Laboratorio de Enzimologa

Ingeniera en Biotecnologa de los RR.NN

Docente: Valentina Venturi.
PRCTICA No. 2 RECONOCIMIENTO DE LIPASAS EN SEMILLAS DE
HIGUERILLA (Ricinus communis)
Fecha de realizacin: 11/Noviembre/2015 Fecha de entrega: 16/Noviembre/2015
Pamela Elizabeth Logroo Lpez, Johana Maricela Lozano Calva, Mara Beln Poma, Juan Clavijo.

METODOLOGA.
Para el reconocimiento de lipasas en semillas de higuerilla (Ricinus communis), primero se
trituraron las semillas de higuerilla maduras hidratadas y no hidratadas (2 horas), previamente
peladas hasta alcanzar un peso de unos 10 gramos de semillas trituradas. Se colocaron 2.0 g de
la biomasa de semilla seca no germinada en los primeros 3 Erlenmeyers (I-II-III) y luego 12 ml
de agua destilada. Luego, se agreg 2.0 ml de cido actico 0.1N al tubo Falcon II y se hirvi el
de la muestra III durante 5 minutos (la I es el control). Se realiz la misma metodologa para
semillas germinadas, adicionando los extractos a los tubos Falcon IV (el testigo), V (hervida) y
VI (con adicin 2.0 ml de cido actico 0.1N). As, se midi el pH de cada uno para luego
colocarlas en una estufa a 37C durante 24 horas. Tras 24 horas de fermentacin, se aadi 2.5
ml de etanol a cada tubo.
Para la valoracin cido-base de cada una de las muestras se consider como reactivo valorante
al NaOH 0.1N. Antes de la titulacin, se agreg 2.0 ml de cido actico 0.1N al resto de las
muestras (I-III-IV-V), para igualar las condiciones del ensayo. Se carg la bureta con 5 mL de la
disolucin de NaOH 0,1N y 5 mL de fenolftalena al 0.1% en etanol. Se enras y comenz la
valoracin, agitando continuamente, hasta viraje del indicador.
RESULTADOS Y DISCUSIN.
En la experiencia de laboratorio se identific la actividad de las lipasas en semillas de Ricinus
communis; para esto se tom en cuenta dos tipos de muestras: semillas de higuerillas secas, no
hidratadas y semillas de higuerilla germinadas de acuerdo a lo descrito en la metodologa.
Primero se midi el pH de cada una de las seis muestras, teniendo como resultados: un pH
neutro para las muestras blanco I y IV respectivamente y un pH cido que vara entre 5 a 6 para
las dems muestras (Ver Tabla. 1), gracias a estos pH se pudo identificar la presencia de lipasas
en las muestras de higuerilla preparadas en el laboratorio.
Tabla 1. Muestras de semillas de higuerillas segn el experimento realizado en el laboratorio.
Muestra
s
I
II
III
IV
V

Semillas

cido actico

Hervida

pH

NaOH (ml)

No germinadas (blanco)
No germinadas
No germinadas
Germinadas (blanco)
Germinadas

No
Si
No
No
No

No
No
Si
No
Si

7
4,5
6
7
5

19.2
13
16
15
16

VI
Germinadas
Si
No
6
12
La valoracin de estas muestras se hizo con hidrxido de sodio (0,1N) y como se utiliz como
indicador a la fenolftalena. El volumen del valorante para cada una de las muestras en dicha
titulacin fue diferente, siendo 19,2 ml de valorante para la muestra blanco de semillas de
higuerilla secas y 15 ml para la muestra blanco de las semillas germinadas. ( Ver Tabla. 1); sin
embargo todas las muestras alcanzaron el punto de equivalencia, esto se pudo determinar
mediante el cambio de color de las muestras. Cada una de las muestras de torn de un color
salmn a rosado plido (Ver Anexo 1), lo que indica la neutralizacin de dichas muestras.
La actividad hidroltica de las lipasas se pudo determinar mediante la cuantificacin indirecta de
los cidos grasos (Ver Tabla. 2). Estos cidos grasos se formaron durante la hidrlisis del aceite
de Ricinus communis por la fermentacin del mismo en cada una de las muestras tratadas; para
esto se tom en cuenta: los volmenes de cada una de las muestras, el cual corresponde a 18,5
ml para todas ellas, los volmenes obtenidos luego de la titulacin de cada una de las muestras y
la concentracin del valorante. En pH neutro no se produce hidrlisis (Ver Anexo 2).
Tabla 2. Concentracin de cidos graos liberados por lipasa en las muestras que contienen
semillas de higuerilla.
Muestra
s
I
II
III
IV
V
VI

Semillas
No germinadas (blanco)
No germinadas
No germinadas
Germinadas (blanco)
Germinadas
Germinadas

Concentracin de cidos grasos

liberados por lipasas (mol/ml).
33,51
17,29
5,405
16,21

Camacho y Carvajal (2014) en su estudio sobre mtodos para cuantificar la actividad enzimtica
de enzimas comerciales; cuantificaron la actividad enzimtica de la lipasa presente en una
emulsin de goma arbiga/aceite de oliva. Esta hidrolasa acta sobre el sustrato en la interfase,
por esta razn se requiere gran precisin para la evaluacin de su actividad. Segn los autores,
el mtodo ms comnmente usado para determinar la actividad de las lipasas mide los cidos
carboxlicos libres o residuos de cidos grasos generados durante la hidrlisis de los sustratos
nativos, por titulacin. De esta manera ellos procedieron a calcular los cidos grasos a travs de
los equivalentes de NaOH usados en la titulacin, obteniendo en su trabajo como resultado 30
mol de cidos grasos/ml de muestra.
En cuanto a la medicin de pH Canter (1998) al igual que Escobar (2012) en sus investigaciones
identifican la presencia de lipasas en muestras de Ricinus communis, esto se debe a que esta
enzima puede ser detectada durante el proceso de fermentacin de dichas semillas. Adems un
pH cido es el ptimo para que cumpla con su actividad hidroltica, puesto que este tipo de
hidrolasas se encuentran activas entre un pH de 4,5 y 5.
La hidrlisis de los triglicrido en grasas o aceites se debe a la accin hidroltica de la enzima
lipasa, dando como resultado la liberacin de cidos grasos y glicerol. La actividad de estas
enzimas depende en gran parte del estado de agregacin del sustrato y tienen aplicaciones
biotecnolgicas en reacciones de sntesis e hidrolisis de triglicridos (TAG) y otros steres que a

su vez tienen aplicaciones en produccin de sabores, frmacos, agroqumicos, cosmticos,

detergentes, biodiesel, etc. (Jaeger & Eggert, 2002).
De acuerdo a los resultados obtenidos en la prctica de laboratorio y segn la bibliografa
consultada se puede concluir que esta experiencia fue un xito, ya que se pudo determinar la
presencia de lipasas en las muestras con Ricinus communis, gracias a la hidrlisis del aceite de
ricino contenido en sus semillas.
Conclusin.
La cuantificacin de la actividad enzimtica de las lipasas presentes en las muestras de Ricinus
communis se hizo tanto para semillas secas como germinadas, esto se debe a que la actividad de
estas enzimas no solo est presente durante la germinacin, como en la mayora de oleaginosas;
sino que tambin se encuentran activas en las semillas sin germinar. Esto se logr hacer
mediante un mtodo de estimacin que midi los cidos carboxlicos libres o cidos grasos
generados durante la hidrolisis del aceite de ricino, por titulacin; dndonos como resultados:
33,51 (muestra seca II), 17,29 (muestra seca III), 5,405 (muestra germinada V) y 16,21
(muestra germinada VI). Lo cual indica que se encontr mayor actividad enzimtica de lipasas
en las muestras con semillas de higuerilla secas, que en las muestras que contenan semillas
germinadas.
CUESTIONARIO.

1. Describa la metodologa a seguir para detectar actividad de lipasas en semillas

de plantas.
a. Recoleccin, lavado y extraccin del aceite de la semilla.
Se inicia la recoleccin de semillas con diferentes caractersticas fsicas,
observando que los racimos secos sean los que contienen la semilla madura que
se utilizara en el trabajo (Martnez, 2013).
Las semillas recolectadas se lavan con agua destilada y se cortan en pequeos
pedazos; posteriormente son llevadas a un matraz con acetona por 24 horas a
temperatura ambiente con agitacin manual para extraer el aceite (Martnez,
2013).
Transcurridas 24 h, la solucin se filtra en un embudo Buchner al vaco. El
filtrado se evapora en un rotavapor a 60C para eliminar la acetona contenida. El
aceite obtenido se pesado para realizar los clculos de rendimiento (Martnez,
2013).
En el slido recuperado en el papel filtro se encuentra la lipasa, la cual se deja
secar por un periodo de 24 horas a temperatura ambiente, una vez seco el
material es pesado y conservado a 4C hasta su uso (Bello, 2000).
b. Reaccin de Hidrlisis con lipasas.
Para comprobar la actividad cataltica que realiza la enzima de forma natural en
la hidrlisis de steres, especialmente de triacilglicridos se prepara la reaccin
que se describe a continuacin (Martnez, 2013).

Se elabora un blanco que sirve de referencia para seguir el avance de la reaccin.

En un matraz se deposita cuidadosamente 1 g de aceite; 0.6 ml de CH3COOH 0.1N pH 4.7; 0.1 g de enzima; se agita manualmente por 3 minutos.
Se prepara el bao mara a 37 C donde se coloca las muestras por 24 h.
La reaccin es monitoreada por medio de cromatografa en capa fina por 5 h
ya que se reporta que en este tiempo existe un avance de 80% en la reaccin
(Longenecker H.E. et al. 1935).
Una vez cocluido el tiempo de reaccin se agrega etanol al 95% caliente y se
proce a titular con NaOH 0.1 N usando fenolftalena como indicador.
c. Activacin de la Enzima.
Se utilizara el mtodo propuesto por Melek Tter para activar las lipasas en una
solucin buffer pH 4 (Tter, M 1998).
Se prepara en la solucin buffer pH 4 citrato-fosfato (KH2PO4 /C6H8O7) y se
conserva hasta su uso a 4C.
En un matraz Erlenmeyer, se pesa la enzima, se vierte la solucin buffer y se
conserva a 4C por 4 horas.
Concluido el tiempo de la reaccin se filtra al vaco para obtener la enzima
que se sec por 24 horas a temperatura ambiente.
d. Reaccin de Transesterificacin.
Con la enzima ya activada se realiza las reacciones de transesterificacin, que se
llevan a cabo en matraces de 25 ml. Se coloca en ellos triacilglicridos, alcohol,
lipasas y disolvente en diferentes proporciones (Martnez, 2013).
2. La actividad de las lipasas puede variar en funcin de la edad de la semilla o
del estado de germinacin de la misma?
En las semillas de las plantas, las lipasas suelen aparecer principalmente con la
germinacin, sobre todo en las semillas oleaginosas, que usan los cidos grasos
como fuente de energa para el desarrollo del embrin. En los cereales se desconoce
su localizacin, aunque se piensa que se encuentran en el endospermo, a no ser que
las existentes se deban a contaminaciones con algn microorganismo (Bello, 2000).
De esta manera se puede concluir que la actividad de las lipasas vara
considerablemente en funcin del estado de germinacin de las semillas.
3. Qu efecto ejerce la acidificacin del medio para medir actividad enzimtica?
La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo la
reaccin. La curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima (Fig.
2). En el caso ms general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual
la actividad es mxima se denomina pH ptimo; dicho pH no tiene por qu coincidir
con el pH intracelular (Tena & Jorrn, 2014). La relacin entre el pH y la actividad
depende del comportamiento cido-base del enzima y del propio sustrato. Sustrato y
enzima (centro activo) pueden contener grupos funcionales cidos y bsicos, siendo

su grado de disociacin dependiente del pH, lo que determinar, entre otros

aspectos, la conformacin de la protena, la capacidad de unin del sustrato al centro
activo del enzima (Km) y la capacidad de transformacin del sustrato (kcat) (Tena &
Jorrn, 2014). Los estudios cinticos a diferentes valores de pH nos proporcionan
informacin sobre el mecanismo cataltico de los enzimas y la naturaleza de los
aminocidos ms directamente implicados en la catlisis.

4. A qu tratamiento corresponde el control del bioensayo?

Reconocimiento de lipasas en semillas de higuerilla (Ricinus

communis). Dejar un espacio PREGUNTAR A LA PROFE.
5. Cmo puede cuantificar el contenido de glicridos en una muestra de semillas
de oleaginosas?
ACIDOS GRASOS
El anlisis de los cidos grasos de cualquier alimento requiere de las siguientes
etapas:
1. Obtencin de la materia grasa por mtodo de extraccin en fro con mezcla de
solventes.
2. Derivatizacin de los cidos grasos.
Los mtodos de derivatizacin se pueden dividir en cuatro categoras:
catlisis bsica
catlisis cida, bsica
diazometano
otros mtodos de esterificacin
3. Anlisis por cromatografa gas- lquido (FAO, 2014).
6. Cmo puede detectar presencia de fosfolpidos?
Se los puede determinar gracias a la cromatografa en capa fina (TLC), en donde
actualmente se utiliza dos diferentes mtodos de anlisis de lpidos. En el primer

enfoque, las diferentes clases de lpidos estn separadamente extrados y luego cada
clase de lpidos se analiza a travs de la metodologa nica de TLC. En el segundo
enfoque, mezclas complejas de lpidos se separan en las placas de TLC y, a
continuacin se caracteriza. Las clases de lpidos se dividen en lpidos neutros como los
triglicridos (forma que se forma una molcula de glicerol y tres cidos grasos), los
lpidos polares como los fosfolpidos y colesterol. Idealmente, los lpidos son
depositados en una placa de gel de slice TLC con sistemas de solventes secuencial
corriendo en la misma dimensin. Relativamente lpidos no polares como lpidos
neutros, cidos grasos y colesterol migran a posiciones nicas en la mitad superior del
cromatograma, mientras que los lpidos relativamente polares como los fosfolpidos y
esfingolpidos estn separados en la mitad inferior del cromatograma (Witman &
Moskovitz, 2011).
El poder de la tecnologa para la deteccin de lpidos de TLC cuantitativo es
impresionante. Es posible detectar la presencia de 25 ng de fosfolpidos, 25 ng de
colesterol, y 50 ng de lpidos neutros y cidos grasosos (Witman & Moskovitz, 2011).

REFRENCIAS BIBLIOGRFICAS.
Bello, J. (2000). Ciencia Bromatolgica Principios Generales de los Alimentos. Madrid: Diaz
de Santos.
Camacho, T., & Carvajal, C. (2014). Diferentes mtodos para cuantificar la actividad
enzimtica en hidrolasas de importancia comercial . Tungurahua. Ecuador :
Universidad Tcnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos.
Carrera de Ingeniera Bioqumica.
Canter, L. (1998). ENZIMAS. Espaa, Editorial Mc Graw Hill. Pag 150-151.

Escobar

N. (2012). INGENIERA DE LAS ENZIMAS

http://ingenieranatividad.blogspot.com/fermentacion-levaduras.html

Disponible

en:

Jager, K & Eggert, T. (2002). Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13: 390-397.
FAO. (2014). Departamento de Agricultura. Recuperado el 15 de Junio de 2016, de Mtodos
Analiticos para la deterincion e humead, alchool, energia, materia grasa y colesterol en
alimentos: http://www.fao.org/docrep/010/ah833s/ah833s16.htm
Longenecker H.E., Haley D. E (1935). Ricinus Lipase its Nature and Specifity.J.Am.Chem.Soc.
57 (11): 2019
Martnez, M. (Junio de 2013). Universidad Veracruz. Recuperado el 12 de Junio de 2016, de
Lipasas Contenidas en la semilla de Ricinus communis utilizada como biocatalizador en
la
trasesterificacion
de
triacilglicridos:
http://cdigital.uv.mx/bitstream/123456789/34029/1/martinezlaramaribel.pdf
Tena, M., & Jorrn, J. (2014). Etudio cintico de la actividad invertasa de levaura de panadea.
Recuperado el 12 de Junio de 2016, de Departamento de bioqumica y biologa
molecular, Campus Universitario de Rabanales: http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiol-mol/pdfs/32%20INVERTASA%20CIN%C3%89TICA.pdf
Tter Meleck (1998). Castor Bean Lipase as a Biocatalyst in the Esterification of Fatty Acids to
Glycerol. Department of ChemicalEngineering 75 (3): 417 420.
Witman, G., & Moskovitz, M. (2011). Dynamiv Adsorbents Inc. Recuperado el 15 de Junio de
2016, de http://www.dynamicadsorbents.com/spanishweb/chromatographylipids.htm

ANEXOS.
Anexo I.

Fig 1. Muestras con semilla de higuerilla

Fig 2. Muestras con semilla de higuerilla

germinadas

no germinadas

Anexo II.
a) Clculo de la concentracin de cidos grasos liberados por lipasas.

mol de acidos grasos

ml muestra

( AB)100M
=
V rxn

A= volumen de NaOH gastado por la muestra

B= volumen de NaOH gastado por el blanco
M= molaridad del NaOH

V rxn = volumen del medio de reaccin

Semillas secas no germinadas.

Muestra I

umoles de acido grasos 19,219,2/ml10000,1 M

=
ml muestra
18.5 ml

umoles de acido grasos

=00,00
ml muestra

Muestra II.

umoles de acido grasos 1319,2/ml10000,1 M

=
ml muestra
18,5 ml

umoles de acido grasos

=34,44
ml muestra

Muestra III.

umoles de acido grasos 1619,2 /ml10000,1 M

=
ml muestra
18.5 ml

umoles de acido grasos

=17,29
ml muestra

Semillas germinadas
Muestra IV

umoles de acido grasos 1515 /ml10000,1 M

=
ml muestra
18.5 ml

umoles de acido grasos

=00,00
ml muestra

Muestra V

umoles de acido grasos 1615 /ml10000,1 M

=
ml muestra
18.5 ml

umoles de acido grasos

=5, 405
ml muestra

Muestra VI

umoles de acido grasos 1215/ml10000,1 M

=
ml muestra
18.5 ml

umoles de acido grasos

=16,22
ml muestra