Genetica molecolare

Genetica molecolare: indaga i meccanismi chimici che permettono lespressione delle

informazioni genetiche in un individuo e la trasmissione dei caratteri ereditari da un
individuo ai propri discendenti.
Lunit base delleredit il gene, definito come il tratto di DNA responsabile della
determinazione di un dato carattere.
Nucleotidi
Un nucleotide formato da una molecola di H3PO4, legata a uno zucchero pentoso
(ribosio, RNA; 2-desossiribosio, DNA) legato a sua volta ad una base eterociclica
azotata.
Zucchero e base azotata sono legati tramite latomo di azoto e il carbonio anomerico
dello zucchero (C1).
Le basi si dividono in due gruppi:
-

Pirimidine: citosina ( C) , timina (T), uracile (U)

Purine: adenina (A) , guanina (G).

Struttura del DNA

Il DNA un polimero lineare di nucleotidi, formato da due filamenti avvolti a elica
intorno a un asse centrale. Ogni filamento formato da uno scheletro di molecole di
zucchero e gruppi fosfati alternati.
I due filamenti sono uniti da legami a idrogeno tra le basi azotate che si fronteggiano
nella doppia elica. Queste non si appaiano casualmente: la distanza tra i due filamenti
costante (3,4 A) , per cui lappaiamento ha luogo necessariamente tra una purina e
una pirimidina.
Le basi appaiate sono dette complementari, in particolare:
-

Ladenina si appaia con la timina

La guanina si appaia con la citosina

Con legami a idrogeno.

Ogni filamento ha unestremit 5 e unestremit 3 che si fronteggiano, i due filamenti
sono quindi antiparalleli.

Replicazione del DNA

Ha luogo prima che la cellula si divida, i due filamenti si separano grazie alla rottura
dei legami idrogeno tra le basi e ciascuno di essi funziona come stampo per la sintesi
di un nuovo filamento a esso complementare, utilizzando i desossiribonucleotidi liberi
presenti nella cellula.
Replicazione semiconservativa: ognuna delle due molecole figlie di DNA costituita da
un filamento del DNA parentale (conservato) e un filamento sintetizzato ex novo.
Lintero processo richiede energia e molti enzimi.

La DNA-elicasi srotola la doppia elica nel punto di origine di replicazione, detto

forcella.
Un gruppo di enzimi noto come DNA-polimerasi catalizza e avvia la vera e propria
sintesi del nuovo filamento. Il processo avviene nel nucleo negli eucarioti, nel
citoplasma nei procarioti.
Oltre ad aggiungere nuovi nucleotidi, la DNA-polimerasi riesce ad individuare eventuali
errori. Nel caso di aggiunta di un nucleotide sbagliato, lenzima inverte la sua direzione
di marcia rimuovendo i nucleotidi uno a uno fino ad arrivare allerrore.
Altri enzimi, chiamati nucleasi di restauro del DNA, hanno il compito di eliminare
eventuali errori rimasti dopo la replicazione, andando semplicemente a sostituire i
nucleotidi sbagliati con quelli corretti.
Ognuno dei due filamenti pu fare da stampo per la sintesi dellaltro. Si dice quindi che
una doppia elica di DNA reca lo stesso messaggio su entrambi i filamenti.

Lipotesi un gene-un enzima

Come pu il DNA definire lo sviluppo e la fisiologia di una cellula? Sono stati effettuati
studi su microrganismi biochimicamente mutati, con mutazione si intende un
cambiamento nellinformazione genetica di un organismo.
Studiando mutanti della muffa del pane, due studiosi dimostrarono lesistenza per
ciascuna mutazione di un corrispondente enzima funzionante in modo anomalo.
1941, ipotesi un gene- un enzima, cio un gene responsabile della sintesi di un
determinato enzima.
Ipotesi modificata in un gene.-una proteina, dal momento che non tutte le proteine, la
cui sintesi controllata dal DNA, sono enzimi.
Ulteriori esperimenti confermarono che le proteine sono formate da catene
polipeptidiche, la formulazione originale viene quindi corretta in un gene una catena
polipeptidica.

Il ruolo dellRNA
Come pu un gene, contenuto nel nucleo e formato da una sequenza costituita da solo
quattro nucleotidi, dare origine a una catena polipeptidica, sintetizzata nel citoplasma
e costituita da una sequenza di venti tipi di amminoacidi?
Il passaggio dai geni alle proteine reso possibile dallRNA, un acido nucleico diverso
dal DNA ma anchesso formato da una sequenza lineare di nucleotidi.
Il messaggio contenuto in un gene viene copiato (trascritto) sotto forma di RNA nel
nucleo.
LRNA si trasferisce poi nel citoplasma, dove il messaggio che esso trasporta viene
usato per sintetizzare una proteina nel processo di traduzione.
Il flusso dellinformazione biologica va dunque sempre dal DNA allRNA, alle proteine.

Questa sequenza definita come dogma centrale della biologia molecolare, che
ammette uneccezione:
lenzima trascrittasi inversa, presente in alcuni virus a RNA, permette la sintesi di un
filamento di DNA a partire da una molecola di RNA.

Struttura e funzione dellRNA

-

un filamento singolo
Lo zucchero pentoso il ribosio anzich il 2-desossiribosio
Contiene quattro basi azotate, (A,U e G,C)
Negli eucarioti lRNA sintetizzato nel nucleo, ma svolge le sue funzioni nel
citoplasma

Ne esistono tre tipi:

-

RNA messaggero ( m RNA ) : trasporta linformazione genetica dal DNA al

citoplasma, dove vengono sintetizzate le proteine
RNA ribosomiale ( r RNA )
RNA di trasporto ( t RNA ) : trasporta gi amminoacidi liberi nel citoplasma ai
ribosomi e serve per tradurre linformazione contenuta nella sequenza di
nucleotidi dellm RNA in una sequenza di amminoacidi.

Trascrizione
Linformazione contenuta in un gene viene copiata in una molecola di m RNA. La
sintesi dellm RNA catalizzata dall RNA-polimerasi.
Nel punto di attacco dellenzima, i due filamenti del tratto di DNA corrispondente a un
gene/un gruppo di geni si aprono e uno di essi funziona da stampo per la sintesi di una
molecola di m RNA, con un processo simile a quello della replicazione.
LRNA-polimerasi si muove lungo il filamento stampo di DNA aggiungendo via via
ribonucleotidi allestremit 3. Si dice infatti che la trascrizione avvenga in direzione 5
3 .
Per iniziare la sintesi lRNA-polimerasi si lega a una sequenza specifica sul DNA, detta
promotore; unaltra sequenza specifica, detta segnale di terminazione, indica il punto
di arresto della trascrizione.
un processo che avviene nel nucleo e lm RNA deve essere modificato prima di
migrare nel citoplasma.
Quasi tutti i geni degli eucarioti pluricellulari sono discontinui, formati da unalternanza
di sequenze codificanti (esoni) e non codificanti (introni). Il DNA di un gene discontinuo
viene trascritto completamente, copiando sia esoni che introni, ma prima che lm RNA
lasci il nucleo gli introni vengono eliminati e gli esono saldati in sequenza per formare
lm RNA maturo (splicing).

Il codice genetico.

 un sistema di corrispondenza che permette la traduzione del messaggio contenuto

nellm RNA in una proteina. basato su triplette di nucleotidi, dette codoni, che
rendono possibili 64 combinazioni, piu che sufficienti per codificare i 20 amminoacidi.
Presenta le seguenti caratteristiche:
-

Contiene un segnale di inizio, rappresentato dal codone AUG (codifica

metionina)
Contiene segnali di fine lettura, o codoni stop (non senso) (UUA, UAG,UGA)
Non ambiguo, un dato codone specifica sempre un unico amminoacido
ridondante, quasi tutti gli amminoacidi sono specificati da pi di un codone.
Lisoleucina codificata dai codoni AUU, AUC, AUA (codoni sinonimi,
rappresentano una difesa nei confronti delle mutazioni)
universale, valido per tutti gli organismi con pochissime eccezioni (DNA
mitocondriale, UAA, UAG in un piccolo gruppo di protisti codificano per
lamminoacido glutammina, anzich essere codoni di stop)

Sintesi proteica (traduzione)

lultima tappa del processo di espressione di un gene. Avviene nel citoplasma e ha
sede sui ribosomi.
Al processo partecipano tutti e tre i tipi di RNA: m RNA porta il messaggio, r RNA che
parte integrante del ribosoma, t RNA fa da interprete traducendo il linguaggio degli
acidi nucleici in proteine.
Questa molecola riconosce i codoni dellm RNA grazie a una tripletta di nucleotidi,
lanticodone, complementare a uno specifico codone sullm RNA, e lega inoltre i vari
amminoacidi.
I t RNA sono molecole formate da circa 80 nucleotidi, con struttura a trifoglio.
Ogni cellula ne contiene almeno un tipo per ogni amminoacido, il legame fra t RNA e lo
specifico amminoacido catalizzato da uno specifico enzima, amminoacil-t RNA-ligasi.
I ribosomi possiedono tre importanti siti di legame: uno per lm RNA, e due per il t
RNA: il sito P (peptidico) e il sito A (amminoacilico).
La sintesi proteica avviene in tre fasi:
-

inizio: lestremit 5 dellm RNA si lega alla subunit minore del ribosoma. A
questo complesso si legano poi la subunit maggior e del ribosoma e il primo t
RNA legato al suo specifico amminoacido (amminoacil-t RNA) che si appaia con
il suo anticodone al codone di inizio e va a occupare il sito P.
allungamento: inizia con laggiunta nel sito A di un amminoacil t RNA con un
anticodone complementare a quello del secondo codone dellm RNA. A questo
punto si forma il legame peptidico tra i primi due amminoacidi e
contemporaneamente il t RNA che occupava il sito P esce dal ribosoma.
Il ribosoma si sposta quindi in un codone lungo lm RNA in modo che il secondo t
RNA con i due amminoacidi attaccati vada ad occupare il sito P. nel sito A
tornato libero si porta un terzo amminoacil-t RNA e si forma un nuovo legame
peptidico. Loperazione si ripete pi volte legando gli amminoacidi uno dopo
laltro secondo la specifica sequenza contenuta nellm RNA che dirige la sintesi,
fino a che la catena polipeptidica completa.

Il sito P accetta di volta in volta il t RNA che lega la catena polipeptidica in

crescita, mentre il sito A sempre occupato dal t RNA legato al nuovo
amminoacido che andr ad aggiungersi alla catena.
Quando il ribosoma arriva a uno dei tre codoni di stop, a cui non corrisponde
nessun t RNA, si ha la terminazione dove la traduzione si interrompe, la proteina
si stacca dal t RNA che abbandona il sito P e le due subunit del ribosoma si
dissociano.

Mutazioni geniche
Sono cambiamenti del patrimonio ereditario; le mutazioni geniche interessano un
singolo gene. Sono dovute a errori che possono verificarsi durante la replicazione e
che, se non corretti, determinano unalterazione della sequenza dei nucleotidi nel
DNA.
Le mutazioni che interessano un singolo nucleotide sono dette puntiformi. Queste
possono comportare la sostituzione o la perdita, o laggiunta di un nucleotide.
La perdita e laggiunta di un nucleotide hanno come effetto lo spostamento della
griglia di lettura (frame-shift), in modo da alterare tutto il filamento polipeptidico a
valle della mutazione; producono in sostanza una proteina completamente priva di
attivit biologica.

La sostituzione pu portare semplicemente alla produzione di un codone sinonimo,

e in questo caso sar una mutazione silente, oppure:
-

Mutazione missenso: da origine a un codone che codifica un amminoacido

diverso da quello originario
Mutazione non senso: da origine a uno dei tre codoni di stop che segnano
larresto della sintesi della proteina. Anche le mutazioni non senso, come le
mutazioni frame-shift, hanno effetti gravissimi.

Lemoglobina formata da quattro subunit: due alpha e due beta. Lanemia

falciforme un esempio di mutazione missenso del gene della catena beta che
comporta la sostituzione di un solo amminoacido (valina anzich acido glutammico)
ed una malattia che porta allaggregazione delle molecole di emoglobina, che
deformano i globuli rossi rendendoli fragili.
In base al rapporto che la mutazione ha col tasso di sopravvivenza dellindividuo
pu essere: vantaggiosa, svantaggiosa o neutra.
Oltre alle mutazioni geniche possono verificarsi mutazioni cromosomiche e
mutazioni genomiche, quando riguardano rispettivamente un cromosoma o lintero
patrimonio genetico (spesso incompatibili con la vita).
Agenti mutageni
Pur essendo eventi spontanei, la frequenza delle mutazioni aumentata da fattori
chimici o fisici, detti agenti mutageni. Sono mutageni fisici i raggi uv, i raggi x,
raggi gamma alpha e beta.
Sono mutageni chimici pesticidi e diserbanti.

Soltanto le mutazioni che interessano i gameti possono essere trasmesse alle

generazioni successive.

Regolazione dellespressione genica.

Ogni cellula svolge le sue attivit in modo economico e coordinato, traducendo in
proteine solo i geni necessari a seconda delle circostanze.
Organismi procarioti
La regolazione dellespressione genica avviene a livello della trascrizione, vengono
trascritti in m RNA solo i tratti di DNA corrispondenti alle sequenze geniche che
devono essere tradotte in proteine.
La trascrizione controllata da proteine di regolazione, controllate da geni
regolatori.
Questa proteina pu agire da repressore (quando si lega al DNA bloccando la
trascrizione del gene) oppure da promotore (quando facilita lattacco dellRNApolimerasi al promotore e quindi la trascrizione del gene).
Nei procarioti, la mancanza di nucleo, determina efficienza e semplicit per cui la
trascrizione strettamente legata alla traduzione e lm RNA inizia ad essere
tradotto dai ribosomi prima ancora che la sua sintesi venga terminata.

Lelemento fondamentale nella regolazione genica dei procarioti quello

dellorganizzazione dei geni in operoni: operone un complesso di geni che
vengono regolati in modo strettamente coordinato.
Costituito da un promotore, il sito di attacco dellRNA-polimerasi, un operatore, che
una sequenza di basi e regola lespressione dei geni strutturali, che interagisce
con una proteina repressore o attivatore a seconda che impedisca o stimoli
lespressione, codificata da un gene regolatore.
Sono noti due tipi di operoni.
-

Inducibili: normalmente non espressi, la loro trascrizione richiede la presenza di

un induttore che inattiva il repressore. In un operone inducibile, il repressore
normalmente legato alloperatore, impedendo allRNA-polimerasi di legarsi al
promotore per iniziare la trascrizione. Quando linduttore si lega al repressore
cambiandone la conformazione, questo complesso si stacca dalloperatore
rendendo possibile il legame dellRNA-polimerasi al promotore e di iniziare la
trascrizione.

Es. operone IAC

Il batterio e. coli possiede un meccanismo di controllo che consente lespressio di
alcuni geni solo quando ne avverte il bisogno, e impedisce la produzione di enzimi
e proteine non strettamente necessarie.

Lo zucchero pi adatto al metabolismo di E. Coli il glucosio, tanto che se il

batterio cresce in un substrato che contiene sia Lattosio che Glucosio, questo
utilizza prima unicamente il glucosio e solo successivamente il lattosio. Una volta
esaurite le riserve di glucosio per sintetizza immediatamente gli enzimi necessari
a metabolizzarlo. Questo zucchero funge da induttore, legandosi al repressore,
inattivandolo; lRNA-polimerasi pu cos legarsi al promotore e trascrivere i tre geni
delloperone in blocco, formando ununica molecola di m RNA (LacZ, codifica per
lenzima B-galattosidasi, scinde il lattosio in glucosio e galattosio; LacY, codifica per
la lattosio-permeasi, consente al lattosio di attraversare la membrana cellulare del
batterio; LacA). Il batterio possiede un meccanismo di controllo che consente
lespressione di alcuni geni solo sotto sollecitazione ambientale, e ne impedisce la
produzione quando non necessario.

Reprimibili, normalmente espressi, tranne quando presente un corepressore

che attiva il repressore impedendo allRNA-polimerasi di trascrivere i geni
strutturali delloperone.

Operone trp
Codifica gli enzimi deputati alla sintesi dellamminoacido triptofano in E. Coli. In
assenza di trp loperone attivo e i geni degli enzimi necessari vengono trascritti.
Quando il triptofano presente nel terreno di coltura, si lega al repressore
fungendo quindi da corepressore attivandolo in modo da bloccare la trascrizione.

Regolazione espressione genica negli eucarioti

Il materiale genetico degli eucarioti, non organizzato in operoni, ma da geni
discontinui, esoni e introni. Inoltre, se nei procarioti il controllo dellespressione
genica serve sostanzialmente per produrre proteine necessarie per utilizzare i
nutrienti disponibili nellambiente, negli eucarioti indispensabile per il
differenziamento cellulare. Tutte le cellule dellorganismo pluricellulare derivano
dallo zigote, che dividendosi ripetutamente per mitosi, forma lindividuo adulto.
Nel corso dello sviluppo embrionale, le cellule si differenziano, producendo proteine
diverse che ne caratterizzano la struttura e la funzione.
Anche se tutte le cellule di un organismo contengono lintero programma genetico,
cio sono geneticamente equivalenti , il differenziamento dipende dal fatto che
ogni cellula esprime soltanto i geni che codificano per le sue proteine
caratteristiche.
Gli eucarioti possono regolare lespressione genica controllando i diversi processi
che permettono la traduzione del messaggio genetico in proteine.
-

Controllo conformazionale della cromatina:

la cromatina si presenta in due forme; eucromatina, poco condensata ed
eterocromatina, pi condensata. Ad essere trascritta leurocromatina, pi
accessibile come stampo.
Controllo della trascrizione:
la trascrizione selettiva dei geni il principale meccanismo di regolazione
dellespressione genica: questo controllo coinvolge proteine regolatrici che si
legano a siti specifici sulla molecola di DNA. LRNA-polimerasi si lega a un

promotore; la trascrizione dipende anche dalla presenza di particolari sequenze

dette enhancer (intensificatori) che aumentano la velocit di sintesi dellRNA.
Analogamente, controllata anche dai silencer (inibitori) che ne inibiscono la
trascrizione.
Sono coinvolte anche proteine regolatrici, o fattori di trascrizione, che si legano
al DNA in corrispondenza degli enhancer e dei silencer che possono fungere da
attivatori o inibitori.
Controllo della maturazione e del trasporto dellRNA
Quasi tutti i geni degli eucarioti pluricellulari sono discontinui, formati da
unalternanza di sequenze codificanti (esoni) e non codificanti (introni). Il DNA di
un gene discontinuo viene trascritto completamente, copiando sia esoni che
introni, ma prima che lm RNA lasci il nucleo gli introni vengono eliminati e gli
esoni saldati in sequenza per formare lm RNA maturo (splicing) che migrer nel
citoplasma, mentre lm RNA non maturo resta nel nucleo e verr poi degradato.
Controllo della traduzione:
avviene tramite il legame dellm RNA a proteine inibitrici presenti nel
citoplasma, che impediscono il legame col ribosoma.
Controllo delle modificazioni post-traduzionali:
una volta sintetizzate, le catene polipeptidiche vengono modificate per
determinarne lattivazione e la loro durata di vita nella cellula.

Epigenetica
Riguarda i meccanismi di controllo dellattivit genica che non alterano la sequenza
dei nucleotidi, interessano principalmente la regolazione dellattivit dei genomi.
Un importante meccanismo epigenetico dato dalla condensazione della cromatina,
che coinvolge diverse modifiche epigenetiche. Una di queste la metilazione che
agisce direttamente a livello del DNA (metilazione di alcuni nucleotidi N + CH3, la
metilazione silenzia i geni).
Un importante meccanismo epigenetico la condensazione della cromatina, processo
che coinvolge diverse modifiche epigenetiche: una di queste, la metilazione, agisce
direttamente a livello del DNA; altri meccanismi agiscono sugli istoni o sugli enzimi
che regolano queste proteine.
Le modifiche epigenetiche influiscono su molti aspetti della biologia cellulare e hanno
un ruolo importante in alcune patologie delluomo. Attualmente si ritiene che questi
meccanismi siano coinvolti nello sviluppo embrionale, nella differenziazione delle
cellule staminali, nellorigine dei tumori e nellattivit del sistema immunitario. noto
inoltre che lepigenetica controlli la fioritura e lo sviluppo del seme nella pianta.

Tecnologie del DNA

Lingegneria genetica comprende i metodi che permettono di modificare in modo
mirato il patrimonio genetico di un organismo.
Per ottenere brevi tratti di DNA contenenti i geni che si vogliono studiare, si impiegano
enzimi di restrizione, in grado di tagliare il DNA in corrispondenza di sequenze
specifiche, dette siti di restrizione, formate da 4-8 coppie di basi.
Per separare e analizzare i frammenti di DNA si usa lelettroforesi su gel. Si pone il
campione trattato con lenzima (o la miscela) di enzimi di restrizione a unestremit di

una piastra ricoperta di gel (agarosio, poliacrilammide..), poi si applica un determinato

voltaggio ai due lati della piastra gelificata.
I frammenti di DNA (carichi negativamente) migrano verso lelettrodo positivo a una
velocit inversamente proporzionale la loro lunghezza, ostacolati dalla matrice del gel.
Dopo alcune ore i frammenti di DNA si distribuiranno in diverse bande, ognuna
contenente frammenti di lunghezza simile. Le bande sarebbero invisibili, sul gel, ma
vengono rese evidenti trattando il campione con coloranti che si legano al DNA e lo
rendono fluorescente, oppure con un isotopo radioattivo del fosforo che entra nella
composizione dei nucleotidi.
Trattando un tessuto con un certo enzima di restrizione si ottengono sempre gli stessi
frammenti di DNA.
La presenza di frammenti di lunghezza diversa indica unanomalia nel DNA, spesso
correlabile a mutazioni genetiche; una mutazione pu modificare o eliminare un sito di
restrizione. I frammenti di lunghezza diversa vengono ricercati per diagnosticare
alcune malattie genetiche.
Il progetto pi importante quello dellidentificazione di tutti i geni umani, della loro
sequenza, della loro localizzazione sui cromosomi. I risultati attesi dallanalisi del
genoma umano sono le definizioni delle correlazioni fra determinate patologie e
specifiche alterazioni genetiche. Questa conoscenza renderebbe molto pi facile
lindividuazione e la cura di numerose malattie.
Il progetto genoma umano consiste nella mappatura dellintero genoma umano che ha
fornito un primo set di risultati nel 2001, ancora in elaborazione. La stima del numero
dei geni umani di 25.000 contro le previsioni di 100.000 circa. Ora che il genoma
stato mappato, lobiettivo di identificare i diversi geni, i loro meccanismi di
regolazione, quali proteine controllano e le loro funzioni.
La proteomica la disciplina che si occupa dello studio di funzioni e struttura di tutte
le proteine codificate dal genoma umano.
La bioinformatica riguarda larchiviazione, analisi e confronto fra sequenze di DNA di
organismi diversi, realizzata con computer.

Clonaggio di un gene
La produzione di una sostanza attraverso lingegneria genetica si articola in 5 tappe:
-

Isolamento del genere che codifica la proteina che si vuole produrre

Costruzione del DNA ricombinante, cio inserimento del gene che interessa nel
DNA vettore
Introduzione del DNA ricombinante in una cellula ospite che si moltiplichi
attivamente
Clonaggio del gene, cio produzione di numerose copie del gene grazie alla
proliferazione della cellula ospite e produzione della proteina
Recupero e purificazione della proteina.

La tecnica del DNA ricombinante possibile grazie alluniversalit del codice genetico
che permette allorganismo ospite di leggere e tradurre, oltre al proprio DNA, anche
quello di un qualsiasi altro organismo.
La produzione del DNA ricombinante resa possibile dagli enzimi di restrizione.
Un frammento di DNA tagliato con un determinato enzima pu unirsi ad un altro
frammento di DNA tagliato con lo stesso enzima perche le due porzioni hanno
estremit adesive complementari.
Le estremit possono essere saldate da un altro enzima, DNA ligaqsi .
Usando un opportuno enzima di restrizione e la DNA ligasi possibile dunque inserire
qualsiasi tratto di DNA, preparato artificialmente o isolato da un organismo, nel DNA di
un organismo diverso, ottenendo un DNA ricombinante.