Clonacin.

Despus de la exitosa clonacin de ovinos, bovinos y caprinos

numerosos laboratorios intentaron clonar cerdos. A pesar de los esfuerzos,
en esta especie los resultados no fueron buenos inicialmente. Esto motivo
que numerosos grupos hayan continuado con la produccin de cerdos
transgnicos por microinyeccin pronuclear. As se han generado cerdos con
un incremento de la conversin alimenticia, originados por la introduccin
de la construccin compuesta por metalotioneina + hormona del
crecimiento (Nottle et al,.1999). Recientemente tambin se han obtenido
cerdos destinados a aumentar la asimilacin del fsforo y reducir la
concentracin de este elemento en las heces, mediante la expresin de la
fitasa bacteriana en la glndula salivar de cerdos, esto tendra beneficios al
reducir la polucin ambiental. La fitasa es una enzima que desdobla el cido
ftico liberando el fsforo del mismo (Golovan et al., 2001). Tambin se ha
alterado la leche de los cerdos para incrementar la salud y el desarrollo de
los lechones esto se ha logrado sobreexpresando alfa-globulina bovina
(Wheeler et al 2001). Estas tcnicas de modificacin gentica se realizaron
en estos trabajos basadas en la introduccin del DNA forneo por
microinyeccin en la cigotas. Esta metodologa es altamente ineficiente (12% de insercin estable) y produce un alto grado de mosaiquismo debido a
la insercin tarda durante el desarrollo embrionario temprano.
El primer cerdo producido por clonacin de clulas somticas fue producido
en el ao 2000 (Polejaeva et al) desde esta fecha se han hecho importantes
progresos. Entre ellos la produccin de los primeros cerdos por
incorporacin de genes al azar (Park et al., 2000; Lai et al., 2001 y 2002). Si
bien esta modificacin aumenta la eficiencia en la obtencin de animales
transgnicos, la integracin del transgen contina siendo al azar, por lo cual
la expresin del mismo es esencialmente impredecible. Para solucionar este
problema se han estado reclonando los animales con expresin adecuada
(Salamone et al., 2004) para tener animales de produccin predecible, pero
an son necesarias futuras mejoras.
La tcnica de recombinacin homloga permite la modificacin precisa de
los genes existentes, evita los problemas derivados de los efectos
posicinales y de inactivacin por insercin y permite adems la
inactivacin de genes especficos as como el reemplazo de un gen por otro.
La utilizacin de la tcnica de recombinacin homloga permite aplicaciones
sumamente atractivas en el campo de la produccin animal (Piedrahita,
2000). En cerdos la transgnesis en sitio especifico o recombinacin
homologa ha sido lograda exitosamente (Day et al., 2002; Lai et al., 2002;
Ramsoondar et al., 2003; Sharma et al., 2003).
Los cerdos son fisiolgicamente similares a humanos y ha habido intenso
inters en utilizarlo para transplante de rganos, as como, para modelo de
enfermedades. La produccin de rganos y tejidos animales humanizados
para ser utilizados en transplante ha despertado tambin un inters
enorme. Esto implicar la expresin de ciertas protenas humanas y el
silenciamiento de algunas protenas de origen animal. Esto puede lograrse
creando cerdos por recombinacin homologa mediante el llamado knockout
de la alfa-1,3- galactosiltransferasa. La obtencin de productos para
transplantes es probable que se requieran sucesivas modificaciones
genticas.

La expresin de protenas de valor biolgico especialmente de inters

farmacolgico usando como biorreactores animales transgnicos, ha
demostrado ser un sistema muy eficiente de produccin en numerosas
especies. Las limitaciones han sido el nivel de expresin, modificaciones
post-transcripcionales y el efecto biolgico de las protenas exgenas sobre
el animal que las produce. Una vez que el animal fundador ha sido obtenido
tambin es una limitante llegar a tener un buen nmero de animales a
escala comercial. En el porcino se ha seleccionado las vesculas seminales
como rgano de expresin de dichas molculas. Las ventajas que tienen
dichas glndulas incluyen el hecho que el semen luego de producida la
pubertad, es generado constantemente y por lo tanto tambin el fluido
seminal, adems se puede colectar en una forma no invasiva, no dolorosa y
que no requiere gran entrenamiento. Un cerdo transgnico puede producir
por muchos aos y ser reemplazado por reproduccin simple en forma no
muy costosa. El plasma seminal es una secrecin externa y una vez
producida no es reabsorbida, es mas, el exceso de secrecin prosttica es
eliminada por uretra a travs de la orina. Esto permitira expresar molculas
con fuerte actividad biolgica y estara ofreciendo ventajas frente a la
glndula mamaria donde ya se ha observado la reabsorcin linftica de
protenas secretadas. Por otro lado ha sido demostrado que en ratones a los
que se le incorporo el transgen de la hormona del crecimiento para ser
expresado en vesculas seminales, no se incrementan los niveles en sangre
de dicha hormona cuando se llega a la pubertad. Incluso cuando se
expresan niveles de 500 ug/ml en el fluido seminal (Sirad et al., 2002).
Adems los espermatozoides son muy sensibles a cambios de pH y a las
proteasas y el fluido seminal esta preparado para proteger a los
espermatozoides a travs de anti-proteasas, esto es interesante porque
probablemente sera posible aprovechar esta caracterstica para preservar
protenas frgiles. Las protenas estn en el plasma seminal en forma
soluble y no forman micelas como en la leche donde las protenas pueden
ser atrapadas en las mismas. Los espermatozoides pueden ser
centrifugados y el plasma seminal diluido y purificado usando todo tipo de
columnas sin problemas de formacin de cogulos.
Los cerdos son una especie con una eficiencia reproductiva importante, un
macho heterocigoto puede inseminar unas 50 cerdas por mes utilizando
inseminacin artificial y cada una de estas puede dar origen a 10 lechones,
5 de los cuales sern machos y 2-3 transgnicos, originando un grupo de
150 lechones en 5 meses, por lo que al ao habra un numero suficiente de
machos para empezar a producir a escala industrial.
A la pregunta cuales sern sus aplicaciones agropecuarias en nuestro
sistema de produccin? La respuesta es que nuestra capacidad de
imaginacin e innovacin es insuficiente. La aplicacin ms inmediata ser
la multiplicacin de animales de elite. La utilizacin de animales clonados
facilitara la produccin y difusin de animales transgnicos. Por ejemplo,
existe inters en Europa en reemplazar el gen PrP que torna a los bovinos
susceptibles al virus de la vaca loca por otro que le otorgue mayor
resistencia. Numerosas compaas ya han producidos animales transgnicos
y clonados especialmente expresando nuevas protenas en leche de valor
farmacutico (Baguisi et al., 1999, Salamone et al. 2005). Hay proyectos

que intentan producir cerdos modificados genticamente para producir

semen de un solo sexo, o utilizar cerdos como modelo para enfermedades
humanas como la arteriosclerosis, etc. (Forsberg, 2005). Todo esto indica la
enorme potencialidad de esta tcnica y el futuro desarrollo que pueda
alcanzar en la especie porcina.
- Tcnicas de clonacin de embriones. Con base en los conceptos de la
clonacin descritos anteriormente, se observa que existen tres tcnicas que
han sido utilizadas en animales de granja o de laboratorio para producir
embriones genticamente idnticos. Dos de ellas cabran en el concepto de
la clonacin en un sentido horizontal: la particin o divisin de embriones
por microciruga, y la separacin y cultivo de blastmeros aislados por
mtodos enzimticos o mecnicos (Agca y col 1998; Rexroad y Powell
1997). La tercera entra en el concepto de la clonacin en un sentido
vertical: la transferencia nuclear a partir de clulas somticas de adulto o
embrionarias (Campbell y col 1996) o de blastmeros de embriones (Prather
y col 1987; Savoir y col 1997; Tanaka y col 1997) entre otras clulas (Tabla
5).

- Particin o divisin de embriones. En la dcada de los 70 se pensaba que

los embriones en fases tempranas de la segmentacin no sobreviviran
despus de una microciruga. Fue en los aos ochenta cuando se demostr
que las mrulas y blastocistos de los animales domsticos eran capaces de
desarrollarse despus de una particin y producir nacimientos viables (Rorie
y Godke 1987). Actualmente la particin de embriones permite la
produccin de gemelos idnticos al dividir el embrin original por mtodos
microquirrgicos. Las evidencias experimentales indican que existe una

relacin inversa entre el nmero de secciones que se le hagan al embrin y

el porcentaje de xito. Las tasas de produccin de gemelos monocigticos
van desde poco mas de 30% en bovinos y ovinos (Edwards y Beard 1998;
Herman y col 1998; Williams y col 1983) siendo hasta casi 70% en bovinos,
con porcentajes de gestacin superiores a 60% (14) e incluso, en algunos
casos, equivalentes a 100% (Williams y col 1983).
El nmero de clulas que tenga el embrin no solo limita el nmero de
segmentos en que pueda dividirse, sino que tambin tiene incidencia sobre
otros aspectos. Tpicamente se utilizan embriones en etapa de mrula o
blastocisto (Baker 1985; Seidel 1993). Esta estrategia permite utilizar una
de las secciones para otros fines experimentales como la determinacin del
sexo del embrin, mientras que el resto se cultiva o congela para despus
transferirse a hembras receptoras previamente sincronizadas para
mantener la gestacin (King y col 1992; Schmidt y col 1992; Palma y col
1995).
Los embriones en etapa de blastocisto son seccionados de manera que se
dividan en dos partes iguales tanto la masa celular interna (MCI como el
trofoectodermo). Es recomendable emplear soluciones que deshidraten
ligeramente al embrin (por ejemplo, sacarosa 200mM), con lo que se
reduce el dao al trofoectodermo durante su particin. Una vez cortadas, las
mrulas compactas y los blastocistos no necesariamente deben ser
introducidos a zonas pelcidas, teniendo una sobrevivencia aceptable al ser
transferidas en hembras receptoras; aunque existen informes que indican
tasas de supervivencia de 15% en medios embriones (demi-embriones) sin
zona pelcida y de 35% cuando se transfieren con zona pelcida. En este
ltimo caso las tasas de gestacin van de 55% a 65% en bovinos (Baker
1985). Willadsen y Godke en 1995, obtuvieron tasas de gestacin de 80% en
bisecciones de embriones de ovino indistintamente si tenan zona pelcida o
no. En la tabla 6 se muestran algunos de los factores principales que
afectan las tasas de xito con esta tcnica.
- Separacin y cultivo de blastmeros aislados. En algunas especies, como
los equinos, se ha utilizado la separacin de blastmeros de embriones
previos a su implantacin para efectuar estudios de diagnstico de
enfermedades genticas. En ellos se ha determinado la viabilidad de los
embriones analizados despus de su transferencia en hembras receptoras,
encontrndose tasas de gestacin de 21% (Huhtinen y col 1997).
En humanos la separacin y cultivo de blastmeros aislados tambin han
sido utilizados en estudios de biopsias de embriones en diferentes etapas de
segmentacin con la finalidad de dar alternativas a los estudios de
diagnstico prenatal, evaluando a su vez el desarrollo embrionario in vitro
con el propsito de que se seleccionen los mejores embriones capaces de
desarrollarse en blastocistos y congelarlos mientras se evalan sus
blastmeros aislados (Geber y col 1995; Pierce y col 1997; Geber y Sampaio
1999).
La tcnica de separacin de los blastmeros implica la remocin de la zona
pelcida, ya sea por mtodos qumicos, mecnicos o enzimticos, para
posteriormente obtener los blastmeros mediante aspiracin, extrusin o

disminucin de sus interacciones en soluciones libres de Ca2+ y Mg2+

(Savoir y col 1997; Saito y Niemann 1991; Cheong y col 1993; Reicheit y
Niemann 1994). Los blastmeros de rata aislados en la etapa de dos clulas,
son capaces de formar embriones completos (Matsumoto y col 1989). En el
ratn se han obtenido gemelos idnticos removiendo la zona pelcida de
embriones de dos clulas y cultivndolos separadamente previo a su
transferencia (Williams y col 1984). En otras especies, el xito del
experimento se ha determinado como dependiente de diversos factores. As,
por ejemplo, en porcinos y ovinos la baja eficiencia en la obtencin de fetos
se debe a la baja sobrevivencia in vivo.
En embriones libres de zona pelcida en fases previas a la compactacin
(Williams y col 1984). Esta tasa de nacimientos puede aumentarse si se
utilizan embriones encapsulados en gel de azarosa (Herman y col 1998;
Lehn-jensen y col 1983). De manera que algunas estrategias para suplir a la
zona pelcida son el empleo de capsulas artificiales de azarosa (Willadsen
1979) o de alginato de sodio (Eaton y col 1990; Adaniya y col 1993), o
matrices extracelulares como la fibronectina y laminina (Saito y niemann
1991; Wilton y Trounson 1989).
EI nmero de clulas que forman al embrin separado constituye otro factor
importante en la probabilidad de xito. Willadsen en 1989, demostr que la
tasa de gestacin en ovinos y bovinos se reduca conforme se hacan grupos
de clulas de nmeros menores. La mayor tasa de gestacin que obtuvo
este autor fue del 66% al utilizar embriones de dos clulas o dos grupos de
clulas provenientes de embriones de hasta ocho clulas. Cuando utiliz
embriones de cuatro clulas o pares de clulas de embriones de ocho
clulas, la tasa de gestacin se redujo a 50%. Cuando se utilizaron los
blastmeros individuales provenientes de embriones de ocho clulas, la tasa
de gestacin fue de slo 5%. En todos los casos en los que se separaron las
clulas embrionarias, el nmero de clulas formando el blastocisto se
reduca linealmente con el nmero de "divisiones" a la que era sometido el
embrin. Un dato importante de este estudio es que cuando se utilizaron las
clulas individuales de los embriones de ocho clulas, el desarrollo de la MCI
se vea fuertemente comprometido al extremo de formarse slo vesculas
sin la presencia de este grupo de clulas.

Aparentemente, en los blastmeros aislados se promueve ms fcilmente la

apoptosis y se afecta preferentemente a las clulas de la MCI. Este proceso
contribuye a la incidencia de abortos debido a que la poca cantidad de
clulas de la MCI reduce la viabilidad fetal (Chan y col 2000).
En monos esta misma tcnica ha sido aplicada a partir de embriones de
ocho clulas, en la que se separan los blastmeros mientras son mantenidos
en medio libre de Ca2+ y Mg2+ ,y luego se reagrupan por pares que se
introducen en zonas pelcidas para que puedan desarrollarse hasta la fase
de compactacin y as transferirlos a hembras receptoras. El 8% de los
embriones tratados brindaron cras vivas (Chan y col 2000).
- Transferencia nuclear. Una tcnica que incrementa el potencial de
desarrollo de los blastmeros aislados de embriones de ocho clulas o de
etapas mas tardas de la segmentacin es la transferencia nuclear
(Willadsen 1989). Esta tcnica permite la produccin de individuos

genticamente idnticos originados a partir de un solo donador de ncleos

(Romo 1994). Implica la insercin por mtodos qumicos, fsicos, biolgicos o
mecnicos del ncleo de una clula donadora que puede ser tomada de
varios tejidos a la cual se le llama carioplasto, con un ovocito activado y
carente de ncleo, o con un huevo fertilizado al que se le hayan extrado los
proncleos (Edwards 1998; Wlladsen 1989; Meng y col 1997; Bromhall
1975). Contrariamente a lo que pudiera pensarse, el desarrollo de esta
metodologa es ms bien antiguo, si bien hasta hace poco ha acaparado el
inters no slo de la comunidad cientfica, sino del pblico en general. En la
tabla 7 se muestra una cronologa de los eventos ms importantes en la
obtencin de organismos clonados por transferencia nuclear.
Es importante destacar que tanto el citoplasma que recibir al ncleo
transferido como el propio ncleo deben tener caractersticas fisiolgicas
especficas para que se realice con xito tanto la transferencia nuclear como
el desarrollo posterior de la clula reconstituida y, eventualmente, el
desarrollo del nuevo organismo. La clula que contiene al ncleo que ser
transferido (carioplasto) debe tener caractersticas particulares que
permitan cierto porcentaje de xito antes de ser colocado en el espacio
perivitelino adyacente a la membrana del ovocito (citoplasto) y se fusione.
Experimentalmente el uso de citocalacina B para bloquear la polimerizacin
de microfilamentos, y de colchicina para la de los microtbulos, permiten
controlar los movimientos del citoesqueleto en el carioplasto, provocar una
elasticidad de la membrana plasmtica y favorecer as la enucleacin
mediante el uso de micropipetas, sin romper la membrana plasmtica
(Edwards 1998; Prather y col 1987; Cheong y col 1993; McGrath 1983;
Prather 1990; Yong 1998).
Si se utiliza un embrin en segmentacin como carioplasto, tambin
requerir de la micromanipulacin para obtener sus blastmeros. Uno de
estos ltimos se transfiere dentro del ovocito en metafase II desprovisto
previamente de su ncleo, y se fusiona con l. Mediante este proceso, el
ovocito se activa y da inicio a su desarrollo como un nuevo embrin. En
algunas especies la sola transferencia del carioplasto inicia la activacin del
ovocito (Edwards 1998; Prather 1990; Bromhall 1975; McLaren 1984)

La primera etapa de esta metodologa es la obtencin del citoplasma

adecuado para que sirva de aceptor del ncleo. A los ovocitos en metafase II
se les retira el ncleo, en el caso de huevos fertilizados, se les extraen los
proncleos en microscopa de contraste de fases. Para confirmar que el
material cromosmico haya sido totalmente extrado, se aplican tinciones
de ADN en el citoplasma del ovocito. El colorante ms utilizado para esta
etapa es el Hoechst 33258 para visualizar la ausencia de contenido nuclear
en los ovocitos enucleados, bajo luz ultravioleta durante perodos de menos
de diez segundos, sin efectos negativos en el desarrollo de los embriones
reconstituidos (Yong 1998; Stice y col 1993; Le Bourhis y col 1998).
Respecto a las caractersticas del carioplasto, entre mas diferenciada est la
clula somtica, menor ser la probabilidad de xito en la transferencia
nuclear. Para que una clula sea totipotencial requiere que su ncleo sea
capaz de desarrollarse en un nuevo embrin (Solter 1996). Para ello los
genes que dan lugar al desarrollo de un organismo completo deben estar
presentes an cuando no todos sean expresados (Casas y col 1998).
Algunos de los genes que deben expresar las clulas totipotentes son el gen
Tnap, los factores de transcripcin, los genes Oct 3/4, el proto-oncogen ckit,
y la ADN metiltransferasa Mt (Urven y col 1993).

La experiencia con mltiples tipos celulares tanto embrionarios como de

tejidos diferenciados ha demostrado que el uso de ncleos de blastmeros
obtenidos de embriones de dos clulas es mas eficiente que los de ocho
clulas; asimismo, los ncleos de blastmeros de las clulas de la MCI son
mas eficientes que los de las clulas de la granulosa, por ende, las clulas
embrionarias son mas efectivas que las clulas de individuos adultos
(Edwards 1998). A su vez, los ncleos de las clulas de la MCI son ms
efectivos que los de las clulas del trofoectodermo (McLaren 1984). Cheong
et al (1993) encontraron que al utilizar ncleos de blastmeros de
embriones de dos, cuatro y ocho clulas que se hallaran en la fase
temprana del ciclo celular (fase G 1 de la segunda divisin), como
donadores de ncleos para ser transferidos, los de dos clulas daban 78%
de blastocistos y 29% de ratones nacidos vivos a partir de los embriones
reconstituidos, mientras que los de cuatro clulas daban 71% de
blastocistos y 22% de ratones nacidos vivos, y los de ocho clulas daban
46% y 17% respectivamente. En resumen, los ncleos obtenidos de
embriones en las fases tempranas de la segmentacin tienen la ventaja
sobre los provenientes de clulas diferenciadas en que los primeros
revierten con facilidad los cambios que sufren previo a su diferenciacin;
mientras que los ltimos deben revertir los cambios que ya han sufrido
durante ms de 30 ciclos de divisiones celulares.
Es por ello que una transferencia nuclear eficiente, con un desarrollo a
trmino del huevo manipulado, depender de la reprogramacin adecuada
del ncleo donador. Las macromolculas del tipo del ARN mensajero y las
protenas almacenadas en el ovocito slo soportan el desarrollo embrionario
durante un tiempo relativamente corto. Entre ms corto sea este perodo, se
requerir menor tiempo para la reprogramacin. Conforme el embrin sufre
cambios mayores y crece, sus clulas requerirn mayor tiempo y ser
probable que esta reprogramacin no se lleve a cabo adecuadamente. En
algunas especies, la activacin de la transcripcin del genoma reintroducido
ocurre hasta el estado previo al blastocisto, por 10 que depende de la
transcripcin del ARN materno. En embriones productos de una fertilizacin
normal, este proceso se lleva a cabo a diferentes tiempos en diferentes
especies: a partir del estado de dos clulas en ratones y caprinos; de cuatro
clulas en porcinos; y en el paso de ocho a diecisis clulas en embriones
de ovinos y bovinos (Prather y col 1987). En la transferencia nuclear, la
compatibilidad entre el citoplasma recipiente y el ncleo donador, es poco
entendida an y toma parte en la reprogramacin del ncleo donado (Solter
1996).
Dentro de los cambios que deben revertir los ncleos de las clulas de
adulto durante la transferencia nuclear est la metilacin del ADN que es
esencial para el desarrollo embrionario. El genoma del ovocito est poco
metilado, mientras que en el embrin comienza a incrementarse esta
metilacin. Esto ultimo afecta la expresin de los genes, la inactivacin del
cromosoma X, la diferenciacin celular, y el imprinting (Kokalj-Vokac 1998).
Otros cambios asociados son la activacin de las histonas y modificaciones
en otras protenas nucleares. Si estos cambios no se revierten, durante el
crecimiento ocurriran modificaciones genticas de los ncleos adultos, tales

como la mutagnesis somtica, los errores mitticos, las deleciones y

trisomas (Edwards 1998).
Con el propsito de revertir los cambios en las clulas diferenciadas y as
incrementar las tasas de xito en la fusin y en el desarrollo de embriones
reconstituidos por medio de la transferencia nuclear, es importante la
sincronizacin de los ciclos celulares de las clulas donadoras de ncleos y
de los ovocitos receptores (Meng y col 1997; Solter 1996; Serrano y col
1997). Merchant en 1996, le llama a este proceso sincronizacin
nucleocitoplsmica. Como es ampliamente conocido, durante la vida fetal y
hasta la pubertad, el ovocito de los mamferos se encuentra detenido en la
etapa de diploteno de la profase de la meiosis I y sus cromosomas se
condensan poco antes de que ocurra la ovulacin por accin de las
gonadotropinas. Este estmulo promueve que el ovocito reasuma su
programa de divisin formndose el ovocito secundario con su primer
cuerpo polar, eliminando as la mitad de su material gentico. En los
mamferos adultos, el crecimiento del ovocito es continuo y termina en la
ovulacin, cuando es depositado en el oviducto en donde madura e inicia su
segunda divisin meitica (meiosis II), en la cual se vuelve a detener, solo
que esta vez hace en la metafase II. El ovocito arrestado en metafase II
continuar su divisin nicamente si es activado por el espermatozoide
durante la fertilizacin, en cuyo caso culminar su segunda divisin meitica
y formar el segundo cuerpo polar (Merchant 1997; Loi y col 1998;
Wassarman 1999).
Durante la maduracin y la activacin, el citoplasma del ovocito modifica
sus propiedades en la medida en que la clula es liberada del arresto en la
metafase II y es activada con la fertilizacin mediante una serie de
descargas de calcio que promueven la reaccin cortical. Una vez ocurrida la
fertilizacin, la transcripcin del ARN materno comienza a controlar el
desarrollo en las primeras divisiones mitticas hasta la activacin del
genoma embrionario. Cuando se efecta una transferencia nuclear, la
transcripcin del genoma materno del ovocito dirige al ncleo donado
mientras que ste es capaz de asumir el control de las fases embrionarias
tempranas por s mismo (Edwards 1998).
AI igual que en las clulas que se dividen, el ciclo celular del ovocito se
encuentra controlado mediante dos factores protenicos: el factor promotor
de la mitosis de la maduracin (MPF) formado por una ciclina y la cinasa
dependiente de ciclina, y el factor citosttico (CSF) que es esencialmente el
mismo MPF pero asociado a una protena que inhibe la accin de la cinasa.
Cuando la protena inhibidora de la ciclina se degrada, la clula es capaz de
sintetizar ADN, si el inhibidor no se degrada, la clula primeramente es
incapaz de entrar a la fase S del ciclo y, en consecuencia, puede condensar
de manera prematura su material gentico. Cuando las concentraciones del
MPF se elevan, se inducen algunas alteraciones, tales como la
desintegracin o rompimiento de la envoltura nuclear (DEN), la
condensacin prematura de los cromosomas (CPC) y la reorganizacin del
citoesqueleto (Campbell y col 1996; Meng y col 1997).
Para que los eventos ocurran apropiadamente despus de la transferencia
nuclear, los niveles de MPF deben descender o ser bajos. De otro modo la

incidencia de dao cromosmico y aneuploidas puede ser alta (Meng y col

1997; Yong 1998). Si la transferencia nuclear se hace cuando el ovocito
tiene bajos niveles de MPF (siete a diez horas despus de su activacin), no
slo se presentarn menos problemas de aneuploidas, sino que adems se
mantendr intacta la envoltura nuclear y los cromosomas no se
condensarn prematuramente, por lo que continuarn su ciclo de
replicacin-condensacin de manera normal, favoreciendo la sincronizacin
nucleocitoplsmica y con ello el desarrollo del cigoto as reconstituido
(Merchant 1997).
Si se fusionan clulas en G con clulas en G, el material gentico de estas
ltimas sufre una condensacin prematura como si estuviera lista a iniciar
los movimientos clsicos de la divisin celular (mitosis). Si la fusin es entre
clulas en etapa S y G, la sntesis del material gentico se completa y el
contenido de cromosomas en el producto es aberrante, pues no slo hay
ms sino que incluso las clulas hijas sufren la falta de uno o varios de ellos,
mientras que la otra presenta ms de un par de copias de un cromosoma
(trisomas) (Serrano y col 1997). Los ncleos donadores que se encuentren
en la fase del ciclo G resultan en un mejor desarrollo que los que estn en
fases S o G, ya que es ms sencillo reprogramar un genoma que est
abierto para sufrir una replicacin, adems de que los factores citoplsmicos
tienen mayor acceso al genoma cuando las clulas donadoras estn en
dichas fases (Wilmut y col 1997). Los ncleos se inducen a entrar en un
estado de quiescencia (G) cultivando las clulas donadoras o en medios con
cantidades reducidas de suero. De esta manera se coordinan los ciclos
celulares del carioplasto y citoplasto.
Ahora bien, para la fusin de carioplastos y citoplastos se han utilizado
estmulos elctricos, virales y qumicos. La fusin elctrica y la fusin viral
se han utilizado en roedores, lepridos y ovinos. La fusin elctrica se ha
usado adems en bovinos y en monos rhesus (Meng y col 1997; Prather
1990). La fusin inducida por el virus Sendai tiene el inconveniente de que
los ncleos transferidos no sobreviven o los embriones reconstituidos no
logran segmentarse. Las tasas de xito en la fusin por virus son de 30% en
ovinos, siendo de tan solo 8% en bovinos (Prather 1990; Bromhall 1975), por
que este tipo de estmulo ya no se utiliza. Una vez efectuada la fusin, los
factores presentes en el citoplasma del ovocito enucleado y activado sern
los que reprogramen al ncleo, confirindole la habilidad para regular el
desarrollo embrionario hasta que llegue a trmino (Edwarsd 1998; McLaren
1984). Este desarrollo embrionario puede llevarse a cabo in vitro, o in vivo
en oviductos de ovino (Wlladsen 1989; Prather 1990).
Todava existe gran variabilidad de resultados con estas tcnicas, con tasas
de xito en la electrofusin de blastmeros obtenidos a partir de embriones
de ocho clulas del 90% en ovinos, 74% en bovinos, 84% en lepridos y
87% en porcinos (Prather 1990), y tasas de gestacin de 0% a 54% (1) o
hasta de 78% en bovinos. En esta ltima especie, las tasas de segmentacin
de los embriones reconstituidos varan segn el sexo de los mismos: 73%
para embriones hembras, 63% para embriones machos (Le Bourhis y col
1998).

Existe un informe interesante en bovinos que describe la transferencia

nuclear utilizando ovocitos de vacas Holstein (Bos taurus) con ncleos de
clulas aisladas de embriones Brangus (5/8 Angus, Bos taurus y 3/8
Brahman, Bos indicus).En otra etapa del estudio, utilizaron blastmeros de
embriones de ocho a diecisis clulas de ovino que se fusionaron con
ovocitos enucleados de caprino, desarrollndose hasta el estado de ocho
clulas al ser cultivados in vivo en oviducto de ovino. Lo anterior demuestra
que es factible obtener un clon a partir de dos clulas provenientes de
diferentes especies animales y cultivarlo in vivo en el aparato reproductor
de una especie no homloga (Willadsen 1989).
- Ventajas y desventajas de las tcnicas de clonacin. La clonacin a partir
de clulas de animales adultos tiene algunas ventajas y desventajas
dependiendo de la tcnica que se trate (Cuadros 4 y 5), aunque en general
todas tendran la ventaja de que al conocerse las caractersticas del
donador permitiran seleccionar a los individuos con alto valor biolgico o
productivo si las caractersticas seleccionadas dependen solo de factores
genticos, lo que no es tan probable por el efecto de las condiciones
ambientales, de manera que se desconoce hasta qu grado es un clon
realmente idntico a su donador (Lisker y Tapia 1997).

Una de las consideraciones que deben hacerse cuando se planea la

clonacin por transferencia de ncleos tornados de clulas de adultos, es
que stos reflejan la edad biolgica del donador. Esto ltimo parece ser
trivial, sin embargo tiene importancia si se analiza lo ocurrido con las
regiones terminales de los cromosomas. En estas regiones se encuentra
ADN de secuencia altamente repetida y en forma general, por tripletes o
ttradas de nucletidos repetidos, dichas secuencias se conocen como
microsatlites. Experimentalmente se ha determinado que el nmero de
repeticiones que debe tener es importante para la funcin celular. Durante
el envejecimiento, cada vez que la clula se divide el nmero de estas
repeticiones se hacen menores y permiten que se desarrollen enfermedades
propias de la edad adulta an en organismos "jvenes" (Marshall 2000).
Sin embargo, Lanza et al. (2000), observaron que en bovinos clonados por
transferencia nuclear a partir de clulas somticas envejecidas in vitro,
ocurra un aumento en la duracin de la vida replicativa de la clula as
como en la longitud de sus teloneros. As mismo, las clulas somticas que
han estado expuestas a carcingenos qumicos y radiaciones durante
perodos prolongados, en este sentido, es posible que hayan acumulado

mutaciones que pueden manifestarse durante la gestacin, como

malformaciones congnitas o predisposiciones a diversas enfermedades en
los recin nacidos (Lisker y tapia 1997)

Con la clonacin queda todava un buen nmero de problemas a resolver,

como son la eficiencia de la tcnica de transferencia nuclear, que
actualmente es muy baja y demasiado costosa para aplicarla
comercialmente de manera rutinaria, ya que an en el estudio mas
conocido de esta tcnica se obtuvo una eficiencia de 0.36% (Wilmut y col
1997). Considerando que el patrn de desarrollo de los cigotos es muy
diverso, la adaptacin de las tcnicas a otras especies precisa an de una
extensa investigacin para cada una de ellas (Merchant 1997).
- Aplicaciones de la clonacin de embriones. En el mbito cientfico, la
clonacin ha abierto un nuevo campo de experimentacin para abordar
problemas fundamentales sobre los mecanismos que controlan la
diferenciacin celular en el inicio del desarrollo (Merchant 1997). Tambin es
til en los estudios de fisiologa, embriologa, gentica y crianza animal
(Herman y col 1998; Williams y col 1984).
Los individuos genticamente idnticos pueden ser de sumo valor para los
experimentos controlados en los que se evalen los efectos ambientales,
tales como nutricin, instalaciones y medicamentos. La transferencia de
genomas idnticos en diferentes tipos de citoplastos permitira evaluar las
interacciones entre citoplasma y ncleo (Williams y col 1983; Prather 1990).
Los clones transgnicos y los derivados de clulas primordiales pueden ser
incluidos en la investigacin de terapias celulares o genticas,
principalmente si se trabaja con primates no humanos, ya que esto ltimo
salvara la distancia existente entre las especies de roedores comnmente

utilizadas en los laboratorios para desarrollo y prueba de frmacos de uso

en humanos. En enero de 2001, el grupo de Gerald Schatten dio a conocer
el nacimiento de un simio que tiene insertado el gene de la protena verde
fluorescente (GFP), de tal suerte que sus clulas pueden ser utilizadas con
relativa facilidad para estudios encaminados a determinar los efectos
nocivos de frmacos que puedan ser semejantes a los obtenidos en
humanos, por lo que los estudios de fases terminales pueden ser mas
rpidos y con un modelo mas cercano evolutivamente, en lugar del riesgo
que implica hacer la extrapolacin del modelo de roedor o conejo,
comnmente usado en la investigacin farmacolgica.
Asimismo, los clones con fechas distintas de nacimiento (considerando que
de un mismo grupo de clones unos sean transferidos directamente y otros
sean congelados para transferirlos con posterioridad) tienen aplicacin en el
anlisis fenotpico de los individuos clonados antes de que sean propagados
y en la transferencia seriada de clulas totipotentes para dirigir la edad
celular mas all de las expectativas de vida (Mclaren 1984). Adems, los
clones implantados en una misma hembra subrogada podran probar los
efectos epigenticos que incluyan el ambiente materno (Chan y col 2000).
- Clonacin de embriones por generacin mltiple. La ltima meta de los
proyectos de clonacin de embriones es producir gran nmero o un nmero
ilimitado de individuos idnticos a partir de un individuo original. Lo anterior
ha sido llevado a cabo a travs de la clonacin por generacin mltiple
tambin conocido como reclonacin, que utiliza embriones clonados por
transferencia nuclear como donadores de ncleos para producir la prxima
generacin de embriones idnticos. De manera que si el primer ciclo de
transferencia nuclear produce 10 embriones clonados viables, el siguiente
ciclo posiblemente resultara en 100 embriones clonados en la segunda
generacin (Singla y col 1997; Stice y col 1993).
A este respecto, desde la dcada de los 80, se han reportado resultados
exitosos en los procedimientos de reclonacin, pudindose obtener seis
generaciones de embriones (Willadsen 1989) y terneros de tercera
generacin a partir de embriones en diferentes estados de segmentacin,
obtenidos por transferencia nuclear. Asimismo, la multiplicacin en serie de
embriones mediante la clonacin ha incrementado el nmero de progenie
producida de un embrin donador determinado. Mediante ciclos repetidos
de transferencia nuclear, se han obtenido gestaciones de clones de tercera
generacin y se han producido embriones en etapa de blastocisto de clones
de quinta generacin. Los lmites de la clonacin en serie an no han sido
definidos. Las tasas de gestacin de los embriones en estado de mrula o
blastocisto producidos por clonacin en serie no difieren de las tasas de
gestacin de los clones derivados de embriones frescos (Singla y col 1997;
Stice y col 1993).
Se ha visto que los blastmeros provenientes de embriones clonados por
transferencia nuclear en etapas mas tempranas de la segmentacin, tienen
mayores probabilidades de fusionarse a los citoplastos que los provenientes
de embriones clonados en etapas mas tardas de la segmentacin, y que
esto va relacionado con el tamao del blastmero que se va a transferir. Las
tasas de xito en la reclonacin difieren con relacin en el tiempo de cultivo

y el nmero generacional del clon; por ejemplo, cuatro das de cultivo in

vivo en oviductos de ovino da lugar a tasas de fusin de 68% en embriones
reconstituidos de bovino, respecto del 57% obtenidos tras cinco das de
cultivo in vivo. Sin embargo, los clones de cinco das de cultivo pueden
producir 4.5 generaciones de clones, mientras que los de cuatro das solo
3.6. La tasa de xito en la fusin se reduce de una generacin a otra, ya que
de una lnea clonada se han obtenido 11 clones en la primera generacin,
16 en la segunda, 20 en la tercera y solo 7 clones en la cuarta generacin
(Stice y col 1993).
Yong y Yuqiang (1998), lograron obtener cras de caprino de la primera a la
sexta generaciones, de las cuales tres pares fueron gemelos monocigticos,
tres series fueron de triples monocigticos, dos series de cudruples
monocigticos, tres series de quntuples y una serie de heptaples
monocigticos.
Los abortos y las tasas de gestacin pueden diferir entre reclines y la
primera generacin de embriones clonados por transferencia nuclear.
Willadsen (1989), informa que la segunda o posteriores generaciones de
bovinos y ovinos, tienen tasas de gestacin mas bajas que la primera
generacin de embriones clonados, y que las tasas de aborto se
incrementan a partir de la segunda generacin.
Con el estudio profundo y el adecuado control de las deficiencias actuales
de la clonacin, en un futuro la clonacin en serie permitir a su vez, la
clonacin de animales transgnicos que contengan genes selectos. De ah
se deduce que la clonacin ofrece una enorme oportunidad para la ganancia
gentica, el incremento en la eficiencia de la produccin de alimentos de
origen animal y los programas de investigacin (Singla y col 1997).
- Aspectos comerciales de la clonacin de embriones. Cuando la clonacin
se aplica a los embriones de alto valor, la habilidad para producir varios
nacimientos por cada embrin ofrece suficiente ventaja econmica para
recuperar los costos involucrados, sobre todo si se utilizan procedimientos
de sexado de embriones, de manera que los nacimientos de individuos
clonados sean de sexo predeterminado. Esto pondra un limite en el nmero
de embriones de sexo masculino transferidos, lo cual reducira el nmero de
transferencias requeridas o permitira obtener una poblacin de pie de cra
efectiva con el mismo nmero total de transferencias (Nicholas 1983). Sin
embargo, la eficiencia con la que se cuenta actualmente an no permite una
produccin de embriones en masa a un costo accesible para la produccin
de animales comerciales (Singla y col 1997). Es necesario que se
incrementen significativamente las tasas de xito para que el mercado de
los embriones clonados pueda hacerse realidad. Actualmente en el mundo
existe un laboratorio que ofrece la clonacin de embriones por transferencia
nuclear, a la cual los ganaderos pueden enviar sus embriones para recibir
clones por 100 dlares cada uno (Romo 1994).
Otra limitante es que los pesos de los individuos clonados al nacimiento son
anormales. Estos procedimientos dan lugar a una mayor incidencia de
distocias, aunque posterior al nacimiento las tasas de crecimiento no se
afectan por este procedimiento. No se conoce explicacin biolgica sobre

este aspecto (Singla y col 1997). Es necesario incrementar la eficiencia de

este procedimiento para eliminar el problema de gigantismo fetal que se ha
encontrado en algunos becerros producidos por transferencia nuclear (Roma
1994). En ovinos no se ha observado alteracin en los pesos al nacimiento
de los individuos clonados, pero s un alargamiento en la duracin de la
gestacin que es influenciado por el genotipo fetal (Wilmut y col 1997).
Es clara la necesidad de investigacin bsica, utilizando especies de las que
se tenga un conocimiento adecuado para los fines de la investigacin. Este
tipo de estrategias, por su accesibilidad y bajo costo, podran ser llevadas a
cabo en animales de laboratorio, explorando mas la tcnica en los mbitos
celular y molecular, de manera que la solucin a los problemas de las tasas
de gestacin y pesos al nacimiento podra obtenerse de los experimentos a
partir de estas especies (Singla y col 1997).
- Aplicacin de la clonacin en la conservacin de especies. La reciente
demostracin de la capacidad para clonar mamferos adultos, ha propiciado
una variedad de nuevas ideas de investigacin para los interesados en las
especies en peligro de extincin.
La clonacin tiene el potencial de minimizar la prdida de recursos
genticos, al igual que rescatar la prdida de material gentico; por lo que
permitira expandir el nmero de tasas incluidos en los programas de
supervivencia de especies, porque hara posible la criopreservacin de
embriones clonados; aunque habra que pensar con cuidado, en las especies
animales que podran ser utilizadas como las receptoras de los embriones
de especies en peligro de extincin que vayan a ser clonados, y
considerando: que los tipos de placentacin son diferentes para cada
especie; que la transferencia embrionaria interespecfica slo funciona en
las especies en las que es posible crear hbridos; que hay especies silvestres
que no se reproducen en cautiverio, y tambin que el comportamiento
materno de las hembras receptoras hacia las cras nacidas a partir de
embriones clonados de especies no homlogas a ellas, podra afectar la
supervivencia de los clones, etctera (Ryder 1997).
El grupo Lanza et al. (2000) efectuaron la primera clonacin de una especie
en peligro de extincin: un gaur asitico a quien llamaron No, obtenido
por la transferencia de ncleos utilizando clulas de piel (fibroblastos) de
gaur macho y ovocito enucleado de vaca domstica, y cuyo embrin
reconstituido fue transferido en una vaca domstica. Actualmente esperan
el nacimiento del gaur clonado y sealan que estn en planes de ser
clonadas especies tales como el antlope bongo, el tigre de Sumatra y el
panda gigante. Asimismo, se cuenta con clulas preservadas de una especie
ya extinta, la cabra bucardo de montaa, de Espaa, en la que se esta
pensando aplicar la clonacin.
Consideraciones ticas de la clonacin. Hasta ahora se ha hablado sobre
algunas consideraciones que deben ser cuidadosamente estudiadas con
respecto ala clonacin de animales, tanto para el abasto como para la
conservacin de especies en peligro de extincin; queda solamente
mencionar las probables consecuencias que esta tcnica tendra si fuera
aplicada a los seres humanos.

En 1984 McLaren consideraba que la transferencia nuclear podra ser

aplicada en los seres humanos; sealaba que para las parejas que tuvieran
el riesgo de transmitir defectos genticos a su progenie, si se recuperaran
varios ovocitos de una mujer, se enuclearan y se les transfiriera un ncleo
de la MCI de alguno de sus propios embriones; unos cuantos podran ser
congelados mientras que los remanentes genticamente idnticos podran
ser evaluados para defectos genticos por anlisis cromosmico, anlisis de
ADN 0 por mtodos bioqumicos. De esta forma se asegurara a la pareja
que cualquier embrin transferido al tero materno del stock que fuera
congelado, estara libre de defectos genticos.
A este respecto existen opiniones tanto en favor como en contra. Por
ejemplo, en 1997 el Consejo Biotico de Estados Unidos de Amrica
(Nacional Bioethics Advisory Comisin 1997), seal la preocupacin
existente acerca del posible dao fsico provocado por la manipulacin del
ovocito, ncleo y embriones, as como del dao psicolgico en cuanto al
sentido de la individualidad y la autonoma personal de los individuos
clonados. Mencionan la preocupacin tica sobre la degradacin de la
calidad de la familia y el parentesco en el caso de que los padres quisieran
tener un control excesivo sobre las caractersticas de sus hijos.
Lisker y Tapia (1997) opinan que la clonacin de embriones humanos tendra
utilidad en la investigacin siempre y cuando los embriones no fueran
implantados en el tero de mujeres, y que tuviera la finalidad de
incrementar el conocimiento en biologa celular y los mecanismos de
expresin gentica, ya que no deben ponerse obstculos al avance en la
investigacin cientfica. Aunque hacen hincapi en la importancia de discutir
y resolver todos los problemas ticos y legales que plantea la clonacin de
nuestra especie.
A finales del 2000 las autoridades inglesas aceptaron la aplicacin de la
clonacin por transferencia nuclear en humanos, pero con una temporalidad
finita de solo 2 semanas y con una idea de aplicacin exclusiva para la
obtencin de tejidos que puedan ser utilizados para transplante. Una
alternativa en este sentido es la estrategia definida por los trabajos de
Onishi et al. (2000), y de Polajaeva et al. (2000) en los cuales se obtuvieron
cerdos clonados por transferencia nuclear y cuya similitud en cuanto a
tamao de rganos y capacidades de aspecto inmunolgico son muy
similares a la de los humanos.
Hottois (1998) considera que se le est dando mayor prioridad alas
reacciones simblicas de la clonacin que al anlisis de sus tcnicas. Opina
que no hay razn para enjuiciar la clonacin, ya que desde el punto de vista
de una pareja con problemas de esterilidad total, 0 que hayan perdido a un
hijo, 0 de una pareja en la que ambos cargan genes letales, la clonacin no
implicara la reproduccin en masa de clones sino de tan solo uno 0 quizs
dos, y que ello no afectara la autonoma de los clones. Adems, recuerda
que la identidad biolgica entre los clones, y entre ellos y su donador no
sera total, ya que existen diferencias ligadas al ADN mitocondrial (que
permanece en los ovocitos receptores) y alas la seleccin natural, son
reintegrados al juego con lo que eventualmente pueden obtenerse

individuos en cuyos embarazos se manifiesten nuevamente estos genes

letales.
Por otro lado, Bryan (1998) trata de aproximar el que sera el sentir de los
humanos como individuos clonados con el de los gemelos monocigticos
que nacen de manera natural. Explica que en virtud de que aun cuando
estos ltimos son idnticos genticamente, siempre hay uno que nace
primero que el otro y que, por 10 tanto los medios uterino y extrauterino
influyen para producir no solo apariencias sino tambin personalidades
diferentes en cada uno. En el aspecto psicolgico, seala como ventaja que
los gemelos monocigticos tienen facilidad para relacionarse y
comprenderse mutuamente dada su identidad biolgica; pero como
desventajas, que tienen mayores riesgos de nacer prematuramente 0 de
tener altas tasas de muerte perinatal.
Por ltimo, Edwards y Beard (1998) sealan que la biseccin 0 separacin
de embriones y la transferencia nuclear actualmente aplicadas en animales,
podran considerarse para su aplicacin en humanos en la prxima dcada