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UNIVERSIDAD TCNICA DE MACHALA

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS AGROPECUARIAS


CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

Calidad, Pertinencia y Calidez

ANTEPROYECTO

Determinacin y cuantificacin de residuos


de oxitetraciclina e ivermectina en la carne
bovina a nivel del Camal Municipal del
Cantn Santa Rosa

AUTOR:
MARCO VINICIO FLORES BLACIO
0704661537

TUTOR:
Mvz. Lenin Aguilar M Sc.

Machala, El Oro, 2016

UACA

NDICE
I.
INTRODUCCIN

II. REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1.

Antibiticos

2.1.1.

Definicin y caractersticas generales

2.1.2.

Antibiticos ms usados en animales

2.1.2.1.

2.1.2.1.1.

Farmacodinamia

2.1.2.1.2.

Farmacocintica

2.1.2.1.3.

Indicaciones y dosis

2.1.2.1.4.
2.1.2.2.

Tiempo de retiro

2.1.2.1.5.

Lmites mximos de residuos (LMR)

Efectos de consumir carne bovina con residuos de oxitetraciclina.

2.1.2.2.1.

6
7

Resistencia antimicrobiana

Mecanismos generales de resistencia a antibiticos


2.2.

Oxitetraciclina

Antiparasitarios

7
7

2.2.1.

Definicin y caractersticas generales

2.2.2.

Antiparasitarios ms usados en animales

2.2.2.1.

2.3.

Ivermectina

2.2.2.1.1.

Farmacodinamia

2.2.2.1.2.

Farmacocintica.

2.2.2.1.3.

Indicaciones y dosis.

2.2.2.1.4.

Tiempo de retiro.

2.2.2.1.5.

Lmites mximos de residuos (LMR)

2.2.2.1.6.

Riesgos de consumir carne bovina con residuos de ivermectina

Produccin de carne de ganado bovino del Ecuador

2.3.1.

Poblacin del ganado bovino en el Ecuador

2.3.2.

Consumo per cpita de carne de las distintas especies de animales

III. MATERIALES Y MTODOS


3.1.

Materiales

9
9
10
11
11

3.1.1.

Localizacin del estudio

11

3.1.2.

Poblacin

11

3.1.3.

Muestras

11

3.1.4.

Variables a analizar

12

3.1.5.

Medicin de las variables

12

3.2.

Metodologa

12
2

3.2.1.

Recoleccin de la muestras

12

3.2.2.

Mtodo para determinar y cuantificar la ivermectina segn PUAL25

12

3.2.2.1.

Aparatos.

12

3.2.2.2.

Instrumentos.

13

3.2.2.3.

Reactivos.

13

3.2.2.4.

Soluciones.

13

3.2.2.5.

Materiales.

14

3.2.2.6.

Estndares

14

3.2.2.7.

Procesamiento de las muestras

14

3.2.2.8.

Procedimiento de cuantificacin

16

3.2.3. Mtodo para determinar y cuantificar oxitetraciclina en carne segn


Quintana, Medina, & De Nbrega26

17

3.2.3.1.

Aparatos.

17

3.2.3.2.

Reactivos.

17

3.2.3.3.

Soluciones.

17

3.2.3.4.

Condiciones cromatogrficas.

18

3.2.3.5.

Procesamiento de las muestras

19
20

IV. BIBLIOGRAFA

I.
3

INTRODUCCIN
En la actualidad el manejo de los frmacos (antibiticos y antiparasitarios) es
inadecuado, ya que se los usa sin direccin veterinaria, a tal punto que de acuerdo a
Ayuso1 se emplean ms antibiticos en la industria alimentaria que en la
farmacutica; provocando que existan residuos de estos medicamentos en los
productos obtenidos del animal (carne, leche, huevos, etc.), los cuales llegan al
consumidor producindole reacciones alrgicas, resistencia bacteriana, alteracin de
la flora bacteriana intestinal y produccin de problemas de comercializacin debido
al incumplimiento en las normas establecidas a nivel internacional (Codex
Alimentario) 2,3
Debido a estas razones es necesario tener un estricto control de estos con el fin de
que no causen daos a la salud del consumidor, por tal motivo se deben realizar
anlisis fisicoqumicos para determinar la presencia principalmente de residuos de
antibiticos y antiparasitarios en carne fresca a niveles iguales o inferiores al nivel
mximo de residuos permitido, ya que el uso indiscriminado de los antibiticos ha
generado una respuesta de supervivencia en los microorganismos, que los capacita
para evadir con eficiencia la accin bactericida de algunos agentes resultando en un
grave problema de salud pblica, ya que se estima que el nmero de infecciones por
bacterias multirresistentes alcanza las 400.000 al ao a nivel mundial 4
En la actualidad existen varios mtodos que tienen como fin detectar residuos de
distintos frmacos5, en este caso oxitetraciclina e ivermectina, en la carne de los
animales de abasto, siendo uno de las ms sensibles la cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC) 6
Por estas razones me he planteado los siguientes objetivos:
Objetivo General:
Determinar y cuantificar la presencia de residuos de distintos frmacos
(oxitetraciclina, sulfamidas e ivermectina) de uso comn en la medicina veterinaria
de especies mayores en la carne a nivel de camales municipales, utilizando el
mtodo de Cromatografa Liquida de alta resolucin (HPLC).
Objetivos Especficos:
Determinar y cuantificar la presencia de residuos de oxitetraciclina en la carne
del ganado bovino
Determinar y cuantificar la presencia de residuos de ivermectina en la carne
del ganado bovino

II.
4

REVISIN BIBLIOGRFICA
2.1.

Antibiticos

2.1.1. Definicin y caractersticas generales


Los antibiticos son compuestos qumicos producidos por microorganismos con la
capacidad de inhibir el crecimiento o de eliminar a las bacterias u otros
microorganismos, sin alterar a las clulas del hospedador; por tal motivo los
antibiticos deben seleccionarse analizando las diferencias entre la bioqumica del
agente infectivo y la del hospedador7
2.1.2. Antibiticos ms usados en animales
De acuerdo a la investigacin realizada por Cholca 8, en Cayambe Santo Domingo,
vemos que los antibioticos mas usados en el ganado bovino lechero son los
Betalactamicos (Penicilinas, Aminopenicilinas, Cefalosporinas) con un 39%,
Aminoglucosidos (Estreptomicina, Dihidroestreptomicina) con 27%, Macrolidos
(Eritromicina, Espiramicina, Tilosina) con 23%, Tetraciclinas (Oxitetraciclina) con el
7%, Cloranfenicol con 3% y Sulfonamidas (Sulfatiazol, Trimetropin) con solo el 1%
2.1.2.1.

Oxitetraciclina

La oxitetraciclina, tambin denominada terramicina, se obtiene a partir de


Streptomyces rimosus y es una de las tetraciclinas ms utilizadas en la teraputica
veterinaria9.
Se encuentra en dos presentaciones:

De larga accin: con la que se obtienen valores sanguneos teraputicos


durante 120 h cuando est al 20 por ciento.

De accin intermedia: que produce valores teraputicos por alrededor de 78


h en dilucin al 10 por ciento.
2.1.2.1.1.

Farmacodinamia

Evita que las protenas bacterianas se sinteticen; esta accin antibacteriana es el


resultado de la fijacin a la subunidad 30S de los ribosomas por uniones quelantes
con los grupos fosfato en el RNA mensajero, impidiendo la fijacin del RNA de
transferencia sobre el RNA mensajero (interaccin codonanticodon) 10.
2.1.2.1.2.

Farmacocintica

Despus de absorberse, las oxitetraciclinas llegan a sangre y tejidos, cualquiera que


sea su forma de preparacin o va de administracin 9.

Por va IM, la oxitetraciclina se absorbe bastante bien y se detecta en plasma


a los 15 min, para alcanzar su Cpmx en 1 h. Mantiene cifras teraputicas
durante 6-12 h, aproximadamente.
Por va IV lenta en vacas, se han logrado concentraciones tisulares ms
homogneas y altas en el tracto urogenital que cuando se aplica diluida en
lavados uterinos.
2.1.2.1.3.

Indicaciones y dosis

Bovinos: se la utiliza para tratarlas siguientes enfermedades 9:

Mastitis coliforme en dosis de 11-20 mg/ kg por va IV


Mastitis por E. coli una dosis de 20 mg/kg por va IV
Endometritis infecciosa, actinomicosis, actinobacilosis y queratoconjuntivitis
seca (Moraxella bovis) una dosis de 11 mg/ kg/12 h por va parenteral (IV)
En dosis ms altas se le ha usado como segunda opcin contra la
leptospirosis.
Dermatofitos y anaplasmosis en dosis de 20 mg/ kg
2.1.2.1.4.

Tiempo de retiro

En vacas de ordeo debe ser por lo menos de dos das.

El retiro de rastro no debe ser inferior a un mes en animales destinados al


sacrifico9.
2.1.2.1.5.

Lmites mximos de residuos (LMR)

Tabla 1. Lmites mximos de residuos (LMR) de oxitetraciclina en los distintos


animales destinados al consumo humano 11

Fuente: Annamaria (2015)


2.1.2.2. Efectos de consumir carne bovina con residuos de
oxitetraciclina.

Alergias
Resistencia microbiana
6

Carcinogenicidad
Mutagenicidad
Teratogenicidad
Alteraciones en el depsito de calcio en los huesos 2,12,13
Mancha los dientes de los nios pequeos 14, 15.
Alteraciones gastrointestinales16
Al consumir leche contaminada con residuos de tetraciclinas pueden
provocarse reacciones adversas como dolor epigstrico y abdominal,
nuseas, vmitos, diarreas; en personas hipersensibles al antibitico se
puede presentar fotosensibilidad por exposicin cutnea al sol, en lactantes
prematuros o nios en estado de desarrollo seo y dentario acelerado, puede
causar alteraciones y disminucin del crecimiento seo, por sus propiedades
quelantes de calcio y otros cationes, formando compuestos estables que
interfieren en la osificacin y denticin normal, sin embargo, esta situacin no
parece ser un fenmeno frecuente y puede ser reversible si la exposicin fue
durante poco tiempo (Barrera & Ortez, 2012)
2.1.2.2.1.

Resistencia antimicrobiana

La resistencia de las bacterias a los antibiticos se define como la capacidad que


tienen estas para tolerar y sobrevivir a la exposicin de un antimicrobiano que
debera haberlas eliminado o inhibido su desarrollo a travs de varios mecanismos 17,
convirtindolas en superbacterias18.
Las infecciones causadas por microorganismos resistentes no responden al
tratamiento ordinario, lo que da lugar a una enfermedad prolongada y a mayor riesgo
de defuncin, incrementan el riesgo de propagacin de microorganismos resistentes
a otras personas, elevan los costos de atencin sanitaria y la carga econmica para
las familias y las sociedades e inclusive ponen en riesgo el xito de intervenciones
tales como los trasplantes de rganos, la quimioterapia contra el cncer y las
operaciones de ciruga mayor19
Mecanismos generales de resistencia a antibiticos 9

Bloqueo del transporte del antibitico: se consigue resistencia a la fosfomicina


por prdida del sistema de transporte del glicerol-fosfato que es el que usa la
fosfomicina para alcanzar el interior de la bacteria.

Induccin de la sntesis de enzimas que modifican o degradan el antibitico.

Alteracin o inactivacin qumica, o eliminacin del antibitico.

Expulsin del antibitico por un mecanismo activo de bombeo

Modificacin del blanco o sitio de accin del antibitico: la metilacin del


ARN23S en una posicin especfica confiere resistencia a los macrlidos que
no pueden fijarse al ribosoma y producir su efecto inhibitorio.

Produccin de una enzima alternativa que evita el efecto inhibitorio (bypass):


la resistencia al trimetoprim se consigue produciendo una dihidrofolato7

reductasa nueva que deja sin efecto la inhibicin de la dihidrofolato-reductasa


normal de la bacteria.

Aparicin por mutacin de un gen bacteriano que posee una actividad


diferente.

2.2.

Antiparasitarios

2.2.1. Definicin y caractersticas generales


Medicamentos usados en para eliminar parsitos internos y externos como:
helmintos, nematodos, triquinosis, trematodos, filiaras, etc. actan generalmente
bloqueando el sistema neuromuscular o respiratorio del parasito, interfiriendo con el
metabolismo o hacindolos ms susceptibles al ataque de los macrfagos del
hospedero9.
2.2.2. Antiparasitarios ms usados en animales
De acuerdo a la investigacin realizada por Cholca 8, en Cayambe Santo Domingo,
vemos que los antibioticos mas usados en el ganado bovino lechero son:
Benzoimidazoles (Albendazol, Fenbendazol) con 52%, Imidazotiazoles (Levamisol)
con 22%, Lactonas Macrociclicas (Ivermectina) con 18% y otros antihelminticos
(Piperazina) con el restante 8%.
2.2.2.1.

Ivermectina

Antiparasitario de amplio espectro, eficaz contra una gran variedad de nematodos y


ectoparsitos, es un polvo de color blanco, muy soluble en metiletilcetona,
propilenglicol y polietilenglicol, poco soluble en agua e insoluble en carbohidratos
saturados como el ciclohexano; es muy liposoluble y estable 9.
2.2.2.1.1.

Farmacodinamia

La ivermectina se une selectivamente y con gran afinidad a los canales regulados


por glutamato del ion cloro en la clulas nerviosas y musculares de invertebrados,
produciendo un aumento de la permeabilidad de la membrana celular a los iones
cloro con hiperpolarizacin de la clula causando parlisis y muerte del parasito. Se
cree tambin que la ivermectina interfiere con la funcin gastrointestinal de los
parsitos susceptibles, produciendo inanicin del parasito. Adicionalmente, la
ivermectina interacta con otros canales de cloro regulados por ligandos tales como
los regulados por el cido gama amino butrico (GABA) 20.
2.2.2.1.2.

Farmacocintica.

Se elimina por la bilis (gran cantidad en heces), tambin se excreta por la orina y en
la leche. En bovinos, la excrecin fecal representa 98% o ms del total de la dosis
administrada. Se distribuye ampliamente en los tejidos y por lo general se
encuentran residuos en bilis, grasa e hgado 9

Por va intrarruminal alcanza 40% de biodisponibilidad, pero sus valores en


plasma pueden durar de 7 a 14 das; no se recomienda la va IM.
Por va SC se detecta en plasma despus de 1 h de haberlas aplicado y hasta
30 das despus de la administracin en una dosis de 200 ug/kg
Si se administra por va IV, la vida media se reduce a 30 h.
2.2.2.1.3.

Indicaciones y dosis.

Bovinos: para el tratamiento contra diversos nematodos gastrointestinales y


pulmonares la dosis es de 200 pg/ kg por va SC 9.

2.2.2.1.4.

Tiempo de retiro.

Se recomienda que cuando se usen los bolos de liberacin prolongada en bovinos


de carne se observe un tiempo de retiro de 180-184 das. Para las formas
inyectables los tiempos de retiro son9:
Bovinos: 35-49 das
No se utiliza en vacas que estn criando o cercanas al parto, dada la sensibilidad de
los neonatos a la ivermectina9.
2.2.2.1.5.

Lmites mximos de residuos (LMR)

Tabla 1. Lmites mximos de residuos (LMR) de ivermectina en los distintos


animales destinados al consumo humano 11

Fuente: Annamaria (2015)


2.2.2.1.6.
Riesgos de consumir carne bovina con residuos de
ivermectina
La Ivermectina por lo general es bien tolerada y las reacciones adversas son
generalmente menores y raras, pero se tiene precaucin con los nios menores a
dos aos dado que la barrera hematoenceflica puede estar menos desarrollada que
en nios de ms edad21, pudiendo provocar alteraciones del sistema nervioso
central12,13,22
9

2.3. Produccin de carne de ganado bovino del Ecuador


En Ecuador se procesan alrededor de 220 000 toneladas mtricas de carne,
obtenidas del milln de reses faenadas en camales formales, de acuerdo a la
Federacin Nacional de Ganaderos23.
2.3.1. Poblacin del ganado bovino en el Ecuador
Tabla 3. Nmero de cabezas de ganado vacuno, segn cantn y provincia 24
CANTN
TOTAL EL ORO
Machala
Arenillas
Atahualpa
Balsas
Chilla
EL Guabo
Huaquillas
Marcabel
Pasaje
Pias
Portovelo
Santa Rosa
Zaruma
Las Lajas

Cabezas
162.467
1.996
22.501
11.487
3.664
8.929
9.005
*
6.720
6.088
26.988
4.715
24.588
19.975
15.806

Fuente: INNEC (2010)


2.3.2. Consumo per cpita de carne de las distintas especies de
animales
De acuerdo a un artculo publicado por el diario El Comercio 23 en la Revista Lideres
el ecuatoriano consume cada ao, en promedio 54 kilogramos de distintas
variedades de carne:
32 kg corresponden a carne de pollo
12 kg son de cerdo
9 kg corresponden a res
1 kg es de pescado.

10

III.
MATERIALES Y MTODOS
3.1.

Materiales

3.1.1. Localizacin del estudio


El presente estudio se llevara a cabo en el cantn Santa Rosa, provincia de El Oro
ubicado en la parte sur-occidental del territorio ecuatoriano y cuyos lmites son:

Al norte con los cantones Machala y Pasaje

Al sur con los cantones Arenillas y Pias

Al este con los cantones Atahualpa y Pasaje

Al oeste con el cantn Arenillas

Latitud: S 3 30' / S 3 20'


Longitud: W 80 0' / W 79 45'
Coordenadas Planas UTM (aprox):

Norte: 9613070 / 9631470

Este: 611070 / 638870


3.1.2. Poblacin

La poblacin de bovinos del cantn Santa Rosa de acuerdo al censo realizado en el


2010 por el INEC, MAGAP y SICA es de 24588 24.
11

3.1.3. Muestras
Las muestras de carne fresca sern recolectadas en el Camal Municipal en un
nmero igual al obtenido en la aplicacin de la frmula para cada uno de los
frmacos a investigar:
n=Npqz2/pqz2+(N-1)l2
n= [24588x0.95x0.05x(1.96)2]/[0.95x0.05x(1.96)2+(24588-1)x(0.05) 2
n=(4486.72)/(0.182476+61.46)
n=4486.72/61.65
n=73 animales
3.1.4. Variables a analizar
Se analizarn las siguientes variables:

Cantidad de residuos de Oxitetraciclina e Ivermectina en la carnes

Tipo de alimentacin (balanceado, pasto o mixto)

Sexo

Edad

Tipo de explotacin en donde es originario el animal


o Bovinos: produccin lechera o engorde

3.1.5. Medicin de las variables


Los frmacos sern medidos en ug/kg de acuerdo a los resultados que nos muestre
el equipo de HPLC y de acuerdo a estos valores se analizara que musculo fue el de
mayor predileccin para la acumulacin de antibiticos
De acuerdo al tipo de explotacin y del tipo de alimentacin de lo resolver tomando
datos directamente de los productores mediante una pequea encuesta

3.2.

Metodologa

El estudio es del tipo descriptivo y de laboratorio aplicando los siguientes mtodos:


Determinar ivermectina: El mtodo sugerido por la Norma oficial mexicana nom020-zoo-1995; usada para determinar ivermectinas en hgado de bovinos, equinos,
porcinos, ovinos y aves por cromatografa de lquidos alta resolucin 25.
Determinar oxitetraciclina: Mtodo usado en el trabajo cientfico de Quintana,
Medina, & De Nbrega26 Determinacin de residuos de tetraciclinas: oxitetraciclina,
12

tetraciclina y clortetraciclina en tejido muscular de porcino mediante cromatografa


lquida de alta resolucin.
3.2.1. Recoleccin de la muestras
Para la recoleccin en el Camal Municipal, se procedi de la siguiente manera:
a) Con un bistur se cort un pedazo de los msculos del anca, del cuello y del
muslo de una dimensin aproximada a 3 x 3 cm.
b) Prximo a esto fueron colocadas en fundas rotuladas previamente y puestas
en refrigeracin
c) Una vez tomadas las muestras se procede a trasladarlas al laboratorio de
Qumica de la Unidad Acadmica de Ciencias Qumicas y de la Salud.
3.2.2. Mtodo para determinar y cuantificar la ivermectina segn PUAL25
3.2.2.1.

Aparatos.

Agitador mecnico.
Balanza analtica.
Bao de aceite.
Bao de ultrasonido.
Centrfuga de 5000 rpm.
Evaporador de nitrgeno.
Licuadora.
Mezclador vrtex.

3.2.2.2.

Instrumentos.

Cromatgrafo de lquidos de alta resolucin con detector de fluorescencia.


3.2.2.3.

Reactivos.

Acetona, grado HPLC.


Acetonitrilo, grado HPLC.
Agua, grado HPLC.
Anhidrido actico, G.R.
Cloroformo, grado HPLC.
N,N - Dimetil formamida, G.R.
Isooctano, grado HPLC.
Metanol, grado HPLC.
1-metilimidazol, 99 % de pureza.
Trimetil-clorosilano.

3.2.2.4.

Soluciones.

Solucin de acetona:agua 1:1 v/v.


Fase mvil: 96 % de metanol, 4% de agua grado HPLC.
13

Reactivo derivatizante: En un tubo de centrfuga de vidrio de 15 ml, mezclar 2


partes de 1-metilimidazol con 3 partes de anhidrido actico y 9 partes de N,N dimetil
formamida, agitar en un mezclador vrtex. Preparar antes de usar y descartar el
sobrante.
El reactivo derivatizante es sensible a residuos acidos y alcalinos, por lo tanto, debe
seguirse un rgimen de limpieza riguroso para los tubos de vidrio que se usen en su
preparacin, se recomienda:
Remover todos los residuos de muestra manualmente, no lavar en mquina.
Lavar con agua y jabn, enjuagar con agua corriente y secar.
Sumergir en cloruro de metileno por 2 horas.
Remojar en solucin detergente otras dos horas.
Enjuagar con agua caliente, agua destilada, acetona y metanol antes de secarlos.
3.2.2.5.

Materiales.

Cartucho de extraccin en fase slida de slica gel de 500 mg.


Columna de 150 mm de longitud, 4.6 mm de dimetro interno Zorbax
ODS.
Cuchillo o escalpelo con bistur.
Jeringas de 50 l, 250 l y 5 ml.
Nitrgeno, alta pureza.
Pipetas graduadas de 1 y 2 ml.
Pipetas Pasteur.
Pipetas volumtricas de 0.5, 1, 2, 3, 4 y 5 ml.
Tubos de centrfuga de 15 y 50 ml con tapn esmerilado.
Tubos de centrfuga de polipropileno de 50 ml.

Las condiciones de los tubos de 15 ml afectan la resolucin analtica; para evitarlo


deben silanizarse. Esto hace que sea ms fcil limpiarlos y cubrir los sitios reactivos
que puedan adsorber la ivermectina.
3.2.2.6.

Estndares

El estndar de referencia usado es ivermectina, que es una mezcla de dos


homlogos: 22, 23 dihidroavermectina BIa o H2BIa en una proporcin de 80%
mnimo y la 22, 23 dihidroavermectina BIb o H2BIb en no ms del 20 %
La concentracin comercial disponible, es aproximadamente de 1.38% para H2Bla y
0.21 % para H2Blb.
Solucin Patrn de 125 g/ml.
Siguiendo las instrucciones que acompaan al estndar, preparar una solucin que
contenga aproximadamente 125 g/ml de ivermectina en metanol grado HPLC.
14

Solucin de trabajo 0.5 g/ml.


A partir de la solucin patrn, preparar dos diluciones intermedias para obtener una
concentracin aproximada de 0.5 g/ml en metanol grado HPLC.
La soluciones patrn y de trabajo, debern conservarse en tubos de polipropileno a 20C. La solucin patrn tiene una vida de anaquel de 1 ao y la de trabajo de 90
das.
3.2.2.7.

Procesamiento de las muestras

Extraccin.
1. Con el cuchillo o el bistur quitar el tejido conectivo del musculo y licuar.
2. En un tubo de centrfuga de polipropileno de 50 ml, pesar 2.5 0.1 g de tejido
homogeneizado.
3. Por cada serie de muestras, preparar un blanco de cristalera, un blanco de
reactivos, un tejido blanco y una muestra de recuperacin, la cual se fortifica
con 100 l de la solucin estndar de trabajo de 0.5 g/ml para tener
aproximadamente 20 ppb.
4. Adicionar 15 ml de la solucin de acetona:agua 1:1.
5. Agregar 15 ml de isooctano grado HPLC , tapar los tubos y agitar en vrtex
por 20 s para dispersar el tejido.
6. Agitar mecnicamente durante 10 min.
7. Centrifugar a 2000 rpm, durante 10 min.
8. Transferir el isooctano, capa superior, a un tubo de centrfuga de polipropileno
de 50 ml.
9. Evaporar el isooctano a aproximadamente 0.5 ml, en un bao de vapor a 55 60 C y una corriente suave de nitrgeno. Quedar un lquido viscoso.
10. Realizar dos extracciones ms, repitiendo los pasos del 9.1.5. al 9.1.9.
11. Es muy importante transferir slo la capa de isooctano, durante la extraccin
del tejido. Para evitar tomar de la capa inferior, de cada una de las tres
porciones de 15 ml de isooctano, transfiera slo de 13 a 14 ml.
12. Adicionar 4 ml de acetonitrilo, previamente calentado a 55 - 60C, al tubo de
polipropileno que contiene el residuo viscoso.
13. Tapar el tubo y mezclar en vrtex.
14. Regresar el tubo al bao de vapor a 55 - 60C por 5 min.
15. Agitar el tubo en vrtex por 2 min.
16. Poner el tubo en un bao de ultrasonido por 2 min.
17. Poner el tubo en un congelador a 0C durante una hora y media.
18. Centrifugar el tubo fro a 1500 rpm por 5 min.
15

19. Decantar el acetonitrilo, en un tubo de centrfuga de vidrio de 15 ml


previamente silanizado.
20. Evaporar el acetonitrilo, en un bao de vapor a 55 - 60C, con una corriente
suave de nitrgeno. Deber quedar un lquido viscoso, similar al del paso
9.1.9.
21. Preparar el estndar externo, colocando 100 l de la solucin del estndar de
trabajo de 0.5 l/ml, en un tubo de centrfuga de vidrio de 15 ml y evaporando
el solvente, en un bao de vapor a 55 - 60C, con una corriente suave de
nitrgeno.
22. Agregar 150 l del reactivo derivatizante a cada tubo. Tapar y agitar en vrtex
por 20 s.
23. Colocar el tubo en el bao de ultrasonido, por 5 min.
24. Centrifugar a 1500 rpm durante 1 min.
25. Poner los tubos en el bao de aceite a 96 2C durante una hora y media.
26. Humedecer los cartuchos de extraccin de slica gel con 5 ml de cloroformo.
27. Desechar el solvente.
28. Remover los tubos del bao, quitarles el exceso de aceite y dejarlos enfriar.
29. Adicionar 1 ml de cloroformo a cada tubo.
30. Decantar el contenido de los tubos en los cartuchos de extraccin de slica
gel.
31. Lavar con 3 ml de cloroformo y agregar el lavado al cartucho de extraccin.
32. Despus que ha pasado el cloroformo, lavar el reservorio y el cartucho de
extraccin de slica gel con 8 ml de cloroformo, adicionndolos en porciones
sucesivas de 2 ml.
33. Conservar todos los eluatos clorofrmicos, en un tubo de centrfuga de vidrio
de 15 ml.
34. Evaporar el cloroformo a sequedad, en un bao de vapor a 55 - 60C, con
una corriente suave de nitrgeno.
35. Llevar a un volumen final de 1 ml con metanol.
36. Tapar los tubos, agitar en vrtex y despus en el bao de ultrasonido .
37. Poner los tubos en congelacin, durante 30 min.
38. Centrifugar los tubos fros a 1500 rpm por 5 min.
39. Transferir una alcuota a un vial de volumen reducido e inyectar al
cromatgrafo de lquidos.
3.2.2.8.

Procedimiento de cuantificacin

16

Las condiciones que enseguida se presentan, se sugieren como gua, para lo cual el
analista deber optimizar estos parmetros para el instrumento que est usando.

Fase mvil: 4 % de agua en metanol


Velocidad de flujo: 1.8 ml/min.
Volumen de inyeccin : 50 l.
Temperatura de la columna: 30C.
Longitud de onda de excitacin: 360 nm.
Longitud de onda de emisin: 425 nm.
Atenuacin del detector: 10.
Velocidad de la carta: 5 mm/min.
Rango del registrador: 1 mv.

Inyectar el blanco de cristalera, el blanco de reactivos, el estndar externo, el tejido


blanco, la recuperacin y las muestras. El porcentaje de recuperacin aceptable es
de 60 a 110%.
Los blancos no debern presentar picos que interfieran con el tiempo de retencin
del estndar; en caso contrario, eliminar el problema y repetir el anlisis.
3.2.3. Mtodo para determinar y cuantificar oxitetraciclina en carne
segn Quintana, Medina, & De Nbrega26
3.2.3.1.

Aparatos.

I. Cromatgrafo lquido equipado con dispensador de solventes que provee un flujo


de 1-2 mL/min., con baja pulsacin. Se utilizaron dos cromatgrafos lquidos:
1. Waters modular compuesto por: bomba de distribucin de solventes modelo
510, detector ultravioleta modelo 484, mdulo de datos modelo 745B, inyector
Rheodyne, detector UV a 350 nm, 0,005 unidades de absorbancia por la
escala total (AUFS).
2. Shimadzu Class VP: bomba LC-10ATVP, detector SPD-M10AVP, inyector
Rheodyne, controlador del sistema SCL-10AVP, impresora Epson modelo
C60. Condiciones de trabajo: volumen de inyeccin 50-60 o 100 L. Tiempo
de corrida 15 min.
II. Columnas cromatogrficas
1. Para la determinacin de las Tetraciclinas se emple la columna Spherisorb
C8 5 m x 250 x 4,6 mm.
2. Para la confirmacin de los resultados cuantitativos se emplearon las
columnas:
2a. Columna de C18 5 mm Sun Fire 250 x 4,6 mm.
2b.Columna C18 Nova Pak 4 mm 300 mm x 3.9 mm.

17

3.2.3.2.

Reactivos.

Patrones de referencia: tetraciclina clorhidrato Sigma, oxitetraciclina clorhidrato


Sigma y clortetraciclina Clorhidrato (Sigma Aldrich, MO, USA). Acetonitrilo grado
HPLC; metanol grado HPLC; agua destilada; cido ctrico; Na2HPO4 anhidro; sal
sdica del cido etilendiamino tetractico; cido oxlico.
3.2.3.3.

Soluciones.

McIlvaine buffer pH 4,0: 28,4 g Na2HPO4 anhidro (grado reactivo)/1L en agua.


Diluir la solucin con agua hasta el aforo y mezclar. Colocar 21.0 g de Ac. ctrico en
un frasco volumtrico de 1L, diluir con agua destilada hasta completar 1 L. Mezclar
bien. Combinar 1L del sol. de cido ctrico con 625 mL de la sol. de fosfato sdico en
un baln aforado de 2L. Ajustar a pH 4.0 0.05. Preparar esta solucin
semanalmente.
McIlvaine buffer-Solucin de EDTA: Ajustar McIlvaine buffer de forma de contener
0,1M de etilendiamino del cido tetractico sal sdica. A 1.625 L de buffer McIlvaine
pH 4,0, aadir 60,5 g de EDTA. 2H2O disdico. Mezclar hasta que se disuelva.
Preparar semanalmente.
Solucin metanlica de cido oxlico 0,01M: pesar 1.26 g de cido oxlico
dihidratado en un frasco volumtrico de 1 L, disolver y llevar a volumen con metanol.
Preparar diariamente.
Solucin acuosa de cido oxlico 0,01M: disolver 1,26 g de acido oxlico
dihidratado en agua destilada dentro de un frasco volumtrico de 1L. Diluir a
volumen y mezclar.
Soluciones patrones
1. Solucin madre de cada uno de los antibiticos de una concentracin de 1000 mg/
mL (1000 ppm) en metanol.
2. Solucin madre combinada de los tres antibiticos (clortetraciclina (CTC),
oxitetraciclina (OTC) y tetraciclina (TTC)) a una concentracin de 100 mg/mL (100
ppm) de cada uno: medir dentro de un baln aforado de 100 mL, 10 mL de cada una
de las soluciones anteriores. Aforar con metanol.
3. Solucin de trabajo combinada de los tres antibiticos a una concentracin de 25
mg/ml (25 ppm): medir 2,5 mL de la solucin anterior dentro de un baln aforado de
10 mL y diluir con metanol. Preparar semanalmente.
Solucines patrones cromatogrficas:
A partir de la solucin de trabajo combinada (25 mg/ml) preparar soluciones a
diferentes concentraciones 0,05-0,10-0,25-0,5 y 1,0 mg/ml (0,05-0, 10-0,25-0,5 y 1,0
ppm). Preparar semanalmente. Conservar en la nevera.
18

3.2.3.4.

Condiciones cromatogrficas.

1. Para la determinacin de las tetraciclinas.


Columna Spherisorb C8 5 m x 250 x 4,6 mm. Fase mvil: solucin acuosa de
cido oxlico 0,01M: acetonitrilo: metanol (600:200:200). Flujo 1,2 mL/min.
2. Para la confirmacin de los resultados cuantitativos:
2a. Columna de C18 5 mm Sun Fire 250 x 4,6 mm. Fase mvil: solucin
acuosa de cido oxlico 0,01M: acetonitrilo: metanol (850: 50: 100). Flujo 1,2
mL/min.
2b. Columna C18 Nova Pak 4 mm 300 mm x 3.9 mm. Fase mvil: solucin
acuosa de cido oxlico 0,01M; acetonitrilo: metanol (750: 150: 100). Flujo 1,0
mL/min.
Todas las determinaciones son con sistema isocrtico.
Filtrar y desgasificar la fase mvil.
3.2.3.5.

Procesamiento de las muestras

Se pesan 3 0,05 g de tejido dentro de un tubo de centrfuga de polipropileno de 50


mL, y en otro tubo de centrfuga igual al anterior, se pesan otros 3 g de tejido blanco
al cual se le aaden 60 L de la solucin estndar combinada que contiene 25
g/mL de cada antibitico (1,5 g de cada tetraciclina en los 3 g). A cada tubo de
centrfuga se le aaden 10 mL de la sol. McIlvaine buffer-EDTA y se agita con vrtex
durante 30 seg., y se centrifuga a 2500 x g, durante 10 min. Se transfiere el
sobrenadante a otro tubo de centrfuga de 50 mL, tubo 2, cuidando de no transferir
ningn tejido. Se resuspende dos veces el tejido mediante la adicin de 10 y 5 mL,
respectivamente, de la sol. McIlvaine buffer-EDTA al primer tubo y agitacin con
vrtex. Despus de centrifugar a 2500 x g, durante 10 min., se transfiere el
sobrenadante al tubo 2.
Una vez reunidos los tres extractos en el tubo 2, se centrifuga a 2500 x g por 20
min., y se filtra el sobrenadante a travs de un filtro GB en el embudo Buchner,
recolectando el filtrado dentro de una fiola Kitasato de 125 mL de capacidad,
aplicando vaco.
Se lava el tubo de centrfuga dos veces con 2 mL de sol. McIlvaine buffer-EDTA y se
filtra a travs del Buchner.
A un grupo de cartuchos SPE en el Manifold se le aaden 20 mL de metanol seguido
de 20 mL de agua y se descarta el eluato. Se filtra el lquido contenido en la fiola
Kitasato a travs del cartucho y se lava el Kitasato dos veces con 2 mL de sol.
McIlvaine buffer-EDTA y con 10 mL de agua y se transfiere al sep-pak. Al finalizar la
filtracin a travs del sep-pak, se pasa una corriente de aire por 2 min., con la
finalidad de que el cartucho se seque. Se eluye el seppak seco mediante la adicin
de 3 mL de sol. metanlica de cido oxlico (1,26 g%o), cuidando la velocidad de
19

filtracin, ya que esta solucin pasa mucho ms rpido que la solucin acuosa. Se
recoge el eluato en un vial, al cual se le aaden 2 mL de agua destilada, de manera
de tener la muestra en 5 ml. Si es necesario, antes de inyectar en el cromatgrafo se
filtran las muestras por cartucho de filtracin de 13 mm id. 0,45 mm con Luer-lock o
un swinnex con membrana de filtro apropiada.

IV.
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25