EnsayodeEsterilidad

AptituddelaMetodologa

Uruguay 469 - 6 A, Bs. As. SAFYBI APINAM

09 de octubre de 2013
Bioq. Mara Ins Gollan
Lic. Mirtha Ascoy Padilla

ENSAYODEESTERILIDAD
Segnlasdistintasfarmacopeas,esterilidad esel
estadolibredemicroorganismosvivosdetodotipo.
Esteconceptoesfcildeenunciarperoenlaprcticano
sepuededemostrar.

ENSAYODEESTERILIDAD
PASOSINVOLUCRADOS
1. Controles
2. Muestreo
3. Mediosdecultivousados
4. MtododelEnsayo(FiltracinporMembrana,
TransferenciaDirecta)
5. Observacineinterpretacindelosresultados

ENSAYODEESTERILIDAD
MTODOSANALTICOS
MtododeFiltracinporMembrana: eselmtodode
eleccin.Consisteenfiltrarelproductoatravsdeuna
membrana,cuyotamaodeporopermitaretenerlos
microorganismosquepudieranestarpresentesenel
mismoyluegocultivarlos,introduciendolamembrana
enmediosadecuadosparaeldesarrollodelosmismos.
TipodeMuestrasparaelMtododeFiltracinporMembrana:
Lquidosmisciblesenvehculosacuosos
Slidosfiltrables
Formassemislidasyaceitessolublesenmiristatode
isopropilo
Aerosolesestriles
Dispositivosmdicosesterilizados
Jeringasprellenadas

ENSAYODEESTERILIDAD
MTODOSANALTICOS

MtododeFiltracinporMembrana:
Lamuestradisueltaesfiltradaatravsdeunamembrana
compuestaporsteresdecelulosade0,45mdeporo,que
retienelosmicroorganismos.
Setransfiereelvolumennecesariodecadarecipiente,en
condicionesdeasepsia,directamentesobrelamembrana.
Selavalamembranaconnomenosde3porcionesde100ml
cadaunaconlasolucindelavadocorrespondiente.
Unavezterminadalafiltracinseintroducelamitadola
membranaenteraen100mldecadaunodelosmedios.

Utilizandounsistemacerradodefiltracin,setransfierenlos
mediosdecultivodirectamenteenlosdispositivosestriles
sobrelasmembranas.

ENSAYODEESTERILIDAD
MTODOSANALTICOS
MtododeTransferenciaDirecta: lamuestraesinoculadadirectamente
enelmediodecultivo.Elvolumendelamuestranodebesuperar el10%
delvolumendemediodecultivo.Seempleacuandonoesposiblefiltrarel
producto.
TipodeMuestrasparaelMtododeTransferenciaDirecta:
Lquidosnofiltrables
Formassemislidasyaceitesinsolubles
Slidosnofiltrables
Algodnpurificado,gasa,apsitosquirrgicos,materialparasuturasy
productosrelacionados.
Dispositivosmdicosesterilizados.
Jeringasestrilesvacas

ENSAYODEESTERILIDAD
MEDIOSDECULTIVO
Seempleandosmediosbsicosparaelensayo:

MEDIOFLUDODETIOGLICOLATO(FMT):
Estemedioeselindicadoparainvestigarlapresencia
debacteriasaerobiasyanaerobias.

CALDODEPEPTONASdeCASENAySOJA(TSB):
Estemedioeselindicadoparainvestigarlapresencia
debacteriasaerobias,hongosylevaduras.
Temperaturadeincubacin:
FMT9 Seincubaentre30y35C.
TSB9 Seincubaentre20y25C.
Tiempodeincubacin:
FMTyTSB Seincubadurante14das.
TSB9 Seincubadurante14das.

ENSAYODEESTERILIDAD
DILUYENTESYLQUIDOSDELAVADO

SolucinA:aguapeptonadaal1,pH:7.1 0.2.
SolucinD:aguapeptonadaal1 +1mldepolisorbato80,en 1
l,pH:7.1 0.2.
SolucinK:peptonayextractodecarne+10grdepolisorbato
80,en1l,pH:6.9 0.2.
Betalactamasa:paraPenicilinasyCefalosporinas,enlaSolucin
A.

ENSAYODEESTERILIDAD
Sedebecontrolar:
Lafertilidaddelmediodecultivo.Laposibilidadde
detectarunacontaminacinbaja.
Laesterilidaddelmediodecultivo.

ENSAYODEESTERILIDAD
MEDIOSDECULTIVO
Cadamediodecultivoutilizadodebesometerseaun
ensayodePromocindeCrecimiento demodode
comprobarquepuedenproliferarmicroorganismos
diferentes,tantoencondicionesaerobiascomo
anaerobias(inculoentre10y100ufc/ml).
Paraelloseusancepasexigentesdesdeelpuntode
vistadelasnecesidadesnutritivasydelascondiciones
deaerobiosisyanaerobiosis.Algunasdeestascepas
puedenser:
FMT:
Staphylococcusaureus ATCC6538
Pseudomonasaeruginosa ATCC9027 Micrococcusluteus
(Kocuriarhizophila)ATCC9341
Clostridiumsporogenes ATCC19404 Bacteroidesvulgatus
ATCC8482
TSB:
Bacillusspizizenii ATCC6633
Candidaalbicans ATCC10231
AspergillusbrasiliensisATCC16404

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ENSAYODEESTERILIDAD
CONTROLES

POSITIVO,deambosmedios,conuninculopequeo(no
mayorde100ufc/ml).
NEGATIVO,deambosmedios.
BLANCODELENSAYO,testigoenelcualsepasar solucin
diluyentey/odelavadoporotramembranaquesesiembrade
lamismamaneraquelaanteriordondesepas lamuestra.

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ENSAYODEESTERILIDAD
CONTROLES

READETRABAJO:
ElEnsayodeEsterilidadsiempredeberealizarseenunreadededicacin
exclusiva.
Elreadebeserdelamismaclasedereausadaparalasoperacionesde
fabricacin,estril/aspticadeproductos.
Fuente.OPSRedPARFDocumentoTcnicoN 11BuenasprcticasdelaOMS
paraLaboratoriosdeMicrobiologaFarmacutica Enero2013.

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ENSAYODEESTERILIDAD
CONTROLES
READETRABAJO:
Monitoreomicrobiolgico
Grado

Muestreo
deaire
(UFC/m3)

Placasde
exposicin
(90mm)
(UFC/4hs)

Placasde
contacto
(55mm)
(UFC/placa)

Impresin
deguantes
(cinco
dedos)
(UFC/guant
e)

<3

<3

<3

<3

10

100

50

25

200

100

50

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ENSAYODEESTERILIDAD
CONTROLES
Elreadecontrol debeposeerpresinpositiva.Sedebeninstalarequipos
deadecuacindeairefiltradoporHEPAparamantenerdichaPresin,
regulandoladireccindelascorrientesdelaire.
AdemsseusanaerosolesgermicidasylmparasUVprevioalensayo.
Todaslassuperficies (paredes,pisos,mesadas)yutensilios debenestar
limpiosydesinfectadosconunasolucingermicida.
Ademssedebenrealizarlosensayosbajogabinetede flujo
unidireccional.

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ENSAYODEESTERILIDAD
CONTROLES
GABINETEDEFLUJOUNIDIRECCIONAL:
IntegridaddelfiltroHEPA
Eficienciadelequipo
Losgabinetesdeflujounidireccional,as como
laslmparasgermicidassesometern
peridicamenteacontroles.

AUTOCLAVE:
Validacindelosprocesos
MonitoreodelosciclosconIB

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ENSAYODEESTERILIDAD
CONTROLES
ESTUFADEESTERILIZACINPORCALORSECO:
Validacindelosprocesos
MonitoreodelosciclosconIB
MEDIOSDECULTIVO:
Controldeesterilizacin
PromocindelCrecimiento
ESTUFASDEINCUBACIN:
Calibracinymonitoreo

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ENSAYODEESTERILIDAD
CONTROLES
PERSONAL:
Losoperadores,nomsdedos,debenestarequipadosconropas
adecuadasyestriles,camisolnomameluco,barbijo,cubrecalzadoy
guantes.
Elpersonalquerealiceelensayodebeposeersuficienteexperienciay
estarautorizado.
Lainterpretacindelosresultadosdeber hacerlounapersonacon
estudiosdeMicrobiologaoquesehayaadiestradoenello.

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ENSAYODEESTERILIDAD
MTODOSANALTICOS
Sialdaceroelproductoenturbiaelmediodecultivo,ya
seaparalametodologadefiltracinpormembranaopara
siembradirecta,pasadoslos14dasdeincubacin,deber
transferirseporcionesnomenoresa1mldelmediode
cultivoalmismomedioyacontinuacinincubarel
recipienteoriginalyeldetransferenciadurantenomenos
de4das.

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ENSAYODEESTERILIDAD
INTERPRETACINDELOSRESULTADOS

Sinohayevidenciadecrecimientomicrobiano,lamuestra
cumple conelensayo.
Sihayevidenciadecrecimientomicrobianoysecompruebaque
no hanexistidofallas enelprocedimiento,lamuestranocumple
conelensayo.
Sisedemuestraquehanexistidofallasenelprocedimiento,se
repiteelensayoconelmismonmerodemuestras.

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ENSAYODEESTERILIDAD
INTERPRETACINDELOSRESULTADOS
Fallas:
1)Losregistrosdelmonitoreomicrobiolgicodelasinstalaciones
demuestranunafalla.
2)Enlarevisindelprocedimientoanalticousadoserevelaun
error.
3)Loscontrolesnegativospresentancrecimientomicrobiano.
4)Despusdeidentificarlosmicroorganismosaisladosdelos
tubosdeprueba,severificaqueinequvocamenteson
microorganismosprovenientesdelrea,equiposuoperador.
Siexistealgunadeestasfallaselensayoseconsidera invlidoydebe
repetirse
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ENSAYODEESTERILIDAD
INTERPRETACINDELOSRESULTADOS
Sinohayevidenciadecrecimientomicrobianoenlarepeticin
delensayo,lamuestracumple conelensayo.
Sihayevidenciadecrecimientomicrobianoenlarepeticindel
ensayo,lamuestranocumple conelensayo.

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APTITUD
Unmtodomicrobiolgicoes
aptoparaundeterminado
ensayocuandosedemuestra
quelosproductosaensayar,el
mtodo,losmaterialesyel
equipamientoautilizar,no
interfiereneneldesarrollode
eventualesmicroorganismos
presentesenlasmuestrasyque
losresultadosobtenidossean
confiables.

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APTITUD
Laaptituddelensayodeesterilidadsellevaacabocuando:
Seefectaelensayoparaunproductonuevo.
Siemprequeexistauncambioenlascondiciones
experimentalesdelensayo.

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MUESTREO
N DE UNIDADES DEL LOTE

N MNIMO DE UNIDADES A ANALIZAR PARA CADA MEDIO

DE CULTIVO

Inyectables
< que 100
> que 100 pero que 500

10% o 4 (el que sea mayor)

10

> que 500

2% o 20 (el que sea menor)

SPGV

2% o 10 (el que sea menor)

Antibiticos slidos: envases de < 5 g.

20

Antibiticos slidos: envases a 5 gr.

Productos oftlmicos y no inyectables

que 200

5% o 2 (el que sea mayor)

> que 200

10

Productos biomdicos
100 paquetes
> 100 y 500
> 500

10% o 4 (el que sea mayor)

10
2% o 20 (el que sea menor)

Productos slidos a granel

de 4 envases

Todos

> de 4 y de 50

20% o 4 (el que sea mayor)

> de 50

2% o 10 (el que sea mayor)

24
24

CANTIDADESAENSAYARPARAPRODUCTOSSLIDOS
CONTENIDO DE CADA ENVASE

CANTIDAD MNIMA TOMADA DE CADA

ENVASE PARA CADA MEDIO DE CULTIVO

< 50 mg

Todo el contenido de cada envase

> 50 mg y < 300 mg

Mitad del contenido de cada envase pero no < de

50 mg

300 mg a 5 g

150 mg

>5g

500 mg

Antibiticos

150 mg

Algodn, gasa, apsitos quirrgicos

100 mg/paquete

Suturas y otros materiales descartables

Envase completo

Otros dispositivos mdicos

Dispositivo completo, cortado en piezas o

desarmado

25
25

CANTIDADESAENSAYARPARAPRODUCTOSLIQUIDOS
YOTRASPREPARACIONES
CONTENIDO DE CADA ENVASE

CANTIDAD MNIMA TOMADA DE CADA ENVASE PARA

CADA MEDIO DE CULTIVO

Lquidos (distintos de antibiticos)

< 1 ml

Todo el contenido de cada envase

de 1 a 40 ml

Mitad del contenido de cada envase pero no < 1 ml

> de 40 ml y no > a 100 ml

20 ml

> a 100 ml

10 % del contenido del envase, pero no < a 20 ml

Antibiticos lquidos

1 ml

Preparaciones insolubles, cremas, y ungentos

a ser suspendidos o emulsionados

La muestra de cada envase no debe ser < a 200 mg

26
26

ENSAYODEAPTITUD
FILTRACINPORMEMBRANA
Inculo:Entre10y100ufc/ml.
Ensayo:
1. SuspenderodisolverlamuestraenSoluc.delavado.
2. Filtrarlamuestra.
3. LavarlamembranaconelvolumenapropiadodeSoluc.de
lavadoquehayasidodemostradoenlosensayospreliminares.
4. AgregarelInculodecadaunodelosmicroorganismos
descriptosanteriormente(porseparado),paracadamedioenla
ltimaporcindeSoluc.delavado.
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ENSAYODEAPTITUD
MTODODEFILTRACINPORMEMBRANA
5.Endiferentestubosrepetirlospasos3y4(sinel
agregadodelamuestra).Estostubossonlos
CONTROLESPOSITIVOSdelensayo.
6. Incubarlasmembranasenlosmedioscorrespondientes.

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ENSAYODEAPTITUD
MTODOFILTRACINPORMEMBRANA:Conclusiones
Sielcrecimientodeltubo MUESTRA+INCULO es
comparablealtuboCONTROLPOSITIVO,usandolamisma
cantidaddelavados,significaqueelensayoesapto.
SielcrecimientodeltuboMUESTRA+INCULO noes
comparablealtuboCONTROLPOSITIVO,significaqueel
productocontieneinhibidores delcrecimientoquenosehan
podidoeliminar.

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ENSAYODEAPTITUD
MTODOFILTRACINPORMEMBRANA:Consideraciones
Sielproductoinhibeelcrecimiento:
Serepetir elensayoconmayorcantidaddelavados.Se
puedelavarhasta10vecesconunvolumende100mlpor
vez.
SepuedeagregarunagenteneutralizanteounaBeta
lactamasa.

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ENSAYODEAPTITUD
MTODODETRANSFERENCIADIRECTA
Inculo:Entre10y100ufc/ml.

1tubodecadamediodecultivoconMUESTRA+INCULO.
1tubodecadamediodecultivoconInculo como
CONTROLPOSITIVO.
1tubodecadamediodecultivocomocontrolnegativo.

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ENSAYODEAPTITUD
MTODODETRANSFERENCIADIRECTA:Conclusiones
SielcrecimientodeltuboMUESTRA +INCULOes
comparablealtuboCONTROLPOSITIVO,significaqueel
productonocontieneinhibidoresdelcrecimiento.
SielcrecimientodeltuboMUESTRA+INCULO noes
comparablealtuboCONTROLPOSITIVO,significa queel
productocontieneinhibidoresdelcrecimiento.

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ENSAYODEAPTITUD
MTODODETRANSFERENCIADIRECTA:Consideraciones
Sielproductoinhibeelcrecimiento:
Usaragentesneutralizantes:lecitina,Tween
(Polisorbato)80,azolectinaobetalactamasa.
Sinoesefectivo,sedebeincrementarlarelacin
Mediodecultivo/Muestra.Sepuedeusarhasta2.000
mldeMediodecultivo.

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ENSAYODEAPTITUD
TIEMPODEINCUBACIN
EP USP:Incubacinhasta5das.
FA7maedicin:Incubacinhasta7das.

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APTITUD
Ladeterminacindelaaptituddeunametodologaesuna
demostracindequelaaplicacindelprocedimientorealizado
noseproducen:
RESULTADOSFALSOSNEGATIVOS
RESULTADOSFALSOSPOSITIVOS

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APTITUD

RESULTADOSFALSOSNEGATIVOS
Efectobacteriostticoofungisttico:
Deel/losactivo/s
Delosexcipientes
Delosagentessanitizantesdelos
envases
Debidosalprocedimiento

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APTITUD
RESULTADOSFALSOSNEGATIVOS
Mediosdecultivo:
Promocindecrecimiento
Geometraytamaodelenvasedondesepreparaelmediode
cultivo

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APTITUD
RESULTADOSFALSOSPOSITIVOS
Debidoalamanipulacinhumana
Delambiente

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APTITUD
CONCLUSIONES
Laausenciadecontaminacin
microbiana,evidenciadaporlos
procedimientosdescriptos,confirma
queelproductosatisfacelosrequisitos
delensayodeesterilidad.
Noobstante,debidoalaslimitaciones
inherentesalaestadsticadelmuestreo,
esteresultadonopermiteasegurarla
esterilidaddelatotalidaddellote.

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APTITUD
CONCLUSIONES
Elensayodeesterilidadalquese
someteelproductoterminado
debeserconsideradoslocomo
laLTIMAETAPADEUNASERIE
DEMEDIDASDECONTROLque
estnespecificadasenlas
BUENASPRCTICASDE
FABRICACIN

40

MUCHAS GRACIAS POR SU

ATENCIN

migollan@anmat.gov.ar