Marcadores genticos

Gentica Molecular 2016

Universidad de Morn

Marcadores genticos
Son caracteres que presentan polimorfismo o
variabilidad experimentalmente detectable en
individuos de una poblacin segregante y un
tipo de herencia predecible segn las leyes de
Mendel.
Pueden ser morfolgicos, bioqumicos o
moleculares

Marcadores morfolgicos:
Caractersticas fenotpicas de sencilla identificacin:
tamao, color, mayor produccin de un determinado
nutriente, etc.
Limitaciones para mejoramiento gentico:
- en general son caracteres dominantes (no se puede
saber si un individuo es homo o heterocigota);
- pueden ser polignicos: dificultades en la seleccin
- si se manifiestan en el animal o planta adulta: mayores
tiempos de evaluacin

Marcadores bioquimicos:

Polimorfismo en ciertas protenas detectado a travs de

tcnicas bioqumicas
Fueron muy usados en plantas, ya que podan aplicarse a
todas las especies
Ejemplos: isoenzimas; proteinas de reserva

Marcadores bioqumicos: Isoenzimas

Isoenzimas: protenas con la misma actividad enzimtica
Zimograma: deteccin de una determinada actividad
enzimtica en un gel: observacin del patrn de bandas.
Polimorfismos por:
- mutaciones en el ADN que no afectan la funcin enzimtica
pero provocan un cambio en la carga de la protena
- duplicaciones gnicas
- variaciones en la estructura secundaria: nmero de
subunidades que componen la enzima funcional
- compartimentalizacin subcelular: formas enzimaticas
codificadas en el nucleo pero localizadas en el citoplasma,
mitocondrias, cloroplastos, con distinta movilidad
electroforetica

Aplicacin de isoenzimas en la tipificacin

Extractos de tejido de 15 diferentes ranas arboricolas

(Hyla cinerea) muestran cuatro variedades alelicas de la
enzima aconitasa: F, E, M, S.
Se ven heterocigotas y homocigotas

Marcadores bioqumicos:
Protenas de reserva en semillas
- Sirven de nutricin para el embrin, y tienen relacin
directa con la calidad de cereales y oleaginosas.
- Ej: gluteninas de trigo: polimerizan durante el amasado
de la harina dando una red llamada gluten, importante en
la elaboracin del pan
- Codificadas por familias de genes
Polimorfismo
por
duplicaciones,
deleciones,
traslocaciones, insercion de elementos mviles.
- Anlisis de variabilidad de gluteninas: uso en
mejoramiento de la calidad panadera del trigo

Anlisis de gliadinas en variedades de trigo: asociacin

con la calidad de la harina para hacer pan

Marcadores moleculares
Son secuencias identificables de ADN
Encontrados en una regin especfica del genoma

Pueden estar asociados a un gen o a la herencia de una

caracterstica

Marcador molecular
Gen de interes

Secuencia marcadora:

=> Segmento de ADN cercano a la

secuencia del gen de inters

Gen de inters asociado a una

secuencia marcadora

Los marcadores y los genes se encuentran cerca y en el mismo

cromosoma
tienden a permanecer juntos a lo largo de las
generaciones

Esto se denomina ligamiento gentico y ayuda a predecir si un

organismo va a tener un cierto gen de inters o no.

Caractersticas deseables de un
marcador molecular
Polimrfico: hay diferencias (mutaciones) entre individuos o entre

cepas, razas o especies

Codominante: se detectan los cambios en cada uno de los alelos
No pleiotropico (pleiotropia = un gen determina mas de un

fenotipo. Por ej. gatos albinos, por mutacion en un gen, tienden a

ser sordos y de ojos azules)
No epistatico (epistasis = cuando un gen enmascara la expresin

de otro)
Heredables de acuerdo a las leyes de Mendel
Neutral o no selectivo

Qu mtodos de estudio existen?

usa hibridizacin
(Southern blot)

RFLP

PARA = PCR-RFLP

usan PCR

AFLP
RAPD
STRs
SNPs

Se basan en
polimorfismo en
sitios de enzimas
de restriccin

Enzimas de restriccin
Endonucleasas bacterianas que cortan al DNA en un
lugar especifico
- Defensa contra virus (el ADN de las bacterias no se
degrada porque se metila)
- Hay de dos tipos: las que dejan extremos cohesivos y
las que dejan extremos romos
- Sitio de corte: palidrome
Ejemplos:
GAAT T C
C T TAA G

EcoRI

extremos cohesivos

CCCGGG
GGGCCC

SmaI

extremos romos

Nomenclatura de enzimas de restriccin

Cuatro letras y un numero romano: Gnero, especie y cepa de la

bacteria de donde se aislaron y nmero de la enzima aislada
Nombre

Corresponde a:

Escherichia

Gnero de la bacteria

co

coli

Especie de la bacteria

RY13

Cepa de la bacteria

La primera enzima
identificada

Orden de identificacin de la enzima en la

bacteria

Sistemas de marcadores moleculares

RFLP
- Restriction Fragment Length Polymorphism:
polimorfismo del largo de fragmentos de restriccin
- Se basa en la variacin en el nmero de sitios de
reconocimiento para una enzima de restriccin en una
secuencia determinada de ADN
- Est acoplado a Southern blot: usa una sonda
especfica para un fragmento de ADN

RFLP
Organismo B

Organismo A
GAATTC
CTTAAG

GAATTC
CTTAAG

GAATTC
CTTAAG

sonda

GAATTC
CTTAAG

sonda

Digestin con EcoR I

Southern Blot
1) Electroforesis
2) Hibridizacion con
una sonda marcada
3) Deteccin

GAATTC
CTTAAG

B AxB

RFLP
R R R S S M

S S R R M

RFLP de cepas de staphylococcus

resistentes (R) y sensibles (S) a la
meticilina

Sistemas de marcadores moleculares

PRA
- PCR Restriction Analysis: Analisis de restriccin
de PCR (de productos de PCR)
- 1) PCR de un fragmento especfico
- 2) Tratamiento con enzima de restriccin
- 3) Anlisis del patrn de bandas

PRA (PCR Restriction Analysis)

DNA

Aplicacin de PRA a Babesia bovis

Amplificacin por PCR

de un gen
Corte de los amplicones por una
enzima de restriccin
electroforesis
- Mtodo simple
-Puede verse diversidad entre aislamientos
- No hubo correlacion entre variabilidad
genetica y distancia geografica o
patogenicidad
Wilkowsky, S., Farber, M, Gil G., Echaide, I., Mosqueda, J., Alcaraz, E., Suarez, C., Florin-Christensen, M.
Molecular characterization of Babesia bovis strains using PCR-restriction fragment length polymorphism
analysis of the msa2-a/b genes. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1149, 9-18, 2008

Sistemas de marcadores moleculares

AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism:
Polimorfismo en el largo de fragmentos
amplificados
Usa PCR pero no hay una secuencia blanco
especfica:
1) Tratamiento con enzima de restriccin
2) PCR
3) Anlisis del patrn de bandas

AFLP
TTAA
AATT

GAATTC
CTTAAG

G
CTTAA

AATTC
G

Digerido con
EcoR I y Mse I

T
AAT
TAA
T

G AATTC
CTTAA G

T TAA
AAT T

G AATTC
CTTAA G

T TAA
AAT T

G AATTC
CTTAA G

DNA genmico

AG

T TAA
AAT T
CT

Ligacin de adaptadores

PCR

Segunda PCR selectiva

AFLP

AFLP de variedades
de plantas

AFLP de cepas de
Legionella pneumophila

AFLP: fingerprinting: presencia/ausencia

de una banda ~ cdigo de barras

Diferenciacin de especies de la familia

Acetobacteraceae por AFLP

Sistemas de marcadores moleculares

RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA: ADN polimrfico

amplificado al azar
PCR usando una variedad de primers cortos

simultneamente (se unen a varias regiones del genoma) ->

anlisis del patrn de bandas

RAPD
Organismo A

PCR
electroforesis

Organismo B

B AxB

Polimorfismo en
la secuencia en el
sitio de un primer

RAPD

Diferenciacin por RAPDs de las cepas M y S de una

bacteria usando distintos juegos de primers

Sistemas de marcadores moleculares

STRs (short tandem repeats)

Repeticiones en tandem

Microsatelltes
Minisatelites

Satelites

Unidad repetitiva
1 to 5 bp
Marcadores
moleculares

No telomericos
Unidad repetitiva
6 to > 50 bp

telomericos

Proceso de seleccin de marcadores satelitales

Genoma nuclear de Babesia bovis (8,2 Mb)
Tandem Repeat Finder (TRF)
3885 loci repetitivos
Criterios de seleccin

Microsatelites
Unidad repetitiva 2-5 bp
Nmero de repeticiones 7

Minisatellites
Unidad repetitiva 6-21 bp
Nmero de repeticiones 7

119 loci repetitivos

Primer design -> amplicons 400 bp

Proceso de seleccin de marcadores satelitales

119 loci repetitivos
PCR

Isolate A

DNA de 5 aislamientos de
B. bovis
Electroforesis en geles de
agarosa

polimrficos

no polimrficos
Electrophoresis

Electroforesis en geles
de poliacrilamida

tincin argntica

Isolate B

Tipificacin de cepas de B. bovis

Cepas de referencia
1. T2B (Texas)
2. Mo7 (Mexico)
3. RAD (Mexico)
4. R1A (Argentina)
5. S2P (Argentina)

Alelos que se identificaron:

Matriz de distancia: nmero de alelos diferentes entre cada par de cepas

Neighbor Joining: clusters

RA
D

Mo7

R1A

S2P

T2

Distancias genticas correlacionan con distancia geogrfica

Perez-Llaneza, A.*, Caballero, M*., Baravalle, E., Mesplet, M., Mosqueda, J., Echaide, I., Suarez, C., Katzer,
F., Pacheco, G., Florin-Christensen, M., Schnittger, L. Development of a tandem repeat-based multilocus
typing system distinguishing Babesia bovis geographic isolates. Veterinary Parasitology 167: 196-204, 2010.
*Tesinistas de UM

Sistema de micro y minisatlites desarrollado para B.

bovis aplicado a un numero mayor de aislamientos:
Tambin se agruparon de acuerdo a su origen geogrfico

Nueva herramienta para

la tipificacin molecular
de B. bovis

Flores DA*, Minichiello Y*, Araujo FR, Shkap V, Bentez D, Echaide I, Rolls P, Mosqueda J, Pacheco
GM, Petterson M, Florin-Christensen M, Schnittger L. Evidence for extensive genetic diversity and
substructuring of the Babesia bovis metapopulation. Transbound Emerg Dis. 60 Suppl 2:131-6, 2013
*Tesinistas de UM

SNP
(Single Nucleotide Polymorphism)
Primer F

ADN genmico

ORF

Amplificacin por PCR

Primer R

Secuenciacin directa del amplicn

Organismo A)
B)
C)
D)
E)
F)

.....GATATTCGTACGGATGT-TCCA.....
.....GATGTTCGTACTGATGTATCCA.....
.....GATATTCGTACGGATGT-TCCA.....
.....GATATTCGTACGGATGTATCCA.....
.....GATGATTCGTATGATGTATCCA.....
.....GATGATTCGTATGATGTATCCA.....

Haplotipos AG- => organismo A, C

AGA => organismo C
GTA => organismo B, E, F

SNPs
Constituyen el 90 % de todas las variaciones genticas
Ocurren cada 1000 to 1500 bases
Son normalmente bi-allicos, y 60 % son un reemplazo citosina-

timidina
Deben ocurrir en mas de 1% de una poblacin para ser
considerados SNP

MLST: multilocus sequence

typing
Es un anlisis de SNPs mltiples: 7 a 8 genes de mantenimiento

(housekeeping genes)
Se aplica especialmente a microorganismos patgenos
Es una tcnica robusta que permite comparaciones entre

laboratorios (existen bases de datos on line de MLST para distintos

patgenos)
Las variaciones se analizan por dendogramas

Variables crticas de los sistemas de

marcadores moleculares (I)
RFLP
ADN necesario
/100 markers (ug)

100

AFLP
0.5

Calidad del ADN

alta

Se basan en PCR

No

Si

Requieren secuenciacin

Si

No

Nivel de
polimorfismo

medio

moderada

medio

N de loci
Polimorficos analizados

13

20-100

Codominancia

Si

No

RAPD
2.5
alta

STRs
10

SNP
10

moderada

alta

Si

Si

Si

No

Si

Si

medio

alto

muy alto

1.5-50

13

No

Si

Si

Variables crticas de marcadores

moleculares (II)
RFLP

AFLP

RAPD

STRs

RC

RC

SS

SS

mediana

baja

alta

alta

Nivel de destreza

mediano mediano

bajo

Costo de desarrollo

bajo

moderado

bajo

alto

alto

Costo por muestra

alto

alto

bajo

medio

bajo

Especficos de especie (SS)

Reacciones cruzadas (RC) SS
Confiabilidad

alta

mediano

SNP

bajo

Seleccin de marcadores
Determinada por:
Objetivos (polimorfismo de un gen vs comparacin

global del genoma)

Diversidad genmica y estructura de la especie
Tipo de muestra (ADN de un solo organismo o
mezcla)
Tiempo
Costo (de desarrollo, por muestra)

Ejemplos de usos de marcadores

moleculares

1. Mejoramiento gentico asistido por marcadores

(MAS): Seleccin de caractersticas deseables en
animales de produccin o vegetales: cuantitativas
(QTLs) por ej. tamao, produccin de sustancias
para consumo (leche, carne, aceite, gluten),etc. o
cualitativas, como resistencia a enfermedades,
etc.
(QTL: locus para una caracteristica cuantificable)

Usos de marcadores moleculares

2. Diagnstico: Identificacin de tendencias
hereditarias a contraer enfermedades
3. Conservacin: Estudio de variabilidad gentica
de una poblacin para estimar riesgo de extincin.
4. Epidemiologa de patgenos: identificacin y
distribucin geogrfica de cepas

5. Trazabilidad de productos de granja hasta el

animal de origen

Usos de marcadores moleculares

6. Deteccin de organismos modificados
genticamente (aunque otros mtodos como
PCRs simples son mas comunes)
7. Estudios de filiacin
8. Medicina forense

Conclusiones finales
Gran variedad de mtodos: es importante elegir el mas

adecuado para el objetivo buscado.

Marcadores moleculares: son herramientas, no fines en si

mismos.
Con

la simplificacin y disminucin del costo de

secuenciacin de grandes fragmentos de ADN o genomas
completos puede disminuir su necesidad en un futuro no
muy lejano.