ESTRUCTURA DE LOS CIDOS NUCLICOS

Mdelo de la Doble Hlica

Difraccin de Rayos X: ADN-B

J. Watson y F. Crick

Composicin de los cidos nucleicos.

Proporciones de las Bases Nitrogenadas: Reglas de Chargaff (1950).
El Modelo de la Doble Hlice: Watson y Crick (1953).
Alternativas al Modelo de la Doble Hlice.
Propiedades fsico-qumicas de los cidos nucleicos.
Densidad de los cidos Nucleicos.
Desnaturalizacin: Temperatura de Fusin.
Absorbancia a 260 nm.
Cintica de la Renaturalizacin: Curvas Cot.
Hibridacin de los cidos nucleicos.
Secuenciacin del ADN: Mtodo Didesoxi y Mtodo Automtico.

COMPOSICIN QUMICA DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Miescher en 1871 aisl del ncleo de las

clulas de pus una sustancia cida rica
en fsforo que llam "nuclena". Un ao

ms tarde, en 1872, aisl de la cabeza de

los espermas del salmn un compuesto
que denomin "protamina" y que result
ser una sustancia cida y otra bsica. El
nombre de cido nucleico procede del de
"nuclena" propuesto por Miescher.

Cuando se realiza la hidrlisis completa de los cidos nucleicos, se obtienen tres tipos de
componentes principales:
Azcar, en concreto una pentosa.
Bases nitrogenadas: pricas y pirimidnicas.
cido fosfrico.
El azcar, en el caso de los cidos desoxirribonucleicos (ADN) es la 2-desoxi-D-ribosa y en el
caso de los cidos ribonucleicos (ARN) es la D-ribosa.

Pentosas

cido fosfrico

Las bases nitrogenadas que forman parte de los cidos nucleicos son de dos tipos, pricas y
pirimidnicas. Las bases pricas derivadas de la purina (fusin de un anillo pirimidnico y uno de
imidazol) son la Adenina (6-aminopurina) y la Guanina (2-amino-6-hidroxipurina). Las bases
pirimidnicas (derivadas de la pirimidina) son la Timina (2,6-dihidroxi-5-metilpirimidina o tambin
llamada 5-metiluracilo), Citosina (2-hidroxi-6-aminopirimidina) y Uracilo (2,6-dihidroxipirimidina).
Las bases nitrogenadas que forman normalmente parte del ADN son: Adenina (A), Guanina (G),
Citosina y Timina (T). Las bases nitrogenadas que forman parte de el ARN son: Adenina (A),
Guanina (G), Citosina (C) y Uracilo (U). Por tanto, la Timina es especfica del ADN y el Uracilo es
especfico del ARN.

Bases Pricas

Bases Pirimidnicas

Adems de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado otras bases
nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de ARNs. Ejemplos
de algunas de estas bases pricas poco corrientes son: Hipoxantina, Xantina, 2-metiladenina, 6metil-aminopurina. Entre las bases pirimidnicas podramos citar la 5-metilcitosina (propia del
ADN) y la 5-hidroximetil citosina (HMC) que sustituye a la citosina en los fagos T-pares.
En los ARN transferentes (ARN-t) que intervienen en el proceso de traduccin de protenas se
encuentran la Ribotimidina, Dihidrouridina, Seudouridina e Inosina (I).
La unin de la base nitrogenada a la pentosa recibe el nombre de nuclesido y se realiza a travs
del carbono 1 de la pentosa y los nitrgenos de las posiciones 3 (pirimidinas) o 9 (purinas) de las
bases nitrogenadas mediante un enlace de tipo N-glucosdico. La unin del nuclesido con el
cido fosfrico se realiza a travs de un enlace de tipo ster entre el grupo OH del carbono 5 de
la pentosa y el cido fosfrico, originando un nucletido. Los nucletidos son las unidades o
monmeros utilizados para construir largas cadenas de polinucletidos.
Nuclesido = Pentosa + Base nitrogenada.
Nucletido = Pentosa + Base nitrogenada + cido fosfrico.
Polinucleotido = Nucletido + Nucletido + Nucletido + ....

Nucletido
Tanto los nucletidos como los nuclesidos pueden contener como azcar la D-ribosa

(ribonucletidos y ribonuclesidos) o la pentosa 2-desoxi-D-ribosa (desoxirribonucletidos y

desoxirribonuclesidos).
Adems, los nucletidos pueden tener 1, 2 3 grupos fosfato unidos al carbono 5 de la pentosa,
existiendo por tanto, nucletidos 5 monofosfato, nucletidos 5 difosfato y nucletidos 5 trifosfato.
En algunos casos el cido fosfrico se une a la pentosa por el carbono 3, existiendo nucletidos
3 monofosfato, difosfato o trifosfato segn el nmero de grupos fosfato que posea.
La terminologa empleada para referirse a los nuclesidos y nucletidos es la siguiente:
Base Nitrogenada

Nuclesido

Nucletido

Adenina

Adenosina

cido Adenlico

Guanina

Guanidina

cido Guanlico

Citosina

Citidina

cido Citidlico

Timina

Timidina

cido Timidlico

Uracilo

Uridina

cido Uridlico

Los nucletidos se unen entre si para formar largas cadenas de polinucletidos, esta unin entre
monmeros nucletidos se realiza mediante enlaces fosfodister entre los carbonos de las
posiciones 3 de un nucletido con la 5 del siguiente.

Polinucletido

PROPORCIONES DE LAS BASES NITROGENADAS: REGLAS DE CHARGAFF

Al principio se pensaba que los cidos nucleicos eran la repeticin montona de un
tetranucletido, de forma que no tenan variabilidad suficiente para ser la molcula biolgica que
almacenara la informacin. Sin embargo, Chargaff (1950) demostr que las proporciones de las
bases nitrogenadas eran diferentes en los distintos organismos, aunque seguan algunas reglas.
Estas reglas de Chargaff se cumplen en los organismos cuyo material hereditario es ADN de
doble hlice y son las siguientes:
REGLAS DE CHARGAFF PARA ADN DE DOBLE HLICE
La proporcin de Adenina (A) es igual a la de
Timina (T). A = T . La relacin entre Adenina y
Timina es igual a la unidad (A/T = 1).
La proporcin de Guanina (G) es igual a la de
Citosina (C). G= C. La relacin entre Guanina y
Citosina es igual a la unidad ( G/C=1).
La proporcin de bases pricas (A+G) es igual
a la de las bases pirimidnicas (T+C). (A+G) =
(T + C). La relacin entre (A+G) y (T+C) es
igual a la unidad (A+G)/(T+C)=1.

Edwin Chargaff

Sin embargo, la proporcin entre (A+T) y (G+C)

era caracterstica de cada organismo, pudiendo
tomar por tanto, diferentes valores segn la
especie estudiada. Este resultado indicaba que
los cidos nucleicos no eran la repeticin
montona de un tetranucletido. Exista
variabilidad en la composicin de bases
nitrogenadas.

En la siguiente tabla se observan las proporciones de las bases nitrogenadas en algunos

organismos.
Procedencia del ADN

5-Me-C

Timo de Bovino

28,2

21,5

21,2

27,8

1,3

Esperma de bovino

28,7

22,2

20,7

27,3

1,3

Germen de trigo

27,3

22,7

16,8

27,1

6,0

Saccharomyces

31,3

18,7

17,1

32,9

Escherichia coli

26,0

24,9

25,2

23,9

Mycobacterium tuberculosis

15,1

34,9

35,4

14,6

X174

24,3

24,5

18,2

32,3

T3

23,7

26,2

27,7

23,5

T5

30,3

19,5

19,5

30,8

T7

32,4

18,3

32,4

17,0 HMC

Virus ARN

Mosaico del tabaco (TMV)

29,8

25,4

18,5

26,3

Mosaico amarillo nabo

22,6

17,2

38,0

22,2

Poliomielitis

28,6

24,0

22,0

25,4

Encfalo miocarditis del ratn

27,3

23,5

23,2

25,9

Reovirus Tipo 3

28,0

22,3

22,0

27,9

Tumor de las heridas

31,1

18,6

19,1

31,3

De la observacin de la tabla anterior pueden extraerse las siguientes conclusiones:

Todos los ADN estudiados cumplen la relacin A=T y G=C, excepto el ADN del bacteriofago
X174. El ADN de este virus es de una sola hlice.
En los virus ARN no se cumple la equimolaridad de las bases excepto en el caso del virus
del Tumor de las heridas y de los Reovirus que tienen ARN de doble hlice. En estos virus
se cumple que A=U y G=C, adems se cumple que A+G/U+C=1.
El fago T2 y los otros fagos T-pares (T4 y T6) en vez de citosina tienen hidroximetil-citosina
(HMC).
Algunos organismos tiene en su ADN una pequea proporcin de 5-metil-citosina (5-Me-C)
que sustituye a la citosina.
Igualmente, en la siguiente tabla puede observarse como la proporcin A+T/G+C varia de un
organismo a otro.
Organismo

Tejido

A+T/G+C

Escherichia coli

1,00

Diplococcus pneumoniae

1,59

Mycobacterium tuberculosis

0,42

Levadura

1,79

Paracentrolus lividus (erizo mar)

Esperma

1,85

Arenque

Esperma

1,23

Mdula sea

1,33

Hombre

Timo

1,52

Hombre

Hgado

1,53

Hombre

Esperma

1,52

Rata

Por tanto, la proporcin A+T/G+C es especfica de cada organismo y como veremos ms

adelante cuando hablemos de las propiedades fsico- qumicas de los cidos nucleicos, dicha
proporcin est relacionada con la densidad y la temperatura de fusin.

EL MODELO DE LA DOBLE HLICE: WATSON Y CRICK (1953)

Una vez demostrado que los cidos nucleicos eran los portadores de la informacin gentica, se
realizaron muchos esfuerzos encaminados a determinar su estructura con exactitud. Watson y

Crick (1953) fueron los primeros investigadores en proponer una estructura para los cidos
nucleicos y su labor investigadora se vio recompensada con el Premio Nobel en 1962, Premio
Nobel que compartieron con M. H. F. Wilkins y que se les concedi por sus descubrimientos en
relacin con la estructura molecular de los cidos nuclecos y su significacin para la transmisin
de la informacin en la materia viva.. Para realizar su trabajo emplearon dos tipos de datos ya
existentes.

Francis H. C. Circk

James D. Watson

Maurice H. F. Wilkins

Por un lado, utilizaron los datos obtenidos varios aos antes por Chargaff (1950), relativos a
la composicin de bases nitrogenadas en el ADN de diferentes organismos.
El otro tipo de datos eran los procedentes de estudios de difraccin de rayos X sobre fibras
de ADN. Para determinar la estructura tridimensional o disposicin espacial de las
molculas de ADN, se hace incidir un haz de rayos X sobre fibras de ADN y se recoge la
difraccin de los rayos sobre una pelcula fotogrfica. La pelcula se impresiona en aquellos
puntos donde inciden los rayos X, produciendo al revelarse manchas. El ngulo de
difraccin presentado por cada una de las manchas en la pelcula suministra informacin
sobre la posicin en la molcula de ADN de cada tomo o grupo de tomos.
Mediante esta tcnica de difraccin de rayos X se obtuvieron los siguientes resultados:
Las bases pricas y pirimidnicas se encuentran unas sobre otras, apiladas a lo largo del eje
del polinucletido a una distancia de 3,4 . Las bases son estructuras planas orientadas de
forma perpendicular al eje (Astbury, 1947).
El dimetro del polinucletido es de 20 y est enrollado helicoidalmente alrededor de su
eje. Cada 34 se produce una vuelta completa de la hlice.
Existe ms de una cadena polinucleotdica enrollada helicoidalmente (Wilkins et el. 1953,
Frankling y Gosling, 1953).

Difraccin de Rayos X: ADN-B

Rosalin Franklin

Basndose en estos dos tipos de datos Watson y Crick propusieron su Modelo de estructura para
el ADN conocido con el nombre de Modelo de la Doble Hlice. Las caractersticas del Modelo de
la Doble Hlice son las siguientes:
El ADN es una doble hlice enrollada helicoidalmente a derechas (sentido dextrorso). Algo
parecido a dos muelles entrelazados.
Enrollamiento de tipo plectonmico: para separar las dos hlices es necesario girarlas como
si fuera un sacacorchos.

Mdelo de la Doble hlice: ADN-B

J. Watson y F. Crick

Cada hlice es una serie de nucletidos unidos por enlaces fosfodister en los que un grupo
fosfato forma un puente entre grupos OH de dos azcares sucesivos (posiciones 3 de un
azcar y 5 del siguiente).
Las dos hlices se mantienen unidas mediante puentes o enlaces de hidrogeno producidos
entre las bases nitrogenadas de cada hlice. Siguiendo los datos de Chargaff (1959), la
Adenina de una hlice aparea con la Timina de la hlice complementaria mediante dos
puentes de hidrgeno. Igualmente, la Guanina de una hlice aparea con la Citosina de la
complementaria mediante tres puentes de hidrgeno.

Par A-T

Par G-C

Pares A-T y G-C

Las dos hlices por razones de complementaridad de las bases nitrogenadas son
antiparalelas, teniendo secuencias de tomos inversas. Una hlice lleva la secuencia 5P
3 OH , mientras que la hlice complementaria sigue la secuencia de tomos 3OH 5P.
El dimetro de la doble hlice es de 20 .
Las bases nitrogenadas son estructuras planas perpendiculares al eje de la doble hlice y
estn apiladas unas sobre otras a una distancia de 3,4 . Cada 10 bases, cada 34 se

produce una vuelta completa de la doble hlice (360).

Las bases se encuentran en sus configuraciones cetnicas, cumpliendo as las reglas de
apareamiento A-T y G-C.
La secuencia de bases nitrogenadas puede ser cualquiera, no existe ninguna restriccin.
Adems, la estructura en doble hlice propuesta por Watson y Crick (1953) sugera varas
propiedades importantes del material hereditario:
Las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas A-T y G-C sugieren un forma
sencilla de replicacin del material hereditario. Esta forma sencilla de replicacin se
denomina mtodo Semiconservativo. Cuando el ADN se replica sus dos hlices se separan
y cada una de ellas sirve de molde para sintetizar una nueva hlice siguiendo las reglas de
apareamiento de las bases nitrogenadas.
La mutacin a nivel molecular consistira en un cambio en la secuencia de bases
nitrogenadas del ADN.
Al no existir ninguna restriccin en la secuencia de bases nitrogenadas, el ADN posea la
suficiente variabilidad como para ser el material hereditario.
Adems, esta estructura sugera la existencia de algn cdigo que permitiera pasar de la
secuencia lineal de bases nitrogenadas en el ADN a la secuencia lineal de aminocidos en
las protenas.

ALTERNATIVAS AL MODELO DE LA DOBLE HLICE

El modelo de la Doble Hlice propuesto por Watson y Crick est basado en estudios del ADN en
disolucin (hidratado). La denominada forma B ADN-B tiene un mayor inters biolgico ya que
es la que presenta el ADN en interaccin con las protenas nucleares. Adems de la forma B,
existen otras estructuras posibles que puede presentar el ADN. Algunas de estas alternativas son
las siguientes:
ADN-B: ADN en disolucin, 92% de humedad relativa, se encuentra en soluciones con baja
fuerza inica se corresponde con el modelo de la Doble Hlice.
ADN-A: ADN con 75% de humedad, requiere Na, K o Cs como contraiones, presenta 11
pares de bases por giro completo y 23 de dimetro. Es interesante por presentar una
estructura parecida a la de los hbridos ADN-ARN y a las regiones de autoapareamiento
ARN-ARN.
ADN-C: ADN con 66% de humedad, se obtiene en presencia de iones Li, muestra 9+1/3
pares de bases por giro completo y 19 de dimetro.
ADN-Z: doble hlice sinistrorsa (enrollamiento a izquierdas), 12 pares de bases por giro
completo, 18 de dimetro, se observa en segmentos de ADN con secuencia alternante de
bases pricas y pirimidnicas (GCGCGC), debido a la conformacin alternante de los
residuos azcar-fosfato sigue un curso en zig-zag. Requiere una concentracin de cationes
superior a la del ADN-B, y teniendo en cuenta que las protenas que interaccionan con el
ADN tienen gran cantidad de residuos bsicos sera posible que algunas convirtieran
segmentos de ADN-B en ADN-Z. Las posiciones N7 y C8 de la Guanina son ms
accesibles.

ADN-A

ADN-B

ADN-Z

ADN-A

ADN-Z

ADN-B

ADN con enrollamiento paranmico: Las dos hlices se pueden separar por traslacin,
cada hlice tiene segmentos alternantes dextrorsos y sinistrorsos de unas cinco bases. Uno
de los principales problemas del modelo de la doble hlice (ADN-B) es el enrollamiento
plectonmico, para separar las dos hlices es necesario girarlas como un sacacorchos,
siendo necesario un gran aporte energtico.
ADN triple hlice o ADN-H: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hlice intercalando
oligonucletidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el
surco mayor de una doble hlice. Este oligonucletido se une a pares de bases A-T y G-C
mediante enlaces de hidrgeno tipo Hoogsteen que se establecen entre la T o la C del
oligonucletido y los pares A-T y G-C de la doble hlice. No se sabe la funcin biolgica del
ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucariticos.

Triple hlice: pirimidinas

Triple hlice: purinas

Triple Hlice

ADN cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de Guanina (ADN cuadruplexo)
unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucletidos que solamente
contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucariticos (telmeros) tienen
una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que
se repite muchas veces en tandem una secuencia rica en Guaninas. Se piensa que el ADN
cuadruplexo telomrico servira para proteger los extremos cromosmicos de la
degradacin enzimtica. Ejemplo de secuencia telomrica rica en guaninas (G): 5P
TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH

Cuartetos de Guanina
Adems, de las alternativas anteriormente citadas es necesario tener en cuenta que no todos los
organismos vivos tienen como material hereditario ADN de doble hlice, algunos virus tienen
ADN de hlice sencilla, ARN de una y de doble hlice.
Palndromos: plegamiento o apareamiento de una hlice consigo misma. El palndromo
tambin es una figura gramatical que se lee igual en los dos sentidos, por ejemplo: DABALE
ARROZ A LA ZORRA EL ABAD. Existe ADN palindrmico de hlice sencilla y de hlice
doble. En el palndromo de doble cadena la secuencia de bases se lee igual en direccin 5
P 3OH en ambas cadenas.

Secuencias palindrmicas

Palndromos en ADN de una y doble hlice

Existen algunos virus cuyos cidos nucleicos son de una sola hlice: el ADN de los
fagos X174 y M13 es circular de hlice sencilla, sin embargo, se ha comprobado que una
pequea parte resiste la accin de enzimas que digieren especficamente ADN de hlice
sencilla. Por tanto, estas regiones resistentes de ADN presentan complementaridad interna
o autoapareamiento, formando ADN duplex o doble hlice, teniendo secuencias
palndrmicas. Una situacin semejante se ha observado en el ARN de hlice sencilla del
bacteriofago MS2 (3569 ribonucleotidos y tres genes). En este caso, el gen de la protena
de la cubierta del virus presenta segmentos que tienen complementaridad interna
(autoapareamiento) que se pliegan sobre si mismos formando horquillas (regiones de ARN
de doble hlice).

ARN Fago MS2: protena de la cpside

El ARN transferente (ARN-t) que transporta los aminocidos y el ARN ribosmico (ARNr) que intervienen en el proceso de traduccin, son cidos ribonucleicos de una sola hlice y
tambin presentan autoapareamiento.

Esquema ARN-transferente

Esquema ARN-ribosmico de Tetrahymena

PROPIEDADES FSICO-QUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Las principales propiedades fsico-qumicas de los cidos nucleicos que vamos a considerar son
las siguientes:
Densidad de los cidos nucleicos.
Desnaturalizacin de los cidos nucleicos: Temperatura de fusin (Tm).
Absorbancia a 260 nm.
Cintica de Renaturalizacin: Curvas Cot.
Hibridacin de los cidos nucleicos.

DENSIDAD DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Densidad: existe una relacin lineal entre el contenido en G+C y la densidad del ADN
determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C mayor densidad posee el
ADN.

Cuanto mayor es el contenido en

(G+C) mayor es la densidad.

Meselson y col. (1957) desarrollaron una tcnica de centrifugacin en gradiente de densidad.

Cuando se centrifuga a alta velocidad un solucin densa (saturada) de un soluto de bajo peso
molecular (ClCs 7,7 M, sucrosa, etc.) se produce un equilibrio entre dos fuerzas opuestas, la de
difusin del soluto y la fuerza de sedimentacin, como consecuencia se produce un gradiente de
densidad que aumenta en la direccin de la fuerza centrifuga (aumenta a medida que avanzamos
hacia el fondo del tubo de centrifuga). Si aadimos al centrifugar una molcula de ADN, est
migrar hacia el fondo del tubo hasta llegar al punto en que la densidad del soluto de bajo peso
molecular (la densidad del ClCs) coincide con la densidad del ADN centrifugado (densidad de
flotacin). Posteriormente, es posible aislar las molculas de ADN de diferente densidad
practicando un orificio en el fondo del tubo y sacando varias fracciones diferentes. Tambin es
posible pinchar el tubo con una jeringa, justo en la posicin de la banda y extraer el ADN
contenido de esa zona del tubo.

Centrifugacin en gradiente de CsCl

Basndose en mltiples estudios de la densidad de los ADNs de diferentes organismos y de su
composicin en bases nitrogenadas, se ha establecido una frmula emprica que relaciona la
densidad de flotacin () con el contenido en G+C expresado en moles por ciento. Est frmula
es la siguiente: = 1,660 + 0,00098(G+C).

DESNATURALIZACIN: TEMPERATURA DE FUSIN

Desnaturalizacin: la proporcin A+T/C+G est relacionada en primer lugar con la estabilidad de
la molcula de ADN de doble hlice. Cuanto mayor es el contenido en G+C de una molcula,
mayor cantidad de pares G-C presentar, como consecuencia tendr una mayor cantidad de
triples enlaces y, por consiguiente, ser necesario suministrar una mayor cantidad de energa a
esa doble hlice para separar sus dos hebras (desnaturalizacin o fusin del ADN). Cuanto
mayor es el contenido en G+C mayor cantidad de calor que hay que suministrar a un ADN de
doble hlice para desnaturalizarlo. La temperatura de fusin (Tm) necesaria para desnaturalizar
la mitad del ADN de una mezcla (punto medio de la reaccin ADN doble hlice ADN hlice
sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en G+C, a mayor contenido en G+C
mayor temperatura de fusin (Tm).

Relacin entre el contenido en (G+C) y Tm

Curvas de desnaturalizacin de diferentes ADNs

ABSORBANCIA A 260 nm
Absorbancia a 2.600 : El estado fsico de los cidos nucleicos est relacionado con su
capacidad de absorcin de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 . El menor grado de absorcin se
produce en estado de doble hlice, la absorcin aumenta cuando se produce la desnaturalizacin
pasando a estado de hlice sencilla (efecto hipercrmico, aumento de la absorbancia) y, por
ltimo, si degradamos este ADN de hlice sencilla a nivel de nucletidos libres, de nuevo
aumenta la absorbancia.

Esquema efecto hipercrmico

Por tanto, la absorbancia a 2.600 se puede utilizar como una medida del estado fsico de la
molcula de ADN. Las curvas de fusin tienen forma de S observndose un aumento brusco de
la absorbancia al llegar a una temperatura determinada, la temperatura de fusin.

CINTICA DE RENATURALIZACIN: CURVAS CoT

Velocidad de renaturalizacin: la velocidad de renaturalizacin del ADN de un organismo est
relacionada con su complejidad. La complejidad se define como la suma del nmero de
nucleotidos que tiene cada tipo de secuencia sin tener en cuenta el nmero de veces que esta
repetida. El ADN de los virus y las bacterias en su mayora slo tiene secuencias que estn una
sola vez en el genoma (secuencias nicas). Sin embargo, los organismo ms complejos, como
los eucariontes, presentan distintos tipos de secuencias en su genoma. Los eucariontes tienen
secuencias nicas (SU), secuencias de bajo nmero de copias (SBNC, 2-10 copias), secuencias
repetidas (SR, alrededor de 102 copias) y altamente repetidas (SAR, 103 a 106 copias).
Tipo de Secuencia

N de repeticiones

N de nucletidos

A (SU)

5.700

B (SU)

7.530

C (SBNC)

3.720

D (SBNC)

4.350

E (SR)

200

500

F (SAR)

10.000

300

G (SAR)

1.000.000

200

Complejidad

22.300

Si imaginamos un organismo eucarionte con los tipos de secuencias indicados en la tabla

anterior, su complejidad sera la suma del nmero de nucletidos de cada tipo de secuencia
(22.300) sin tener en cuenta el nmero de veces que est repetida cada una de ellas.
No es difcil imaginar que la velocidad de renaturalizacin del ADN (paso de dos hlices sencillas
a una doble hlice) este relacionada con el nmero de veces que esta repetida una determinada
secuencia.
Supongamos que tenemos dos organismos hipotticos distintos, ambos con la misma cantidad de
ADN (1.000.000 de pares de nucletidos). El organismo A posee 1.000 secuencias nicas
diferentes, cada una con una longitud media de 1.000 nucletidos. El organismo B tiene una
secuencia de 100 nucletidos de longitud que est repetida 10.000 veces. Si extraemos el ADN
de estos dos organismos por separado, lo desnaturalizamos y las piezas de ADN desnaturalizado
de cada organismo se ponen en condiciones de renaturalizar (tamao uniforme de los fragmentos
de ADN, entre 250 y 450 pb, temperatura, condiciones inicas, etc), es evidente que el ADN del
organismo B renaturalizar mucho antes, ms rpidamente, que el del organismo A, ya que es
mucho ms probable que la secuencia que est repetida 10.000 veces encuentre otra
complementaria en el medio de reaccin para formar la doble hlice.

Las curvas de renaturalizacin o curvas Cot, de organismos que carecen de secuencias repetidas
como virus y bacterias, tienen forma de S, tienen un slo punto de inflexin o punto medio de la
reaccin. Todas las secuencias son nicas y tienen la misma probabilidad de encontrar a su
complementaria para formar la doble hlice.

Curvas Cot de virus y bacterias

Curvas Cot de un eucarionte

Las curvas Cot de organismos eucariontes con diferentes tipos de secuencias, poseen varios
puntos de inflexin. Cada uno de ellos correspondiente a un tipo de secuencias (nicas,
moderadamente repetidas, y altamente repetidas).
Como en el caso de las curvas de fusin, tambin se utiliza como medida el punto medio de la
reaccin de renaturalizacin, es decir, el Cot o tiempo al que se ha reasociado la mitad del
ADN. El Cot es directamente proporcional a la complejidad del ADN del organismo. Valores de
Cot bajos (10-4 a 10-1) corresponden a secuencias altamente repetidas, valores de Cot
comprendidos entre 10 y 102 corresponden a secuencias moderadamente repetidas y las
secuencias nicas o de bajo nmero de copias dan lugar a valores de Cot altos (mayores de
103) .

HIBRIDACIN DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Las tcnicas de desnaturalizacin y posterior renaturalizacin se utilizan para conseguir la
hibridacin de cidos nucleicos, es decir, una vez separadas las dos hebras del ADN doble
hlice, es posible volver a formar una doble hlice con una hebra de ADN que sea
complementaria (hibridacin de ADN con ADN) o volver a formar una doble hlice con un
segmento de ARN que contenga la secuencia complementaria (hibridacin de ADN con ARN).

Endonucleasas de restriccin
Las tcnicas de hibridacin (desnaturalizacin y posterior renaturalizacin) permiten, por ejemplo,
identificar el gen que ha dado lugar a un determinado ARN-mensajero. Si se asla un mensajero
determinado en una clula, es posible hibridar este ARN con el ADN de la clula previamente
fragmentado mediante el uso de endonucleasas de restriccin.
Las endonucleasas de restriccin de tipo II son enzimas que reconocen secuencias cortas de
ADN (de 4 a 6 pares de bases) de tipo palindrmico y cortan por el interior de la secuencia diana
a la misma altura en las dos hlices de ADN (corte simtrico) o a distinto nivel en cada hlice
(corte asimtrico).

Eco RI

Hae III

Dichas endonucleasas de restriccin fueron descubiertas por Werner Arber, Hamilton O. Smith y
Daniel Nathans en la bacteria E.coli , trabajos por los que recibieron el premio Nobel. Estas
enzimas forman parte del sistema de defensa (sistema de modificacin-restriccin) de las
bacterias frente a la entrada de ADN exgeno en su interior. Existen cientos de endonucleasas
diferentes que reconocen distintas secuencias cortas de tipo palndrmico. En la siguiente tabla
se indican algunas de las endonucleasas ms frecuentes:
Bacteria de la que procede

Secuencia que reconoce (5'

3') y lugar de corte ()

Eco RI

Escherichia coli

5' GAATTC 3' (asimtrico)

Eco RII

Escherichia coli

5' CCTGG 3' (asimtrico)

Hae III

Haemophilus aegyptus

5' GGCC 3' (simtrico)

Hin dII

Haemophilus influenzae

5' GTPiPu AC 3' (simtrico)

Hin dIII

Haemophilus influenzae

5' AAGCTT 3' (asimtrico)

Hpa I

Haemophilus parainfluenzae

5' GTTAAC 3' (simtrico)

Hpa II

Haemophilus parainfluenzae

5' CCGG 3' (asimtrico)

Ava I

Anabaena variabilis

5' CGPuPiCG 3' (simtrico)

Endonucleasa
restriccin

de

La utilizacin de diferentes endonucleasas y la separacin por tamaos de los fragmentos

producidos mediante electroforesis permite construir lo que se denomina Mapas de restriccin.

Cuando el ADN de un organismo eucarionte se fragmenta con una endonucleasa de restriccin,

se producen cientos de miles o incluso hasta millones de fragmentos. Dichos fragmentos se
separan por tamaos mediante electroforesis en geles de agarosa, una vez se parados por
tamaos se transfieren los fragmentos a una membrana de nylon en condiciones
desnaturalizantes y de forma que permanezcan en la misma posicin. Los fragmentos
desnaturalizados y pegados a la membrana se pueden renaturalizar o hibridar utilizando una
segmento de ADN o de ARN (habitualmente denominado sonda) marcado radiactivamente. Dicha
sonda, hibridar solamente con aquellos fragmentos de ADN que contengan la secuencia
complementaria. La tcnica que permite transferir los fragmentos de ADN desnaturalizados a una
membrana de nylon y posteriormente hibridar con una sonda de ADN marcada se denomina
Tcnica Southern (hibridacin ADN-ADN), cuando la hibridacin se realiza con una sonda de
ARN marcada se denomina Northern (hibridacin ADN-ARN).
El empleo combinado de endonucleasas de restriccin y de diferentes sondas de ADN de
secuencia nica marcadas permite obtener Polimorfismos para Longitudes de Fragmentos de
Restriccin (RFLPs), muy utilizados en la construccin de mapas de ligamiento.
Hibridacin "in situ"
Las tcnicas de hibridacin "in situ" permiten localizar un segmento concreto de ADN (por
ejemplo un gen) en una posicin determinada de un cromosoma eucaritico. Es posible obtener
preparaciones citolgicas de cromosomas en metafase mittica o en otras fases del ciclo,
desnaturalizar el ADN de los cromosomas en la propia preparacin citolgica y posteriormente
hibridar con la pieza de ADN deseada marcada. Actualmente, el marcaje suele ser de tipo
fluorescente, denominndose dicha tcnica Hibridacin "in situ" mediante fluorescencia
(abreviadamente FISH). Tambin, es posible marcar todo el ADN de un genomio o juego de
cromosomas completo y realizar una Hibridacin "in situ" Genmica (abreviadamente GISH) que
permite averiguar si los cromosomas de un determinado genomio estn presentes. Otra
aplicacin, consiste en detectar determinados cromosomas o regiones cromosmicas concretas
utilizando sondas o piezas de ADN marcadas mediante fluorescencia y procedentes solamente
del cromosoma deseado, de esta manera, se obtiene lo que se denomina Pintura Cromosmica.

FISH trigo (Triticum

intermedium)

GISH: Hbrido
(Liliaceae)

Pintura
cromosmica
(ratn)

Pintura cromosmica
(humanos)

SECUENCIACIN DEL ADN: MTODO DIDESOXI Y MTODO AUTOMTICO

El anlisis ms detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de
nucletidos. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes mtodos para obtener la
secuencia de nucletidos del ADN, sin embargo, actualmente los mtodos ms utilizados son el
de secuenciacin automtica y el mtodo enzimtico de terminacin de cadena de Sanger
tambin conocido por el mtodo didesoxi.

Mtodo enzimtico de terminacin de cadena o mtodo didesoxi de Sanger

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el mtodo

enzimtico de terminacin de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:
El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un
segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por
tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Adems, debe estar en estado de hlice
sencilla.
Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La
ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hlice sencilla y siguiendo las
reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va aadiendo nucletidos a partir de
un cebador o "primer".
Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucletido corto de alrededor de 20 bases de
longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a aadir nucletidos por el
extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del
fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucletidos del
segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia
complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN, adems, este
cebador procede de una regin del vector muy cercana al punto de insercin del ADN
problema cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente.
Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar
radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucletidos
trifosfato en cada reaccin.
Por ltimo, se necesitan nucletidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los
nucletidos didesoxi son nucletidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la
posicin 3' de la desoxirribosa. Estos nucletidos pueden incorporarse a la cadena de ADN
naciente, pero no es posible que se una a ellos ningn otro nucletido por el extremo 3'. Por
tanto, una vez incorporado un nucletido didesoxi se termina la sntesis de la cadena de
ADN.

Breve descripcin del mtodo enzimtico de terminacin de cadena

En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reaccin.
Cada mezcla de reaccin contiene los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y
dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucletido dideoxi, por
ejemplo ddATP, a una concentracin baja. El nucletido didesoxi utilizado (ddATP en este
ejemplo) competir con su homlogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se
est sintetizando, produciendo la terminacin de la sntesis en el momento y lugar donde se
incorpora.

Por este sistema, en cada mezcla de reaccin se producen una serie de molculas de ADN
de nueva sntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucletido y
marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el
cebador utilizado).

Los fragmentos de ADN de nueva sntesis obtenidos en cada mezcla de reaccin se

separan por tamaos mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos
(0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos
de ADN que se diferencian en un solo nucletido.Los productos de cada una de las cuatro
mezclas de reaccin se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel.
Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una pelcula fotogrfica
de autorradiografa. La aparicin de una banda en una posicin concreta de la
autorradiografa en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del
ADN de nueva sntesis (complementario al ADN molde) est la base correspondiente al
nucletido didesoxi utilizado en la mezcla de reaccin correspondiente.

Esquema de las electroforesis de las reacciones de secuenciacin

Autorradiografa

Teniendo en cuenta que el ADN de nueva sntesis crece en la direccin 5' 3', si
comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamao (extremo 5') y avanzamos
aumentando el tamao de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de
nueva sntesis en la direccin 5' 3'.

Breve descripcin del mtodo automtico de secuenciacin

La principal diferencia entre mtodo enzimtico de terminacin de cadena y el mtodo
automtico de secuenciacin radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el mtodo
automtico en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro
mezclas de reaccin, cada una con nucletido trifosfato (dTTP) marcado con un
fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible
leer al mismo tiempo los ADNs de nueva sntesis producto de las cuatro mezclas de
reaccin.
La segunda diferencia radica en el sistema de deteccin de los fragmentos de ADN. La
deteccin del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reaccin se lleva a cabo al
mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor
tamao que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema
aumentar el nmero de nucletidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por
consiguiente, en cada secuenciacin.
El siguiente esquema representa de forma abreviada el mtodo automtico de secuenciacin.

Esquema del mtodo automtico de secuenciacin

En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el mtodo
automtico de secuenciacin. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible
determinar el nucletido existente en esa posicin de la secuencia.

Secuencia obtenida por mtodos automticos