sanas con 7 animales por
cada grupo:
-
Grupo 1. Diabticas tratadas, recibieron el licuado al 6%.
Grupo 2. Diabticas tratadas, recibieron extracto acuoso al 6%.
Grupo 3. Sanas control, recibieron el licuado al 6%.
Grupo 4. Sanas tratadas recibieron extracto acuoso al 6%.
Se registr el control de consumo de alimento y lquido diariamente; el peso corporal y los niveles
sanguneos de glucosa en ayuno, al inicio, mitad y final del experimento por medio de la vena caudal.
Al final de los 11 das, todas las ratas fueron sacrificadas bajo anestesia con ter, la sangre fue tomada
por puncin cardiaca, se coloc en tubos para la separacin del suero y plasma; y este fue guardado y
antioxidantes. Se colect la orina de 12 horas antes del sacrificio para la determinacin del examen
general de orina, microalbmina y creatinina.
De las muestras de plasma se determin la capacidad antioxidante de los tratamientos por tres tcnicas
(TAC por crocin, ABTS y FRAP) en el lector de microplaca.
5.5
Anlisis estadstico
Los resultados son expresados como la media desviacin estndar. Los datos fueron analizados
usando el anlisis de varianza (ANOVA) por los mtodos de Tukey, Dunnet, Dunns y Holm Sidak, segn
corresponda. Se realizaron las correlaciones lineales para determinar la influencia de las variables en los
tratamientos por el mtodo de correlaciones lineales de Pearson.
Se utilizaron los paquetes estadsticos de Sigma Stat 3,5 para Windows versin 2006 y Minitab 15.
47
6
6.1
RESULTADOS Y DISCUSION
Composicin proximal, fenoles totales y flavonoides
En la Tabla 5 se muestran los resultados obtenidos del anlisis efectuado a la hoja de chaya, extracto de
hoja fresca diluido con agua al 6% y del t preparado con hoja fresca al 6%, en el cual se puede ver que
el contenido nutrimental es mayor en la hoja cruda. Resultados similares fueron obtenidos por Kuti y col.
en 1996, con respecto a protenas, grasas, humedad y fibra, el resto de los componentes no fueron
reportados por estos autores, los cuales adems demostraron que la chaya nutrimentalmente es superior
a la espinaca, especficamente en cuanto a su contenido de protena, calcio, potasio, hierro y cido
ascrbico, este ltimo en un 400%. De manera similar en el estudio efectuado por Ventura en el 2004 en
donde se compararon tres isotipos de chaya; ambos estudios mostraron valores de 17 +/- 1 mg/100 g de
chaya para la Vitamina C.
Tabla 5 Composicin nutrimental de la hoja de chaya
DETERMINACION
HOJA
EXTRACTO 6%
TE 6%
Carbohidratos (%)
10.42
0.22
0.19
Cenizas (%)
1.69
0.03
0.03
Fibra cruda (%)
1.37
Grasas (%)
0.59
0.09
0.05
Humedad (%)
79.12
99.47
99.64
Protena (%)
6.80
0.19
0.09
74.22
2.48
1.95
115.86 mg/kg
11.88 mg/L
5.19 mg/L
Contenido energtico
Kcal/100g
Sodio
Para la determinacin de fenoles totales se utiliz la curva estndar del cido glico (ver anexo III), de la
cual se obtuvo la ecuacin lineal que es y= 0,0279x + 0,049, la cual tiene una correlacin de 0,99; estos
datos se tomaron como base para realizar los clculos para la determinacin de fenoles totales en las
muestras de chaya en diferentes preparaciones del presente estudio (ver Tabla 6).
Podemos observar que en el contenido de fenoles totales se obtuvo un valor mayor en la muestra de
extracto que en la de licuado, siendo de 94 y 52 mg equivalentes de cido glico (mg eq a. glico)/ g de
chaya respectivamente, mientras que el ms bajo se obtuvo en el t siendo este de 5,5 mg eq a. glico.
Ventura report en 2004 para extracto acuoso 31 1,6 mg eq a. glico/g de chaya, para tejido fresco 87
2,1 mg eq a. glico/g de chaya y para el tejido liofilizado 149 9,2 mg eq de a, glico; resultados de la
isoforma 3 de la chaya, que es la que se utiliz en este estudio, y 12 mg eq a. glico para la espinaca ( en
extracto acuoso), podemos ver que los resultados obtenidos en la hoja de chaya son superiores que para
la espinaca, alimento considerado nutracutico.
48
Tabla 6 Concentracin de fenoles totales y flavonoides en la hoja, extracto y licuado de chaya
Extracto
T
Licuado
FENOLES
Mg eq cido glico/gr Chayaa
94 0.03**
5.5 0.02*
52 0.28***
FLAVONOIDES
mg eq catequina/gr Chayaa
3,4 0.52*
0,14 0.05*
2,2 0.89**
Prueba T de Student *P=0,02, **P=0,1, ***P=0,2

Hoja fresca de chaya
Para la determinacin de flavonoides se realiz la curva estndar de catequina, la cual la podemos ver en
el anexo III, con la ecuacin lineal y=0,00627x + 0,0711 y con una correlacin de 0,9955, tomando la
ecuacin para calcular el contenido de flavonoides reportados en mg equivalentes de catequina. Los
resultados se encuentran en la tabla 6, donde se puede observar que el contenido de flavonoides es de
3,4 mg equivalentes de catequina / g de chaya para la muestra de extracto puro de chaya, que es mayor
a lo reportado por Ventura, 2004 de 1,5 mg eq de catequina/g de espinaca, pero se tienen diferentes
valores dependiendo del estado de madurez de la hoja. En el caso del t de chaya se tiene un valor de
hay 0,14 mg eq de Catequina lo cual puede ser debido a un efecto de degradacin por efecto de la
coccin.
El contenido de fenoles y flavonoides, as como de las vitaminas C y E hacen de la chaya un alimento rico
en compuestos antioxidantes cuya ingesta puede considerarse adecuada para neutralizar los radicales
libres de las especies reactivas de oxgeno generadas en los procesos patolgicos como la diabetes.
Consecuentemente existe un inters en conocer los mecanismos de proteccin antioxidante contra el
dao inducido por los radicales libres, por lo que el plasma o suero son utilizados como un modelo para
estudiar el dao inducido por radicales libres (Avello y Suwaski, 2005, 2006; Atalay y Laaksonen, 2002 y
Andersen y col., 2006).
6.2
Primera fase del experimento subcrnico
Durante las 7 semanas del estudio, con la administracin del t de chaya al 2% el consumo promedio de
alimento, en el grupo de ratas sanas que recibieron el t de chaya, se mantuvo constante (297
g/da/rata), durante las 7 semanas del estudio. Por el contrario, las ratas diabticas tratadas con agua y
chaya aumentaron hasta el 25% y 35% respectivamente su propio consumo, al final del experimento
(Grfica 1
Consumo de alimento de ratas sanas y diabticas tratadas con t de chaya durante el
experimento subcrnico.Grfica 1). Sin embargo el tratamiento del t de chaya no muestra ningn efecto
sobre esta manifestacin (polifagia), lo cual nos indica que posiblemente no se este controlando la
sintomatologa caracterstica de la enfermedad.
49
A lim ento (g/da/rata)
SC
DC
DA
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
Tiempo (semanas)
Grfica 1 Consumo de alimento de ratas sanas y diabticas tratadas con t de chaya durante el
experimento subcrnico.
SC= Sana con t de chaya, DC= Diabtica con t de chaya, DA= Diabtica con agua.
Los valores son presentados como la media DE, n = 6-7
* No existen diferencias estadsticas con p<0,05 y =0,05 por la prueba de Tukey
La ingesta promedio de lquido, en el grupo de ratas sanas que recibieron el t de chaya fue constante
(36 8 ml/da/rata), durante las 7 semanas del estudio. A diferencia de las ratas diabticas que desde el
inicio de su hiperglicemia el consumo del lquido es marcadamente superior y se mantiene arriba durante
todo el estudio. Para las diabticas que recibieron el t la ingesta al inicio y al final fue de 162 67 a 234
50 ml/da y para las diabticas que recibieron agua el consumo fue de 213 82 a 328 78 ml/da (ver
Grfica 2). Significando un aumento al final del estudio de 6.6 y 9.3 veces respectivamente, en relacin al
grupo control de ratas sanas. Lo que nos muestran estos resultados es que el tratamiento con t de
chaya no tiene efecto significativo en la ingesta de lquido.
50
SC
DC
DA
Lquido (ml/da/rata)
500
400
*
300
*
200
100
0
1
3
4
Tiempo (semanas)
Grfica 2 Consumo de lquido de ratas sanas y diabticas tratadas con t de chaya durante el
En la Grfica 3 se puede observar que los niveles de glucosa no bajaron de forma significativa durante el
tratamiento de t de chaya. Diversos estudios se han realizado con respecto al efecto hipoglucmico y
antioxidante de plantas mexicanas que son usadas en tratamientos alternativos para la diabetes.
Hernndez y col. en el 2002 realizaron una recopilacin de informacin acerca de 269 plantas originarias
de Mxico a las cuales se les atribuyen propiedades hipoglucemiantes dentro de estas se encuentra la
Chaya, aunque falta informacin sobre cual es el mecanismo de accin que se ejerce en el organismo
para que se tengan efectos favorables. Por eso es importante que los resultados obtenidos en este
estudio ayuden a entender mejor que es lo que puede ayudar a aminorar las complicaciones de la
enfermedad.
Vergara en el 2005 encontr que no haba efecto hipoglucemiante en el t de chaya an
con la combinacin de un frmaco en el experimento subcrnico de 7 semanas, lo cual se esta

confirmando con los resultados obtenidos.
51
Glucosa (mg/dl)
SC
DC
DA
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
*
*
3
4
5
Tiempo (semanas)
Grfica 3 Concentracin de Glucosa de ratas sanas y diabticas tratadas con t de chaya durante el
Sin embargo se debe mencionar que durante esta primera fase del experimento 2 ratas diabticas
murieron; la primera muerta a las 3 semanas del estudio, perteneca al grupo de diabticas con agua; la
segunda muerta a las 6 semanas correspondiente al grupo diabtica tratada con t de chaya; esto puede
ser atribuido a las complicaciones derivadas por la enfermedad.
La
52
Tabla 7 muestra las correlaciones entre los tres grupos, considerando la relacin que existe entre el peso,
glucosa, triglicridos, microalbmina y creatinina por el mtodo de Pearson.
Considerando las
correlaciones mayores de 0,8 tenemos las variables que manifiestan ms influencia entre si.
53
Tabla 7 Correlaciones entre grupos de diabticas con t de chaya, diabticas agua y sanas con t de chaya
PDC
PDA
PDC
PDA
PSC
GSC
GDC
GDA
TSC
TDC
TDA
MDC
MDA
MSC
CreDC
CreDA
CreSC
0,964
-0,987
-0,048
-0,702
-0,676
0,629
0,734
0,184
0,266
0,749
-0,806
0,655
0,646
-0,299
-0,981
-0,005
-0,569
-0,546
0,824
0,831
0,416
0,443
0,618
-0,529
0,638
0,859
-0,029
-0,028
0,658
0,653
-0,755
-0,854
-0,384
-0,404
-0,783
0,66
-0,728
-0,772
0,119
0,283
0,0574
0,188
0,307
0,0694
-0,477
-0,078
-0,269
-0,282
-0,049
-0,455
0,94
-0,036
-0,127
-0,004
-0,343
-0,361
-0,391
-0,35
0,165
-0,495
-0,074
-0,341
-0,044
-0,136
-0,543
-0,022
-0,382
0,163
-0,153
0,842
0,729
0,488
0,381
-0,102
0,474
0,862
0,254
0,589
0,25
0,685
-0,564
0,575
0,66
-0,153
0,849
0,674
0,0441
0,822
0,95
0,588
0,588
0,292
0,833
0,818
0,827
-0,464
0,934
0,6
0,139
-0,223
-0,077
0,777
0,778
0,43
0,481
PSC
GSC
GDC
GDA
TSC
TDC
TDA
MDC
MDA
MSC
CreDC
CreDA
CreSC
PDC= Peso diabtica con t de chaya, PDA= Peso diabtica con agua, GDC= Glucosa diabtica con t de chaya, GDA= Glucosa
diabtica con agua, GSC= Glucosa sana con t de chaya, TDC= Triglicridos diabtica con t de chaya, TDA= Triglicridos
diabtica con agua, TSC= Triglicridos sana con t de chaya, MDC= Microalbmina diabtica con t de chaya, MDA= Microalbmina
diabtica con agua, MSC= Microalbmina sana con t de chaya, CreDC= Creatinina diabtica con t de chaya, CreDA= Creatinina
diabtica con agua, CreSC= Creatinina sana con t de chaya.
En la Grfica 4 se puede observar que los niveles de triglicridos sanguneos en las ratas diabticas que
recibieron el t de chaya mostraron una disminucin del 40% comparado con el 28% del grupo de ratas
diabticas que solo recibi agua y las ratas sanas normoglicmicas tratadas con chaya tambin
mostraron una reduccin del 30%. Sin embargo los resultados no son estadsticamente significativos
(P=0,430), por otro lado, los niveles de colesterol (datos no mostrados) no resultaron modificados en
ninguno de los grupos estudiados. Lo que indica que el tratamiento con t de chaya no tiene efecto en
disminuir los niveles lipdicos en ratas diabticas.
SC
% Triglicridos
60
DC
DA
40
20
0
-20
-40
-60
Tiempo (semanas)
Grfica 4 Cambio en los niveles de triglicridos sanguneos, en las ratas diabticas tratadas con t de
chaya y agua durante el experimento subcrnico.
No existen diferencias estadsticas con p<0,05 y =0,05 por la prueba de Tukey
54
De acuerdo a investigaciones realizadas por Iglesias y col., 2003, la hiperglicemia de la diabetes puede
ser la causa de las complicaciones diabticas, debido a la alta concentracin de glucosa en la orina la
cual es fundamental para el desarrollo de la nefropata, esto aparece cuando la concentracin plasmtica
es elevada y la cantidad de glucosa filtrada a travs de los glomrulos excede la capacidad mxima de
resorcin de los tbulos renales.
Se puede observar en la Grfica 5 el volumen de orina acumulada durante un perodo de 12 hr, en esta
etapa del experimento se tiene una correlacin entre los grupos diabticos de chaya y agua del 0,984,
con =0,05 no encontrndose una diferencia significativa entre los grupos.
SC
DC
DA
60
50
ml de Orina
40
30
20
*
*
10
0
-10
Tiem po (sem anas)
Grfica 5 Volumen (ml) de orina en 12 horas de las ratas diabticas y sanas, tratadas con t de chaya y
agua.
El marcador clnico ms temprano de la enfermedad renal diabtica es la microalbuminuria, definida como
presencia en la orina de 20 a 200 microgramos por minuto 30 a 300 miligramos por 24 hr de la protena
ms abundante en sangre, la albmina, problema que va acompaado de un aumento en la prdida de
agua por el efecto osmtico de la glucosa.
Al realizar las determinaciones de los niveles de microalbmina de manera semanal se encontr que en
las ratas diabticas con t de chaya (DC) y diabticas con agua (DA) fueron >30 mg/dL, valores que
indican dao renal y factor de riesgo de enfermedad cardiovascular, sin embargo, para el grupo de DC los
niveles fueron menores (50%) que los DA al final del experimento (Grfica 6). Estos resultados fueron
correlacionados con los niveles de creatinina (Grfica 7), obteniendo que para el grupo de diabticas con
chaya hay un coeficiente de correlacin de 0.8330; en el caso de las diabticas con agua es de 0.60; y
para las ratas sanas con chaya el coeficiente es de 0.777. En los dos casos de tratamiento con t de
chaya vemos que estn relacionados la microalbmina y la creatinina lo cual nos indica un posible dao
renal.
55
SC
DC
DA
Tiempo (semanas)
5
4
3
2
1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Microalbmina (mg/dL)
Grfica 6 Cambio en los niveles de microalbmina en orina, de las ratas diabticas y sanas tratadas con
t de chaya y agua durante el experimento subcrnico.
SC
DC
DA
C reatinina (m g/dL)
120
100
80
60
40
20
0
1
Tiempo (semanas)
Grfica 7 Cambio en los niveles de creatinina en la orina, de las ratas diabticas y sanas tratadas con t
de chaya y agua durante el experimento subcrnico.
Con los resultados obtenidos se tiene un posible dao renal, el comparativo entre los tratamientos no
presenta diferencias significativas entre los grupos de ratas diabticas.
56
6.3
Segunda fase experimento subcrnico
En esta fase experimental se indujo la diabetes con STZ a tres grupos de rata, el consumo de alimento se
mantuvo constante en un 50 10 g a lo largo del experimento y para las ratas sanas se mantuvo en 27
6 g, existe un decremento de 23 g en el consumo de alimento entre las ratas sanas y las diabticas. En lo
que respecta al consumo de lquido, tambin se puede apreciar un decremento al final del experimento
con respecto al consumo al inicio de esta fase subcrnica, en donde las ratas diabticas disminuyeron en
promedio 55 ml para los grupos de diabticas con agua y diabticas con t de chaya y siendo mayor para
el grupo de diabticas con antioxidantes en donde hubo un decremento de 75 ml como se puede ver en la
Grfica 8, debido a los resultados no se encontraron diferencias estadsticas que sean significativas. Esto
nos refiere a una de las manifestaciones clnicas de esta patologa como es la polifagia y la polidipsia la
cual es muy severa al inicio de la enfermedad (Figueroa, 1997; Dorantes, 2002 y Bentez, 2006); y en
este estudio se atena a lo largo del tiempo especialmente para los grupos que reciben el complejo
antioxidante y la chaya.
SA
SAOx
SC
DA
DAOx
DC
L q u id o (m l/d a/rata)
300
250
200
150
100
50
0
1
Tiempo (semanas)
Grfica 8 Consumo de lquido de ratas sanas y diabticas tratadas con t de chaya, antioxidante y agua.
SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con t de chaya, DA= Diabtica con agua,
DAOx= Diabtica con antioxidantes, DC= Diabtica con t de chaya.
Los valores son presentados como la media DE, n = 7
No existen diferencias estadsticas entre los grupos con misma letra (a,b), p<0,05 y =0,05 por la prueba
de Tukey
La polifagia evaluada por el consumo de alimento se observ ms en el grupo de las ratas diabticas que
slo recibieron agua que en las que recibieron el t de chaya, el cual se increment el 90 y 53% con
respecto al grupo de ratas sanas. Este incremento en el consumo de alimento no se reflej en el peso
corporal de estos grupos.
57
En lo que respecta a los niveles de glucosa sangunea a lo largo del experimento no se encontr efecto
hipoglucemiante en el tratamiento ni con t de chaya, ni antioxidante para las ratas diabticas, para las
ratas sanas no hay variaciones en los niveles de glucosa sangunea (ver Grfica 9), esto comprueba los
resultados obtenidos en la primer fase experimental subcrnica as como lo efectuado por Vergara en el
2005 en donde se evalu el efecto hipoglucemiante del t de chaya. Pero de acuerdo a lo reportado por
Kuti y col. en el 1996, en donde se observo que el t de chaya presentaba un efecto hipoglucemiante en
conejo en un experimento agudo de 6 hr, esto puede indicar que puede ser una variable la especie,
adems de que en administracin aguda puede ayudar posiblemente..
SA
SAOx
SC
DA
DAOx
DC
500
Glucosa (mg/dL)
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
1
Tiempo (semanas)
Grfica 9 Niveles de glucosa sangunea en las ratas diabticas y sanas tratadas con t de chaya,
antioxidante y agua.
No existen diferencias estadsticas entre los grupos de las mismas letras y con p<0,05 y =0,05 por la
prueba de Tukey
En la Tabla 8 podemos observar las correlaciones entre los tratamientos, en donde se puede observar
cuales son las variables y tratamientos que estn presentan una relacin.
58
Tabla 8 Correlacin entre glucosa, peso corporal, triglicridos, colesterol total y colesterol de alta densidad
GSAO
x
GSC
GSAO
x
GSA
GDAO
x
GDC
GDA
PDC
PDAO
x
PDA
PSC
PSAO
x
PSA
TDC
TDA
0,74
1
GS
A
0,8
GDAO
x
GDC
GDA
-0,139
0,204
0,408
PDC
0,12
PDAO
x
PDA
PSC
-0,228
0,229
0,089
PSAO
x
TDC
TDA
-0,17
0,763
0,213
TDAO
x
TSC
TSA
-0,197
0,805
0,316
0,086
TSAO
x
CDA
-0,070
0,053
CDC
CSC
CSAO
x
HDLD
C
HDL
DA
HDL
DAOx
HDL
SC
HDL
SA
HDL
SAOx
0,559
-0,433
-0,953
-0,362
-0,433
-0,892
-0,404
0,231
0,295
0,78
0,176
0,234
0,078
-0,274
0,268
0,29
0,239
0,683
0,086
-0,024
0,784
-0,424
0,202
0,752
-0,423
-0,28
0,102
-0,117
-0,88
-0,39
0,121
-0,794
-0,361
0,0007
0,139
0,051
0,238
-0,264
0,274
0,191
0,183
0,097
6
0,707
0,322
-0,208
0,699
0,284
-0,129
0,088
0,846
-0,346
0,241
0,408
-0,389
-0,977
-0,193
-0,491
-0,858
-0,346
0,247
0,513
0,82
0,795
-0,879
0,897
0,907
0,889
0,909
0,178
0,443
-0,373
0,637
0,685
0,487
0,542
0,235
0,263
0,649
0,872
0,429
0,0788
-0,511
0,492
-0,237
-0,79
0,087
0,661
0,051
-0,369
0,367
0,706
0,712
0,695
-0,45
0,691
-0,379
0,255
0,268
-0,388
0,624
0,238
0,0593
0,459
0,102
0,629
0,0228
-0,323
0,477
0,46
0,186
0,895
0,476
-0,649
0,648
0,85
0,839
0,846
0,171
0,227
-0,298
0,116
0,525
0,666
0,499
0,162
0,326
0,446
0,407
0,369
0,525
-0,149
0,319
0,278
-0,391
-0,00737
0,727
0,756
0,521
-0,48
0,509
0,103
0,498
0,343
0,508
0,599
-0,485
0,555
0,124
-0,332
0,604
0,817
-0,337
-0,226
0,58
-0,452
0,149
0,73
0,0401
0,996
0,845
-0,793
0,804
0,463
0,179
0,646
0,832
0,859
-0,54
-0,51
0,593
-0,271
0,76
0,906
-0,245
0,309
0,474
-0,0798
0,506
0,887
-0,239
0,849
-0,802
0,807
0,455
0,224
0,623
0,842
0,845
-0,512
0,516
0,581
-0,272
0,76
0,933
-0,266
0,295
0,505
-0,135
0,514
0,904
-0,222
0,994
0,989
-0,27
0,31
-0,576
-0,87
0,692
0,337
0,386
0,385
0,385
0,584
0,876
0,632
-0,29
-0,262
0,323
-0,394
-0,756
0,358
0,992
-0,2
0,317
-0,518
0,894
0,653
0,271
0,386
0,327
0,4
0,564
0,904
0,702
-0,316
-0,197
0,373
-0,436
-0,746
0,33
0,847
0,368
0,579
0,897
-0,17
0,312
-0,477
0,325
0,511
-0,182
TDAO
x
TSC
TSA
TSAO
x
CDA
CDC
CDAO
x
CSA
CSC
-0,67
0,333
0,42
0,163
0,196
0,311
-0,396
0,379
0,416
0,065
0,813
0,498
0,0969
0,001
0,595
0,619
0,0243
-0,13
-0,92
-0,769
0,814
0,427
0,857
0,259
0,29
-0,387
CSA
0,305
0,871
CDAO
x
0,126
-0,123
PSA
0,526
0,677
-0,23
-0,205
0,379
-0,379
-0,739
0,297
0,064
0,679
0,683
0,0718
0,371
0,292
-0,731
0,352
0,488
0,198
0,531
0,262
-0,69
0,878
0,404
0,0187
0,525
-0,552
0,301
0,492
-0,574
0,592
0,133
0,228
0,32
0,492
-0,696
-0,599
0,519
0,837
-0,384
0,706
0,648
-0,0197
0,699
0,81
-0,497
-0,414
0,969
0,827
0,0431
0,324
0,121
0,36
0,704
0,906
0,188
0,835
0,049
0,207
0,768
0,414
-0,357
0,275
-0,0361
-0,366
-0,171
-0,502
-0,507
0,121
0,434
0,115
-0,192
-0,487
-0,701
-0,694
-0,216
0,612
-0,152
0,0697
0,121
-0,91
0,296
-0,838
-0,503
-0,277
-0,661
-0,525
0,587
0,394
-0,87
0,733
-0,31
0,489
-0,106
-0,789
-0,382
-0,0227
0,82
0,102
0,243
0,0751
0,284
0,73
0,907
0,391
-0,146
0,342
0,692
-0,149
0,68
0,98
-0,0149
0,931
0,416
0,0863
0,012
8
0,597
GDC= Glucosa diabtica con t, GDAOx= Glucosa diabtica con AOx, GDA= Glucosa diabtica con agua, GSC= Glucosa sana con t, GSAOx= Glucosa sana con AOx, GSA=
Glucosa sana con agua; PDC= Peso diabtica con t, PDAOx= Peso diabtica con AOx, PDA= Peso diabtica con agua, PSC= Peso sana con t, PSAOx= Peso sana con AOx,
PSA= Peso sana con agua; TDC= Triglicridos diabtica con t, TDAOx= Triglicridos diabtica con AOx, TDA= Triglicridos diabtica con agua, TSC= Triglicridos sana con t,
TSAOx= Triglicridos sana con AOx, TSA= Triglicridos sana con agua; CDC= Colesterol diabtica con t, CDAOx= Colesterol diabtica con AOx, CDA= Colesterol diabtica con
agua, CSC= Colesterol sana con t, CSAOx= Colesterol sana con AOx, CSA= Colesterol sana con agua; HDLDC= Colesterol de alta densidad diabtica con t, HDLDAOx= Colesterol
de alta densidad diabtica con AOx, HDLDA= Colesterol de alta densidad diabtica con agua, HDLSC= Colesterol de alta densidad sana con t, HDLSAOx= Colesterol de alta
densidad sana con AOx, HDLSA= Colesterol de alta densidad sana con agua.
59
Al analizar la concentracin de glucosa en suero al final del experimento, las diabticas con t de chaya
tuvieron un valor de 373,43 53,44 mg/dL, el grupo de diabticas con agua de 360,67 31,36 mg/dL,
diabticas con antioxidantes (AOx) de 442,29 63,89 mg/dL, para los grupos de ratas sanas se tiene que
la sanas con agua tienen un valor de glucosa de 100,8 9,45 mg/dL, las sanas con chaya de 109 11,02
mg/dL y las sanas con AOx de 100,7 6,32 mg/dL. No se encontr diferencia estadstica significativa
entre los dos grupos de diabticas con agua y chaya, pero con respecto a las sanas se tiene una
diferencia significativa (ver Grfica 10).
600
b
Glucosa (mg/dL)
500
400
300
200
100
0
SA
SAOx
SC
DA
DAOx
DC
Tratamientos
Grfica 10 Concentracin de Glucosa sangunea al final del experimento en ratas sanas y diabticas
tratadas con agua, antioxidante y t de chaya, durante 49 das.
No existen diferencias estadsticas entre grupos de letras iguales (a, b), pero si entre los grupos de letras
diferentes (a,b) por la prueba de Tukey con p<0,05 y =0,05
En triglicridos para las diabticas con t de chaya tenemos un valor de 211,83 37,67 mg/dL, las
diabticas con agua 183,47 30,74 mg/dL y diabticas con AOx 188,18 30,19 mg/dL, para los grupos
de sanas se obtuvieron valores de 135,88 17,62 mg/dL para sana con t de chaya, 135 25,21 mg/dL
para sanas con agua y 139,17 10,62 mg/dL sanas con AOx; en todos los grupos de diabticas se tienen
valores por arriba del valor mximo que es de 150 mg/dL (ver Grfica 11). Con respecto al anlisis
estadstico no hay diferencias significativas entre los grupos diabticas, solamente se puede observar
diferencias significativas de las diabticas con respecto a las ratas sanas.
60
300
T rig licrid o s (m g /d L )
250
200
150
100
50
0
SA
SAOx
SC
1
DA
DAOx
DC
Tratamientos
Grfica 11 Concentracin de Triglicridos al final del experimento en ratas sanas y diabticas tratadas
con agua, antioxidantes y t de chaya, durante 49 das.
diferentes (a,b) con p<0,05 y =0,05 por la prueba de Holm Sidak
En la Grfica 12 se muestra el comparativo de las concentraciones de colesterol total, para el grupo de
diabticas con t de chaya se tiene 106,81 12,75 mg/dL, en el grupo de diabticas con agua de 106,95
7,66 mg/dL, diabticas con AOx de 108,52 26,49 mg/dL presentado una gran variabilidad en los
datos, para los grupos de sanas se obtuvieron para sanas con t de chaya 79,89 5,31 mg/dL, sanas con
agua de 78,76 4,16 mg/dL y sanas con AOx de 80,63 8,18 mg/dL. No se encontraron diferencias
estadsticamente significativas entre los grupos de diabticas y sanas.
61
160
Colesterol (mg/dL)
140
120
100
80
SAOx
SC
60
40
20
0
SA
DA
DAOx
DC
Tratam ientos
Grfica 12 Concentracin de Colesterol al final del experimento en ratas sanas y diabticas tratadas con
agua, antioxidantes y t de chaya, durante 49 das.
diferentes (a,b) con p<0,05 y =0,05 por la prueba de Tukey
En la Grfica 13 podemos observar el comparativo correspondiente a la concentracin de colesterol de
alta densidad, se considera un parmetro aceptable a valores mayores a 45 mg/dL; para el grupo de
diabticas con t de chaya se tiene un valor de 52,41 3,7 mg/dL, en diabticas con AOx 53,01 4,05
mg/dL y para las diabticas con agua 57,80 12,32 mg/dL; en los grupos de sanas los valores son para
las sanas con t de chaya 77,47 2,78 mg/dL, sanas con AOx 78,28 4,35 mg/dL y sanas con agua de
67,52 9,63 mg/dL, todos los valores tanto para diabticas como para sanas se encuentran dentro de los
parmetros establecidos. No hay diferencias estadsticas significativas entre los tratamientos ni entre los
grupos de ratas sanas ni diabticas.
62
90
Colesterol HDL ( mg/dL)
80
70
a
b
60
50
40
30
20
10
0
SA
SAOx
SC
DA
DAOx
DC
Tratamientos
Grfica 13 Concentracin de Colesterol de alta densidad (HDL) al final del experimento en ratas sanas y
diabticas tratadas con agua, antioxidantes y t de chaya, durante 49 das.
diferentes (a,b) con p<0,05 y =0,05 por la prueba de Holm Sidak.
Las manifestaciones clnicas que caracterizan la existencia de la diabetes en humanos como
hiperglicemia, prdida de peso, polifagia, poliuria, polidipsia, se presentaron de forma similar en el modelo
experimental con STZ en ratas, como lo reportan Ravi y col., 2004. En relacin a la prdida de peso,
nuestros resultados mostraron una disminucin del 15-25% similar a lo encontrado en otros reportes
(Ravi y col., 2004; Madar Z., 1983), siendo la prdida de peso relativamente menor (15%) aunque no
significativa para el grupo que recibi el t de chaya.
Analizando los datos en conjunto podemos ver que para el grupo de sanas con t de chaya hay una
correlacin entre la glucosa y los triglicridos del -0,805 y entre glucosa y HDL de -0,892, el peso tiene
una correlacin del -0,87 con respecto a los triglicridos y con el colesterol total de -0,876; lo cual como
afecta la influencia de un alto nivel de glucosa y peso alto en los niveles lipdicos. En el tratamiento de
diabticas con t de chaya se tiene una correlacin entre los niveles lipdicos, encontrando que entre el
colesterol total y HDL existe una correlacin de -0,838 y entre Colesterol total y triglicridos es de -0,931;
lo cual nos indica que al tener un nivel muy alto de triglicridos, los niveles de Colesterol Total y
Colesterol de alta densidad son ms bajos.
Para el grupo de diabticas con AOx tenemos una relacin
entre la glucosa y el peso de -0,879 lo cual nos indica que hay una influencia significativa en la que a
mayor nivel de glucosa menor peso corporal. En el grupo de sanas con AOx no hay diferencias
estadsticas significativas. En el tratamiento de sanas con agua hay una correlacin positiva que indica
que cuando hay un aumento en los triglicridos el colesterol total y el HDL se incrementan tambin (para
63
los niveles de triglicridos y colesterol total de 0,969, y entre triglicridos y HDL de 0,906 lo que nos dice
que entre ellas hay una influencia que aumentan).
Aunque se comprueba que existen correlaciones entre las variables no se puede observar ningn efecto
hipoglucmico, ni un decremento en los niveles lipdicos tanto para el tratamiento con t de chaya como
para la administracin de antioxidantes por medio de vitaminas.
6.4
6.4.1
Tercera fase
Curvas hipoglucmicas
Se efectuaron experimentos agudos con grupos de 7 ratas tanto sanas como diabticas probando
diferentes tratamiento y diferentes dosis, administrando de manera intragstrica con previo ayuno de 8
horas. Con la administracin de extracto puro sin diluir a una dosis de 0,5 g de hoja de chaya/kg de peso
corporal se presentaron convulsiones, dificultad para respirar y taquicardia en las ratas sanas,
recuperndose despus de 2 hr sin tener efecto secundario detectable en das posteriores. Para el grupo
de diabticas se llego a la dosis letal 25% (DL25), los sntomas fueron los mismos pero de manera ms
severa incluso con un deceso a tan solo 2 min de haber suministrado la dosis, sangrado incluso la nariz
en un caso (se efectu la autopsia no encontrndose algn problema aparente), y otro deceso despus
de dos horas de la administracin de la dosis, presentando convulsiones incontrolables, dificultad para
respirar y taquicardia, las dems se recuperaron despus de 6 hr de la administracin del extracto de
chaya solo presentando fatiga y somnolencia posterior a las 6 hr..
De acuerdo a los resultados obtenidos en la Grfica 14 representados como diferencias en porcentaje de
glucosa sangunea en los cuales se hace un comparativo por concentracin. En el inciso a) el
comparativo correspondiente a la concentracin al 2% (v:v) de diferentes preparaciones para ratas sanas
y diabticas, en el inciso b) se tienen las curvas al 6% (v:v) y el inciso c) la grfica tiene el comparativo del
10 y100% de concentracin (v:v) de la diferencia porcentual de la glucosa sangunea. El mayor efecto
hipoglucemiante se present es la concentracin del 6% de licuado crudo de chaya tanto para las ratas
diabticas como las sanas, por lo que se consider esta dosis y la concentracin de 6% extracto acuoso
de chaya, para administrar ad libitum por 11 das.
64
a)
% Glucosa (mg/dL)
Curvas hipoglicmicas de concentraciones al 2% de chaya

DT2
DL2
SL2
ST2
DA
SA
120
100
80
60
40
20
0
-20
-40
-60
1
Tiempo(horas)
Curvas hipoglicmicas de concentraciones al 6% de chaya
b)
% Glucosa (mg/dL)
DT6
DL6
SL6
SE6
ST6
DA
SA
120
100
80
60
40
20
0
-20
-40
-60
1
Tiempo (horas)
Curvas hipoglicmicas de concentraciones al 10 y 100% de chaya
DE10
DL10
DE100
DT10
ST10
SE10
SL10
SE100
DA
SA
c)
% Glucosa (mg/dL)
100
80
60
40
20
0
-20
-40
-60
1
Tiempo (horas)
Grfica 14 Curvas hipoglucmicas de glucosa sangunea en ratas diabticas y sanas.

a) En concentracin al 2% (v:v) de t de chaya, licuado de chaya y agua;
b) En concentracin al 6% (v:v) de t de chaya, licuado y extracto de chaya y agua,
c) Concentracin al 10% (v:v) de t de chaya, extracto y licuado de chaya , 100% de extracto de hoja de
chaya y agua.
SA= Sana con agua, ST2= Sana t de chaya al 2%, SL2= Sana con licuado de chaya al 2%, ST6= Sana con t de chaya al 6%,
SL6= Sana con licuado al 6%, SE6= Sana con extracto al 6%, ST10= Sana t de chaya al 10%, SL10= Sana licuado de chaya al
10%, SE10= Sana extracto de chaya al 10 %, SE100=Sana extracto al 100%, DA=Diabtica con agua, , DT2= Diabtica con t de
chaya al 2%, DL2= Diabtica con licuado al 2%, DT6= Diabtica con t de chaya al 6%, DL6= Diabtica con licuado al 6%, DE6=
Diabtica con extracto al 6%, DT10= Diabtica t de chaya al 10%, DL10= Diabtica licuado de chaya al 10%, DE10= Diabtica
extracto de chaya al 10 %, DE100= Diabtica extracto al 100%,
65
El experimento agudo con la administracin de extracto y licuado al 6% a los grupos de ratas sanas y
diabticas se realiz durante 11 das, durante este perodo se realizaron tres mediciones de los
parmetros, al inicio, medio y final del tratamiento.
En la Grfica 15 se puede observar un decremento en la concentracin de la glucosa sangunea durante
el experimento de 11 das, en las diabticas tratadas con licuado de hoja de chaya al 6%, fue de 10.54%,
diabticas 6% extracto de 6.92%, 14 y 7.9% para las sanas con licuado de hoja de chaya al 6% y extracto
de chaya al 6% respectivamente. Hay diferencias estadsticas significativas por la prueba de Holm Sidak
entre los grupos diabticas a sanas tanto para extracto como licuado de p<0,001 con =0,05. Entre las
diabticas con extracto y diabticas licuado existe una diferencia significativa de p=0,08 con =0,05, pero
entre los dos grupos de sanas no hay diferencias.
DL
DE
SL
SE
450
Glucosa ( mg/dL)
400
350
300
250
200
150
100
50
0
6
Tiempo (das)
11
Grfica 15 Concentracin de glucosa en ratas sanas y diabticas, tratadas con licuado y extracto al 6%
durante 11 das.
SL= Sana con licuado de chaya al 6%, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabtica
con licuado de chaya al 6%, DE= Diabtica con extracto acuosos de chaya al 6%.
a
Existen diferencias estadsticas significativas entre los grupos de ratas diabticas, No existen diferencias
significativas entre los dos grupos de ratas sanas con p<0,05 y =0,05 por la prueba de Tukey
En la Grfica 16 correspondiente al peso se puede observar que se mantuvieron muy constantes los
valores durante el experimento y presentan una diferencia estadstica significativa entre los grupos de
diabticas de P=0,108, entre sanas de P= 0,025, ambos con un =0,05 por el mtodo de Holm Sidak.
66
SL
SE
Peso ( grs)
500
450
400
DE
350
300
250
200
150
100
50
0
DL
a
b
b
6
Tiempo (das)
11
Grfica 16 Registro de peso de ratas sanas y diabticas, tratadas con licuado y extracto al 6% durante 11
das.
SL= Sana con licuado de chaya al 6%, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabtica
con licuado de chaya al 6%, DE= Diabtica con extracto acuosos de chaya al 6%.
a,b
No existen diferencias estadsticas significativas entre los grupos de ratas diabticas, pero si con
respecto a las sanas, con p<0,05 y =0,05 por la prueba de Tukey
Se realiza la correlacin lineal de las mediciones hechas de peso y glucosa durante el experimento
obteniendo una matriz de correlacin por el mtodo de Pearson (ver Tabla 9), en la cual podemos
analizar el mejor tratamiento administrado de estos datos. Solo en el grupo de ratas sanas tratadas con
extracto al 6% se tiene una correlacin negativa de 0,828 entre el peso y la glucosa lo que nos indica que
con el aumento de peso la glucosa disminuye con la administracin del extracto.
PDL
PDE
PSL
PSE
GDL
GDE
GSL
PDL
1
Tabla 9 Correlacin peso-glucosa de experimento agudo

PDE
PSL
PSE
GDL
GDE
0,996
-0,997
-0,945
0,593
0,104
1
-0,987
-0,912
0,663
0,0136
1
0,966
-0,532
-0,177
1
-0,296
-0,423
1
-0,74
1
GSL
0,867
0,908
-0,828
-0,656
0,915
-0,406
1
GSE
0,788
0,84
-0,74
-0,543
0,963
-0,531
0,99
PDL= Peso diabtica licuado, PDE= Peso diabtica extracto, PSL= Peso sana licuado, PSE= Peso sana extracto; GDL= Glucosa
diabtica licuado, GDE= Glucosa diabtica extracto, GSL= Glucosa sana licuado, GSE= Glucosa sana extracto.
El anlisis de la glucosa sangunea al final del experimento se tiene para el grupo de diabticas con
extracto acuoso al 6% se obtuvo un valor de 366,45 21,17 mg/dL, en las diabticas con licuado de
322,24 59,38 mg/dL, para las diabticas con agua los valores son 439,58 36,09 mg/dL, para las sanas
con extracto de 116,61 31,59 mg/dL, las sanas con licuado 103,61 11,11 mg/dL y las sanas con agua
de 129,75 7,12 mg/dL. Por el mtodo de Tukey con p<0,001 y un =0,05 se encuentra que si hay
diferencia estadstica significativa entre los grupos de diabticas con extracto y licuado con respecto a las
tratadas con agua. Entre los grupos de sanas no hay diferencias estadsticas significativas.
Estos
67
resultados nos indican que la administracin de la hoja fresca de chaya, ya sea preparada como extracto
o en licuado, baja los niveles de glucosa sangunea, comparando contra el grupo control de diabticas
con agua, siendo un 16,63 % menor en las ratas diabticas tratadas con extracto al 6 % y 26,69 % para
las ratas diabticas con licuado al 6 %; al realizar la comparacin con el grupo control de ratas sanas con
agua se tiene tambin una disminucin de la glucosa del 10,13 % para las ratas sanas tratadas con
extracto al 6% y un decremento del 20,15 % para las sanas con licuado al 6%, como podemos observar
en estos resultados y los mostrados en la grfica 17 el mejor tratamiento hipoglucmico es la
administracin del licuado de hoja al 6%.
500
G lu c o sa (m g /d L )
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
SA
SE
SL
DA
DE
DL
Tratamientos
Grfica 17 Concentracin de glucosa sangunea al final del experimento en ratas sanas y diabticas,
tratadas con licuado y extracto de chaya al 6% y agua
SA= Sana con agua, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, SL= Sana con licuado de chaya al
6%, DA= Diabtica con agua, DE= Diabtica con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabtica con
licuado de chaya al 6%.
a,b,c
Existen diferencias estadsticas significativas entre los grupos de ratas diabticas, d No existen
diferencias significativas entre los grupos de ratas sanas, pero si con respecto a las ratas diabticas con
p<0,05 y =0,05 por la prueba de Tukey
Para triglicridos en suero los datos se reportan como media +/- desviacin estndar, para el grupo de
diabticas con extracto se obtuvo un valor de 178,91 16,23, en las diabticas con licuado de 174,82
44,90, para las sanas con extracto de 128,07 10,68 y las sanas con licuado 132,77 7,62 (ver Grfica
18). No hay diferencias significativas entre los tratamientos p<0,05 con un =0,05 por el mtodo de
Dunns.
68
T rig licrid o s (m g /d L )
300
250
200
150
b
a
SE
SL
100
50
0
SA
DA
DE
DL
Tratamientos
Grfica 18 Concentracin de triglicridos en suero de ratas sanas y diabticas, tratadas con licuado y
extracto al 6% y agua al final del experimento de 11 das.
a,b
No existen diferencias significativas entre los dos grupos de ratas sanas, pero si con respecto a las
ratas diabticas, con p<0,05 y =0,05 por la prueba de Tukey
En la Tabla 10 se observan los valores de colesterol total y colesterol de alta densidad con los diferentes
tratamientos, no encontrando diferencias significativas en ninguna de las dos variables entre los grupos
de ratas diabticas, ni entre las ratas sanas. En la Grfica 19 se puede observar la concentracin del
colesterol total, en el cual si existe una diferencia significativa entre las ratas diabticas con respecto a las
sanas. Todos los resultados obtenidos se encuentran dentro de los estndares establecidos para estas
variables siendo el valor mximo permisible para colesterol total 200 mg/dL.
Tabla 10 Concentracin de colesterol total y colesterol de alta densidad en suero de ratas sanas y
diabticas tratadas con licuado y extracto de hoja de chaya al 6% al final del experimento de 11 das.
Colesterol
Colesterol HDL
Diab Extracto* Diab Licuado*

Diab Agua*
106,3 9,5
98,5 5
106,95 7,67
67,8 2,9
63,8 5,3
57,81 12,32
Datos reportados como media desv std.
*mg/dL
Sana Extracto* Sana Licuado* Sanas Agua*

93,9 4,3
93,3 2,2
81,11 3,86
54,2 2,9
57,6 4,7
67,53 9,64
69
140
Colesterol (mg/dL)
120
b
a
100
a
80
60
40
20
0
SA
SE
SL
DA
Tratamientos
DE
DL
Grfica 19 Concentracin de colesterol total en suero de ratas sanas y diabticas, tratadas con licuado y
extracto al 6% y agua durante 11 das.
a,b,c
Existen diferencias estadsticas significativas entre los grupos de ratas diabticas, d No existen
diferencias significativas entre los dos grupos de ratas sanas con p<0,05 y =0,05 por la prueba de Tukey
La Grfica 20 corresponde a la concentracin del colesterol de alta densidad valor mnimo debe ser de 45
mg/dL, correspondientes al colesterol total y HDL respectivamente. No presentando diferencias
Colesterol HDL (mg/dL)
significativas en ningn tratamiento.
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
SA
SE
SL 1
DA
DE
DL
Tratamientos
Grfica 20 Concentracin de colesterol de alta densidad en suero de ratas sanas y diabticas, tratadas
con licuado y extracto al 6% y agua durante 11 das.
a,b
No existen diferencias estadsticas significativas entre los grupos de ratas diabticas y sanas, con
70
Para el grupo de diabtica con licuado al 6% presenta una correlacin entre Colesterol de alta densidad
(HDL) y triglicridos y colesterol total de 0,773 y 0,752 respectivamente lo que indica que estas variables
relacionadas entre si positivamente, lo que indica que cuando aumente el HDL aumentaran los
triglicridos y el colesterol total; para el grupo de diabticas y sanas con extracto al 6% no se
correlacionan el perfil de lpidos con la correspondiente glucosa, presentando diferencias estadsticas
significativas con p<0,001, =0,05 por el mtodo de Holm Sidak. En el grupo de sanas con licuado las
correlaciones son negativas e inferiores a 0,7, encontrando que entre la glucosa y el colesterol total de 0,667 y entre triglicridos y HDL de -0,668, los resultados presentan diferencias estadsticas significativas
de p<0,001 con =0,05 por el mtodo de Holm Sidak.
En el presente estudio, se evalu el t de chaya administrado ad libitum sobre el efecto diabetognico de
la estreptozotocina (STZ), en las ratas. La diabetes inducida por STZ en los animales de laboratorio ha
sido ampliamente utilizada para investigar sobre la misma y sus complicaciones a largo plazo, as como
para evaluar el posible efecto hipoglucmico y antihiperglicmico de nuevos compuestos sintticos o
provenientes de plantas. La severidad de la diabetes experimental y su persistencia en las ratas depende
de la dosis empleada de STZ (Tancrede G., y col. 1983).
De acuerdo a los resultados encontrados en esta etapa la administracin de extracto y licuado al 6% tiene
efecto hipoglucmico en el tratamiento de ratas diabticas, siendo mejor tratamiento el licuado; en ambos
tratamiento no se presentan diferencias significativas para los resultados obtenidos en el perfil lipdico,
pero si existe una tendencia a influir positivamente en ellos.
6.5
Determinacin de capacidad antioxidante
Existen numerosos estudios relacionados con la diabetes en los cuales las defensas antioxidantes
celulares son superadas por la produccin de especies reactivas, a esto se le conoce como estrs
oxidativo. La glucosa en sangre conduce al incremento en la actividad de procesos metablicos donde se
generan metabolitos intermediarios los cuales tienen accin pro-oxidante. Por lo que es de gran
importancia tomar en cuenta a los antioxidantes provenientes de una dieta rica en vitaminas A, E, C,
compuestos fenlicos y flavonoides como es el caso de la chaya.
El anlisis de la capacidad antioxidante en el plasma es importante debido que aqu en el soluto se
encuentran el 70% de las protenas, principalmente inmunoglobulinas (anticuerpos), albmina,
transferrina y protenas que ayudan a la coagulacin de la sangre como el fibringeno. Tambin
encontramos iones de sales inorgnicas, hormonas, vitaminas.
Es por esto que en esta etapa se realiz primero una estandarizacin de tres tcnicas
espectofotomtricas, TAC, ABTS y FRAP, con las cuales se evalu la capacidad antioxidante total en
plasma por cada tratamiento y experimento (subcrnico y agudo).
71
6.5.1
Determinacin de la capacidad antioxidante total por la tcnica TAC por crocin
La capacidad antioxidante total por crocin es una tcnica comnmente utilizada para reportar la capacidad
antioxidante en fluidos biolgicos, la cual se lleva a cabo por medio de una cintica incubando durante 60
min a 37C. En la Grfica 40 del anexo IV Error! No se encuentra el origen de la referencia.podemos
observar la cintica a diferentes concentraciones con la cual se calcul el % de inhibicin para la
elaboracin de la curva estndar de cido ascrbico (Grfica 41 del anexo IV).
Similarmente se corre la cintica correspondiente al trolox para elaborar la curva estndar la cual se
puede apreciar en la Grfica 42 del anexo IV.
Posteriormente se analizaron las muestras de plasma de la segunda fase subcrnica (comparativo del t,
antioxidante y agua) y de la fase aguda (extracto y licuado de hoja de chaya al 6%); se hicieron diluciones
para generar una curva con diferentes concentraciones por cada muestra y poder interpolar el 50% de
inhibicin de cada muestra por cada grupo de ratas diabticas y sanas. A continuacin se muestra unas
grficas elaboradas en minitab 15 de diferentes curvas de concentracin de plasma (ver Grfica 21).
a)
Linear
Q uadratic
Rata 11 Sana extracto por TAC
b)
C ubic
Rata 12 Diabtica Extracto por TAC
Linear
Q uadratic
60
50
50
50
50
40
% inhibicin
% de inhibicin
40
30
20
30
20
10
10
0
0
0
0
c)
4
l plasma
d)
Linear
Quadratic
Rata 12 Sana con agua por TAC
10
l plasma
50
Rata 12 Sana extracto por TAC

50
50
50
40
% de inhibicin
40
% inhibicin
30
20
30
20
10
10
0
0
4
l plasma
4
5
l plasma
Grfica 21 Curvas de % de inhibicin de l de plasma de diferentes muestras de tratamientos por TAC

a.
Curva de % inhibicin para rata sana 11 del grupo de tratado con extracto de hoja de chaya al 6%
b.
Curva de % inhibicin para rata diabtica 12 del grupo de tratado con extracto de hoja de chaya al 6%
c.
Curva de % inhibicin para rata sana 12 del grupo de tratado con agua
d.
Curva de % inhibicin para rata sana 12 del grupo de tratado con extracto de hoja de chaya al 6%
72
Con los resultados que se obtuvieron al interpolar el 50% de inhibicin se calcul el valor de la capacidad
antioxidante total que es TAC = 1/IC50 y se correlaciona con el 50% de inhibicin de cada una de las
curvas estndar de cido ascrbico y trolox.
En la Grfica 22 se tiene el comparativo correspondiente al experimento subcrnico de la segunda fase
0,5
0,45
mmol/L
A.Ascrbico
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
SA
SAOx
ST
DA
DAOx
DT
Tratamientos
Grfica 22 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por TAC del experimento
subcrnico de la segunda fase
Los valores son presentados como la media DE, n = 6 - 7
73
1,6
1,4
mmol/L
Trolox
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
SA
SAOx
ST
DA
DAOx
DT
Tratamientos
Grfica 23 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por TAC del experimento subcrnico
de la segunda fase
0,7
mmol/l
A. Ascrbico
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
SA
SE
SL
DA
DE
DL
Tratamientos
Grfica 24 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por TAC de la tercera fase
74
a,b
2,5
2
mmol/l
Trolox
1,5
1
0,5
0
SA
SE
SL
DA
DE
DL
Tratamientos
Grfica 25 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por TAC de la tercera fase
a,b
6.5.2
Determinacin de la capacidad antioxidante total por la tcnica ABTS
La tcnica de ABTS se corri por medio de una cintica la cual quedo estandarizada en tiempo en 10 min,
se hacen las curvas de % inhibicin para cido ascrbico (ver Grfica 43 del anexo V) y trolox (ver Grfica
44 del anexo V), los cuales fueron utilizadas para realizar los clculos tomando el 50% de inhibicin del
estndar contra el 50% de inhibicin de la muestra (el clculo de la muestra fue realizado sacando su
linealidad y posteriormente interpolando el valor).
Para el anlisis por ABTS se hacen diluciones previas para cada muestra de plasma (cuatro diferentes
concentraciones, diluyendo en buffer fosfato de sodio), Con minitab 15 se generaron las grficas la
ecuacin de la curva. A continuacin se muestras algunas grficas (ver Grficas 26).
75
Linear
Q uadratic
Rata 2 Sana Te por ABTS
Linear
Quadratic
Rata 12 Sana Agua por ABTS
90
80
70
% inhibicin
% inhibicin
80
70
60
50
50
40
60
30
50
50
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
l plasma
0.6
0.7
20
0.2
0.8
Linear
Q uadratic
C ubic
Rata 22 Diabtica Extracto por ABTS
0.4
0.5
l plasma
0.6
0.7
0.8
Linear
Quadratic
Rata 13 Sana AOx por ABTS

80
80
70
70
% inhibicin
% inhibicin
0.3
60
50
50
40
60
50
50
30
40
20
0.2
0.3
0.4
0.5
l plasma
0.6
0.7
0.2
0.8
0.3
0.4
0.5
l plasma
0.6
0.7
0.8
Grficas 26 Curvas de plasma de diferentes muestras de tratamientos por ABTS
mmol/L AAscrbico
35
30
25
20
15
10
5
0
SA
SAOx
ST
DA
DAOx
DT
Tratamientos
Grfica 27 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por ABTS del experimento
76

45
mmol/L Trolox
40
35
30
25
20
15
10
5
0
SA
SAOx
ST
DA
Tratamientos
DAOx
DT
Grfica 28 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por ABTS del experimento
Los valores son presentados como la media DE, n =6- 7
14
mmol/L AAscrbico
12
10
8
6
4
2
0
SA
SE
SL
DA
DE
DL
Tratamientos
Grfica 29 Comparativo Capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por ABTS de la tercera
fase
77
a,b
mmol/L Trolox
20
1
15
10
5
0
SA
SE
SL
DA
Tratamientos
DE
DL
Grfica 30 Comparativo Capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por ABTS correspondiente a la

tercera fase
a,b
La ltima tcnica estandarizada fue la del Potencial antioxidante de la reduccin del fierro, en la cual se
corrieron las curvas estndar de cido ascrbico (ver Grfica 45 del anexo VI) y sulfato ferroso (ver
Grfica 46).
A continuacin se anexan algunas grficas correspondientes al anlisis de las muestras de plasma por
FRAP elaboradas en minitab 15 (ver Grfica 31)
78
Linear
C ubic
Rata 13 Sana Aox por FRAP

50
50
50
% inhibicin
% inhibicin
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
l plasma
1.2
1.4
1.6
Linear
Quadratic
C ubic
Rata 25 Diabticas licuado por FRAP

50
2
l plasma
Linear
Quadratic
C ubic
Rata 2 Diabtica Extracto por FRAP

50
50
50
40
% inhibicin
40
% inhibicin
Linear
C ubic
Rata 21 Diabtica Agua por FRAP
30
20
30
20
10
10
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
l plasma
1.4
1.6
1.8
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
l plasma
1.2
1.4
1.6
1.8
Grfica 31 Curvas de plasma de diferentes muestras de tratamientos por FRAP

Con los resultados obtenidos al calcular el 50% de inhibicin para cada muestra de plasma por cada una
de las tres tcnicas, se correlacin con las curvas estndar para obtener el valor en mg equivalentes del
estndar en mmol/L del estndar.
79
2,5
mmol/L cido ascrbico
2
1,5
1
0,5
0
SA
SAOx
ST1
DA
DAOx
DT
Tratamiento
Grfica 32 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por FRAP del experimento
Los valores son presentados como la media DE, n = 6 - 7
600
M eq FeSO4
500
400
300
200
100
0
SA
SAOx
ST
DA
DAOx
DT
Tratamiento
Grfica 33 Comparativo capacidad antioxidante en M eq de FeSO4 por FRAP del experimento
Los valores son presentados como la media DE, n = 6- 7
80
mmol/L cido ascrbico
2,5
2
1,5
1
0,5
0
SA
SE
SL 1
DA
DE
DL
Tratamiento
Grfica 34 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de cido ascrbico por FRAP de la tercera
fase
a,b
700
600
M eq FeSO4
500
400
300
200
100
0
SA
SE
SL
DA
DE
DL
Tratamiento
Grfica 35 Comparativo capacidad antioxidante en M/L de FeSO4 por FRAP de la tercera fase
81
a,b
En la Tabla 13 del anexo VII se encuentran de manera condensada los resultados de los diferentes
tratamientos y experimentos (subcrnico y agudo), comparando las tres tcnicas; TAC, ABTS y FRAP;
entre si.
82
En la Grfica 36 se hace el comparativo entre las tres tcnicas para ve cual es la que tiene ms
sensibilidad tomando los resultados del grupo de diabticas con extracto, reportados como mmol/L de
cido ascrbico.
Podemos observar que por la tcnica de ABTS es en donde se tiene una mayor
sensibilidad para el anlisis de las muestras de plasma.

12
Comparativo de tcnicas
mmol/L de a.ascrbico
10
8
6
4
2
0
DE - FRAP
DE- TAC
DE- ABTS
Grfica 36 Comparativo entre tcnicas para el grupo de diabticas con extracto

Al realizar el comparativo entre todos los grupos podemos apreciar que la tcnica de ABTS es la ms
sensible y la mayor capacidad antioxidante total en los grupos de sanas corresponde al grupo de sanas
con te seguido de las sanas con antioxidantes.
CAPACIDAD AOx mmol/L
40
30
20
10
DE
DL
SL
ST
SA
SE
SAOx
DAOx
DA
DT
0
0
10
15
20
25
30
COMPARATIVO DE TRATAMIENTOS POR TECNICAS FRAP, TAC Y ABTS

FRAP
TAC
ABTS
Grfica 37 Comparativo de sensibilidad de las tcnicas utilizadas para determinacin de antioxidantes.

SE= sana extracto, DE= diabtica extracto, SL= sana licuado, DL= diabtica licuado DAOx, SA= sana con
agua, DA= diabtica con agua, ST= sana con te, DT= diabtica con te, SAOx= sana con AOx, DAOx=
diabtica con AOx
83
Fernndez y col. en el 2006 han realizado diversos estudios en los que manifiestan que la ingesta de
alimentos como espinacas, fresas, arndanos, chocolate negro, caf, t negro y verde, proantocinidinas
de la uva y bebidas alcohlicas como cerveza, vino blanco y vino tinto, entre otros, generan una influencia
mediante su suplementacin en la dieta a largo plazo incrementando la capacidad antioxidante del
plasma la cual representa el balance antioxidante del organismo y valora tanto los antioxidantes
endgenos como exgenos. Lo que se ha usado como marcador indirecto de la biodisponibilidad de los
antioxidantes presentes en los alimentos en estudios de intervencin, tanto para evaluar el efecto aislado
de un alimento a corto plazo como su a largo plazo. No existe consenso cientfico sobre el ms idneo,
pues difieren en el objeto de medida y su posible significacin biolgica, as como en la interferencia que
puedan presentar con los componentes del plasma. Se podra escoger cualquiera de los mtodos de
medida de actividad antioxidante adaptados para muestras biolgicas siempre que el mtodo est
analticamente validado.
Hay autores que utilizan el plasma en el estudio de la capacidad antioxidante y otros emplean suero
sanguneo. El suero se obtiene despus de la eliminacin del cogulo de fibrina de la sangre a
temperatura ambiente. La muestra se somete as a una mayor exposicin a la luz, por lo que
posiblemente se pierden antioxidantes que son inestables en tales condiciones. Por otra parte, durante la
agregacin, las plaquetas liberan radicales que pueden disminuir la capacidad antioxidante de la muestra
de suero. Esto hace aconsejable trabajar con muestras de plasma en lugar de suero para evitar prdidas
de compuestos. La determinacin clnica de compuestos endgenos que influyen potencialmente en la
capacidad antioxidante (albmina, bilirrubina, cido rico) se realiza con mayor frecuencia en muestras de
plasma.
La medida de actividades enzimticas en el plasma es de gran utilidad para el diagnstico de una gran
variedad de enfermedades. Salgado en el 2002 escribi que a menudo la capacidad antioxidante total
(CAT) disminuye significativamente en diversas patologas (24% en la anorexia nerviosa, 20% en la
encefalpata VIH, 13% en la polineuropata diabtica y un 17% en la cardiomiopata). Sin embargo en
pacientes con enfermedades renales, la CAT est significativamente elevada. La presencia de enzimas
en el plasma puede incrementarse en situaciones patolgicas que supongan el aumento de la
permeabilidad de las membranas de las clulas que las sintetizan, o simplemente la rotura o muerte de
estas clulas, como ocurrira en casos de infeccin, hipoxia, agresin qumica, desarrollo tumoral, etc. La
mayor desventaja de la utilizacin de ensayos enzimticos para la diagnosis del dao de tejidos es la baja
especificidad por un tejido o tipo celular concreto, ya que muchas enzimas son comunes en ms de un
tejido.
84
CONCLUSIONES
El efecto del t de chaya en las ratas sanas es el que mayor capacidad antioxidante presenta, pero para
las ratas diabticas se aprecia que falto una concentracin mayor.
La administracin del licuado y extracto de chaya presentaron valores superiores de capacidad
antioxidantes tanto en ratas sanas como en diabticas en las tres tcnicas.
La tcnica de ABTS es la que presenta mayor sensibilidad.
El t de chaya no mostr actividad antihiperglicmica ni hipoglicmica en este estudio sobre los niveles de
glucosa.
El te de chaya no atenu los niveles de triglicridos, colesterol total y colesterol de alta densidad.
No se observ disminucin en los niveles de triglicridos y colesterol sanguneos y la excrecin de
microalbmina en el experimento agudo.
Se observ un efecto antihiperglicmico en el estudio agudo. La administracin del tratamiento con
licuado de chaya al 6% para el grupo de ratas diabticas, bajo los niveles de glucosa en un 10,54%.
La administracin del extracto y del licuado de chaya atenu los efectos severos de la diabetes en cuanto
al consumo de lquido, alimento y disminucin de peso.
Por lo que su empleo podra ser recomendado para atenuar las complicaciones generadas por la
diabetes.
85
RECOMENDACIONES
Se recomienda adquirir un lector de microplaca, el cual puede ser usado para el anlisis de ms muestras
en menor tiempo, con la ventaja de cuando este estandarizada una tcnica el consumo de reactivos ser
menor adems de poder analizar parmetros con una menor cantidad de muestra. Esta limitacin de
equipo gener retraso en el procesamiento de las muestras de este proyecto, as como desfasamiento en
los tiempos planteados desde el inicio del mismo.
Es recomendable que existan paquetes estadsticos para cumplir con las necesidades mnimas
requeridas para el anlisis de los datos, por las limitaciones en cuanto a la falta de software o el
vencimiento de la licencia, lo que evita que se puedan utilizar todas las funciones de cada software.
SUGERENCIAS PARA TRABAJOS FUTUROS

Para complementar los resultados presentados en el presente trabajo es recomendable que se realice un
anlisis de peroxidacin lipdica en plasma, y tejidos biolgicos (hgado y riones), verificando con el
cido tiobarbitrico para determinar malonaldehdo (MDA) y xido ntrico (NO) para verificar el grado de
un estrs oxidativo.
Correlacionar los resultados obtenidos en este estudio (capacidad antioxidante en plasma por las tcnicas
TAC, ABTS y FRAP) con los que se proponen para un trabajo posterior.
86
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95
ANEXO I (REACTIVOS)
Induccin con STZ:

Estreptozotocina (STZ) al 98% hplc No. Cat.50130 de Sigma
Citrato de sodio No. Cat. S1804 de Sigma.
Acido Ctrico
Hidrxido de sodio 1N No.Cat. 3722-01 de Baker
Eter Etlico Anhidro. No. Cat. 31450 de Golden Bell.
Determinacin de Glucosa:
Tiras reactivas accutrend para Glucosa
Kit para determinacin de glucosa marca Randox
Determinacin de Triglicridos:
Tiras reactivas accutrend para triglicridos
Kit para determinacin de triglicridos marca Randox
Determinacin de Colesterol
Tiras reactivas accutrend para colesterol
Kit para determinacin de Colesterol total marca Randox
Kit para determinacin de Colesterol HDL marca Randox
Determinacin de examen general de orina
Tiras reactivas para general de orina marca Bayer
Tiras reactivas para Microalbmina y Creatinina en orina marca Bayer
Determinacin de antioxidantes por TAC por crocin:
2,2-Azobis-(2-amidinopropane) dihydrochloride(ABAP AAPH), PM= 271.2. No. Cat. 440914 de Sigma.
6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX), PM= 250.29. No. Cat. 17415BD de
Sigma - Aldrich.
Crocetin digentibiose ester (Crocin), PM= 976.98. No. Cat. 17304 de Sigma-Fluka.
cido ascrbico, PM= 176.12 No. Cat. A5960 de Sigma.
cido rico. No. Cat U2625 de Sigma.
Cloruro de sodio. No. Cta. 3624- 05 de J.T. Baker.
Cloruro de potasio. No. Cta. 3040- 1 de J.T. Baker
Fosfato dibsico de sodio. No. Cat 3828- 01 J.T.Baker.
Fosfato monobsico de potasio. No. Cat. 3246- 01 de J.T.Baker.
96
Determinacin de antioxidantes por FRAP

Acetato trihidratado de sodio. No. Cat. 236500 de Sigma Aldrich.
cido actico glacial. No. Cat 9507- 05 de J.T.Baker.
cido clorhdrico. No. Cat 9535- 05 de J.T. Baker.
Alcohol etlico absoluto. No. Cat- 9014-02 de J.T.Baker.
2,4,6-tripyridyl-triazine(TPTZ). No. Cat. 93285 de Sigma Aldrich.
FeII =FeSO47H2O; Riedel-de Haen. No. Cat. F7002 de Sigma Aldrich.
FeCl36H2O. No. Cat. F2877 de Sigma - Aldrich.
Determinacin de antioxidantes por ABTS
cido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfnico (ABTS). No. Cat. A1888 de Sigma.
Persulfato de potasio. No. Cat. 216224 de Sigma Aldrich.
Determinacin de compuestos fenlicos totales
Folin Ciocalteu. No. Cat. F9252 de Sigma.
Carbonato de sodio
cido glico. No. Cat. G7384 de Sigma.
Determinacin de flavonoides
Nitrito de sodio
Cloruro de aluminio
Hidrxido de sodio
Catequina
97
ANEXO II (PREPARACIN DE SOLUCIONES)

Preparacin de Buffer de citrato 10 mM, pH= 4.5
Para preparar 25 ml de buffer se pesan 0.3225 gr de cido ctrico y 0.285 gr de citrato de sodio, se
disuelven en 23 ml de agua hplc y se ajusta el pH a 4.5, se afora a 25 ml, verificar el pH y ajustarlo
nuevamente de ser necesario (el buffer se puede preparar con un da de anticipacin y mantener en
frasco color mbar en refrigeracin a 4C).
Preparacin de la Estreptozotocina (STZ):
Se pesan los animales a inducir el mismo da y se calcula la cantidad de STZ total a utilizar que se inyecta
va intraperitonial de acuerdo a una dosis de 45 mg/ kg de peso corporal (PC) de cada rata y se pesa, se
calcula el volumen total en que se disuelve la STZ de acuerdo al total de animales a inducir, se considera
un volumen de 0.5 ml a la rata que ms pese y de aqu se realiza el clculo para cada rata. Se disuelve
la STZ en el buffer, esta solucin dura aproximadamente 20 min, debe dar una ligera coloracin amarilla
transparente, se utilizan jeringas para insulina de 0.5 ml.
Preparacin de Buffer fosfato salino (PBS):
Pesar 7 g de NaCl, 0.2 g de KCl, 1.44 g de Na2HPO4, 0.24 g de KH2PO4 y disolver en 800 ml de agua hplc,
ajustar el pH a 7.4 y aforar a 1 lt. Colocar en frasco ambar y refrigerar a 4C (mximo 2 a 3 meses).
Preparacin del ABAP AAPH:
2,2-Azobis-(2-amidinopropane) dihydrochloride (ABAP) se disuelve con PBS (pH=7.4) a una
concentracin de 6,25 mg/ml. (se elabora antes de usarse, queda a una concentracin de 2,5 mg/ml en
placa), colocar la solucin en frasco color ambar o protegida de la luz.
Preparacin de la solucin de crocin 100 M:
El crocin se prepara a una concentracin de 200 M, se pesa 0,01953 gr y se disuelve en 100 ml de PBS
a pH=7.4, se realiza posteriormente una dilucin para que quede a 100 M (queda a una concentracin
en placa de 40 M, se coloca en varios recipientes color ambar y se almacena a -20C), las alcuotas de
crocin se toman cuando se requiera para el anlisis (mximo dos meses).
cido ascrbico al 200 g/ml:
Pesar 0,002 gr, se disuelven en 10 ml de agua hplc. Se realizan varias diluciones para obtener diferentes
concentraciones de 0 a 10 g/ml (almacenar en frascos color ambar o protegidas de la luz, mximo 10
das).
Trolox al 1000 g/ml:
Pesar 0,025 gr y disolverlos en 25 ml de PBS. Se elabora la curva estndar disolviendo a diferentes2
concentraciones desde 0 a 25 g/ml (almacenar en frascos color ambar o protegidas de la luz, mximo 15
das).
Buffer de acetato 300 mmol/l a pH=3.6:
Se pesan 0.775 gr de C2H3NaO23H2O (Riedel-de Haen) en 4 ml de cido actico, se disuelven en 200 ml
de agua hplc, se ajusta a pH=3.6, aforar con agua hplc a 250 ml (la solucin es estable hasta dos meses
en refrigeracin a 4C).
98
Solucin de TPTZ 10 mmol/l:

Se disuelven 0.1248 g de TPTZ en 50 ml de 40 mmol/l de HCl (la solucin es estable hasta un mes).
Solucin de cloruro ferrico 20 mmol/l:
Se disuelven 0.270 g de FeCl36H2O en 50 ml de agua hplc (la solucin es estable por lo menos 1 mes).
Preparacin del reactivo de FRAP:
Se prepara con 17 ml de buffer de acetato, 1.7 ml de solucin de TPTZ y 1.7 ml de solucin FeCl36H2O
(se prepara el mismo da que se va a utilizar).
Preparacin del estndar de FeSO4:
Se pesa 0.0278 g de FeSO4 y se disuelve en 50 ml para tener una solucin al 2000 M, con esta solucin
se elabora la curva con soluciones acuosas de FeII en concentraciones entre 1 50 g/ml (FeII
=FeSO47H2O; Riedel-de Haen) para generar la grfica.
Preparacin de primaria de ABTS 7 mM:
Se pesa 0.01920 gr de ABTS y se disuelven en 5 ml de PBS.
Persulfato de potasio 140 mM:
Se pesa 0.1892 g y se disuelven en 5 ml de agua hplc.
Solucin de ABTS 7 mM:
Mezclar la solucin de primaria de ABTS al 7 mM con la de persulfato de potasio. La mezcla se debe de
colocar en un frasco ambar protegido de la luz y se dejan reposando a temperatura ambiente por espacio
de 16 horas para que se lleve a cabo la reaccin.
Folin Ciocalteu 1 N:
El reactivo se encuentra a 2 N, por lo que se procede a diluir V1C1=V2C2. Se toman 5ml de agua hplc y
5ml del reactivo de Folin Ciocalteu (almacenar en frasco mbar a 4oC, verificar el reactivo antes de usarse
color debe ser dorado, no utilizarse si tiene un color verde olivo).
Carbonato de sodio (Na2CO3) al 7%:
Pesar 0.35 g de Na2CO3 y aforar con agua hplc a 5 ml.
cido glico a 1 mg/ml:
Pesar 0.01 g de cido glico y aforar con agua hplc a 10 ml. Hacer una dilucin 1:10 con agua hplc
(0.1mg/ml). Almacenar en frasco ambar, se prepara el mismo da que se usa.
Nitrito de sodio al 5%:
Pesar 0.25 g de NaNO2, aforar a 5 ml de agua destilada.
Cloruro de aluminio al 10%:
Pesar 0.5 g de AlCl3 y aforar a 5 ml con agua destilada.
Hidrxido de sodio 1 M:
Se pesa 1 g de NaOH y se afora a 25 ml con agua destilada.
Solucin estndar de catequina a 1 mg/ml:
Se pesan 10 mg de catequina y se le adicionan 10 ml de metanol, se prepara el mismo da que se usa.
99
ANEXO III (CURVAS ESTANDAR DE CIDO GLICO Y CATEQUINA)

Tabla 11 Cantidades para preparar curva estndar de cido glico para determinacin de fenoles totales
cido Glico (l)
Agua HPLC (l)
Reactivo de Folin (l)
Carbonato de sodio 7% (l)
Blanco
50
25
125
48
25
125
46
25
125
44
25
125
42
25
125
10
40
25
125
12
38
25
125
14
36
25
125
y = 0.0279x + 0.049
R2 = 0.99
0,7
Absorbancia
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
15
Concentracin (mg equivalentes cido glico)
20
Grfica 38 Curva estndar de cido glico para la determinacin de fenoles totales en la hoja de chaya.
100
Tabla 12 Cantidades para preparar curva estndar de catequina para determinacin de flavonoides
Catequina
Agua HPLC
NaOH 1 M
Agua HPLC
std/blanco
(l)
(l)
(l)
(l)
Blanco
125
7.5
15
50
52.5
125
7.5
15
50
50.5
125
7.5
15
50
48.5
125
7.5
15
50
46.5
125
7.5
15
50
44.5
10
125
7.5
15
50
42.5
12
125
7.5
15
50
40.5
14
125
7.5
15
50
38.5
Muestra
14
125
7.5
15
50
38.5
A b s o rb a n c ia
No. Muestra/
NaNO2 (l)
AlCl3 (l)
y = 0,00627x + 0,0711
R2 = 0,9955
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
0,50
1
2
3
4
5
6
7
Concentracin de catequina ( mg/ml)
10
Grfica 39 Curva estndar de catequina en mg/ml para determinar flavonoides en la hoja de chaya.
101
ANEXO IV (CURVAS ESTNDAR POR LA TECNICA TAC)
Cintica de cido ascrbico (mg/ml)

Blanco
10
0,3
Absorbancia
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (min)
Grfica 40 Cintica de TAC por crocin para cido ascrbico (mg/ml)

0
10
% inhibicin
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1
10
Concentracin cido ascrbico

Grfica 41 Curva estndar de cido ascrbico por la tcnica de TAC
102
0
10
20
% inhibicin
30
40
50
60
70
80
90
100
2.4
10
12
16
20
28
Concentracion Trolox (mg/ml)
Grfica 42 Curva estndar de Trolox por la tcnica de TAC
103
ANEXO V (CURVAS ESTNDAR POR LA TECNICA ABTS)
0
10
20
% de inhibicin
30
40
50
60
70
80
90
100
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
2,8
Concentracion cido ascrbico (mg/ml)
3,2
Grfica 43 Curva de % de inhibicin de cido ascrbico por la tcnica de ABTS
0
10
% inhibicin
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0.8
1.6
2.4
3.2
16
20
Concentracin de Trolox ( mg/ml)
Grfica 44 Curva de % inhibicin de TROLOX por la tcnica ABTS
104
ANEXO VI (CURVAS ESTNDAR POR LA TECNICA FRAP)
% in h ib ici n
50
100
150
200
250
300
0,25
0,5
1,5
2
2,5
4
5
6,5
Concentracin cido ascrbico (mg/ml)
7,5
10
12,5
Grfica 45 Curva de % de inhibicin de cido ascrbico por la tcnica de FRAP
% in h ib ic i n
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0.25
0.5
1.25
2.5
7.5
10
12.5
25
Concentracin FeSO4 (M)

Grfica 46 Curva de % de inhibicin de FeSO4 por la tcnica de FRAP
105
ANEXO VII (TABLA DE RESULTADOS DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTES TOTAL POR LAS TECNICAS TAC, ABTS y FRAP)
Tabla 13 Resultados comparativos de las tcnicas TAC, ABTS Y FRAP

ABTS
mmol/L Trolox
Sana Agua
12,3631
Sana AOx
20,4163
Sana te
30,7173
Diabtica Agua
13,5099
Diabtica AOx
4,9098
Diabtica te
7,7876
Media +/- desviacin estndar
mmol/L A Ascrbico
+/- 1,4936 9,2595 +/- 1,1186

+/- 3,4163 15,2911 +/- 2,5587
+/- 10,7193 23,0061 +/- 8,0284
+/- 2,8200 10,1184 +/- 2,1121
+/- 0,4373 3,6773 +/- 0,3275
+/- 3,0239 5,8326 +/- 2,2648
TAC
mmol/L Trolox
1,0115
0,7627
0,7729
0,7822
1,2211
1,1447
+/+/+/+/+/+/-
0,2428
0,1522
0,1637
0,1959
0,2508
0,2785
ABTS
mmol/L Trolox
Sana Agua
Sana Extracto
Sana Licuado
Diabtica Agua
Diabtica Extracto
Diabtica Licuado
12,3631
14,2006
10,1157
13,5099
12,3263
14,3785
+/+/+/+/+/+/-
mmol/L A Ascrbico
mmol/L A
Ascrbico
0,3178 +/- 0,0763
0,2396 +/- 0,0478
0,2428 +/- 0,0514
0,2458 +/- 0,0616
0,3837 +/- 0,0788
0,3597 +/- 0,0875
FRAP
M eq de FeSO4
219,2940
417,9834
364,0530
306,2755
332,4082
420,8538
+/+/+/+/+/+/-
TAC
mmol/L Trolox
1,4936 9,2595 +/- 1,1186 1,0115 +/2,0991 10,6357 +/- 1,5721 1,5255 +/1,9326 7,5763 +/- 1,4474 1,5635 +/2,8200 10,1184 +/- 2,1121 0,7822 +/1,8711 9,2319 +/- 1,4014 1,0716 +/1,2955 10,7690 +/- 0,9703 1,2984 +/-
0,2428
0,5518
0,4121
0,1959
0,1782
0,2054
mmol/L A
Ascrbico
0,3178 +/- 0,0763
0,4793 +/- 0,1734
0,4912 +/- 0,1295
0,2458 +/- 0,0616
0,3367 +/- 0,0560
0,4079 +/- 0,0645
23,9643
87,2241
111,7276
78,5937
78,8138
115,8069
mmol/L A
Ascrbico
0,8048 +/- 0,0879
1,5339 +/- 0,3201
1,3360 +/- 0,4100
1,1240 +/- 0,2884
1,2199 +/- 0,2892
1,5444 +/- 0,4250
FRAP
M eq de FeSO4
219,2940
468,7234
464,1858
306,2755
337,1705
389,1979
+/+/+/+/+/+/-
23,9643
53,7329
111,5762
78,5937
71,1147
47,8862
mmol/L A
Ascrbico
0,8048 +/- 0,0879
1,7201 +/- 0,1972
1,7034 +/- 0,4095
1,1240 +/- 0,2884
1,2373 +/- 0,2610
1,4283 +/- 0,1757
106

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POSGRADO EN TECNOLOGA AVANZADA

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA

PARA OBTENER EL GRADO DE

GIOVANNA MARA DEL ROSARIO PALOS SUREZ

DRA. EVA GONZLEZ JASSO y

Metabolismo proteico ......................................................................................................... 17

Metabolismo de las lipoprotenas....................................................................................... 17

Modelos experimentales en animales para el estudio de la diabetes ............................... 17

Modelos experimentales .................................................................................................... 17

Induccin qumica .............................................................................................................. 17

Tratamientos para la diabetes............................................................................................ 18

Plantas medicinales ........................................................................................................... 18

Cnidoscolus chayamansa .................................................................................................. 19

Radicales libres .................................................................................................................. 21

Actividad Antioxidante ........................................................................................................ 24

Generalidades de los antioxidantes ................................................................................... 24

Clasificacin de los antioxidantes ...................................................................................... 26

Estrs oxidativo .................................................................................................................. 34

Mtodos para determinar la capacidad antioxidante ......................................................... 34

OBJETIVO GENERAL ......................................................................................................................... 38

OBJETIVOS ESPECFICOS .............................................................................................. 38

Mtodo del ABTS (Mariken y col., 2004) ........................................................................... 42

Determinacin de Fenoles totales (Singleton, 1965) ......................................................... 43

Determinacin de Flavonoides (Liu y col., 2002)............................................................... 43

Determinacin sangunea de Glucosa ............................................................................... 44

Determinacin sangunea de Triglicridos......................................................................... 44

Determinacin sangunea de Colesterol ............................................................................ 44

Determinacin en orina de Creatinina y Microalbmina .................................................... 45

Composicin proximal, fenoles totales y flavonoides ........................................................ 45

Primera fase (experimento subcrnico) ............................................................................. 45

Segunda fase (experimento subcrnico) ........................................................................... 46

RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................................................ 48

Composicin proximal, fenoles totales y flavonoides ........................................................ 48

Primera fase del experimento subcrnico.......................................................................... 49

Segunda fase experimento subcrnico.............................................................................. 56

Tercera fase ....................................................................................................................... 63

Tercera fase (experimento agudo)..................................................................................... 46

Curvas hipoglucmicas ...................................................................................................... 63

Determinacin de la capacidad antioxidante total por la tcnica TAC por crocin.............. 71

Determinacin de la capacidad antioxidante total por la tcnica ABTS ............................ 74

Grfica 30 Comparativo Capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por ABTS correspondiente a la

Especies reactivas de nitrgeno

Especies reactivas de oxgeno

Potencial antioxidante de reduccin del fierro

Organizacin Mundial de la Salud

Capacidad de absorbancia del radical de oxgeno

Capacidad antioxidante total

Sustancias reactivas al cido tiobarbitrico

Capacidad antioxidante en equivalentes de trolox

Parmetro antioxidante de captura de radicales totales

6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylic acid

Key worlds: Antioxidants, chaya, diabetes.

de glucosa en plasma o suero. En ayunas de 10 a 12 horas, las glicemias normales se

Dao de los pequeos vasos sanguneos (microangiopata),

Dao de los nervios perifricos (polineuropata).

Dao de la retina (retinopata).

Dao renal (nefropata).

Hgado graso o hepatitis de hgado graso (adipohepata).

cambio en el lugar habitual de inyeccin, ingesta insuficiente de hidratos de carbono, diarreas,

Coma diabtico es la consecuencia ms grave de la diabetes, pueden presentarse valores de

A nivel heptico la glucosa no requiere de transportador, pero la menor actividad de la glucocinasa