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1. ENZIMAS DE RESTRICCIN
DEFINICION:
Las enzimas de restriccin, tambin conocidas como endonucleasas, son aquellas que
reconocen una secuencia entre 4-8 pb en DNAds. El sitio de reconocimiento se llama
sitio de restriccin, y la enzima rompe un enlace fosfodiester en la hebra de arriba y otro
enlace fosfodiester en la hebra complementaria.
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de protenas las
enzimas endonucleasas o enzimas de restriccin- que actan como tijeras
moleculares, cortando la doble cadena de ADN a travs del esqueleto de fosfatos sin
daar las bases. El descubrimiento de estas enzimas condujo a dichos microbilogos al
Nbel en 1978 y dio origen a la ingeniera gentica.
Las enzimas de restriccin permiten cortar el genoma de cualquier organismo en
pequeos fragmentos llamados fragmentos de restriccin. La coleccin de miles o
millones de estos fragmentos se llama biblioteca gnica.
Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias
palindrmicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como un
mecanismo de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la clula.
Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre
el DNA extrao y el DNA propio. Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA
metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
Este sistema es anlogo a
un sistema inmune, y le
permite distinguir a la
bacteria entre su propio
DNA y el DNA exgeno,

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siendo este ltimo degradado por la enzima de restriccin. El DNA propio no es


reconocido por sus enzimas de restriccin, puesto que previamente lo ha modificado por
metilacin a travs de la accin de una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos
metilo desde S-adenosilmetionina a bases especficas). Se conocen aproximadamente
1200 tipos diferentes de enzimas, las cuales actan a 37 C y se inactivan rpidamente.

El trmino restriccin proviene del mecanismo de accin que cumplen estas enzimas
en las bacterias que las sintetizan. Cortan el ADN del virus que las parasitan
restringiendo la duplicacin del mismo.
Las enzimas de restriccin cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos
cohesivos son generados cuando la enzima corta las dos hebras asimtricamente,
dejando los extremos de cada hebra de simples cadenas complementarias entre s. Por
otro lado, los extremos romos son generados cuando la enzima corta las dos hebras por
el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena.
Estas molculas son indispensables para la ingeniera gentica, ya que producen
fragmentos que se pueden unir entre s fcilmente (con la ayuda de un pegamento
molecular: la enzima ligasa). Estas enzimas tienen la capacidad de reconocer una
secuencia determinada de nucletidos y extraerla del resto de la cadena. Esta secuencia,
que se denomina Restriction Fragment Lenght Polymophism o RLPM, puede volver a
colocarse con la ayuda de otra clase de enzimas, las ligasas. Anlogamente, la enzima
de restriccin se convierte en una "tijera de ADN", y la ligasa en el "pegamento". Por lo
tanto, es posible quitar un gen de la cadena principal y en su lugar colocar otro.

Figura 1.
Enzimas de restriccin. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de extremos.
En el primer caso, el corte genera nuclotidos de simple cadena llamados extremos
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cohesivos. Estos extremos se pueden unir por medio de otra enzima, la ADN ligasa. En
el segundo caso, se generan extremos doble cadena (extremos romos). Estos extremos
tambin pueden ser unidos con la ayuda de una enzima ligasa pero, como no los
extremos no son complementarios, la unin ser ms inespecfica.
Fragmentos de restriccin:
La longitud de los fragmentos de restriccin depende de los sitios de corte de la enzima.
Si ocurriese un cambio de bases en el sitio de corte, la enzima respectiva dejar de
reconocer a ste como tal, dando lugar a un corte en otro sector y por lo tanto se
originar un fragmento de restriccin de mayor longitud. Tambin hay que tener en
cuenta que un cambio en una base puede crear un sitio de corte en una zona donde
habitualmente no exista, dando lugar a la aparicin de un fragmento de restriccin de
menor

longitud.

Estas variaciones de reconocen como RFLP o Polimorfismo de longitud de los


fragmentos de restriccin.
RFLP, uso en identificacin de personas:
A lo largo de todo el genoma existen determinadas regiones en las cuales las bases se
repiten en secuencias cortas. Estas regiones se conocen como repeticiones en tandem de
nmero variable o VNTR . Se han identificado numerosas enzimas de restriccin que
actan a este nivel, las cuales al cortar determinan la aparicin de fragmentos cuyas
longitudes

depender

del

nmero

de

VNTR

existentes.

Como hay una gran cantidad de regiones VNTR y diferentes entre s, el patrn de
bandas resultante es exclusivo de cada individuo, dado que la probabilidad que se repita
en

dos

sujetos

diferentes

es

inferior

una

cada

cien

millones.

Esta particularidad resulta til en la identificacin de las personas y en la gentica


forense, ya que no existe un individuo con idntico patrn gnico que el otro.

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TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCIN:


Sistemas tipo I:
Son complejos multienzimticos, con pesos moleculares de 400.000 daltons o
mayores.
Sus actividades principales son reconocer la secuencia especifica del ADN,
mutilar y restringir, pero la restriccin no ocurre en el sitio de reconocimiento,
sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.
Requieren ATP, Mg2+ y S-adenosilmetionina para su actividad.
Las enzimas de restriccin correspondientes a este tipo tienen diferentes
actividades enzimticas, como metilacin de DNA, para lo que requieren Sadenosilmetionina y es estimulada por Mg2+ y ATP, actividad ATPasa y actividad
nucleoltica sobre DNA.
Los sitios de ruptura en el DNA no son especficos, ocurriendo entre 1 y 5 kb del
sitio de reconocimiento. Esta es la razn por la cual las enzimas de restriccin
pertenecientes al tipo I no han sido muy utilizadas en biologa molecular.
Sistemas tipo II
Enzimas diferentes realizan la restriccin y modificacin. La restriccin ocurre
en el sitio de reconocimiento adyacente.
Estas enzimas tipo II son las utilizadas en el clonamiento de genes, puesto que
permiten romper el DNA en sitios especficos, y as, recuperar secuencias
conocidas.
Son menos complejas, con pesos moleculares menores de 80.000 daltons
Requieren nicamente Mg2+ para la actividad nucleoltica. No necesitan ATP.
Estas endonucleasas reconocen secuencias especificas en el DNA, rompindole
en ambas cadenas y generando fragmentos equimolares en la molcula de DNA
sustrato.
Las secuencias de reconocimiento de las enzimas tipo II son de tipo palndrome
(se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda).

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Se denominan isoquizmeros a aquellas enzimas que han sido obtenidas de


diferentes especies de bacterias, pero que reconocen la misma secuencia de
DNA.
Se han aislado alrededor de 350 diferentes endonucleasas de restriccin del tipo
II, con aproximadamente unas 85 secuencias especficas de reconocimiento
diferentes.
Dada su especificidad, que posibilita el predecir los posibles fragmentos
producidos a partir de una secuencia conocida de DNA, estas enzimas han sido
extremadamente tiles en biologa molecular.
Provocan 2 tipos de cortes:

Cortes escalonados, dejando productos con extremos complementarios


(cohesivos) Ej: Eco RI

Cortes simtricos, dejando productos con extremos ciegos Ej: Alu I

Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos (con extremos ciegos y con


extremos escalonados), en ingeniera gentica se prefieren aquellos con
extremos complementarios, puesto que permiten la unin espontnea del gen a
clonar con el vector. Si las molculas a utilizar presentan extremos ciegos, hay
que conferirles extremos cohesivos, por ejemplo utilizando la enzima transferasa
terminal.
Ejemplos de enzimas de restriccin tipo II:
MICROORGANISMO

ENZIMA

SECUENCIA

Arthrobacter luteus

Alu I

AG

CT

TC GA
Escherichia coli RY13

Eco RI

AATTC

CTTAA G
Escherichia coli J62

Eco RV

GAT

ATC

CTA TAG
Klebsiella neumoniae

Kpn I

GGTAC

C CATGG

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Nocardia otitis-caviarum

Not I

GC

GGCCGC

CG CCGG CG
Haemophilus aegyptus

Hae III

RGCGC

Y CGCGR
Haemophilus influenzae

Hinf I

ANTC

CTNA G

R: significa base prica (A G)


Y: significa pirimidina (C T)
N : significa cualquier nucletido
* : indica ruptura enlace fosfodiester

Sistemas tipo III


Es similar al sistema tipo I,
Utilizan una enzima oligomrica que realiza todas las actividades enzimticas, y
rompen el DNA 25-27 pb ms all del sitio de reconocimiento.
Comprende endonucleasas que requieren ATP y Mg2+ aunque no tienen actividad
de hidrlisis de ATP detectable
La actividad endonucleasa no tiene un requerimiento estricto de Sadenosilmetionina, aunque resulta estimulada por l.
La actividad metilasa requiere S-adenosilmetionina nicamente como donador
de grupos metilo y se han aislado formas metilantes libres de actividad
nucleoltica, sugiriendo que la endonucleasa y la metilasa son componentes del
mismo complejo molecular que es capaz de disociarse en condiciones
apropiadas.
El sitio de ruptura de DNA, por estas enzimas del tipo III, ocurre a
aproximadamente 10 a 20 nucletidos de distancia del sitio de reconocimiento.

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Aplicaciones:
El descubrimiento de las endonucleasas de restriccin ha permitido el desarrollo
vertiginoso de lo que se denomina tecnologa del DNA recombinante. Vamos sin
embargo a desarrollar brevemente algunos aspectos en los que la utilizacin de estas
enzimas tienen una aportacin especifica al campo de la biologa molecular.
Las enzimas de restricci6n han sido utilizadas para la construccin de los mapas
genticos de pequeos genomas como plsmidos, bacterifagos o virus.
Adems de este uso son imprescindibles para la caracterizacin de genes obtenidos por
tcnicas de DNA recombinante, como por ejemplo determinacin de exones e intrones
de un gen, zona de los promotores, secuencias adyacentes a los extremos 5', zonas de
poliadenilacin, y en general todo tipo de estudios de carcter estructural en los que es
imprescindible el desarrollo de mapas de restriccin.

Estudio del numero de copias de un gen.


En algunas ocasiones se puede determinar cual es l numero de copias de un gen
presentes en un determinado genoma. Este anlisis se realiza mediante la deteccin de la
ausencia de sitios de reconocimiento para determinadas endonucleasas de restriccin,

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dentro de la secuencia codificante del gen. Mediante digestin del DNA genmico con
las enzimas de restriccin para las que no existen sitios de reconocimiento en ese gen e
hibridacin con sondas de DNA para ello, podemos tener una aproximacin del nmero
de copias presentes en el genoma mediante la observacin del numero de bandas de
hibridacin obtenidas en el digerido del DNA genmico.
Este tipo de aproximacin se ha utilizado en el anlisis del numero de copias presentes
en el genoma humano para l interferan 1'5', as como para l numero de copias
presentes para la subunidad a de la gonadotropina corionica humana '14'.
Fragmentar DNA genmico para separacin de electroforesis y Southern Blot.
Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southerny
Northern blotting.
Medicina:
Existen una serie de enfermedades congnitas debidas a alteraciones en la estructura del
DNA. Estas alteraciones pueden ser detectadas utilizando endonucleasas de restriccin,
ya que una determinada alteracin puede originar o suprimir el sitio de reconocimiento
de una endonucleasa de restriccin determinada. Este hecho permite la deteccin de
enfermedades congnitas tanto en individuos afectados como en individuos portadores,
como, y lo que es ms importante, en DNA extrado de fibroblastos fetales mediante
amniocentesis o biopsia de vellosidades corionicas, permitiendo un diagnostico
prenatal.
La tcnica utilizada consiste en el anlisis de las variaciones en los tamaos de los
fragmentos de restriccin. o RFLPs (~restriction fragment length polymorphisms~). Se
basa en la obtencin de DNA de los individuos afectados por la enfermedad en estudio,
su digestin con una bacteria de diferentes enzimas de restriccin, separacin mediante
electroforesis, transferencia a nitrocelulosa e hibridaci6n con sondas de DNA
pertenecientes al gen en estudio o a un fragmento de DNA prximo a ese gen, para
evitar la posibilidad de separacin en los procesos de recombinacin meitica. Mediante
el anlisis del tamao de los distintos fragmentos de restriccin que producen

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hibridacin, podemos asociar un determinado modelo de restriccin con el


padecimiento de la enfermedad que estamos estudiando.
Hay que destacar que las poblaciones humanas son polimrficas, es decir que existen
pequeas variaciones en la estructura del DNA de unos individuos a otros; lo que se
pretende con el anlisis por RFLPs es asociar una variante determinada con una
enfermedad determinada, por el anlisis del DNA de individuos pertenecientes a
familias afectadas por esa enfermedad.

2. ADN LIGASA
DEFINICIN:
En 1967 la investigacin en varios laboratorios simultneamente llev al
descubrimiento de la ADN ligasa llamada tambin enzima de unin de polinucletidos.
ADN ligasa es una enzima que forma enlaces covalentes entre el extremo 5 de una
cadena polinucleotdica y el extremo 3 de otra cadena polinucleotdica. Esta enzima
requiere de un grupo OH- libre en el 3`final de la cadena de ADN y un grupo fosfato en
el 5`final. La formacin de un enlace fosfodiester entre estos grupos es una reaccin
endergnica.
La ADN ligasa usada ms habitualmente es la T4 ADN ligasa, que requiere ATP como
cofactor.
La enzima, ADN ligasa, repara los millones de discontinuidades de ADN generadas
durante la vida normal de la clula, por ejemplo, acoplando los abundantes fragmentos
de ADN formados durante la copia del material gentico en la divisin celular; Participa
tambin en el mantenimiento de la actividad genmica y su actividad.
Las ADN ligasas son blancos atractivos para la quimioterapia del cncer y otras
enfermedades.
TIPOS:
En los mamferos se ha identificado 3 genes que codifican para el ADN ligasa: LIG1,
LIG2, LIG4. Estos tres genes codifican para cuatro ADN ligasas existentes, la ADN
ligasa II deriva del ADN ligasa III por medio de un mecanismo proteoltico. La ADN
ligasa 1 es especifica para replicacin de ADN y es la encargada de formar el enlace
fosfodiester entre los fragmentos de la cadena rezagada. Dos formas de ADN ligasa III

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se producen por remocin alternativa de intrones. La ADN ligasa III expresada en


forma ubicua forma complejos con la protena XRRCC1 implicada en la reparacin de
roturas de cadena sencilla .En contraste, la ADN ligasa III se expresa solo en clulas
meiticas masculinas, lo que sugiere que intervienen en la recombinacin meitica. La
ADN ligasa IV parece estar implicada en la reparacin directa de roturas de doble
cadena DSB (double strand break)
Las aplicaciones en la investigacin de la biologa molecular.
Las ligasas de ADN se han vuelto una herramienta indispensable en la investigacin de
la biologa molecular moderna para el recombinante generador las sucesiones de ADN.
Por ejemplo, se usan los ligasas de ADN con las enzimas de la restriccin para insertar
ADN fragmenta, a menudo los genes, en el plsmidos.
Uno vital, y a menudo trapacero, es realizar la recombinacin exitosa experimenta
involucrando el ligase est controlando la temperatura ptima. La mayora de los
experimentos usa T4 ADN Ligasa (se aisl del bacterifago T4) qu es muy activo a las
25C. Sin embargo para realizar el ligado exitoso, la temperatura de la enzima ptima
necesita ser equilibrada con la Tm de temperatura fundicin (tambin la temperatura del
recocido) del los fragmentos ligados de ADN.
Si la temperatura ambiente excede la Tm, el apareamiento homlogo de los fines
pegajosos no ocurrir porque la temperatura alta rompe la vinculacin de hidrgeno. El
ms corto el ADN fragmenta, el ms bajo la Tm. As para los fines pegajosos (los
traslapo) mucho tiempo, menos de diez pares de la base se realizan los experimentos del
ligacin a las temperaturas muy bajas (~4-8C) para un perodo largo de tiempo (a
menudo de noche).
Los ligasas de ADN disponibles comercialmente comunes se descubrieron
originalmente en el bacterifago T4, E. coli u otras bacterias.

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3. ADN POLIMERASA
DEFINICIN:
La bsqueda de una enzima que sintetizase el ADN llevo al descubrimientos de la ADN
polimerasa por Arthur Kornberg y colaboradores. La ADN polimerasa es la principal
enzima de la replicacin. Partiendo de una cadena inicial o primer la ADN polimerasa
aade nucletidos complementarios a la cadena molde extendiendo la nueva cadena de
ADN en direccin 5- 3.
La ADN polimerasa es la enzima principal en el proceso de replicacin. Partiendo de una
cadena inicial o primer la ADN polimerasa es capaz de aadir nucletidos
complementarios a la cadena molde estableciendo enlaces fosfodister. La ADN
polimerasa slo puede catalizar el crecimiento de la cadena inicial en direccin 5'-3',
ensamblando los trifosfatos de desoxirribonuclesido en el ADN, sirviendo como patrn
una cadena simple de ADN. La ADN polimerasa tambin se encarga de la reparacin del
ADN asociada a la replicacin. sta que Constituye la piedra angular de la reaccin de la
polimerasa en cadena (PCR) que se utiliza para amplificar el ADN. El modelo de
sustitucin es altamente especfico.

Las actividades exonucleasas de la DNA pol:


La ADN polimerasa son protenas que adems de las actividades polimerasas que
poseen, tienen tambin actividades exonucleasas.
Los ADN pol de tipo I terminan la replicacin, eliminando los cebadores ARN en los
secuencias de Okazaki y corrigindo los
errores producidos por la polimerasa de tipo
III.
Para realizar sta actividad, una ADN
polimerasa de tipo I posee dos tipos de
actividades exonucleasas. Una actividad
exonucleasa 5' 3' que elimina todos los
nucletidos

(ribonucletido

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desoxiribonucletido) situados al final del cebador. Esta actividad es muy til para la
reaccin en cadena en tiempo real y en la tcnica del marcado de sondas denominada
translacin nick (nick translation). La otra actividad (3' 5') es la actividad
"proofreading", osea la correcin de errores. Esta actividad no existe en los procariotas
(bacterias), solamente en los eucariotas y archaea. Las polimerasas que poseen sta
actividad exonucleasas producen menos faltas pero son 10 veces ms lentas.
Las polimerasas se utilizan tambin para el secuencaje. Se considera que la actividad
exonucleasa 5' 3' destruye una parte de los cebadores y como tal se pueden encontrar
polimerasas desprovistas de stas actividades.
TIPOS:
Hay 5 ADN polimerasas diferentes bien caracterizadas, diferencindose en su localizacin,
actividad y sensibilidad a los inhibidores: alfa, beta, gamma, delta y psilon:
Las ADN polimerasas delta y epsilon:
Dirigen la replicacin de la cadena conductora o leading strand que es la cadena
que crece de 5' a 3' en mismo sentido que crece la nueva copia de ADN.
Estas dos ADN polimerasas funcionan durante la fase S del ciclo celular en las
clulas eucariontes. El ADN polimerasa delta es un heterodmero compuesto de
una subunidad P125 y otra P50, aunque es probable que en levaduras y mamferos
contengan una subunidad adicional con una masa aproximada de 50kDa. P 125 es
la subunidad cataltica tanto para la actividad de polimerasa como para la edicin
con actividad de exonucleasa 3`5`. LA polimerasa delta es necesaria para la
sntesis tanto de la cadena libre como de la cadena rezagada durante la replicacin.
La interaccin de las polimerasas delta y epsilon con el ADN ligasa I es diferente;
la presencia de esta enzima en la horquilla de replicacin reprime la accin de la
polimerasa delta y por el contrario, activa la polimerasa epsilon, de este modo ha
surgido que la replicacin de la cadena rezagada se debe a la polimerasa epsilon.
La ADN polimerasa epsilon parece que tambin est involucrada en un tipo de
reparacin del ADN. Adems, las ADN polimerasas gamma, delta y epsilon tienen

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actividad exonucleasa 3'5' y, por tanto, son capaces de eliminar los nucletidos
del extremo 3' que han sido incorporados incorrectamente en un proceso conocido
como correccin de pruebas.
La ADN polimerasa alfa:
Participa en el proceso de replicacin del ADN dirigiendo la replicacin de la
cadena retardada o lagging strand que es la cadena que crece de 3' a 5' que es el
sentido contrario al del crecimiento global de la nueva copia de ADN.
Una propiedad adicional enzimtica de la ADN polimerasa es su capacidad para
hidrolizar cadenas de ADN bajo ciertas condiciones.
La ADN polimerasa puede hidrolizar ADN progresivamente desde el extremo 3
-hidroxilo de una hebra de ADN. Los productos son mononucletidos. As pues,
la ADN polimerasa I es una exonucleasa 35. El nucletido eliminado debe
tener un termino 3-OH libre, y no puede ser parte de una doble hlice.
Experimentos con una variedad de polmeros sintticos han indicado que la
ADN polimerasa I siempre elimina residuos no aparentes de los extremos antes
de proseguir con la polimerizacin. No hay hidrlisis, si los trminos estn
convenientemente acoplados y estn presentes los precursores activados. La
polimerizacin evita la hidrlisis a partir del extremo 3`. La polimerizacin
generalmente no ocurre excepto si los pares de bases encajan en una doble
hlice. Sin embargo si se produce un error en esta etapa puede ser corregido
antes que sea incorporado al siguiente nucletido. En efecto, la ADN polimerasa
1 examina el resultado de cada polimerizacin que cataliza antes de la
incorporacin del siguiente nucletido. La ADN polimerasa 1 puede tambin
hidrolizar ADN a partir del extremo 5` de la cadena. Esta actividad de nucleasa
5`3` es muy diferente al de la exonucleasa 3`5`. Primero el enlace roto
puede estar en una regin de doble hlice. Segundo la rotura puede ocurrir en el
enlace fosfodiester Terminal o en un enlace a varios residuos de distancia del
Terminal 5`.
Tercero, la actividad de nucleasas 5`3` es intensificada por la sntesis
concomitante de ADN. Cuarto, el centro activo para la actividad de nucleasa
5`3` es completamente diferente de los centros activos de la polimerizacin y

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la hidrlisis 3`5`. El ADN polimerasa 1 puede dividirse en fragmentos de


75000 y 36000 daltons por divisin proteoltica controlada. Los fragmentos
pequeos tienen actividad de nucleasa 5` 3`original, mientras los restantes
fragmentos grandes contienen las actividades de la polimerasa y de nucleasas
3` 5`. As pues la ADN polimerasa 1 contiene al menos 2 tipos de enzimas
distintas en una cadena polipeptdica.
La ADN polimerasa beta:
Se encarga de los procesos de reparacin del ADN.
La ADN polimerasa gamma:
Realiza

la

replicacin

del

ADN

mitocondrial.

Se est estudiando la relacin entre mutaciones en la ADN polimerasa gamma


(mitocondrial) con enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson o algunos
tipos de distrofia muscular. En algunos casos estas mutaciones pueden deberse a la
presencia de regiones de poliglutamina en la secuencia codificante de la ADN
polimerasa gamma. Por otra parte, se ha encontrado que mutaciones en la ADN
polimerasa delta, probablemente en su dominio con actividad exonucleasa
responsable de la correccin de pruebas, pueden ser responsables del inicio y
desarrollo de tumores.

ADN
polimerasa
Localizacin

(I)

(III)

(II)

nuclear

nuclear

nuclear

nuclear

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mitocondrial

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Funcin

en

sntesis

cebar

sntesis ADN

reparacin

3-5

3-5

exonucleasa

exonucleasa

afidicolina

afidicolina

reparacin

replicacin

de ADN
otras
funciones
inhibidores

4.

afidicolina

desoxi-TTP

3-5
exonucleasa
desoxi-TTP

TRANSCRIPTASA INVERSA

DEFINICIN:
Durante muchos aos se crey que ese flujo de informacin gentica era unidireccional,
hasta tal punto que dicho supuesto constitua el llamado "dogma central" de la biologa
molecular. Sin embargo, hace algn tiempo, el descubrimiento de un grupo de
organismos capaces de invertir el sentido de este flujo conmovi los cimientos de este
dogma central. Estos organismos son un tipo de virus que se ha denominado Retrovirus.
La transcriptasa inversa o retrotranscriptasa es una enzima de tipo ADN-polimerasa, que
tiene como funcin sintetizar ADN de doble cadena utilizando como molde ARN
monocatenario, es decir, catalizar la retrotranscripcin o transcripcin inversa. Esta
enzima se encuentra presente en los retrovirus. Su nombre obedece a que el proceso
normal de la transcripcin, la que se puede llamar "directa", codifica el ARN a partir de
la secuencia inicial de ADN, y no al revs. Una forma sencilla de sntesis de DNA de
doble cadena a partir de transcriptasa inversa o tambin llamada DNA polimerasa/RNA
dirigida sera partir de un cebador cola de poli-T que establecera bases
complementarias con la cola de poli-A del RNA transcrito de la hebra a sintetizar,
formndose as un hbrido RNA/DNA. Dicho hbrido podra separarse mediante
ribonucleasas, y posteriormente con la accin de una DNA-polimerasa y un nuevo
cebador, ser completada la hebra de DNA de doble cadena.
La enzima transcriptasa reversa, que naturalmente producen ciertos virus para invadir el
genoma de sus clulas blanco, se utiliza ampliamente para clonar genes a partir de sus
ARN mensajeros
TRANSCRIPCIN REVERSA Y PCR (RT-PCR)

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Este mtodo combina la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) con el proceso de


transcripcin reversa.
Tiene como propsito generar un gran nmero de copias de un fragmento de ADN de
inters in Vitro .La concentracin de copias aumenta exponencialmente, ya que en cada
ciclo se copian las dos cadenas del ADN .Si se inicia la reaccin con una copia del gen y
este es copiado en el primer ciclo, se ha detener dos copias .En el segundo ciclo se a de
concluir con la formacin de cuatro copias, etc.
El mtodo de RT-PCR permite

medir la expresin gnica

mediante una tcnica

alternativa al Northen Blot. Es ms sensible y requiere menos ARN .Sin embargo, la


presencia de ARN o ADN contaminante, tanto en las muestras, como en laboratorios y
reactivos, debe ser evitada con el fin de impedir la aparicin de productos inespecficos.
La transcripcin reversa.,tanto utilizando ARN total como ARNm, es la etapa clave en
el proceso de RT-PCR57.Existen varios factores que influencian la eficiencia del
proceso ,tales como la accin de la enzima que lleva acabo la reaccin y la presencia de
estructuras secundarias en el ARN.
En el caso del estudio de tejidos cancerigenos se realiza la extraccin de ARN del tejido,
se efecta la transcripcin reversa y finalmente se lleva acabo el PCR. Los resultados
son comparados con los tejidos sanos los retrovirus.

1. CARACTERSTICAS:
Tcnica que consiste en la amplificacin in vitro de un fragmento de ADN
especfico, y que est presente en muy bajas cantidades en el material clnico a
investigar.

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El fundamento de esta reaccin en cadena es la repeticin cclica de 3 reacciones


simples que varan slo en cuanto a la temperatura de incubacin, estas son: la
desnaturalizacin, la alineacin y la extensin.

Los elementos que se emplean y participan en esta tcnica, son: la ADN


polimerasa, cantidades elevadas de desoxirribonucletidos trifosfato (dATP,
dGTP, dCTP, dTTP) y dos oligonucletidos cebadores de hebra simple
complementaria a las secuencias conocidas del ADN patrn.

Se emplean ADN polimerasas termoestables, extradas de microorganismos


adaptados a vivir a altas temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres
vivos, como las: Thermus aquaticus, (Polimerasa taq) una bacteria que vive en
fuentes termales y que es muy resistente al calor, lo que hace que no se inactive
por desnaturalizacin cuando en el proceso se aumenta la temperatura, y por
ende se consigue una mejor fidelidad del proceso, ya que es ms especfica.
La reaccin en cadena de la polimerasa, es una tcnica que permite replicar entre
cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas en in vitro,
pequeas cantidades de ADN.
El producto que se obtiene al finalizar la reaccin es una gran cantidad de un
fragmento gnico con alto grado de pureza.

2. TCNICAS:
La tcnica del PCR consiste bsicamente en la desnaturalizacin, alineacin o
hibridacin y la extensin o amplificacin, estos procesos se repiten continuamente.

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A) La Desnaturalizacin, por calentamiento a temperatura elevada ( mayor de


90 C) , del ADN patrn de doble hebra en hebras simples.
B) La Alineacin o unin de los cebadores, se producir la hibridacin del
cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN
molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-65C durante 20-40
segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Los puentes de
hidrgeno estables entre las cadenas de ADN slo se forman cuando la secuencia
del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el
hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los
cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser
amplificada.
C) La Extensin o Amplificacin, acta la ADN polimerasa, tomando el ADN
molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como
soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza
una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los
nucletidos trifosfatos en direccin 53. El tiempo de extensin depende tanto
de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se
va a amplificar.
Hay una regla bsica: en su temperatura ptima, la polimerasa de ADN
polimerizar mil bases en un minuto.

Modificaciones de la tcnica: stas sirven para mejorar la especificidad de la


reaccin de las PCRs:
PCR anidada: (nested PCR) Tcnica muy sensible de PCR en la que el
producto de la primera amplificacin, es utilizado como molde para realizar
una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera
secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy especfica.
PCR in situ: Consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o
clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de
amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En
la tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN

SEMINARIO: TCNICAS MOLECULARES DEL ADN

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blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con


sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades
pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la capacidad
de amplificar especficamente una poblacin de secuencias de menor
representacin.
PCR por contacto: Tcnica utilizada para incrementar la especificidad sin
comprometer la produccin. El principio es iniciar la sntesis a muy altas
temperaturas de alineamiento lo cual slo permite la formacin nica de los
pares

perfectamente

alinanos

cebador-molde.

La

temperatura

de

alineamiento es bajada de una forma gradual con cada ciclo. Una vez que las
copias de la secuencia diana han comenzado a acumularse durante los
primeros ciclos, el alineamiento a alta temperatura llega a ser mucho menos
crtico para la especificidad, como son los productos previos que forman el
molde principal.
Los productos improbablemente tendrn secuencias de alineamiento falso.
El beneficio de disminuir la temperatura de alineamiento es el incrementar la
probabilidad de una interaccin estable cebador-diana. El resultado es una
mejora en la produccin del producto especfico comparndolo con los
protocolos que utilizan alineamiento a una nica alta temperatura.
RT-PCR (Revese Transcription PCR): Utilizado para amplificar, aislar o
identificar una secuencia conocida de tejido RNA. La PCR es precedida por
una reaccin usando la transcriptasa inversa para convertir el RNA a cDNA
(ADN complementario).

RT-PCR se utiliza ampliamente en perfiles de

expresin, para determinar la expresin de un gen o para identificar la


secuencia de una transcripcin de ARN, incluyendo la transcripcin de inicio
y terminacin de los sitios y, si la secuencia del
ADN geonmico de un gen es conocido, el mapa de ubicacin de exones e
intrones en el gen.

3. APLICACIONES BSICAS:
Las aplicaciones de la PCR son mltiples, esta tcnica se desarrolla en diversos campos
como la biologa molecular, la gentica, medicina y otros.

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El producto que se obtiene al finalizar la reaccin -una gran cantidad de un fragmento


gnico con alto grado de pureza- despierta el inters de los investigadores por ampliar
los conocimientos sobre la estructura y funcin de los genes.
Por su alta sensibilidad, esta tcnica permite identificar un gen a partir de un solo
cabello, una clula somtica o un espermatozoide.
Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificacin de personas,
por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el anlisis de muestras del nio y de su
abuela materna.
En la deteccin de mutaciones: La tcnica de PCR nos permite localizar mutaciones
previamente descritas. Se emplea as en la secuenciacin de ADN como un mtodo de
diagnstico: Una vez que se ha caracterizado la relacin con una enfermedad de una
determinada mutacin puntual (mutaciones en el gen de la galactosa 1P uridiltransferasa
en la galactosemia, mutaciones en c-Ras y cncer, etc.) o de una pequea delecin
(delecin de tres bases en el gen CFTR de fibrosis qustica ) puede desarrollarse un
mtodo de deteccin rutinario , la secuenciacin automtica puede implementarse como
mtodo de screening para la localizacin de nuevas mutaciones.
Tambin se ha utilizado para realizar la subtipificacin de neoplasias, para vigilar la
respuesta al tratamiento y en la deteccin de las recurrencias o de recadas tempranas (se
menciona que tiene una sensibilidad para detectar una sola clula tumoral entre un
milln de clulas sanas), lo que permite establecer un pronstico de la enfermedad, as
mismo el PCR se ha utilizado para el estudio de la estructura y expresin de los
oncogenes, y para detectar el reordenamiento de tumores humanos con anomalas del
cariotipo, as como de anomalas de la expresin gentica en ausencia de alteraciones
del cariotipo.
Una de las aplicaciones ms tiles de la PCR en la oncologa peditrica es en la
deteccin de traslocaciones cromosmicas.
En el campo de la microbiologa e infectologa, se ha utilizado esta tcnica para
identificar el DNA de parsitos, virus o bacterias, incluyendo tambin la deteccin de la
resistencia a los antibiticos. De la misma forma puede detectar rpida y exactamente la
presencia de agentes infecciosos de lento crecimiento como Chlamydia trachomatis,
Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, virus de la inmunodeficiencia humana,
Mycobacterium tuberculosis, Micoplasmas, herpesvirus, citomegalovirus, virus de la
Hepatitis C.
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Por lo que se puede emplear en: diagnstico rpido de infecciones vricas, deteccin de
microorganismos en clulas infectadas o transformadas, determinacin de la relacin
gentica entre varios tipos de microorganismos similares, para correlacionar la
presencia de agentes virales o infecciosos en tejidos neoplsicos. La tcnica de PCR
tiene el potencial de realizar una rpida deteccin del DNA bacteriano en muestras de
sangre, y evita los contratiempos encontrados con los cultivos sanguneos en el
diagnstico de bacteriemia.
Entre las aplicaciones mdicas de la PCR, cabe destacar su aporte al desarrollo de
nuevas estrategias de diagnstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus
de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana
(HIV).
Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en
recin nacidos de madres ceropositivas, pues la existencia de anticuerpos maternos
impide obtener resultados confiables, con los mtodos convencionales, durante el
primer ao de vida.
Tambin ha facilitado el diagnstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B,
la distrofia muscular y la fibrosis qustica, e hizo posible reconocer mutaciones de genes
vinculadas con enfermedades oncolgicas.
En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnostico:

Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro


infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo
producto de PCR posea unas caractersticas de tamao o temperatura de fusin
que permitan identificarlo de forma inequvoca. En el caso de infecciones virales
que implican la integracin del genoma del patgeno en el ADN del hospedador,
como es el de la infeccin por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la
determinacin de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la
enfermedad.

La PCR tambin se puede usar en revisiones mdicas rutinarias, como en los


servicios de donantes de sangre. A travs de esta tcnica se pueden detectar
infecciones peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras an
estn en el periodo de incubacin. Dada la sensibilidad de los test de PCR se
pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas

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individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir


de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el causante.

El diagnstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un


proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la
PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus
correspondientes primers y posteriormente secuenciar para detectar la existencia
de mutaciones.

4. VENTAJAS Y LIMITACIONES:
4.1. Ventajas:

Producir grandes cantidades de segmentos de un gen, a partir de una muestra


mnima de ADN

En un espacio corto de tiempo genera un elevado nmero de copias de ADN.

Rapidez

Especificidad

NO requiere uso de radioistopos (riesgosos y costosos)

Practicable con tejidos procedentes de vestigios arqueolgicos.

4.2. Limitaciones:

Contaminacin en la PCR La Reaccin en Cadena de la Polimerasa es una


tcnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones,
ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad
muy pequea) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Vemos
que una de sus mayores ventajas de la tcnica, se convierte a la vez en el
principal inconveniente.

1. CARACTERSTICAS

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Tcnica que permite la identificacin de secuencias especficas de DNA,


mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridacin utilizando sondas
especificas.

Esta tcnica fue desarrollado por E. M. Southern para la deteccin de


genes especficos en el ADN celular.

Para analizar una muestra de DNA cromosomal sta debe ser


previamente fragmentada, por ejemplo utilizando

sonicacin enzimas de

restriccin.

Utiliza la hibridacin de cidos nucleicos para la deteccin de las


molculas buscadas.

Permite detectar qu genes son transcriptos en determinadas condiciones.

El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material gentico; en


cambio el Northern Blot, la expresin de diferentes genes.

2. TCNICAS

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El Southern Blot es una tcnica que permite la identificacin de secuencias


especficas de DNA como anterior fue mencionado.
Inicialmente la muestra de ADN es segmentada por una sonicacin o una
enzima de restriccin, son separados de mayor a menor tamao mediante una
electroforesis de gel de agarosa empleando corriente elctrica. Una vez
terminada la electroforesis y sin teir el gel los fragmentos de DNA se
traspasan a un filtro de nitro celulosa o a una membrana de nylon.

Luego, el filtro se incuba con una sonda marcada, especficamente para la


secuencia que deseas identificar (el traspaso de las muestras desde el gel al filtro

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es una etapa esencial, porque el reconocimiento de bases complementarias entre


sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente).
Esta sonda es una secuencia de cido nucleico, DNAds RNAm, que
reconocer a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a travs del
reconocimiento

de

secuencias

complementarias

de

cidos

nucleicos

(hibridizacin). La sonda se marca con un istopo radioactivo o con un


fluorocromo.
La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el
filtro de una forma sencilla mediante una exposicin a una pelcula de rayos X
para el caso de sondas radiactivas o con una pelcula sensible a la luz, para el
caso de sondas con fluorocromo.

3. APLICACIONES BSICAS
Las aplicaciones son:
Se utiliza para caracterizar ADN clonado.

til en patologa forense para identificar criminales, violadores, etc. La


identificacin con ADN o "huella gentica" se basa en el estudio de una
serie de fragmentos de ADN presentes en todos los individuos pero que
poseen la caracterstica de ser altamente variables o polimrficos entre
los

mismos.

El anlisis de un determinado nmero de estas secuencias o fragmentos


de ADN permite identificar a un individuo con una probabilidad muy
cercana al 100%.
Es aplicable para distinguir muestras de biopsias ante confusiones.

Para la identificacin de fragmentos de ADN que contienen un gen


determinado de entre una mezcla de muchos fragmentos.
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Reordenamiento gentico en procesos linfoproliferativos. Se puede


determinar clonalidad a partir del gen de las cadenas pesadas de
inmunoglobulinas en linfomas B o de receptores de los antgenos en los
linfomas T.
Aplicable para el estudio de alteraciones oncognicas.
Tratado de alteraciones genticas hereditarias.
Para la construccin de patrones de ADN identificativos de cada
individuo como autnticas tarjetas de identificacin como el DNI.

4. VENTAJAS Y LIMITACIONES

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VENTAJAS

LIMITACIONES

Alta sensibilidad.

se encuentra limitado principalmente por


la representacin del material gentico

Alta especificidad.

perteneciente al organismo patgeno en


la

Rapidez en el diagnstico

Debido a la alta sensibilidad de estas


tcnicas, el mayor riesgo es el de
contaminacin de las muestras lo cual
disminuye la especificidad.

muestra

ser

estudiada

la

sensibilidad del mismo a ser degradado.

El conocer parcial o totalmente el


genoma del organismo en cuestin, para
poder desarrollar sondas moleculares
especficas a un organismo tenemos
que haber clonado y secuenciado o
parcialmente caracterizado el material
gentico que permita identificar regiones
especficas a cada organismo y a cada
especie.

Con

frecuencia

se

usan

secuencias repetitivas en el ADN (i.e.


ARN ribosomal) que generan patrones
distintivos de hibridacin similares al
polimorfismo observado en eucariotas.

1. CARACTERSTICAS:
Northern blot o anlisis Northern (en alusin al nombre del cientfico inventor de esta
tcnica), es bsicamente una prueba para detectar las secuencias de ARNm que son
complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.

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Detecta la presencia del ARN mensajero en un tejido en particular y

permite

determinar as el tamao de la trascripcin de ese ARN mensajero.


La presencia de un ARN en particular se detecta hibridizando esta membrana con una
sonda de cido nucleico, generalmente de cADN o ARNr del gen de inters.

2. TCNICA O FUNDAMENTO
EL Northen Blot es un tcnica de deteccin de genes, para lograr este resultado se
siembra las muestras en un gel, realizamos una corrida electrofortica hasta lograr que
las molculas se separen por tamaos de manera tal que se puedan distinguir las
buscadas. Transferimos todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde
un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa y por medio de la hibridacin de la
membrana, detectamos la presencia del ARN

particular con una sonda de cido

nucleico que generalmente de ADN o ARN del gen que nos interesa.
Procederos a detallar cada etapa antes mencionada con mayor precisin:
EXTRACCIN DEL RNA
Las clulas o los tejidos se homogenizan en una solucin que contenga inhibidores
de las ARNasas(ribonucleasas), ya que estos van a impedir la degradacin del ARN
durante su aislamiento y almacenamiento.
Se aprovecha la circunstancia de que la mayor parte de los RNA mensajeros tienen
una cola de poli-A. El RNA celular total se pasa por una columna que contiene polidT unido a una fase slida. El RNA mensajero se une al poli-dT y queda retenido en
la fase slida, eludiendo el resto de RNA y posteriormente se elude el RNA
mensajero.
Despus de la separacin del ARN del ADN geonmico, el RNA purificado se
precipita con etanol durante el paso final de todos los procedimientos.
Debemos tener en cuenta para la realizacin satisfactoria de nuestro trabajo que las
soluciones acuosas de RNA deben almacenarse congeladas y que se asegure la
desnaturalizacin y por ende la obtencin de nuestro ARN intacto.
ELECTROFORESIS DEL RNA

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Recordemos que la electroforesis es una tcnica analtica de separacin que se


fundamenta en la

cintica, basada en el movimiento o migracin de las

macromolculas disueltas en un determinado medio (solucin tampn de


electroforesis), a travs de una matriz o soporte reticulado como resultado de la
accin de un campo elctrico.
La electroforesis en gel es muy utilizada en la deteccin, control de pureza,
caracterizacin, cuantificacin (por comparacin con controles) as como
preparacin y purificacin (por extraccin de bandas desde el gel) que son los
parmetros en los que se basa la utilidad del northen blot para de molculas y
fragmentos de RNA.
Explicaremos la mecnica del procedimiento: Una corriente elctrica se pasa a
travs del gel y el RNA se mueve lejos del electrodo negativo; la distancia movida
depende del tamao del fragmento del RNA ya que los genes son de diversos
tamaos, el tamao de los RNAm vara, de esta manera podemos separar a los
RNAm por sus tamaos.
TRANSFERENCIA A MEMBRANA
Las molculas de DNA o RNA separadas en los geles de agarosa pueden ser
transferidas a membranas de nitrocelulosa o de nylon.
La transferencia se realiza tras la desnaturalizacin del DNA o RNA, la unin a la
membrana ocurre a travs del esqueleto azcar-fosfato de la molcula de DNA o
RNA, quedando libres y expuestas las bases nitrogenadas.
Esto permite localizar e identificar secuencias especficas en los fragmentos
transferidos, incubando la membrana con sondas especficas radiactivas o de otra
naturaleza, que hibridan con la secuencia complementaria, revelando su posicin por
autorradiografa de la membrana.
De esta manera puede identificarse un fragmento especfico de DNA o RNA entre
toda la poblacin de estructuras separadas por electroforesis y transferidas a la
membrana.
La sensibilidad del mtodo es muy elevada por ejemplo, una secuencia nica de
1.000pb presente en el genoma humano (1 parte en 3 millones) puede ser detectada
por este mtodo a partir de 10g de DNA geonmico. Las membranas de
nitrocelulosa dan mejor resolucin que las de nylon, pero stas ltimas presentan
varias ventajas por lo que su uso es ms extendido: tienen una mejor consistencia
(las de nitrocelulosa son bastante frgiles y pueden desmenuzarse con la
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manipulacin) y poseen mayor capacidad de unin de DNA, pudiendo ser utilizadas


para hibridaciones sucesivas; adems, producen poca fluorescencia de fondo
(fluorescencia inespecfica) al ser iluminadas con radiacin UV, lo que es muy til
para la deteccin de bandas de DNA.
La desnaturalizacin de los fragmentos de DNA, previa a la transferencia, se realiza
introduciendo el gel en una disolucin de NaOH que se neutraliza posteriormente,
las cadenas de DNA desnaturalizadas no deben ser muy largas para que la
transferencia sea efectiva.
La transferencia puede

realizarse

por

capilaridad,

por

electroforesis

(electrotransferencia), por centrifugacin o por succin (mediante una bomba de


vaco), aunque los dos ltimos sistemas necesitan dispositivos especficos, por lo
que su uso es ms restringido.
la electrotransferencia se utiliza cuando la separacin del DNA se ha realizado en
geles de poliacrilamida (dado que el reticulado es ms denso que el de la agarosa);
el tiempo de transferencia depende del grosor del gel, del porcentaje de agarosa y
del tamao de los fragmentos de DNA.
Una vez en la membrana, el DNA se fija a ella mediante calentamiento a 80C o
iluminacin con radiacin UV al igual que en el Western Blot, las regiones de la
membrana no ocupadas por el DNA transferido deben bloquearse, para evitar que al
aadir la sonda, sta es una inespecficamente a la membrana y produzca un fondo
en el revelado; para realizar este bloqueo, la membrana se sumerge en una
disolucin que contenga substancias de elevado peso molecular, como ficoll
(400kDa), polivinilpirrolidona (360kDa) o seroalbmina bovina (66kDa), adems de
DNA heterogneo de diversos orgenes (bacteriano, timo de ternera, esperma de
salmn, etc.).
La formacin de las estructuras hbridas (heterodplex) entre la sonda y la secuencia
complementaria buscada es muy dependiente de las condiciones experimentales
(particularmente de la temperatura); para realizarla se utilizan dos sistemas: en el
primero, la membrana se introduce en una bolsa de plstico hermtica que contiene
la disolucin con la sonda, controlndose la temperatura por inmersin en un bao
termostatizado; el segundo, utiliza hornos de hibridacin, introduciendo las
membranas en botellas que contienen la disolucin de la sonda.

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GENERACIN DE UNA SONDA MARCADA


Tradicionalmente, las sondas moleculares se han preparado con nucletidotrifosfatos (ATP, dATP, CTP, dCTP, GTP, dGTP, UTP o dTTP) radiactivos, que
contienen fsforo-32 (P) en la posicin alfa, estos marcadores estn incorporados
en las bases del ADN.
En ciertas aplicaciones se nota el uso de istopos de energa intermedia o baja, se
usan nuclotidos que contienen azufre-35 (35S) o tritio (3H), respectivamente. Las
sondas marcadas con istopos se visualizan mediante autorradiografa, donde la
energa radiactiva impresiona una pelcula de rayos X, en general si las condiciones
del laboratorio lo permiten y contando con personal entrenado para el uso de
istopos radiactivos; el marcado de sondas por mtodos radiactivos no conlleva
mayores riesgos y proporciona una alta sensibilidad a los ensayos.
HIBRIDACIN
Dentro de este proceso se pueden distinguir tres etapas bien marcadas:

Pre-hibridacin o bloqueo

La membrana une cidos nucleicos. La sonda marcada puede unirse de


forma inespecfica y aumentar el ruido.

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La membrana es incubada con una solucin de pre-hibridacin a la


temperatura de hibridacin.
La solucin de pre-hibridacin contiene compuestos que se unen
inespecficamente a la membrana previniendo la unin de la sonda a la
membrana, excepto a su hebra complementaria.

Hibridacin
La sonda marcada se aparea en solucin con su hebra complementaria,
inmovilizada en la membrana.
Condiciones:
Estas deben ser determinadas empricamente.
Los factores que afectan la hibridacin de cidos nucleicos.
La solucin de hibridacin presente en su infraestructura: 5x SSC,
3M NaCl, 0,3M Citrato de Na), 50% Formamida , 1% SDS, 5%
Denhardt
DNA heterlogo (ssDNA espermio de salmn).
La Temperatura debe ser optima para valga la redundancia
optimizar la velocidad de la hibridacin en presencia de
formamida: 15-20 C bajo el Tm

Lavados

Para remover la sonda que est unida en exceso de manera inespecfica pero
poco complementaria, esto se logra incubando la membrana en una solucin
que carece de sonda marcada y utilizando condiciones que minimizan la
hibridacin inespecfica, estrictez, una medida de la probabilidad de separar
dos hebras de cidos nucleicos.
VISUALIZACIN
El RNA puede ser visualizado capturando la radiacin ionizante por una emulsin
fotogrfica. La membrana es expuesta a un film por tiempos variables , el film es
revelado y analizado.

3. APLICACIONES BSICAS
Esta tcnica se ha aplicado en estudios de la modulacin de la sntesis de interleucina 6
en pacientes con artritis reumatoide

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En el anlisis de expresin de receptores que participan en la sntesis de molculas en


cultivos celulares
En anlisis de mutaciones y alteraciones del RNAm de enzimas
En la regulacin de la expresin gnica de marcadores moleculares de clulas
leucmicas humanas y molculas del reconocimiento inmunolgico.
Por citar un caso: para analizar los RNA que codifican la albmina con una fibra de
DNA.
Primero las diferentes molculas de RNA intacto, de los hgados mutantes y de los
normales se separan en bandas por electroforesis en gel. Entonces, para que las
molculas de RNA sean accesibles a las ondas de DNA se hace una replica del patrn de
bandas de RNA del gel con la transferencia de las molculas fraccionadas de RNA a
una hoja de nitrocelulosa o de papel de nailon. El papel se incuba con una solucin que
contiene una sonda de DNA marcado cuya secuencia corresponde en parte a la cadena
molde que produce el RNAm de la albmina.
Las molculas de RNA que se hibridan en el papel con la sonda de DNA marcada (por
ser complementarias aparte de la secuencia normal del gen de la albmina) se colocan
detectando la sonda unida mediante autoradiografa o mtodos qumicos. El tamao de
las molculas de RNA de cada una de las bandas que se unen a las sonda se puede
determinar usando como referencia la migracin de molculas de RNA de tamao
conocido (patrones de RNA) que se someten a electroforesis junto con la muestra. As
se puede descubrir que las clulas hepticas del ratn afectado fabrican albmina de
tamao normal y en cantidades normales; alternativamente podra ocurrir que el RNA
de la albmina se detectara en cantidades muy reducidas.
El RNA de la albmina mutante tambin podra ser anormalmente corto y desplazarse a
travs del gel muy rpidamente. En este caso el gen transferido podra volverse a
estudiar con sondas de DNA masa selectivas que revelasen que zona de RNA esta
ausente.

4. VENTAJAS Y DESVENTAJAS
VENTAJAS

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Es un mtodo estndar que sirve para la deteccin y la cuantificacin de los niveles


del RNAm a pesar del advenimiento de tcnicas de gran alcance, tales como RTPCR, anlisis del arsenal del gen y anlisis de la proteccin del nucleasa.
Proporciona una comparacin relativa directa de la abundancia del mensaje entre las
muestras en una sola membrana (hebra).
Es el mtodo preferido para determinar el tamao de la trascripcin y para detectar
transcripciones alternativamente empalmadas.
DESVENTAJAS
Una de las primeras limitaciones que podemos encontrar en este proceso estriba en
que si las muestras del RNA han sido degradadas leve y uniformemente, la calidad
de los datos y la capacidad de cuantificar la expresin se compromete seriamente.
Por ejemplo, incluso una sola hendidura en el 20% de molculas de la blanco de 4
KB disminuir la seal vuelta por el 20%. As, los reactivos, RNAs libres y las
tcnicas son esenciales. Tambin tenemos que esta tcnica sensible pero sumamente
laboriosa y costosa, no considerndose adecuada para estudios de rutina de una
poblacin grande.

TEMA 1: ENZIMAS DE RESTRICCIN


Enzimas de restriccin
http://www.dialogica.com.ar/medline/2005/09/la_molecula_de_la_vida.html.
http://www.dialogica.com.ar/medline/archives/cat_adn.php)
http://www.uprm.edu/biology/cursos/biologiageneral/EnzimasDNA.htm
http://ejb.ucv.cl/gmunoz/genweb/genetica/frame/textos/4_2enzim_restric.htm

SEMINARIO: TCNICAS MOLECULARES DEL ADN

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http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/tecnologiadel-adn-recombinante/como_cortar_y_pegar_el_adn_tij.php
http://allnatural.iespalomeras.net/manipulacion-adn/tecnicas-ingenieria.html
http://www.quimica.urv.es/~w3siiq/DALUMNES/97/siiq39/Endo.html
ADN Ligasa
http://genemol.org/biomolespa/Enzimas/las-ligasas.html
http://www.electronicafacil.net/ciencia/Article5216.html
http://allnatural.iespalomeras.net/manipulacion-adn/tecnicas-ingenieria.html
Adn Polimerasa
http://www.babylon.com/definition/ADN-polimerasa/Spanish
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/dna%20polimerasa.html
Lubert Stryer. Bioqumica. Editorial Reverte S.A. 1979. Espaa
Transcriptasa
http://danival.org/600%20microbio/7400notasvir/algunos/vir_algunos_retroviru.
html

TEMA 2: PCR (Polymerase Chain Reaction)


Bobadilla N.A. & Gamba G. (1996). Biologa molecular en medicina. V.
Reaccin en cadena de la polimerasa. Rev Invest Clin, 48, 401-6.
http://www.biologia.arizona.edu/human
Mas Eva, Poza Julio; Ciriza Jess 2001, Revista Acuatic No. 15 Fundamento de
la reaccin en cadena de la Polimerasa, Universidad de Zaragoza - Espaa
Prescott Lasing M.,Harley Johon P. 1999, Microbiologa cuarta edicin,
Editorial MacGraw Hill, Madrid Espaa.

TEMA 3: SOUTHERN BLOT

SEMINARIO: TCNICAS MOLECULARES DEL ADN

35

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G:\napo\Cmo estudiar la expresin de diversos genes Southern, Northern


y Western Blot Biologa.htm
G:\napo\Desarrollo terico de temas.htm
http://caibco.ucv.ve/caibco/CAIBCO/Vitae/VitaeDos/Articulos/MedicinaMol
ecular/microbio.htm
http://criminalistic.org/index.php?
option=com_content&task=view&id=55&Itemid=10
http://mail.fq.edu.uy/~microbio/ABMM/HerraMBas1.ppt#609,16,Las
sondas son fragmentos conocidos marcados

TEMA 4: NORTHERN BLOT


Http: //www.genome.gov.
John Crocher, David Burnett, 2005, La Ciencia del Diagnostico del
Laboratorio 2 edicin, Editorial Mc Grau-Hill, Barcelona Espaa.
Ivan Roitt, Jonathan Brostoff, 1997, Inmunologa 4 edicin, Editorial
Harcourt Brace, Madrid Espaa.
Michael T. Madigan, John M. Martinko, 2006, Bruck Biologa de los
Microorgarnismos 10 edicin, Editorial Pearson Edicacion, Madrid
Espaa.

SEMINARIO: TCNICAS MOLECULARES DEL ADN

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