Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Qumica
LABORATORIO DE INMUNOLOGA GENERAL

REPORTE 9:
INMUNOENSAYO ENZIMATICO ELISA

GRUPO 1

EQUIPO 5:
CRUZ MELNDEZ ANDRS
DURN RODRGUEZ PABLO
ESCOBAR HINOJOSA ABRAHAM SALVADOR

Entrega: 16 de Mayo del 2016

Introduccin.

El inmunoensayo enzimtico es una tcnica en la cual uno de los

reactantes, el anticuerpo o el antgeno, se fija a un soporte solido
previamente a su interaccin con el reactante complementario. Debido a
esta caracterstica de la tcnica y al uso de anticuerpos acoplados a
enzimas,

la

tcnica

se

describe

como

ELISA

(enzyme-linked

immunosorbent assay). La tcnica es muy verstil y por eso hay diversas

variantes de la misma dentro de las cuales las ms comunes son ELISA
directo, ELISA indirecto y el ELISA en sndwich o de captura.
En los ELISAs directo e indirecto, el antgeno se adsorbe sobre la
fase slida (placas de un plstico especial de 96 pozos o mdulos de 8, 12
o 16 pozos).
ELISA directo consiste en la adsorcin pasiva de un Ag (o un Ac)
sobre la superficie de la placa y luego la adicin de un Ac (o Ag) que lleva
conjugada la enzima. El ELISA directo comnmente se utiliza para
cuantificar antgenos conocidos.
ELISA indirecto (para deteccin de Ac) consiste en adsorber
pasivamente el Ag sobre la placa, adicionar el suero donde se buscan los
Ac especficos contra el Ag y posteriormente aadir un segundo
anticuerpo anti-gamma globulina que lleva conjugada la enzima.
ELISA tipo sandwich (para deteccin de Ag) puede ser directo o
indirecto. El primero consiste en adsorber los Ac especficos a la placa,
despus aadir la muestra que contiene el Ag y finalmente un segundo Ac
(dirigido contra el mismo Ag) que tiene la enzima conjugada. El indirecto,
utiliza un segundo Ac (contra el mismo Ag) no conjugado y en un paso
siguiente un tercer Ac anti-gamma globulina conjugado a la enzima. El
ELISA en sndwich o de captura se utiliza para la bsqueda y
cuantificacin de antgenos.

ELISA por competencia puede ser directo o indirecto. La prueba se

basa en que se tratan de unir dos reactivos a un tercero. La competencia
apropiada exige la adicin simultnea de los dos reactivos que van a
competir, uno de ellos marcado y el otro sin marca.
Las soluciones para dilucin de los reactantes y lavado de los pozos
son variadas, la ms utilizada es el regulador de fosfatos 0.01 M en
solucin salina 0.15 M a pH 7.4 (PBS). Algunos recomiendan adicionar
Tween 20 al 0.01-0.05% a la solucin de trabajo (PBST), otros lo evitan
sobre todo cuando los antgenos son de naturaleza lipidica. Un paso que
no se debe obviar en las tcnicas de ELISA es el bloqueo de los pozos con
soluciones

de

protena

ajenas

al

sistema

Ag-Ac

es

estudio.

Los

bloqueadores ms utilizados son albumina (bovina, humana o de huevo,

segn el ensayo), gelatina, casina y la leche descremada, todos ellos a la
concentracin del 2 al 3% en PBS. El bloqueador satura los sitios no
ocupados por el reactante inmunolgico usado para forrar la superficie de
los pozos y evita la adsorcin inespecfica de reactantes en los pasos
subsecuentes.
Los anticuerpos de deteccin son anticuerpos dirigidos contra
alguno de los reactantes (antgeno o anticuerpo problemas), acoplados a
enzimas. Las enzimas de mayor uso son la peroxidasa de rbano, la
fosfatasa alcalina y la - galactosidasa pero no son las nicas. Para el
revelado del sistema se utiliza el sustrato de la enzima, a veces se
requiere el uso simultaneo de un cromgeno (como en el caso de la
peroxidasa, donde adems de perxido de hidrogeno se utiliza ortofenilendiamina

algn

otro

cromgeno),

en

otras

ocasiones

el

cromgeno forma parte del substrato como en el caso de la fosfatasa

alcalina (p-nitrofenil fosfato) y de la -galactosidasa (o-nitrofenil galactopiranosido).

El cromgeno es necesario para que el producto resultante tenga

algn color. El color se registra en un colormetro a la longitud de onda
de mxima absorcin del producto colorido.
Objetivos.

Se realizara una prueba de ELISA con el anticuerpo obtenido a partir

del esquema de inmunizacin de conejo.

A partir de los resultados obtenidos en la prueba de ELISA se
identificara el anticuerpo, el titulo del anticuerpo y la dilucin a la
que el Antgeno puede llevar a cabo una reaccin Ag-Ac.

Material.
1.

Suero

de

conejo

(anticuerpo 8.

Amortiguador

de

bloqueo

obtenido a partir del esquema de PBS/leche 5%.

inmunizacin

hecho

durante

el

semestre)
2. Micropipetas.

9. Microplaca.

3. Puntas para micropipeta.

10. Espectrofotmetro (lector de

ELISA).

4. Gradilla.

11. Solucin de lavado.

5. 7 tubos de ensayo de 12x175.

Mtodos.
1. Se realiz el bloqueo de la microplaca durante 45 minutos con con el
amortiguador PBS/leche 5%.

2. Se preparararon diluciones del anticuerpo en amortiguador de

bloqueo (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200) a partir
de 500 L, colocando cada una en un tubo de ensayo.
3. Se incub el anticuerpo primario durante 30 minutos, colocando 90
L por pozo.
4. Se lavaron los pozos con solucin de lavado 4 veces y se retir el
exceso sacudiendo y golpeando suavemente la microplaca de
manera invertida sobre una papel absorbente.
5. Se incub el anticuerpo secundario durante 30 minutos (90 L por
pozo).
6. Se repiti el lavado.
7. Se incub con sustrato revelador durante 10 minutos.
8. Finalmente se ley a 492 nm con el espectrofotmetro para ELISA

Resultados.
Resultados obtenidos despus de la lectura a 492 nm.

A
B
C
D
E
F

6
Suero
bovino
0,055
0,07
0,068
0,048
0,057
0,052

7
Suero
humano
0,134
0,122
0,104
0,083
0,067
0,073

G
H
Blanco

0,044

0,06

0,056

0,064

A partir de los resultados obtenidos en la lectura de la prueba de ELISA

podemos determinar:

Que el anticuerpo que contiene el suero del conejo inmunizado es

Suero Humano.

El titulo del anticuerpo es la dilucin C (1:200) debido a que es la

ltima dilucin en donde hay una reaccin positiva.

La dilucin E (1: 800) es en la que el Anticuerpo permite hacer una

identificacin debido a que las diluciones subsecuentes presentan
picos, resultado de errores en la metodologa experimental.

Conclusiones
Se llevo a cabo el procedimiento experimental para la prueba de ELISA y
a partir de un software se obtuvieron los datos que permitieron la
identificacin del anticuerpo anti-Suero Humano en el plasma de conejo.
Adems se determino el titulo del anticuerpo y la mxima dilucin a la
que el anticuerpo permite ser identificado.
Bibliografa

Rodrguez Padilla, C; Tamez Guerra, R; Manual de Inmunologa, 1 edicin,

Mxico, Editorial Trillas. 2010. Paginas consultadas 114-115.

Rojas-Espinosa, O., Inmunologa (de memoria), 3 edicin, Mxico, Editorial
Mdica Panamericana. 2006. Paginas consultadas 227-230.