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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE POZA RICA BIOPROCESOS DOCENTE: DAVID CRUZ ALEJANDRE INTEGRANTES: PONCE LARA ESTHER GUADALUPE
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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE POZA RICA BIOPROCESOS DOCENTE: DAVID CRUZ ALEJANDRE INTEGRANTES: PONCE LARA ESTHER GUADALUPE

INSTITUTO TECNOLÓGICO

SUPERIOR DE POZA RICA

BIOPROCESOS

DOCENTE: DAVID CRUZ ALEJANDRE

INTEGRANTES:

PONCE LARA ESTHER GUADALUPE TÉLLEZ CORTÉS ELVIA

REPORTE DE EXPOSICIÓN

MÉTODOS DE AISLAMIENTO Y DETENCCIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS

Métodos de aislamiento y detección de ADN.

¿QUÉ SON LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS?

Ácidos Nucleicos Definiciones DNA y RNA son polímeros que almacenan y transmiten información del código genético, por otra parte los Nucleótidos son subunidades de DNA o RNA que consisten en un azúcar, un grupo fosfato y una base A, G, C, T o U.

Las Bases se aparean y se mantienen unidas por puentes de hidrógeno C se une a G A se une a T (sólo DNA) A se une a U (sólo RNA).

MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

AISLAMIENTO Y VISUALIZACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Existen dos variedades químicas de ácidos nucleicos: el DNA (ácido desoxirribonucleico) y el RNA (ácido ribonucleico). Generalmente, la información genética se almacena en forma de cromosomas de DNA y se expresa en forma de mRNA (RNA mensajero). Las bacterias son procariontes (sin núcleo celular); por tanto, todos sus ácidos nucleicos se encuentran en el citoplasma.

El cromosoma de las bacterias es de doble cadena (dsDNA), circular y superenrollado. El RNA generalmente se encuentra en forma de cadena sencilla, aunque suele formar estructuras secundarias de doble hélice, por autoapareamiento de regiones complementarias. Existen diversos tipos de RNA ribosómico (rRNA), nombrados de acuerdo con su coeficiente de sedimentación “Svedberg”, que es una medida de su tamaño (peso), conformación y agregación. Una cantidad menor de RNA aunque muy importante para la célula, es el RNA mensajero (mRNA), que existe en una amplia variedad de tamaños: de cientos a miles de bases (b). El mRNA representa la expresión de algunos de los genes contenidos en el DNA cromosómico.

UTILIDAD DE LA PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

El aislamiento y purificación de ácidos nucleicos puede ser analítico o preparativo y tiene diferentes objetivos. Existen diversos métodos de purificación de ácidos nucleicos. Éstos varían según se desee aislar DNA o RNA, así como del grado de pureza requerido. Otro aspecto importante a considerar es el uso de sustancias tóxicas o inocuas.

Uno de los métodos es por un aislamiento rápido por lisis celular. Después se procede a la separación electroforética en gel de agarosa y visualización de dichos

ácidos nucleicos. También se realiza un cálculo aproximado de pesos moleculares (tamaños) del material genético obtenido.

El objetivo de este método es visualizar las diferentes formas moleculares de los mismos, así como determinar su tamaño aproximado y posteriormente desecharlos. Algunos protocolos de purificación de plásmidos utilizan detergentes (como el SDS) para romper las células, álcali (como NaOH) para desnaturalizar el cromosoma bacteriano y las proteínas y sal (como KCl) para favorecer la precipitación de las proteínas y cromosomas.

Recientemente las investigaciones hechas acerca de los ácidos nucleicos han mejorado las técnicas de hibridación de moléculas complementarias ADN-ADN y ARN-ADN. La capacidad de hibridación de los ácidos nucleicos complementarios es la base para desarrollar métodos de diagnóstico de viroides y virus.

Para facilitar la aplicación del método, el ácido nucleico que debe detectarse se fija a un soporte solido (filtro o membrana) para que la sonda en solución pueda hibridarse sobre ese ácido nucleico ya fijado en la membrana. Por esta razón la técnica se conoce también como gota absorbida

ACIDOS NUCLEICOS: CUANTIFICACION

El ADN como el RAN absorben la luz ultravioleta con un pick de absorción a 260 nm.

Mediante el

uso

de

la

ley

de

Lambert-Beer se puede cuantificar la

concentración usando la relación de su absorbancia a esa longitud de onda

LA TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

La tecnología del DNA recombinante es un conjunto de técnicas que permiten analizar y manipular la información genética. Su aparición revoluciono la forma de estudiar la función y estructura de los genes. También posibilito la comprensión de la salud humana, al permitir el diagnóstico preciso de las enfermedades hereditarias.

Las herramientas moleculares y las numerosas técnicas para manipular el DNA permiten cortar y pegar fragmentos del material genético, insertarlos en vectores que los transportan a los hospedadores deseados y posteriormente localizar, secuenciar y modificar esos fragmentos de ácidos nucleicos.

El uso combinado de las herramientas permite obtener clones moleculares- poblaciones de células con construcciones genéticas homogéneas que posibilitan

el estudio de los genes en distintos sistemas y la expresión de proteínas recombinantes específicas.

LA DETECCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS

  • Reacción de la polimerasa en cadena en tiempo real

  • Fluorescencia guiada por luz angulada RITF-LA

  • Hibridación de las cadenas de DNA

REACCIÓN DE LA POLIMERASA EN CADENA

La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) supuso un gran avance y permitió introducir la biología molecular de forma generalizada en los laboratorios asistenciales. Se trata de una reacción enzimática sencilla, rápida y susceptible de ser automatizada. El hecho que complica y alarga extraordinariamente el proceso es la visualización del producto una vez amplificado, que debe hacerse por hibridación en solución o en fase sólida (southern blot). De esta manera, y según nuestra experiencia, se tarda entre 2 a 4 días en poder informar un resultado.

La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR realizada en tiempo real (PCR-RT), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulación ADN al final de un número predeterminado de ciclos, con PCR-RT esto se hace durante el proceso de amplificación usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia.

La incorporación de fluorescencia al proceso de PCR se puede hacer de muy diversas maneras, pero las más utilizadas son colorantes intercalados o bien sondas marcadas. La modalidad más sencilla y económica, si bien la menos específica, es el colorante SYBR Green. Las sondas fluorescentes más usadas son de tres tipos: sondas con actividad 5' nucleasa (TaqMan), molecular beacons y sondas FRET. Las tres se pueden aplicar en microbiología clínica, aunque las sondas FRET son conceptualmente las más complejas.

FLUORESCENCIA GUIADA POR LUZ ANGULADA RITF-LA

El sistema diseñado integra tecnología de punta en las áreas de biología molecular, óptica, electrónica y software embebido en un equipo portátil. La tecnología se vale del empleo de la reflexión interna total de fluorescencia guiada por luz angulada (RITF-LA) que genera una onda evanescente guiada por una luz angulada incidente en un portaobjetos para detectar cadenas de ácidos nucleicos, empleando sondas de oligonucleótidos en forma de faros moleculares (FM) impresos sobre vidrios a manera de microarreglos. El equipo es portátil, lo que permite que este se emplee en hospitales, centros de salud, aeropuertos y otras áreas de concentración humana en los que se

requiera diagnóstico inmediato. Revela la presencia de ácidos nucleicos de interés en el rango de segundos.

El mercado de la biomedicina está necesitado de nuevos sistemas de detección que posibiliten su utilización masiva en la práctica sanitaria, dando pasos hacia la medicina personalizada. La investigación en genómica y farmacogenómica precisa de tecnología para la detección de ADN de elevada sensibilidad y fiabilidad a un costo razonable.

HIBRIDACIÓN DE LAS CADENAS DE ADN

La hibridación del ADN (unión de dos hebras complementarias de ADN) es el proceso más común para analizar y detectar un gen particular o un segmento de un ácido nucleico. Dentro de los métodos basados en hibridación, los bío-sensores (instrumento para la medición de parámetros biológicos) de ADN.

El acoplamiento entre estos bío-sensores de ADN y las técnicas de amplificación por PCR pueden proporcionar una gran sensibilidad para la detección de secuencias de ácidos nucleicos (ADN y ARN).

Bibliografía