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2005
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RESUMO
Neste trabalho foram analisados, por enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) e imunofluorescncia
indireta (IFI), 101 soros caninos provenientes da Regio
Metropolitana de Salvador, Bahia, sendo 30 soros de ces
com resultado parasitolgico positivo para Leishmania
chagasi em cultura esplnica e 71 soros de ces clinicamente sadios. Dez soros de ces com cultivo positivo e
com resultados sorolgicos concordantes ou no entre os
testes ELISA e IFI foram testados pela tcnica de WesternBlotting (WB). Das 30 amostras de soro com resultado
positivo em cultura, o ELISA detectou 27 amostras positivas
ABSTRACT
THE USE OF INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCEASSAYAS ROUTINE DIAGNOSIS METHOD FOR VISCERAL
CANINE LEISHMANIASIS AND ITS IMPLICATIONS IN DISEASE CONTROL
In this study, 101 canine sera from the Metropolitan
Area of Salvador, Bahia were tested by indirect enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) and indirect
immunofluorescence assay (IFA) for Leishmania reacting
immunoglobulins. Thirty sera came from dogs living in an
endemic area, with positive splenic culture for Leishmania
chagasi and were used as positive standard. The other 71
sera came from healthy dogs, domiciliated in a non-endemic
area. From the thirty dogs with positive culture, 27 were
seropositive by ELISA and 12 by IFA. All 71 sera of healthy
dogs were negative by ELISA and one had a positive result
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INTRODUO
A leishmaniose visceral (LV) uma zoonose
importante pela morbimortalidade a ela associada e
em virtude da sua rpida expanso geogrfica
registrada nas ltimas dcadas, resultando no
estabelecimento de novas reas endmicas, a exemplo
do demonstrado nos estados da Bahia (FRANKE
et al., 2002a) e Maranho (MENDES et al., 2002)
situados na Regio Nordeste do Brasil. As medidas
de controle da LV preconizadas pela Organizao
Mundial de Sade constam do diagnstico precoce
e tratamento dos casos humanos, e do controle dos
vetores e realizao de inquritos sorolgicos nas
populaes caninas seguidos da eliminao dos
animais soropositivos (WHO, 1988). Nos ltimos
anos, alguns autores tm observado que a eliminao
de ces soropositivos no tem contribudo
significativamente para a reduo da incidncia da
doena na populao humana (RACHAMIM et al.,
1991; EVANS et al., 1992; DYE, 1996;
PARANHOS-SILVA et al., 1998).
Uma das explicaes possveis para a reduzida
eficincia da eliminao de ces soropositivos na
reduo da incidncia de casos humanos seria a baixa
sensibilidade do teste de imunofluorescncia indireto
(IFI) utilizado oficialmente nos inquritos sorolgicos
caninos para controle da leishmaniose visceral no
territrio brasileiro (BERRAHAL et al., 1996). A
deteco apenas parcial dos casos caninos em uma
determinada regio resultaria na permanncia de ces
infectados, contribuindo para a continuidade do ciclo
de transmisso do parasito nas populaes caninas
e humanas locais (COURTENAY et al., 2002).
Outros testes sorolgicos, tais como ELISA, DOTELISA ou Western-Blotting (WB), para a deteco
de anticorpos antileishmania foram descritos na
literatura (RACHAMIM et al., 1991; DIETZE et al.,
1995; MANCIATI et al., 1996; BADAR et al.,
1996; VERCAMMEN et al., 1997).
Comparativamente ao teste de IFI, o teste
ELISA tem vrias vantagens, como um procedimento
mais simples e rpido, necessita apenas uma diluio
de soro e considerado mais sensvel
(PARANHOS-SILVA et al., 1996; CABRAL et al.,
1998). A caracterstica do teste WB de reconhecer
antgenos especficos do parasito o torna mais
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do ponto de corte foi estabelecido em trabalhos anteriores como descrito por GREINER et al. (1994).
Os soros em estudo foram enviados para um
laboratrio autorizado da rede de sade pblica da
Bahia, responsvel pelo exame sorolgico das amostras coletadas nos inquritos caninos realizados oficialmente no estado, sendo que cada amostra de soro
foi avaliada pelo teste IFI duas vezes.
Protocolo do Western-Blotting
As protenas do antgeno utilizado para o
ELISA foram separadas por SDS-PAGE com um
gel de poliacrilamida de 12% e transferidas para uma
membrana de nitrocelulose (marca MILLIPORE,
EUA). As membranas foram bloqueadas em PBS-T
com 5% de leite em p desnatado overnight a 5C.
As tiras foram incubadas durante uma hora a 37C
com os soros diludos 1/50 em PBS-T com 1% de
leite em p desnatado. Em seguida, elas foram lavadas cinco vezes em tampo PBS-T e incubadas uma
hora com um conjugado anti-IgG de co/peroxidase
(Sigma, EUA) na diluio de 1/200. A revelao foi
feita com o cromgeno 4-cloro-a-Naftol e perxido
de hidrognio e a reao interrompida com gua destilada.
Protocolo de Elisa
As microplacas foram sensibilizadas
overnight a 4C com o antgeno na concentrao
de 10 mg de protenas por poo diludas em 100ml
de tampo carbonato bicarbonato 0,05M, pH 9,6.
O bloqueio foi feito utilizando-se 200ml de PBS,
contendo 0,05% de tween 20 (PBS-T) com 5% de
leite em p desnatado e incubado temperatura
ambiente durante uma hora. Os soros foram analisados utilizando-se 100ml por poo na diluio de
1/400 em PBS-T com 5% de leite em p desnatado, incubando-se durante uma hora temperatura
ambiente. Posteriormente, 100ml de conjugado antiIgG de ces /Peroxidase (Sigma, USA), na concentrao de 1/25.000, diludo em PBS-T com 5% de
leite em p desnatado, foram acrescentados e incubados durante uma hora temperatura ambiente.
Quatro lavagens com 200ml de PBS-T foram realizadas aps cada perodo de incubao. A revelao foi feita com perxido de hidrognio e OPD em
tampo citrato-fosfato, e a reao foi interrompida
com 50ml de cido sulfrico 4M por poo, sendo a
placa lida imediatamente em filtro 490nm. O clculo
RESULTADOS
Os resultados comparativos dos testes de
ELISA e IFI esto apresentados na Tabela 1. Das
30 amostras de soro com resultado positivo em cultura, o ELISA detectou 27 amostras positivas, e o
IFI mostrou resultado positivo em 12. Das 71 amostras de soro de ces clinicamente sadios, todas apresentaram resultados negativos no ELISA e uma apre-
TABELA 1. Resultados sorolgicos dos testes ELISA e IFI das 30 amostras de ces infectados com Leishmania e 71
amostras de ces clinicamente sadios.
ELISA
IFI
Positivo
Negativo
Positivo
N
%
27
0
90,0
0
3
71
10,0
100,0
12
1
40,0
1,4
Negativo
N
%
18
70
60,0
98,6
44
IFI
ELISA
WB
I
J
K
L
O
P
Q
R
S
T
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
TABELA 3. Percentagem de reatividade de bandas reconhecidas por soros de ces considerados positivos por Western
Blotting.
Peso
(kDa)
T % de reconhecimento
14
16
28
30
32
54
62
68
72
122
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
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+
+
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+
-
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+
+
+
+
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+
-
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-
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+
-
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+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
DISCUSSO
A leishmaniose visceral vem apresentando uma
clara tendncia de expanso geogrfica nas ltimas
dcadas como foi demonstrado por FRANKE et al.
(2002a), na Bahia, e MENDES et al. (2002), no
Maranho, e sua reemergncia tem sido observada
em vrias regies (ARIAS et al., 1996; SILVA et
al., 2001). Fatores como fenmenos climticos,
implantao de projetos agroindustriais, rpido
crescimento das cidades agravado pela falta de
planejamento urbano, impactos ambientais e uma
progressiva deteriorizao da condio
socioeconmica de ampla parcela das populaes
82
82
64
82
73
91
82
73
100
45
45
CONCLUSES
46
47
48