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de Investigacin en Alimentos
Facultad de Ciencias Qumicas
Departamento
Fundamento
La antrona forma un compuesto verde en medio cido fuerte (cido sulfrico)
con ciertos carbohidratos y sacridos, en especial con azcares y almidones. La
reaccin de la antrona en medio sulfrico produce un derivado del furano que
tiene su mximo de absorcin en 620 nm.
Reactivo antrona
El reactivo se prepara de la siguiente manera:
1
DIA-UADEC
Departamento
Fundamento
El mtodo propuesto por Dubois et al., 1956 se fundamenta en que los
carbohidratos son particularmente sensibles a cidos fuertes y temperaturas
altas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar
empezando con una deshidratacin simple, si se contina con el calentamiento
y la catlisis cida se producen varios derivados del furano que condensan
consigo mismo y con otros subproductos para producir compuestos coloridos
producto de la condensacin de los compuestos fenlicos y con heterociclos
con el nitrgeno como heterotomo. La condensacin ms comn es con el
fenol
MATERIALES Y METODOS
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Departamento
3
DIA-UADEC
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Fundamento
El mtodo se basa en la capacidad que tienen los azcares reductores (como la
glucosa y la fructosa) de reducir ciertos iones metlicos, como el cobre, en un
medio alcalino y caliente. En el proceso, la muestra que contiene el azcar
reductor se calienta con la solucin alcalina de tartrato de cobre (reactivo de
Somogyi), y como resultado de la reaccin se forma xido cuproso. ste
reacciona con el arseno-molibdato (reactivo de Nelson) dando un compuesto
de color azul (azul de molibdeno) (Figura 1).
Cu2O
Arseno-Molibdato
Azul de molibdeno
Reactivos
Reactivo de Somogyi
-
Reactivo A
Compuesto
Carbonato de sodio anhidro
Cantidad
(g/L)
25
4
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Departamento
(Na2CO3)
Sal de Rochelle (KaNaC4H4O6)
Bicarbonato
de
sodio
(NaHCO3)
Sulfato
de
sodio
25
20
anhidro
200
(Na2SO4)
En la mezcla de reaccin se incluye sulfato de sodio para minimizar la entrada
de oxgeno atmosfrico en la solucin, lo cual podra causar reoxidacin del
xido cuproso.
El reactivo se debe filtrar y almacenar a no menos de 20C, con el fin de evitar
la cristalizacin del sulfato de sodio.
Reactivo B
Compuesto
Cantidad
(100
mL)
15
1-2 gotas
5
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1 ml de la
muestra
Enfriar en bao
de hielo 20 min
Agregar 1 ml
reactivo
Somogyi
(25 partes
reactivo A, 1
parte reactivo B)
Agregar 1 ml
reactivo Nelson
Bao en
ebullicin por 20
min
Completar a 5
ml
Leer a 500 nm
Notas:
o
o
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Solucin madre de
glucosa(L)
Agua
0
100
200
300
400
500
1000
900
800
700
600
500
destilada
(L)
Concentra
cin
(ppm
)
0
100
200
300
400
500
Referencias bibliogrficas:
Somogyi, M (1926) Notes onsugardetermination. Journal of Biological
Chemistry.
Nelson, N (1944) A photometric adaptation of the Somogyi method for
the determination of glucose.Journal of Biological Chemistry.
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Fundamento
El mtodo a continuacin descrito fundamenta su principio qumico en la
capacidad reductora de los grupos aldehdo y/o cetnicos libres de los
carbohidratos, ante una solucin cupro-alcalina, con la consiguiente oxidacin
de los azcares en el grupo carbonilo y en la funcin alcohol primario, dicha
reaccin se manifiesta en la precipitacin de cobre como xido cuproso. Tal
mtodo es aplicable a monosacridos, disacridos reductores y polisacridos
previamente hidrolizados.
Mtodo volumtrico de Lane y Eynon
En este mtodo el carbohidrato reductor se encuentra en solucin y con el se
reduce un volumen medido y constante de licor cupro-alcalino (reactivo de
Fehling-Soxhlet), en presencia de indicador azul de metileno.
Determinacin de azcares reductores
Reactivos
(ver anexo de preparacin de reactivos)
Material y equipo
Bureta
Matraces erlenmeyer de 250 mL
Pipetas de 5 y 10 mL
Embudo
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Procedimiento
1.- Si la muestra es slida, disolver 2 g en un volumen conocido de agua
destilada y aforar a 100 250 mL. Para muestras lquidas, hacer una dilucin
1:1, dependiendo de la concentracin del carbohidrato en anlisis o bien
trabajar directamente con la muestra.
NOTA: Cuando la muestra sea colorida, como el caso de los refrescos, nctares,
concentrados de frutas, chocolates, jarabes, alimentos en polvo o si tiene
material suspendido, deber realizarse el siguiente proceso:
a
Departamento
Calcular:
% AZCARES REDUCTORES = T
F-S
* Vol. de aforo
x 100
mL gastados * g de muestra
T F-S: ttulo de la solucin Fehling- Soxhlet
HCl concentrado
NaOH 4%
Solucin F-S A
Solucin F-S B
Agua destilada
Azul de metileno 1% (solucin acuosa)
Material y equipo
Refrigerante
Matraz baln fondo plano
Bureta
Matraces erlenmeyer de 250 ml.
Pipetas de 5 y 10 mL.
Parrilla
Procedimiento
A Hidrlisis por reflujo
1.- Si la muestra es slida, disolver 2 g en 50 mL de agua destilada. Para
muestras lquidas, hacer una dilucin 1:1 (completando 50 mL), dependiendo
de la concentracin del carbohidrato en anlisis.
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2.- Pasar la muestra a un matraz baln fondo plano y acidificarla con 1mL de
HCl concentrado.
3.- Conectar el matraz al refrigerante e hidrolizar por 30 minutos (precalentar
la parrilla y mantener alta la temperatura durante los 30 minutos que dura la
hidrlisis).
4.- Enfriar el hidrolizado y neutralizar con 1mL aproximadamente de NaOH 4%.
5.- Aforar a 200 mL con agua destilada.
B) Hidrlisis por calor
1. Si la muestra es slida, disolver 2 g en 50 mL de agua destilada. Para
muestras lquidas, hacer una dilucin 1:1 (completando 50 mL), dependiendo
de la concentracin del carbohidrato en anlisis.
2.- Pasar la muestra a un matraz baln fondo plano y acidificarla con 1mL de
HCl concentrado.
3. Introducir el matraz con la muestra acidificada en una estufa a 45C durante
24 hrs.
4. Comprobar la hidrlisis de los polisacridos adicionando una gota de lugol. Si
ste adquiere una coloracin morada sobre la muestra, indica que la hidrlisis
se ha completado, si no es as, continuar el calentamiento por 3 horas ms.
NOTA: Cuando la muestra sea colorida, como el caso de los refrescos, nctares,
concentrados de frutas, chocolates, jarabes, alimentos en polvo o si tiene
material suspendido, deber realizarse el siguiente proceso:
c
En un matraz Erlenmeyer agregar 5mL de solucin F-S A + 5 mL de solucin FS B + 40 mL de agua destilada. Preparar por triplicado.
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Calcular:
% AZCARES NO REDUCTORES = T
F-S
mL gastados * g de muestra
T
F-S
AZCARES TOTALES
% AZCARES TOTALES = % AZCARES
% AZCARES
NO REDUCTORES
REDUCTORES
Material y equipo
Bureta
Matraces Erlenmeyer de 250 mL.
Pipetas de 5 y 10 mL.
Balanza
Matraces aforados de 500 mL
Procedimiento
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6)
T=VxC
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Hidrxido de sodio 4%
Disolver 4 g de NaOH (lentejas) y aforar a 100 mL. Vaciar a un recipiente y
etiquetar (nombre, concentracin y fecha).
Azul de metileno 1%
Disolver 1 mL de reactivo azul de metileno en 100 mL de agua destilada (en
matraz aforado), mezclar, vaciar a un frasco con gotero y etiquetar (nombre,
concentracin y fecha).
Solucin patrn de dextrosa 1%
Pesar 1 g de dextrosa anhidra y aforar a 100 mL con agua destilada. Si se usa
dextrosa monohidratada pesar 1.1 g.
Solucin de subacetato de plomo (o acetato bsico de plomo) 30%.
Disolver 75 g de una u otra sal y aforar a 250 mL con agua destilada.
Referencia bibliogrfica
Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.
(1990). Method AOAC 923.09, pp 1016.
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Introduccin
La
glucosamina
(C6H13NO5)
es
un
amino
azcar
que
se
encuentra
un
compuesto
pirrlico,
que
al
reaccionar
con
el
p-
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Clculos
Para hacer los clculos correspondientes, se sustituye y en la ecuacin de la
recta por las absorbancias obtenidas de las muestras, el valor obtenido (mg/g
de glucosamina) se divide entre el valor de glucosamina asociada al hongo,
para obtener el contenido de biomasa (mg/g de muestra).
Bibliografa
Blix, G. 1948. The Determination of Hexosamines According to Elson and
Morgan. Acta Chemica Scandinavica 2, 467-473.
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Fundamento
Esta es una tcnica espectrofotomtrica, que se basa en la formacin de una
coloracin caracterstica al acomplejarse las protenas solubles con el colorante
azul de Comassie. El colorante azul de Comassie G-250 existe en dos diferentes
formas: rojo y azul. La forma roja se convierte en azul mediante la unin del
pigmento a las protenas. El complejo protena-pigmento tiene un alto
coeficiente de extincin lo cual resulta en una alta sensibilidad para la
medicin de protena.
La unin del pigmento a la protena es un proceso rpido (alrededor de 2
minutos) y el complejo protena-pigmento permanece disperso en la solucin
durante un tiempo relativamente largo (1 hora, aproximadamente), esto hace
de la tcnica un procedimiento rpido y no requiere de un control estricto del
tiempo de reaccin.
Preparacin del reactivo
Se disuelven 100 mg del colorante Azul de Comassie G-250 en 50 mL de etanol
al 95 %. Se agregan 100 mL de cido fosfrico 85 % (p/v). La solucin se diluye
en agua destilada y se afora a 1 L. El reactivo debe protegerse de la luz y
filtrarse antes de su uso. Este reactivo es estable por al menos un mes a
temperatura ambiente.
Ensayo:
Se han descrito dos diferentes ensayos basados en el uso de este reactivo,
cada uno con diferente sensibilidad.
Ensayo estndar
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Micro-ensayo
Clculos
Para calcular la concentracin de protena en la muestra, se realiz una curva
patrn utilizando Albmina Srica Bovina (BSA) como estndar (Tablas 1 y 2).
Interferencias
Los nicos componentes que se ha encontrado que producen una interferencia
excesiva durante la reaccin son algunos detergentes en altas concentraciones
como: dodecil sulfato de sodio, Tritn X-100, y detergentes comerciales. Las
interferencias debidas a pequeas cantidades de detergente pueden ser
eliminadas usando los controles adecuados.
Referencia:
Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Analytical Biochemistry 72(1-2): 248-254.
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Cuantificacin
de
polifenoles
hidrolizables por el mtodo de FolinCiocalteu
Fundamento
El contenido de polifenoles totales puede ser determinado por medio de un
mtodo espectrofotomtrico con el reactivo de Folin Ciocalteu. Este mtodo se
basa en la presencia de los cidos fosfomolbdico y fosfotngstico en el
reactivo, los cuales se reducen al oxidar a los fenoles debido a la transferencia
de electrones a pH bsico, dando lugar a la formacin de compuestos
cromgenos como oxido de molibdeno y de tungsteno de coloracin azul-verde.
La concentracin producida es proporcional a la concentracin de polifenoles
presentes en la muestra.
Metodologa
Referencia
Belmares, R., Garza, Y., Rodrguez, R., Contreras, J. C. y Aguilar, C. N. 2009.
Composition and fungal degradation of tannins present in semiarid plants.
Electronic Journal of Enviromental, Agricultural and Food Chemistry. 8, 4, 312318.
20
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Ventura, J., Belmares, R., Aguilera, A., Gutirrez, G., Rodrguez, R. y Aguilar, C.
N. 2008. Fungal Biodegradation of Tannins from Creosote Bush (Larrea
tridentata) and Tar Bush (Flourensia cernua) for Gallec and Ellagic Acid
Production. Food Technology and Biotechnology. 46 (2) 213217.
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Fundamento
Esta
tcnica
permite
analizar
el
contenido
de
proantocianidinas
en
0.5 mL de muestra
3 mL HCl-Butanol
0.1 mL reactivo frrico
Tubos con tapa
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Bao metablico
Agua
Espectrofotmetro
Preparacin de reactivos:
Reactivo frrico
Se agregan 20 mL de HCl concentrado, aforar a 100 mL con agua destilada
posteriormente se adicionan 2 g de reactivo sulfato frrico de amonio y se
almacena en un frasco mbar en refrigeracin (4 C) hasta su empleo.
20 mL HCl
concentrado
Aforar a 100 mL
H2O
Adicionar 2 g de
sulfato frrico de
amonio
Conservar en
frasco mbar 4 C
HCl-Butanol (10 %)
Se agregan 10 mL de HCl al 37 % y se afora a 100 mL con terbutanol.
10 mL HCl al 37 %
Aforar a 100 mL
terbutanol
Departamento
0.5 mL de
muestra
3 mL HCl terbutanol
(1:9)
Leer
espectrofotmetro
460 nm
Cerrar
tubos
0.1 mL
reactivo
frrico
Enfriar a
temperatura
ambiente
Calentar tubos
por 1 h (bao
metablico 100
C)
g/L
0.0
0.25
0.50
0.75
1.0
REFERENCIA BIBLIOGRFICA
Swain, T., and Hillis E. 1959. The phenolic constituentes of Prunus domestica.
The quantitative analysis af phenolic constituents. J. Sci. Food Agric. 10:63-68.
Ventura-Sobrevilla J. M. (2006). Tesis licenciatura. Biodegradacion de Taninos en
Extractos de Gobernadora (Larrea tridentata Cov.) y Hojasn (Fluorencia
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Cuantificacin de polifenoles
hidrolizables por el mtodo de FolinCiocalteu en microplaca
Fundamento
El contenido de polifenoles totales puede ser determinado por medio de
un mtodo espectrofotomtrico con el reactivo de Folin Ciocalteu. Este
mtodo se basa en la presencia de los cidos fosfomolbdico y
fosfotngstico en el reactivo, los cuales se reducen al oxidar a los
fenoles debido a la transferencia de electrones a pH bsico, dando lugar
a la formacin de compuestos cromgenos como oxido de molibdeno y
de tungsteno de coloracin azul-verde. La concentracin producida es
proporcional a la concentracin de polifenoles presentes en la muestra.
Metodologa
pozo de la microplaca.
Posteriormente 20 L del reactivo de Folin-Ciocalteu se agregan y
de 5 minutos.
Finalmente, la solucin fue diluida con 125 L de agua destilada y
su absorbancia es leda a 790 nm en un lector de microplacas
(Epoch).
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Notas:
Referencia
Belmares, R., Garza, Y., Rodrguez, R., Contreras, J. C. y Aguilar, C. N.
2009. Composition and fungal degradation of tannins present in semiarid
plants. Electronic Journal of Enviromental, Agricultural and Food
Chemistry. 8, 4, 312-318.
Ventura, J., Belmares, R., Aguilera, A., Gutirrez, G., Rodrguez, R. y
Aguilar, C. N. 2008. Fungal Biodegradation of Tannins from Creosote
Bush (Larrea tridentata) and Tar Bush (Flourensia cernua) for Gallic and
Ellagic Acid Production. Food Technology and Biotechnology. 46 (2) 213
217.
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Determinacin espectrofotomtrica de
cido elgico
10
Fundamento
Esta tcnica se basa en la cuantificacin de cido elgico utilizando un
mtodo espectrofotomtrico. El cual, se basa en la formacin de una
quinona oxima producto de la nitrosilacin del cido elgico. El
mecanismo
de
reaccin
se
debe
una
substitucin
aromtica
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DIA-UADEC
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reactivo.
Se pasa 1 mL a un tubo de ensaye.
Se colocan nuevamente 1.1 mL de piridina.
Se colocan en bao de hielo por 5 minutos.
Se aade 0.1 mL de cido clorhdrico (HCl) concentrado.
Se deja incubar a 30 C por 5 minutos.
Se aade 0.1 mL de nitrato de sodio (NaNO2) al 1 %.
Se lee en el espectrofotmetro a 538 nm. En este paso es
importante colocar en una cubeta de cuarzo debido a la
solucin corrosiva.
Se dejan incubar nuevamente a 30 C por 36 minutos.
Se toma la lectura a 538 nm. La diferencia entre la absorbancia
inicial y la absorbancia a los 36 minutos es proporcional a la
Piridina
(L)
1000
960
920
880
840
800
Observaciones
Se debe de tener mucho cuidado con el manejo de la piridina ya que es
un potente cancergeno y solucin txica. Se debe de trabajar toda la
tcnica con una mscara antigases. De debe de contar con una aeracin
adecuada.
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11
metanlisis
Departamento
Despus
de
la
centrifugacin
de
las
muestras,
los
Departamento
Tiempo
(min)
Inicial
10
20
25
26
31
40
Referencia
Ascacio-Valds,
Flujo (1
mL/mi
n).
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
J.,
%A
%B
%C
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20
30
60
30
0
100
100
80
70
40
70
100
Aguilera-Carb,
A.,
Martnez-Hernndez,
J.L.,
Cuantificacin de cido
Cromatografa
lquida
resolucin (HPLC)
12
glico
de
por
alta
DIA-UADEC
Departamento
deber
ser
previamente
filtrada
(de
ser
necesario)
Flujo de 1 mL/min.
Volumen de inyeccin de 10 L.
Temperatura ambiente.
(A= metanol, B=
Departamento
los 5.6 min. Se tomarn y medirn las reas bajo los picos a este tiempo
de retencin; tanto de la curva de calibracin como la de las muestras.
La cuantificacin del cido glico se llevar a cabo interpolando las
reas de las muestras con las de la concentracin conocida en una hoja
de Excel.
Referencia
Chvez-Gonzlez,
biodegradacin
M.L.
del
(2011).
cido
tnico.
Contribucin
Tesis
de
al
estudio
maestra.
de
la
Universidad
Autnoma de Coahuila.
13
34
DIA-UADEC
Departamento
HPLC
o
o
o
o
o
14
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DIA-UADEC
Departamento
Fundamento
El mtodo consiste en la medicin del cido glico liberado durante la reaccin
enzimtica, utilizando como sustrato para la tanasa un ster del cido glico
(metil-galato). La medicin del cido glico se basa en la formacin de un
cromforo entre dicho cido y la 2-tio-4- cetotiazolidina, tambin conocida
como rodanina (Fig. 1).
minutos a 30 C.
Departamento
de
UI mgA.G.
L
L
5mL
0.25mL
1gA.G.
1000mgA.G.
1molA.G.
170.12 gA.G.
1106 molA.G.
1molA.G.
1
5 min
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DIA-UADEC
Departamento
Figura 2. Esquema del ensayo enzimtico propuesto por Sharma et al. (2000)
Variantes
Esta tcnica ha sido modificada en mltiples ocasiones, a continuacin se
mencionan las principales:
*Cualquier
modificacin
realizada
la
tcnica,
incluyendo
las
antes
38
DIA-UADEC
Departamento
15
Materiales
Reactivos
Procedimiento
Se usaron dos controles, uno de sustrato (CS) y el otro de enzima (CE).
La mezcla de reaccin contena elagitaninos (1 mg/mL) + extracto enzimtico.
CS: 1 ml de elagitaninos (1 mg/ml) en buffer de citrato pH 5 (0.05 M) +
50
l de buffer de citratos.
CE: 1 ml de buffer de citratos pH 5 (0.05 M) + 50 l de extracto enzimtico.
Mezcla reaccin: 1 ml de elagitaninos (1 mg/ml) en buffer de citratos + 50 l
de extracto enzimtico.
Sonicar las muestras por 15 min y filtrar con la ayuda de una pirinola con
un filtro millipore de 0.45 m en viales de vidrio.
Se colocan los viales en el equipo HPLC para ser inyectadas las muestras
y cuantificar el cido elgico (fase mvil de cido actico al 3 %).
DIA-UADEC
Departamento
A partir de la solucin madre preparar soluciones a 400, 300, 200, 100 y 0 ppm
de AE, para realizar una curva de calibracin.
Referencia
Mreles-Ramrez, M.C. 2008. Determinacin de las condiciones de reaccin de la
enzima elagitanasa obtenida por Aspergillus niger GH1 en cultivo en medio
slido. Tesis de licenciatura. Universidad Autnoma de Coahuila.
40
DIA-UADEC
Departamento
Determinacin
16
de
actividad
endoglucanasa
Miguel ngel Medina Morales
de
celulosa,
contribuyendo
la
disminucin
del
grado
de
polimerizacin.
Metodologa
Material
Tubos de ensaye (13 x 100)
Carboximetil celulosa a 500 ppm (Sustrato)
Buffer de ACCNa 0.1 M a pH 4.8
Bao mara a 50 C
Reactivos para determinacin de azcares reductores (Somogyi-Nelson)
Procedimiento
Blanco de sustrato (BS):
En un tubo de ensaye colocar 200 L de buffer mas 50 L de extracto
enzimtico
Blanco de enzima (BE):
En un tubo de ensaye colocar 200 L de sustrato ms 50 L de buffer.
Mezcla de reaccin (MR):
41
DIA-UADEC
Departamento
Referencia
Ghose, T.K. (1987). Measurement of cellulase activities. Pure & Appl. Chem. 59:
257 268.
42
DIA-UADEC
Departamento
Determinacin
17
de
actividad
exoglucanasa
Miguel ngel Medina Morales
de
celulosa,
contribuyendo
la
disminucin
del
grado
de
polimerizacin.
Metodologa
Material
Tubos de ensaye (13 x 100)
Tiras de papel filtro Whatman #1 de 1 cm x 6 cm (Sustrato)
Buffer de ACCNa 0.1 M a pH 4.8
Bao mara a 50 C
Reactivos para determinacin de azcares reductores (Somogyi-Nelson).
Procedimiento
Blanco de sustrato (BS):
En un tubo de ensaye colocar 1 mL de buffer y se colocan 50 L de extracto
enzimtico
Blanco de enzima (BE):
En un tubo de ensaye colocar 1 mL de buffer y se colocan una tira de papel
filtro
Mezcla de reaccin (MR):
En un tubo de ensaye colocar 1 mL de buffer y se colocan una tira de papel
filtro. Se adicionan 50 L de extracto enzimtico.
43
DIA-UADEC
Departamento
Referencia
Ghose, T.K. (1987). Measurement of cellulase activities. Pure & Appl. Chem. 59:
257 268.
44
DIA-UADEC
Determinacin
18
Departamento
de
actividad
glucosidasa
Miguel ngel Medina Morales
45
DIA-UADEC
Departamento
Referencia
Vattem, D y Shetty, K. (2002). Solid-state production of phenolic antioxidants
from cranberry pomace by Rhizopus oligosporus. Food biotechnology. 16: 189
210.
46
DIA-UADEC
Departamento
19
47
DIA-UADEC
Departamento
48
DIA-UADEC
20
Departamento
Fundamento
El radical 2,2-azino bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) (ABTS) posee coloracin
azul, cuando encuentra un H + con el cual complementar su estructura pierde la
coloracin. El cambio de coloracin es lo que permite cuantificar el poder
antioxidante de la sustancia colocada como muestra. Para la formacin del
radical ABTS es necesaria la presencia de persulfato de potasio.
Tcnica:
control.
La longitud de onda para determinar absorbancia es de 734 nm.
49
DIA-UADEC
Departamento
reducci n de ABTS=
( AC A m )
AC
100
Referencia: Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., RiceEvans C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation
decolorization assay. Free radical biology & medicine. 26: 1231-1237.
50
DIA-UADEC
21
Departamento
Fundamento
El radical 2,2-difenil-1-picril-hidracil (DPPH) posee coloracin morada, cuando
encuentra un H+ con el cual complementar su estructura pierde la coloracin.
El cambio de coloracin es lo que permite cuantificar el poder antioxidante de
la sustancia colocada como muestra.
Tcnica:
metanlica.
Determinar la longitud de onda de absorbancia del radical, mediante un
constante. Tomar este valor para hacer las reacciones a tiempo final.
Si las muestras son extractos de plantas, expresar los resultados como
equivalentes de DPPH/ g de material, utilizando el nmero de Avogadro
para su clculo. Basndose en la concentracin de la solucin del radical
y la cantidad de solucin que reaccion con la muestra.
51
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Para graficar los datos, pueden emplearse tambin las relaciones de Abs
Vs concentracin (curva de calibracin) o bien el porcentaje de reduccin
del radical que se calcula con la siguiente frmula:
reducci n de DPPH =
( A C Am )
AC
100
metanol o etanol.
La concentracin a la cual se prepara la solucin del radical puede variar
sensibilidad de la tcnica.
La longitud de onda de absorcin del DPPH vara entre 515 y 520 nm,
Referencia
Molyneux P. (2004). The use of the stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl
(DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol. 26 (2):
211-219.
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22
Departamento
Fundamento
El radical 2,2-difenil-1-picril-hidracil (DPPH) posee coloracin morada, cuando
encuentra un H+ con el cual complementar su estructura pierde la coloracin.
El cambio de coloracin es lo que permite cuantificar el poder antioxidante de
la sustancia colocada como muestra.
Tcnica:
metanlica.
Determinar la longitud de onda de absorbancia del radical, mediante un
barrido en el rango visible. Se puede usar el procedimiento espectro
directo con la luz mientras se llenan los pocillos con DPPH y muestras.
Cuantificar el cambio de absorbancia de manera cintica. Si es necesario
deben hacerse diluciones de la muestra, donde la reaccin de
neutralizacin del radical sea paulatina. El nombre del programa en el
Epoch es DPPH cintica.
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constante. Tomar este valor para hacer las reacciones a tiempo final.
Modificar el tiempo de lectura del programa DPPH punto final del
software Gen 5.
Si las muestras son extractos de plantas, expresar los resultados como
equivalentes de DPPH/ g de material, utilizando el nmero de Avogadro
para su clculo. Basndose en la concentracin de la solucin del radical
reducci n de DPPH =
( A C Am )
AC
100
metanol o etanol.
La concentracin a la cual se prepara la solucin del radical puede variar
sensibilidad de la tcnica.
La longitud de onda de absorcin del DPPH vara entre 515 y 520 nm,
por eso debe determinarse la mejor para el equipo en el cual se trabaje.
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Referencia:
Departamento
diphenylpicryl-hydrazyl
(DPPH)
for
estimating
antioxidant
activity.
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23
Departamento
Evaluacin
electroqumica
actividad anti-radicalaria
de
la
Fundamento
Esta tcnica consiste en la evaluacin del potencial rdox de los compuestos
antioxidantes mediante la aplicacin de un barrido de potencial, siendo posible
cuantificar la respuesta dada en valores de corriente.La voltamperometra
cclica (VC) y voltamperometra diferencial de pulsos (VDP) se realiza en un
potenciostato/galvanostato, la celda electroqumica debe constar de tres
electrodos:
electrodo
de
trabajo
(carbn
vtreo,
platino,
oro,
etc.),
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24
Introduccin
La humedad es una de las determinaciones ms importantes y
ampliamente usadas en el control y procesamiento de muestras. En
alimentos, influye en las estructura, apariencia y gusto de los productos,
determina
su
susceptibilidad
al
deterioro
(fsico,
qumico
Departamento
muestra a la atmsfera abierta debe ser tan breve como sea posible. Se
debe minimizar cualquier probabilidad de calentamiento de la muestra
mientras se muele.
Fundamento y alcance
La materia seca que permanece en el alimento posterior a la remocin
del agua se conoce como slidos totales. Es por eso que este mtodo se
basa en la determinacin gravimtrica de la prdida de masa, de la
muestra desecada hasta peso constante en estufa.
El mtodo es aplicable en muestras slidas, lquidas, pastosas no
susceptibles a degradacin al ser sometidos a temperaturas superiores
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CALCULOS
59
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MST =
Departamento
H =100 MST
25
Determinacin de cenizas
Romeo Rojas Molina
Introduccin
La determinacin de cenizas es tambin conocida como el anlisis de
residuos inorgnicos que quedan despus de la ignicin u oxidacin
completa de la materia orgnica de un alimento. Es esencial el
conocimiento bsico de las caractersticas de varios mtodos para
analizar cenizas as como el equipo para llevarlo a cabo para garantizar
resultados confiables. Para esto, existen tres tipos de anlisis de cenizas:
cenizas en seco para la mayora de las muestras de alimentos; cenizas
hmedas (por oxidacin) para muestras con alto contenido de grasa
(carnes y productos crnicos) como mtodo de preparacin de la
muestra para anlisis elemental y anlisis simple de cenizas de plasma
en seco a baja temperatura para la preparacin de muestras cuando se
llevan a cabo anlisis de voltiles elementales.
Fundamento y alcance
60
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Muestra seca
Crisoles
Balanza analtica
Parrilla de calentamiento
Mufla
Desecador
Pinzas
Procedimiento
1. Poner a peso constante (100 C/24 h) un crisol o cpsula de
porcelana por cada muestra que se va a analizar.
2. Enfriar el crisol por 15-20 min en desecador, pesar (anotar el peso
exacto) y colocar 1 2 g de muestra seca dentro del crisol.
3. Pre-incinerar
en
un
mechero
parrilla
elctrica,
baja
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NOTAS
Referencia
Instituto Nacional de Normalizacin, NCh 841 of 78.
Official Methods of Analysis. A.O.A.C. 15 th Edition 1990
AOAC. 1980.
Association of Official
26
FUNDAMENTO
La muestra seca se extrae con algn disolvente (hexano, ter etlico, ter de
petrleo) posteriormente se determina el extracto seco por diferencia de peso,
del que se elimina el disolvente).
MATERIAL Y EQUIPO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
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7. Disolvente
METODOLOGA
Colocar de 2 5 g en papel filtro de muestra o en un cartucho de celulosa de
poro mediano, el cual se coloca en el
matraz bola fondo plano en la estufa a 100 103C por 24 horas, transcurrido
el tiempo, sacar, enfriar y pesar.
Clculos:
%G = m2 m1
m
x 100
Donde:
%G = Porcentaje de extracto etreo.
m1 = Matraz a peso constante (g).
m2 = Matraz con extracto etreo (g).
m= Peso de la muestra (g).
Referencias
AOAC. Official Methods of Analysis. AOAC. International.1990. 15th Edition,
Association of Official Analytical Chemists. Washington, D.C.
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Introduccin
La fibra cruda es el residuo orgnico combustible e insoluble que queda
despus de que la muestra se ha tratado con una solucin acida y otra
alcalina diluida hirviendo, este tratamiento proporciona la fibra cruda,
que consiste principalmente del contenido de celulosa, lignina y
hemicelulosa. La pared celular de clulas vegetales, contiene la mayor
parte del material resistente a las enzimas del tracto gastrointestinal de
los mamferos. Aunque este material pueda digerirse parcialmente por la
microflora intestinal raramente la digestin es total.
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Metodologa
1.
2.
3.
4.
Departamento
depositarla
en
un
crisol
de
porcelana,
previamente
identificado.
10.Poner a peso constante en la estufa a 100-103 C por 12 h.
11.Sacar de la estufa, enfriar (a peso constante en desecador) y pesar.
12.Pre-incinerar la muestra en parrilla y meter en la mufla a 550-600 C por
2-3 h.
13.Sacar, enfriar (a peso constante en desecador) y pesar
14.Calcular.
Clculos
%FC=
Referencia
Instituto Nacional de Normalizacin, NCh 841 of 78.
Official Methods of Analysis. A.O.A.C. 15 th Edition 1990
28
Determinacin
de
nitrgeno
por
el
mtodo Kjeldahl
Introduccin
En esta tcnica se digieren las protenas y otros componentes orgnicos
de los alimentos en una mezcla con cido sulfrico en presencia de
catalizadores.
amonio.
Departamento
catalizadores
calor
NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN
(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH
2H2O
(3) NH3 + H3BO3 (cido brico)
borato)
2NH 3 + Na2SO4+
NH 4 + H2BO3-
(in
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TITULACIN
El anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) es titulado con
HCl estandarizado:
H2BO3- + H+
(4)
H3BO3
MATERIAL
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
3
1
1
1
EQUIPO
Aparato digestor Kjeldahl (1 para todo el grupo).
1 aparato destilador micro Kjeldahl (1 por equipo).
REACTIVOS
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la
solucin
un
frasco
Se
conserva
indefinidamente.
3.- cido Clorhdrico 0.01N.- Prepare un litro y valrela con una solucin
de NaOH de la misma normalidad.
4.- Hidrxido de Sodio al 30%.- Disuelva 150g de perlas de hidrxido de
sodio en 350 ml. de agua destilada. Almacene la solucin en un
frasco mbar con tapn de vidrio.
5.- H2SO4 concentrado.
6.- Catalizadores para la Digestin.- Mezcle 2.5g de dixido de selenio
(SeO2), 100g de sulfato de potasio (K 2SO4) y 20 g de sulfato de
cobre pentahidratado (CuSO4 . 5H2O).
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PROCEDIMIENTO
Digestin
1.- Pese exactamente 0.15g de harina de trigo en un matraz de microKjeldahl cuidando que la muestra no se adhiera a las pardes o al
cuello del matraz.
2.- Aada 2.5 ml. de H2SO4, dos perlas de ebullicin y aproximadamente
1.0 g de mezcla catalizadora.
3.- Someta a digestin la muestra en el aparato de microKjeldahl bajo
una campana de extraccin, con el matraz ligeramente inclinado
usando baja temperatura al inicio y aumentando el calor a medida
que procede la digestin, rotando los matraces de vez en cuando
para asegurarse de que se digiera toda la muestra. La digestin
terminar cuando el color de la muestra sea azl-verde claro. El
proceso tomar aproximadamente 90 minutos.
4.- Enfre el matraz durante unos 4 minutos para que no se endurezca al
solidificarse la muestra.
5.-
Destilacin
6.- Encienda la unidad destiladora.
7.- Si es posible ajuste la velocidad de destilacin a aproximadamente 5
ml. por minuto
8.- Abra la llave del agua para tener H 2O circulando por el refrigerante
todo el tiempo.
9.- Aada la muestra a la cmara de ebullicin por medio de un embudo
(para recuperar las perlas de ebullicin) y enjuague el matraz con
aproximadamente 5ml. de H2O destilada.
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La mezcla digerida se
Si no cambia de color
aada ms NaOH.
12.- Deje un poco de NaOH en la copita superior del destilador.
13.- Colecte aproximadamente 20 ml. del destilado (4-5 minutos).
El
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Titulacin
15.- Titule la muestra con 0.1N de HCl. Un color violeta indica el punto
final de la titulacin.
Cada
mol
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en donde:
NHCl = Normalidad del HCl en moles/1000ml.
Volumen del cido corregido = (ml. del cido estandarizado para la
muestra) - (ml. de cido estandarizado para el blanco).
14 = Peso atmico del nitrgeno.
Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N a porciento de
protena cruda. El porcentaje de N en protena para el harina de
trigo es de 18% y su factor de conversin es de 5.70.
Referencia
A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists.
Methods of Analysis. Washington, D.C.
Official
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29
La extraccin de ADN por la tcnica de CTAB fue propuesta por Doyle y Doyle
(1987). Este mtodo es apropiado para le extraccin y purificacin del ADN de
plantas, productos alimenticios, cepas fngicas, y es utilizado para la
eliminacin de polisacridos y componentes polifenlicos, que afectan la
pureza del ADN, por lo tanto la calidad de este.
La tcnica consta de tres pasos. El primero consta de una lisis de la pared
celular. La muestra se trata con un buffer que contiene EDTA, Tris/HCl y CTAB,
de esta manera se eliminan los lpidos y las protenas de la pared celular. El
CTAB tiene la funcin de capturar los lpidos y as, liberar el ADN. El EDTA es un
componente quelante, que con otros metales se enlaza al Mg el cual es un
cofactor de las ADNasas, por lo que al unirse el Mg con el EDTA se reduce la
actividad de estas enzimas. El Tris/HCl da a la solucin un pH adecuado para el
ADN no se dae.
La extraccin total de ADN, se realiza utilizando una solucin de cloroformoalcohol isoamlico el cual facilita la eliminacin de polisacridos,
protenas, etc.
Extraccin:
En este paso, los polisacridos, compuestos fenlicos, protenas y otros lisados
celulares son disueltos en una solucin acuosa, separados del CTAB y
complejos cidos nucleicos. La eliminacin de polisacridos as como de
compuestos fenlicos es particularmente importante, por su capacidad de
inhibir un gran nmero de reacciones enzimticas. Normalmente la fase acuosa
se forma en la parte superior, sin embargo, si la fase acuosa es densa, por la
concentracin de sal (0.5M), se forma en la parte inferior. En suma, los cidos
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micropipeta
(cuidando
utilizar
puntillas
estriles),
el
lquido
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minutos.
11.
Centrifugar
12,000rpm
por
minutos
descartar
el
sobrenadante.
12.
etanol al 70% (v/v) mezclado cada vez por inversin suave. Colocar el
tubo destapado en posicin invertida hasta que el olor a etanol
desaparezca.
13.
Refrigerar las
muestras.
NOTA: A partir de esta etapa las muestras deben permanecer refrigeradas
Referencia.
Doyle J.J, Doyle J.L (1987) A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19:11-15
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30
Departamento
(2)
(3)
Departamento
AF EF
AF ENF
(4)
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Departamento
1.8
1.6
1.4
1.2
1
PAF 0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Concentracion (ppm )
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Departamento
Neubauer
Juan Alberto Ascacio Valds
Laboratorio de Microbiologa. Departamento de Investigacin en Alimentos. Facultad de
Ciencias Qumicas. Universidad Autnoma de Coahuila. Saltillo, Coahuila, Mxico.
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