Curso Terico prctico: ANLISIS FILOGENETICO Y

FUNCIONAL DE COMUNIDADES MICROBIANAS

Anlisis de secuencias

Pieter van Dillewijn

Estacin Experimental del Zaidn, CSIC

Anlisis de secuencias
1)Introduccin
2)Secuenciacin
3)Como utilizar las tcnicas de secuenciacin
4)Anlisis de secuencias

Introduccin

METAGENMICA
Definicin:
El estudio de metagenomas:
Metagenoma: el conjunto de todos los genomas de
todos los (micro)organismos en un medio ambiente
determinado Handelsman et al., 1998 Chemistry & Biology.
Genoma: Conjunto de los genes de un individuo o de una
especie.
Gen: Secuencia de ADN que constituye la unidad funcional
para la transmisin de los caracteres hereditarios.

Introduccin

ADN (cido desoxirribonucleico)

Transcripcin
Traduccin
Protena
adeninaA timinaT citosinaC guaninaG

Introduccin

Qu se puede estudiar/averiguar con la metagenmica:

1) Diversidad filogentica:
1.- estructura de comunidades
a.- diversidad microbiana
i.- identificacin de los microorganismos en una comunidad
ii.- cuantificacin
b.- relaciones filogenticas
c.- distribucin
2.- dinmica de comunidades
a.- cambios de poblaciones en el tiempo y el espacio
3.- biogeografa
a.- distribucin de microorganismos en el mundo
4.- Bsqueda y caracterizacin de nuevos organismos
a.- utilizar informacin metagenmica para poder cultivar bacterias anteriormente no
cultivables.
2) Metagenmica funcional
1.- Bsqueda de actividades enzimticas nuevas
2.- Bsqueda de rutas metablicas nuevas
3.- Bsqueda de productos nuevos
3) Metagenmica comparativa
1.- Secuenciacin y comparacin de genomas de bacterias
2.- Relacionar especies con funciones
3.- Relacionar funcin con hbitat (genes mayoritariamente presentes en un hbitat)
4) Evolucin de genes

Introduccin

Diversidad filogentica:
Que hay all?
Metagenmica funcional
Que hace all?
Cmo vive y convive?
Enzimas
Rutas metablicas

Introduccin: Creacin de libreras (meta)genmicas

Lisis, extraccin, purificacin y obtencin de ADN

Introduccin: Creacin de libreras (meta)genmicas

La muestra

Problemas y
consideraciones

Tcnicas
Lisis, extraccin, purificacin y obtencin de ADN

Tipo de vector

Enriquecer ?

La bacteria hospedadora
Tamao de la librera

Anlisis de las libreras

Introduccin: Creacin de libreras (meta)genmicas

Lisis, extraccin, purificacin y obtencin de ADN

Secuenciar

Secuenciar

Secuenciacin: Clsica

Secuenciacin tipo Sanger

Precio para lecturas de 500-900 pb:

6 lectura 8h

Introduccin: Creacin de libreras (meta)genmicas

Lisis, extraccin, purificacin y obtencin de ADN

Secuenciar

Secuenciacin

Estrategias de secuenciacin de libreras metagenmica

Cebador del plsmido

ADN desconocida < 1,5 kb

plsmido

Cebador reverso del plsmido

Primer walking
Cebador del vector

ADN desconocida > 1,5 kb

Cebador reverso del vector

Csmido, fsmido, BAC

Introduccin: Creacin de libreras (meta)genmicas

Lisis, extraccin, purificacin y obtencin de ADN

Secuenciar

Secuenciar

Secuenciacin

Estrategias de secuenciacin
Shotgun sequencing

Librera
(meta)genmica

Secuenciacin: tamaos

Como utilizar las tcnicas de secuenciacin

1) Cual es el objetivo?
1) Metagenmica filogentica
2) Metagenmica funcional

2) Cual es el mejor estrategia de utilizar?

1) Basada en homologa con genes conocidas
2) Secuenciacin de libreras metagenmicas previamente ensayadas
3) Secuenciacin masiva de libreras o ADN del medio ambiente

3) Cunto hay que secuenciar?

1) Tamao de las genomas
2) Tamaos de las libreras

4) Qu mtodo de secuenciacin hay que utilizar?

1) Pirosecuenciacin
2) Otros

5) Diseo experimental
1) Diseo de cebadores
2) Cuanto ADN, etc.

Metagenmica filogentica

Objetivo y estrategia:
Metagenmica filogentica
Identificacin y clasificacin de bacterias
Se basa en genes conservados que pueden ser utilizados como anclas
filogenticos
Basada en homologa con genes conocidas
Estrategia:
1) Crear libreras de genes conservados
2) Buscar en los datos obtenidas tras la secuenciacin masiva
Basada en la secuenciacin masiva
1) Ensamblar genomas enteras
2) Identificar la presencia de organismos segn las secuencias
obtenidas tras la secuenciacin masiva

Metagenmica filogentica
Genes conservados:
Necesarios para el funcionamiento normal de la bacteria
Una copia
No transferencia horizontal
Genes

Actividad

atpD (ATP sintasa)

Produccin de energa

glnII (glutamina sintasa)

Asimilacin de nitrgeno

16S y 23S rARN (subunidades del

ARN ribosomal)
rpoA/B (ARN polimerasa factor)
dnaE (ADN polimerasa)
fusA (factor de elongacin)
pheS (fenilalanil tARN sintasa)
gyrA/B (girasa)

ADN replicacin, transcripcin y

traduccin

recA (recombinasa)
radA (protena de reparacin ADN )

Sistemas de recombinacin y
reparacin de ADN

hsp70 ( chaperona)

Plegamiento de protenas

Metagenmica filogentica

16S rARN

Problemas:
1.- Amplificacin preferencial durante PCR
a.- primer mismatches
b.- hibridacin diferencial por oligmeros
a ADN molde
2.- Formacin de artefactos en el PCR
a.- formacin de heteroduplexes
b.- formacin de quimeras
3.- Mltiple secuencias de 16S rARN en un
genoma

Metagenmica funcional

Objetivo y estrategia:
Metagenmica funcional
Identificacin de protenas, actividades enzimticas, rutas
metablicas o productos
Basada en homologa con genes conocidas
Estrategia:
1) Crear libreras de genes utilizando cebadores (semi)especificas
2) Buscar en los datos obtenidas tras la secuenciacin masiva
3) Buscar en libreras metagenmica mediante sondas (hibridacin)
Basada en funcin
Estrategia:
1) Analizar libreras metagenmica por la funcin (escrutinios)
2) Bsquedas de funciones segn anotacin o profile en los datos
obtenidas tras la secuenciacin masiva

Cuanto hay que secuenciar?

Cuanto hay que secuenciar

Medidas de tener en cuenta

Tamao medio del genoma bacteriana 5

millones de pares de bases (5 x 106 b)
Tamao medio de un gen 900 a 1500
pares de bases
Numero medio de genes por bacteria
4000 genes
par de bases (b) = letra
1 pgina 1 gen
1 libro 5 x 105 letras/ pares de bases
1 genoma con 4000 genes 10 libros de 400 pginas
1Gb = mil millones de pares de bases 2000 libros 200 genomas

Cuanto hay que secuenciar

Cuanto hay que secuenciar?

(Tamao de la librera metagenmica)
Nmero de clones necesario =
P = probabilidad deseable (90%= 0,9)
G = Tamao medio del genoma
z = nmero de especies/ genomas
T = tamao inserto
X = tamao medio de un gen

ln (1-P)
ln (1- (T-X/Gz))

Cuanto hay que secuenciar

Tamao de la librera metagenmica

Nmero de clones necesario =

ln (1-P)
ln (1- (T-X/Gz))

P = probabilidad deseable (90%= 0,9)

G = Tamao medio del genoma
z = nmero de especies/ genomas
T = tamao inserto
X = tamao medio de un gen

El factor G

Tamao medio

Animales

5000 Mb

Planta

5000 Mb

Hongo

10 Mb

Protozoa

1000 Mb

Bacteria

5 Mb

Archea

3 Mb
1

1x102
1x104
Tamao genmico

1x106 Mb

Cuanto hay que secuenciar

Tamao de la librera metagenmica

Nmero de clones necesario =

ln (1-P)
ln (1- (T-X/Gz))

P = probabilidad deseable (90%= 0,9)

G = Tamao medio del genoma
z = nmero de especies/ genomas
T = tamao inserto
X = tamao medio de un gen

El factor z
Estimaciones de nmeros de especies y bacterias en
distintos medio ambientes
1.- suelo 10000 especies o 1x106-9 bacteria /g
2.- marino 2000 especies o 1x106 bacteria/ml
3.- intestino humano 1000 especies o 1x10 13-14 bacteria

Cuanto hay que secuenciar

Cuntos clones para cubrir una genoteca de un especie
Cuntos clones necesito para poder encontrar un gen en una genoteca de Pseudomonas
T = 10 kb
X = 1,5 kb
G 6x103 kb
z=1

ln (1-0,9)
ln (1- ((10-1,5)/ (6x103 1))

= 1624 clones 16 Mb

Cuntos clones para cubrir una comunidad compleja

Para encontrar un gen en una muestra marina con un estimada 2000 genomas

Incrementa el factor z
T = 40 kb
X = 1,5 kb
G 5x103 kb
z = 2000 genomas

ln (1-0,9)
= 6,0 x 105 clones 24 Gb
ln (1- ((40-1,5)/ (5x103 2000))

Contaminacin con ADN eucariota?

Encontrar un gen en una muestra marino con 2000 especies distintas de bacteria y 20
especies de algas (100 Mb genomas) y 10 especies de protistas (50 Mb genomas)

Incrementa el factor G
ln (1-0,9)
= 7,5 x 105 clones 30 Gb
ln (1- (((40-1,5)/ ((5x103 2000) + (100x103 20) + (50x103 10) )

Cuanto hay que secuenciar

Microplaca de 384 pocillos

104 clones = 26 placas

105 clones = 260 placas
106 clones = 2605 placas

Cuntos clones para cubrir comunidades complejas

Se estima que se necesita entre 106 y 1011 clones BAC con insertos de 100 kb para
cubrir todos los genomas presentes en un gramo de suelo que es equivalente a
1x105-8 Mb de secuencia de ADN.
En escrutinios para detectar actividades se calcula que 1 entre 5-5000 Mb ADN
pueden dar positivos lo que significa libreras de millones hasta mil millones de
clones.
Se estima que si se quiere ensamblar el genoma completo de una bacteria del
medio ambiente con shotgun sequencing hara falta secuenciar un mnimo de 6
x109 bp y 1000 veces ms para obtener las secuencias de 1000 genomas

Qu mtodo de secuenciacin hay

que utilizar?

Secuenciacin: Segunda generacin

454 Pirosecuenciacin (Roche)

Unin a nanopartculas
Fragmentacin y unin
a adaptadores
ADN muestra

PCR con cebadores

con adaptadores

Amplificacin en emulsin

Introduccin de las nanopartculas

en las microplacas

Secuenciacin: Segunda generacin

454 Pirosecuenciacin

Regiones

Numero de lecturas

1000000

450000- 650000

160000 250000

80000 120000

16

20000- 32000

Secuenciacin: Segunda generacin

454 Pirosecuenciacin

Imagen de
las seales

Se pasan las bases en forma secuencial:

todo adenina, todo citosina, todo guanina,
todo timina y detecta la luz emitida. La
seal de luz es directamente proporcional a
la repeticin de la base en la secuencia

luz

Precio para lecturas de 100-500 pb:

0,025 a 0,011 / lectura
Milln lecturas por microplaca x2
1Gb /1 dia

Secuenciacin: Segunda generacin

Secuenciacin tipo (Solex) Illumina

El ADN es cortado, seleccionado por su tamao

y ligados a un oligo a cada trmino

El ADN hibrida a los oligos del flow cell

Se quita la hebra reverso

El flow cell tiene oligos unidos covalentemente

Amplificacin para formar miles de copias en micro-colonias

Se aaden un cebador universal (forward primer)

Secuenciacin: Segunda generacin

Secuenciacin tipo (Solex) Illumina

~ 100 pb por lectura

Hasta 25 Gb (25 x109 b) = hasta 250 milliones de lecturas 1,5 dia

10000 $ para 90 Gb

Secuenciacin: Segunda generacin

Secuenciacin tipo SOLiD (Applied BioSystems)

Fragmentacin y unin a adaptadores o librera creados con PCR

con cebadores y adaptadores

Escalar
Unin a nanopartculas amplificacin en emulsin

Unin de nanopartculas a placa de vidrio

Secuenciacin: Segunda generacin

Secuenciacin tipo SOLiD

Hasta 75 bp por lectura

Hasta 300 Gb (300x109bp) = hasta 4000 millones de lecturas
3000-6000$ /exp 1-14 dias

Secuenciacin: Prxima generacin

Otros tipos de secuenciacin

Nanoporos
Usar un nanoporo con una apertura
apenas lo bastante grande como
para pasar una sola hebra de ADN.
Aplicando un pequeo corriente de
iones a travs del nanoporo, las
caractersticas elctricas de cada uno
de los nucletidos que constituyen la
esencia del ADN genera una "firma"
elctrica distintiva

Diseo experimental
Pirosecueciacin ILLUMINA
Tcnica

Aplicacin

Divisiones posible
del placa
Shotgun libraras
Amplicon libraras
Re-secuenciacin
Secuenciacin
Transcriptomica

SOLiD

1,1/2,1/4,1/8

8 carriles

1, 1/4,1/8

Diseo experimental
Calidad del ADN:
- doble cadena, no degradado, y sin partculas
- pura (purificado por columna o de gel de agarosa
- A260/280 valor de 1,8 o ms

Cantidad de ADN
1.Pirosecuenciacin

HMW(>1.5kb)

LMW(70~500bp)

Paired End

5~10g

1~5g

5~10g

* Todos las muestras deben tener una concentracin de 100ng/l

2. ILLUMINA (Solex)
- 1~5g de ADN con una concentracin de 100 ng/L (al menos 100 l de 100ng/L )
3. SOLiD

Low Complexity DNA

20ng~2ug

High Complexity DNA

2ug or above

* Todos las muestras deben tener una concentracin de 100ng/l

Metagenmica filogentica
V7
V6
V4
V5

Que cebador utilizar?

V8

V3

V1

V1

aaattgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacgGTAACAGGAAGAAGCTTGCTCTTTGCTGACGAGtggcggacgggtgagtaatgt

V2

ctgggaaactgccTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGgatgtgcccagatgggatt

agctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatat

V3

tgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACC

V9
CGCAGAAgaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtTTGTTAAGTCAGATGTGAAATC

V2

V4

CCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCttgagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcg

V5

gccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTT

CCggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaaga

V6
V7

accttacctggtcttgacatccACGGAAGTTTTCAGAGATGAGAATGTGCCTTCGGGAAccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccg

caacgagcgcaacccttaTCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAgactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagg

V8

gctacacacgtgctacaatggCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcg

V9

ctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaaGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTA

ccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctta

Secuenciacin: Como

454 Pirosecuenciacin: Libreras de amplicones

2g o mas a una
concentracin de 100 ng/l
Mezcla con cantidades
iguales de cada amplicon:
10 l de 10ng/l

Anlisis de secuencias

Anlisis de datos

Analizar secuencias de 16S rARN

Limpiar secuencias
SANGER

PIROSECUENCIACIN
Ribosomal database Project (RDP) Pyrosequencing Pipeline: http://pyro.cme.msu.edu/
1)
2)

Organizar secuencias segn su secuencia MID

Limpiar secuencias:
Eliminar secuencias con tamaos imposibles
Eliminar secuencias con bases ambiguos

Anlisis de datos

Analizar secuencias de 16S rARN

Cebador del plsmido

gen16S desconocida < 1,5 kb

plsmido

Cebador reverso del plsmido

DNA BASER

A. Quitar secuencias del plsmido

B. Ensamblar secuencias con su secuencia reverso

Anlisis de datos

Analizar secuencias de 16S rARN

Herramientas bioinformticos para 16S rARN:
SILVA rRNA Database Project: http://www.arb-silva.de
Ribosomal Database Project: http://rdp.cme.msu.ed
GENBANK: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html
BLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Procesos:
1) Comprobar secuencias por artefactos: heteroduplexes, quimeras
2) Bsqueda de secuencias idnticas o parecidas en los bases de datos
3) Alineamiento de secuencias

Anlisis de datos

Analizar secuencias de 16S rARN

Herramientas bioinformticos para 16S rARN:
rboles filogenticos: taxonoma comparativa

Anlisis de datos

Analizar secuencias de 16S rARN

Estudios estadsticas:

Nmero de OTUs observado

Grado de biodiversidad:
1) Riqueza observada: Curvas de rarefaccin DOTUR, MOTHUR, ESPRIT
2) Riqueza especifica: ndice Chao
3) ndice Shannon-Wiener
OTU=operational taxonomic unit
80% similitud = filo
97% similitud = especie

No dif.
3% dif
10% dif.
20% dif.

31 esp.

8 filo

Las curvas de rarefaccin se utilizan para

predecir el nmero de especies en una
muestra del medio ambiente y en qu
medida se han analizado suficientes
secuencias (coverage).

Nmero de secuencias mostreados

Estudios comparativas (similitud entre muestras)

ndice Jaccard
ndice Srensen
ndice Theta

Anlisis de datos

Analizar secuencias para secuenciacin masiva

Herramientas bioinformticos:

Ensamblaje de fragmentos
Identificacin de genes (anotacin):
Metagene software: http://metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/
BLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
GenDB: http://www.cebitec.uni-bielefeld.de/groups/brf/software/gendb_info/
MicHanThi : http://www.megx.net/michanthi/
JCoast: http://www.jcoast.net
Informacin filogentica:
Genome DB: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome

Ejemplos
Estudios metagenmicos de secuenciacin masiva de muestras del medio
ambientales y relacionados can la salud animal

Human Microbiome Project

(HMP)
Sedimento
marina
Varios lagos eg.
Lagos de Antrtida

Varios zonas
marinas
Varios manantiales
geotermales
Varios suelos eg.
terragenome

Ejemplos
Estudios metagenmicos
Medio ambiente
estudiado

Lecturas/ bp secuenciado

Resultados

Referencia

Biopelcula en un
efluente de minas

En primera instancia hicieron una librera de

16S rARN para averiguar si la diversidad que
era baja. Luego produjeron una librera con
fragmentos de 3,2 kb e hicieron 103,462
lecturas mediante shotgun sequencing para
obtener 76.2 millones bp de secuencia.
SANGER

Lograron ensamblar casi el genoma completo

de Leptospirillum group II and Ferroplasma
type II, y parcialmente otros 3 genomas.
Anlisis de cada genoma revel rutas para la
fijacin de carbono y nitrgeno y la generacin
de energa.

Tyson et al., 2004

Nature 428: 3743

Mar de Sargasso

1,66 millones de lecturas resultaron en 1.045

mil millones de bp en secuencia
SANGER

Estimaron la diversidad de 1800 especies

distintas incluidos 148 nuevos filotipos.
Encontraron 1.2 millones de genes nuevos
incluyendo 782 nuevos fotorreceptores.

Venter et al 2004
Science 304:66-74

Global Ocean
Sampling
(41 muestras en 8000
km desde el Norte de
Ocano Atlntico a a
Sur del Ocano Pacifico

Secuenciaron 7,7 millones de lecturas de 800

bp cada uno (6,3 mil millones de bases)
SANGER

Consiguieron definir nuevas especies de

bacterias y casi consiguieon ensamblar el
genoma de una especie dominante e
identificaron nuevas familias de protenas.

Rusch et al., 2007

PLoS Biology 5:e16

9 medioambientes:
Subterrneo, salino,
marino, agua dulce,
coral, microbialitos,
pescado, animal,
mosquito

1,040,665 lecturas bacterianas de 45 muestras

distintas y 541979 secuencias virales de 41
muestras distintas. Result en
aproximadamente 150 mil millones de bp de
secuencia
PIROSECUENCIACIN

Este estudio comparativo demuestra que

aunque la diversidad funcional se mantiene en
los distintos medio ambientes existen
diferencias relativas que permiten predecir las
condiciones biogeoqumicas de cada medio
ambiente.

Dinsdale et al 2008
Nature 452: 629-632

Ejemplos
Estudios metagenmicos
Medio ambiente
estudiado

Lecturas/ bp secuenciado

Resultados

Referencia

Oceano rtico, 8
muestras en distintas
localizaciones y
profundidades

195107 lecturas de 16S rARN de archea de 8

muestras con un media de 24 388 lecturas por
muestra.
PIROSECUENCIACIN

Los resultados revela las caractersticas

biogeogrficas de los archea marinas del rtico
y como ciertos tipos de archea dominan en las
distintas profundidades del ocano rtico.

Galand et al 2009
ISME J. 3: 860869

Piel humano (Skin

Microbiome) de 20 sitios
en 10 individuos en dos
distintos tiempos

112,283 sequencias casi completas del gen

16S rARN
SANGER

El analisis revel que habia mucho variabilidad

entre individuos y menos dentro el mismo
individual. Dependiendo de la localizacion, los
comunidades eran ms diversos los sitios entre
los dedos del pie, axila y umbligo y/o ms
estable en el tiempo.

Grice et al 2009
Science 324: 11901192

Distintos zonas del

cuerpo humano: 18
zonas de piel, heces,
boca, nariz, cabello,
oreja en distintas adultos
tomadas en distintos
tiempos

>1,070,000 lecturas de 16S rARN para obtener

una media de 1315 secuencias por muestra
PIROSECUENCIACIN

Observaron que la biodiversidad microbiana

depende de la localizacin en el cuerpo. Se
observaron mucha variabilidad entre
individuales en todas las zonas del cuerpo pero
relativamente gran estabilidad entre el mismo
individual en el tiempo. Zonas de piel como la
palma del mano, el antebrazo, dedo ndice,
detrs del rodilla y en la planta del pie
mostraron igual o ms biodiversidad que el
intestino o boca

Costello et al 2009
Science 326, 16941697

Intestino humano

Analysis de 3,3 millones de genes de 576,7 Gb

de secuencias de muestras faecales de 124
humanos.
ILLUMINA

El nmero de genes es 150 veces mayor que

los en el genoma humano. Se detectaron entre
1000 y 1150 especies bacterianas.

Qin et al 2010 Nature

464: 59-65

5 manantiales
geotermales del parque
nacional de Yellowstone
con distintas
propiedades
fisicoqumicas.

14000 a 15000 lecturas por muestra.

SANGER

Los datos revelaron que ciertos filos

predominan segn las condiciones de cada
manantial. Las actividades enzimticas que
encontraron indican cuales son las funciones
importantes en cada medioambiente
especialmente actividades relacionados con el
transporte de electrones.

Inskeep et al. 2010

PLoS ONE 5: e9773