CINETICA ENZIMATICA

VERONICA MARCELA BARRETO VARGAS

COD. 6122859

UNIVERSIDAD DE AMRICA
DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA
BIOQUMICA

BOGOTA 2015

CINETICA ENZIMATICA

INTRODUCCION:
Definicin: Estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas
por las enzimas. El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de una enzima
permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el
metabolismo, cmo es su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su
actividad por medio de los inhibidores.
Las enzimas, en su mayora, protenas con la capacidad de manipular otras
molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro
cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo
de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas
pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos.
Los mecanismos enzimticos pueden ser divididos en mecanismo de nico
sustrato o mecanismo de mltiples sustratos. Los estudios cinticos llevados a
cabo en enzimas que solo unen un sustrato, pretenden medir la afinidad con la
que se une el sustrato y la velocidad con la que lo transforma en producto. Por
otro lado, al estudiar una enzima que une varios sustratos, la cintica enzimtica
puede mostrar tambin el orden en el que se unen los sustratos y el orden en el
que los productos son liberados.
La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede medirse con relativa
facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La
medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura,
presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato.
En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima
(Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin de los
productos o la desaparicin de los reactivos.
Encontramos diferentes cinemticas entre las cuales:

Cintica de Michaelis Menten:

Permite conocer la velocidad a la que se lleva a cabo una reaccin mediante la
siguiente ecuacin:
[s ]
V =Vmax
[ S ] Km
Km: es una relacin de constantes de velocidad para una determinada
reaccin, es decir la afinidad que tiene la enzima del sustrato.

Esta ecuacin quiere decir que: cuando la concentracin de sustrato es mucho

menos que la Km, la velocidad es directamente proporcional a la
concentracin de sustrato
V =[ S ]

Vmax
Km

Cuando la concentracin de sustrato es mucho mayor que la Km, la V= Vmax,

la velocidad mxima, independiente de la concentracin de sustrato, cuando:
[S] = Km, entonces:
V=

Vmax
2

As, Km es aquella concentracin de sustrato a la cual la velocidad de la

reaccin se hace la mitad de su valor mximo.
La determinacin del valor de las constantes de la ecuacin de Michaelis a
partir de las medidas experimentales de V para diferentes valores de [S] y
ajuste numrico no lineal de los resultados a la ecuacin de Michaelis o
mediante ajuste lineal de los mismos, lo cual implica la linealizacin de la
ecuacin inicial. Las funciones lineales a partir de la ecuacin de Michaelis
son:

Cintica Lineweaver Burk:

Se emplea como herramienta grfica para calcular los parmetros cinticos de
una enzima.
Su utilidad consiste en que el recproco de la cintica de Michaelis-Menten es
fcilmente representable y que de l emanan mucha informacin de inters.
Cuyo reciproco es:

Km
1
1 ( Km+ [ S ] ) Vmax
1
=
=
+
V (Vmax [ S ] )
[S ]
Vmax

Dnde: V es la velocidad de reaccin, Km es la constante de MichaelisMenten, Vmax es la velocidad mxima, y [S] es la concentracin de sustrato.

La representacin grfica de Lineweaver-Burk permite identificar el Km y

Vmax; el punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa
de Vmax, y el de abscisas es el valor de -1/Km.

Cintica Hanes:

Cintica Eadie Hofstee:

INHIBIDORES ENZIMATICOS
Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a enzimas y disminuyen
su actividad. La unin de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio
activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima catalice su reaccin
correspondiente. La unin del inhibidor puede ser reversible o irreversible.

Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma

covalente y modifican su estructura qumica a nivel de residuos esenciales de
los aminocidos necesarios para la actividad enzimtica. En cambio, los
inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a
diferentes tipos de inhibiciones, dependiendo de si el inhibidor se une a la enzima,
al complejo enzima-sustrato o a ambos.

SOLUCION DEL TALLER

moles
tiempo (s) sustrato
0
100
5
90
10
81
15
72,9
20
65,6
25
59
30
53,1
35
47,8
40
43
45
38,7
60
34,9

moles
producto
0
10
19
27,1
34,4
41
46,9
52,2
57
61,3
65,1

Curva de progreso

120

100
f(x) = - 1.14x + 91.92
R = 0.94

80

f(x) = 1.14x + 8.08

R = 0.94
60

40

20

0
0

10

20

30

40

50

60

70

Velocidad inicial
70

f(x) = 1.29x + 5.48

R = 0.98

60
50

CURVA DE
PROGRESO

40

Linear (CURVA DE
PROGRESO)

30
20
10
0
0

10

20

30

40

50

60

Se determina la rapidez inicial (V0) calculando la derivada de la funcin ya sea por

sustrato o por producto:
0,0322 x +2,064 7
Y evaluando est en el origen (x=0):
0,0322 (0)+2,0647
Por tanto se puede establecer la velocidad inicial:

V O=2,,0647

mo
s

Curva de Michaelis:
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

Vo
0
28,6
44,4
54,5
61,5
66,7
70,6
73,7
76,2
78,3
80

Curva de Michaelis
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0

20

40

60

80

100

La concentracin de sustrato = Dos veces constante de Michaelis

V max =80
K a=20

120

Curva de Linewaver:

1/A
0
0,1
0,05
0,0333333
3
0,025
0,02
0,0166666
7
0,0142857
1
0,0125
0,0111111
1
0,01

1/Vo
0
0,0349650
3
0,0225225
2
0,0183486
2
0,0162601
6
0,0149925
0,0141643
1
0,0135685
2
0,0131233
6
0,0127713
9
0,0125

0.04
0.04

f(x) = 0.25x + 0.01

R = 1

0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0
0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

=/ = 0.2498/01
=24.9
= 1/ = 1/0.01
=100

Curva de Hanes:

A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

A/Vo
0
0,3496503
5
0,4504504
5
0,5504587
2
0,6504065
0,7496251
9
0,8498583
6
0,9497964
7
1,0498687
7
1,1494252
9
1,25

Curva de Hanes
1.4
1.2

f(x) = 0.01x + 0.17

R = 0.97

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

20

40

60

80

100

120

Despejando y remplazando los valores de Vo y Km son respectivamente:

Vm

1
pendiente

Vm

1
moles
100
0,01
s
Ka=

0.1706
=17,06
0.01

Curva de Hofstee:
Vo/A
0
2,86
2,22
1,8166666
7
1,5375
1,334
1,1766666
7
1,0528571
4
0,9525
0,87
0,8

Vo
0
28,6
44,4
54,5
61,5
66,7
70,6
73,7
76,2
78,3
80

Ka

Inter sec cin

pendiente

Curva de Hofstee
90
80

f(x) = - 25.01x + 100.01

R = 1

70
60
50
40
30
20
10
0
0.5

1.5

Para hallar Vm se toma en cuenta la relacin b=V m

V m=100,01

mo
s

En la determinacin de KM se toma la relacin m=-KM

K M =25,007 mM

Curva de Eisenthal y Cornish Bowdden:

2.5

Eisenthal-Comish-Bowden
120
100
80
60

Vo

40
20
-110

-90

-70

-50

-30

0
-10

10

30

50

-[A]

Para este mtodo grafico la Vm y la KM corresponden a las coordenadas del

punto en el cual todas las rectas se cruzan.
En el caso de Vm se puede apreciar que aproximadamente su valor es de
100mol/s.
Para la KM se podra tomar de manera visual aproximando un valor entre 20 o 40
o por medio de un mtodo ms exacto que es despejando la coordenada x a partir
de la ecuacin de cualquiera de las rectas que forman el mtodo.
y=2,86+28,6 el valor de KM es 25mM
A partir de la ecuacin

K a 25

Inhibidores:

K m 100

Vo

V10

V20

V30

1/A

1/Vo

1/V10

1/V30

100

66,7

50

40

133,3

88,9

66,7

53,3

0,5

150

100

75

60

0,3333333
3

160

106,7

80

64

0,25

166,7

111,1

83,3

66,7

0,2

171,4

114,3

85,7

68,6

0,1666666
7

175

116,7

87,5

70

0,1428571
4

177,8

118,5

88,9

71,1

0,125

180

120

90

72

0,11111111

10

181,8

121,2

90,9

72,2

0,1

0,02
0,01
0,0149925
0,025
0,0075018 0,0112485 0,0187617 0,0149925
8
9
3
0,0133333
0,0066666
0,0166666
3
7
0,01
7
0,0093720
0,0125
0,00625
7
0,015625
0,0120048
0,0059988 0,0090009 0,0149925
0,0116686
0,0058343 0,0087489 0,0145772
1
1
1
6
0,0114285
0,0057142 0,0085689 0,0142857
7
9
8
1
0,0112485
0,0084388
9
0,0056243
2
0,0140647
0,0055555 0,0083333 0,0138888 0,01111111
6
3
9
0,0055005 0,0082508 0,0138504 0,0110011
5
3
2

0.01
0.01

f(x) = 0.01x + 0
R = 1

0.01
0.01
0
0
0
0

0.2

0.4

0.6

0.8

}
Vm :

1/V20

1
1
=
=200
Interseccion 0.005

1.2

Km :

Pendiente
0,005
=
=1
Interseccion 0.005

Inhibidor no competitivo
0.03
0.03

f(x) = 0.01x + 0.01

0.02
1/Vo

f(x) = 0.01x + 0.01

0.02

f(x) = 0.01x + 0.01

0.01

f(x) = 0.01x + 0

0.01
0
0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

1/[A]

I
0
10
20
30

Inhibidor no competitivo
pendiente
interseccin
0,005
0,005
0,007
0,007
0,01
0,01
0,012
0,012

Se puede calcular fcilmente el Kii con ayuda de los puntos de interseccin de

cada una de las rectas y los valores de [I], para determinarlo primero graficamos
los siguientes valores:

Kii

[I]
0
10
20
30

b
0,005
0,0075
0,01
0,0125

Kii
0.01
0.01
0.01
0.01
Kii 0.01
0
0
0
0

10

15

20

25

30

35

[I]

Kii=20

Se puede calcular fcilmente el Kis con ayuda de los puntos de la pendiente de

cada una de las rectas y los valores de [I], para determinarlo primero graficamos
los siguientes valores:
Kis
[I]
0
10
20
30

m
0,005
0,0075
0,01
0,0125

Kis
0.01
0.01
0.01
0.01
Kis 0.01
0
0
0
0

10

15

20

25

30

[I]

Kis=20

A partir de Michaelis calculamos la constante y la rapidez mxima

Para hallar Vm y Km:
[A] mM
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

V0
moles/min
0
100
133,3
150
160
166,7
171,4
175
177,8
180
181,8

Vm= 181,8 moles/min

Km= 1

35

Km & Vm
200
150

V0 100
50
0

10

12

[A]

CONCLUSIONES

Despus de realizar el estudio de la cintica enzimtica se concluye que se

puede determinar a grandes rasgos el comportamiento de la enzima, puesto
que los parmetros descritos son principales en la determinacin de la
velocidad y de la afinidad de la enzima con un sustrato.
Se puede concluir que de las representaciones anteriores mostradas la de
Lineweaver Burk es la ms empleada, no obstante esta no permite una
determinacin muy fiable de los parmetros, dado que a bajas
concentraciones de sustratos, la recta tiende a infinito mientras que a altas, los
puntos son demasiados cercanos uno de otros. Es decir, no es fcil de obtener
con esta representacin puntos aproximadamente equiespaciados y la
determinacin lineal se realiza mayoritariamente con los puntos de bajas
concentraciones, que son los de mayor error.
La desventaja de la representacin de Hofstee se encuentra en que la variable
V est en ambas coordenadas introduciendo un error importante, pero tiene la
ventaja que los puntos estn ms repartidos.
La representacin lineal de Hanes es la ms satisfactoria de estas, dado que
los puntos que se obtienen suelen ser ms equiespaciados que los de la
representacin de Lineweaver Burk y eso hace que la precisin de clculo
aumente, en particular el valor de Vmax.
Lineweaver o doble inversa, tiene el inconveniente de que comprime los
puntos de concentraciones altas de substrato en una regin pequea y por
tanto da mayor importancia a los puntos de baja concentracin que, a veces,
son los que se determinan con mayor error experimental.

Es observable que el inhibidor ser determinante en la accin de la enzima y

que describir su tipo definir que tan determinante fue este para el proceso
cataltico.
Observamos que en los diferentes tipos de inhibidores la velocidad y
concentracin son directamente proporcionales.

BIBLIOGRAFIA

Bioqumica, Campbell & Farrell (2006), Mexico D.F., Editorial Cencage

Learning
http://www.slideshare.net/tmedicauss/clase-7-cinetica-enzimatica
http://www.slideshare.net/tmedicauss/clase-7-cinetica-enzimatica
https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/miembros/Web_Sofia/GRUPOS/T
ema%207.pdf
http://www.uib.es/facultat/ciencies/prof/josefa.donoso/campus/modulos/mod
ulo4/modulo4_12.htm
http://books.google.com.co/books?
id=IdJ03bLyxH4C&pg=PA274&lpg=PA274&dq=cinetica+de+hanes&source=
bl&ots=Tz_uShSFuu&sig=ztDG_QXczsiun0JzfZZCNeE2Zt4&hl=es&sa=X&
ei=BROcUbfxForC9QTZ0YDYCQ&ved=0CDMQ6AEwAQ#v=onepage&q=ci
netica%20de%20hanes&f=false