VISUALIZACION DE ACIDOS NUCLEICOS POR ELECTROFORESIS

CARLOS CARPIO ZABALETA1 OSNAIDER CASTILLO CONTRERAS1 DAVID

ESTRADA REYES1
RESUMEN
La experiencia realizada tuvo como objetivo visualizar mediante electroforesis en
gel de agarosa extractos de ADN para adquirir destreza en la preparacin de geles
de agarosa y la siembra de muestras para realizar electroforesis. Para esto fue
necesario preparar el gel de agarosa en el que se correra las muestras de ADN
obtenido durante experiencias realizadas con anterioridad. De igual manera fue
necesaria la preparacin de un bfer de corrido. Para poder visualizar el ADN,
terminada la electroforesis, se adiciono con antelacin sybr safe para que este le
confiriera el carcter fluorescente que se observa finalizada la experiencia. Se
pudo notar que hubo muchas diferencias en los resultados obtenidos por cada
grupo de trabajo por lo que no es posible hablar de manera concluyente. No sobra
decir que la electroforesis es una buena tcnica de visualizacin de cidos
nucleicos si se realiza de manera exitosa la extraccin y montaje de dichas
molculas.
Palabras claves: electroforesis, bfer de carga, fluorescencia, cargas elctricas,
fotodocumentador.

INTRODUCCIN
La concentracin e integridad del
ADN extrado, as como el tamao de
distintos fragmentos de ADN (por
ejemplo, productos de PCR) pueden
ser
verificadas
mediante
electroforesis en geles de agarosa o
poliacrilamida.
La electroforesis
consiste en la separacin de
molculas (protenas, isoenzimas,
cidos nucleicos) a travs de una
matriz
tamponada
(agarosa,
acrilamida, almidn). La matriz
funciona como un filtro, separando las
molculas en un campo elctrico, de

acuerdo al tamao y la carga neta

que poseen. En el caso de los cidos
nucleicos, el grupo fosfato es el
responsable por la fuerte carga
negativa en condiciones de pH
neutro, haciendo que los fragmentos
migren hacia el polo positivo (nodo)
durante la electroforesis (Posso y
Ghneim 2008).
Los cidos nucledos separados en
geles de agarosa pueden visualizarse
mediante tincin con colorantes
fluorescentes, lo cual permite evaluar
su
integridad
y
estimar
su
concentracin mediante un anlisis

2. Estudiantes de sexto semestre de biologa de la universidad de sucre.

comparativo
con
patrones
de
concentracin
conocida.
Los
colorantes
fluorescentes
actan
mediante insercin entre las pares de
bases que conforman el cido
nucleico. El bromuro de etidio es
ampliamente
utilizado
para
la
visualizacin de ADN y ARN. Sin
embargo, ste es un reactivo
altamente txico, con propiedades
mutagnicas, por lo que debe ser
manejado con extremo cuidado en el
laboratorio. En la actualidad existen
colorantes fluorescentes alternativos,
como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR
Green I, Vistra Green y Syto60,
desarrollados especficamente para
reducir los riesgos potenciales de
mutagnesis.
La tcnica para la cuantificacin de
ADN consiste simplemente en la
utilizacin de una secuencia de
concentraciones de solucin patrn
de ADN con la que se comparan
muestras de ADN de concentracin
desconocida. El clculo de las
concentraciones se hace bajo la luz
ultravioleta segn la fluorescencia.
Debe evitarse
la exposicin
prolongada a la luz ultravioleta,
incluso con mscara de proteccin.
La estimacin de las concentraciones
de ADN puede realizarse sobre una
fotografa digital del gel tomada bajo
luz ultravioleta si se cuenta con un
analizador de imgenes (Posso y
Ghneim op cit.).
La concentracin de agarosa y el
voltaje con los que se debe trabajar

depende del tamao del segmento de

ADN que se quiera visualizar. Los
segmentos de gran tamao, el del
ADN total (proveniente de una
extraccin de ADN), deben trabajarse
con concentraciones del 0.8% y a
voltajes de 60V para evitar la
fragmentacin del mismo. Los
segmentos de 1500pb en adelante
con geles al 1%, los segmentos de
500pb a 1500pb en geles 1,5% o 2%
y los pequeos segmentos de 100pb
a 500pb (los microsatlites por
ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para
estos el voltaje puede variar de 20V a
120V de pendiendo de la velocidad a
la que quiera que migre el ADN, a
voltajes elevados ms rpido corren
las muestras.

METODOLOGIA
Para
la
realizacin
de
esta
experiencia
fue
necesaria
la
preparacin del bfer de corrido 0.5X
(26 ml de solucin madre TBE 5X en
180 ml de agua destilada) y del gel de
agarosa 1% (0.4 gr de agarosa pura
en 40 ml de solucin TBE 0.5X). El
pesaje de las cantidades necesarias
de cada sustancia se realizo en una
balanza analtica METTLER Toledo y
para la preparacin del gel (se debe
hacer la disolucin en presencia de
calor) se utilizo una estufa VLPE
scientifica.
Luego
de
realizadas
las
preparaciones
mencionadas
anteriormente, se llevo a cabo el

ensamble de el plato de electroforesis

(se utilizo un tanque de electroforesis
Labnet internacional) verificando que
la bandeja se encuentre ubicada en
una superficie plana y nivelada; y se
coloco el peine que creara los posos
donde se adicionaran las muestras
que se van a correr. A continuacin,
se le adiciono al gel, aun en estado
liquido, 2 L de sybr safe y con
mucho cuidado se deposito el gel
dentro del tanque de electroforesis
teniendo cuidado de no formar
burbujas. Se dejo enfriar la mezcla
hasta que el gel se solidificara. Mas
tarde se lleno el tanque de
electroforesis con el bfer de corrido
TBE 0.5X hasta superar el nivel del
gel. Luego se retiro el peine que se
utilizo para la formacin de los posos.
En un papel parafilm, se mezclo 1/5
de bfer de carga con 4/5 de la
muestra problema (2 L de bfer de
carga con 8 L de la solucin
problema) para si depositarlos en los
posos. Las muestras a correr
corresponden
a
las
obtenidas
mediante las experiencias anteriores
(lisados crudos, extraccin por
solubilidad de fases inmiscibles y
extraccin
de
una
muestra
sangunea). Cada grupo de trabajo
deposito en los posos las muestras
que cada uno obtuvo en el orden en
el que se mencionaron anteriormente.
Todo esto con el fin de saber que tipo
de extraccin de ADN es la de mayor
eficiencia.
No
se
utilizaron
marcadores de peso molecular (los
resultados
se
analizaran

cualitativamente). Se instalaron los

electrodos en la cmara y se
sometieron las muestras ha corrido
durante 40 minutos a 85 v.
transcurrido este tiempo se retiro el
gel
y
se
coloco
en
un
fotodocumentador para visualizar la
presencia de ADN en cada uno de los
carriles donde se sembr las
muestras. Se tomaron fotografas
para su posterior anlisis.

RESULTADOS Y DISCUSION
La electroforesis en gel de agarosa
es de las ms utilizadas para analizar
y caracterizar cidos nucleicos de
distintas procedencias. Los geles se
comportan como un tamiz molecular y
permiten separar molculas cargadas
en funcin de su tamao y forma. As,
molculas de DNA de diferente
tamao van a emigrar de forma
distinta en una electroforesis en gel
de agarosa. Para preparar el buffer
de corrido y el gel de agarosa se
utilizo TBE 5X (Tris-borato-EDTA),
que mantiene unas condiciones de
pH adecuadas, facilita la solubilidad
del ADN y evita su degradacin, as
las molculas de ADN se mueven
hacia el polo positivo de la cmara de
electroforesis. El buffer de carga nos
indica donde va la muestra mientras
corre en la cmara de electroforesis,
esto es debido a que le da coloracin
a la muestra y adems peso. La
presencia del agente intercalante, en
este caso el Sybr safe, es un
colorante
fluorescente
que
se
introduce en las bases del ADN
(agente intercalante), proporcionando
una mayor visualizacin al momento
de someter la muestra a los rayos UV.

Finalizada la electroforesis se llevo el

gel de agarosa con las muestras a un
fotodocumentador, donde se observo
el recorrido del ADN de cada carril,
mediante luz UV.

A
continuacin
se
presentan
fotografas de dicha prueba:

Imagen 1

Imagen 2

Imagen 3

Tenidas a vista las muestras

sometidas
a
la
cmara
de
electroforesis, se logra identificar el
recorrido del ADN de las muestras
(lisados crudos, faces inmiscibles y
sangre). En las muestras sometidas
a la electroforesis se pueden
observar en algunos una cantidad
considerable de DNA, mientras que
en otras no se logra observar corrido
alguno de la molcula, adems de
esto se nota gran variabilidad entre
mtodos de extraccin de cidos
nucleicos, especficamente de DNA.
No obstante, se logra visualizar una
mayor cantidad de DNA con el
mtodo de lisados crudos en las
extracciones realizadas por nuestro
grupo (sealadas por el recuadro de
la imagen 1), lo cual, no era el
resultado que se esperaba debido a

que esta tcnica es la mas bsica de

todas la tres utilizadas, esta tcnica
no incluye en su procedimiento una
previa maceracin para destruccin
de la membrana celular que facilita un
poco el absceso al material nuclear,
no obstante se le adiciono buffer de
lisis (compuesto por soluciones como
EDTA, que es un agente quelante
que inactiva enzimas como las
desoxiribonucleasas; el Tris-HCl,
utilizada para regular el pH; SDS,
necesaria para destruir enlaces no
covalentes). El resultado obtenido de
las extracciones hechas por nuestro
grupo de trabajo (carriles encerrados
por
rectngulo),
sea,
mayor
visualizacin de ADN en lisados
crudos, es un poco desfavorable para
nuestro anlisis de comparacin de
mtodos de extraccin de DNA por

electroforesis, pero deja denotado

que el buffer de lisis funcion
correctamente. Pero tambin deja al
descubierto que en los restantes dos
mtodos hubo errores de parte de los
estudiantes en los procedimiento.
El mejor mtodo de extraccin debi
ser el utilizado para la sangre,
seguido de fases inmiscibles. La
electroforesis
realizada
a
las
muestras de todos los grupos
muestran mucha variabilidad, y con
respecto a los resultados no es
posible generalizar y decir cual es el
mejor mtodo de extraccin.

anlisis. Es necesario realizar los

procedimientos de estos mtodos con
supremo cuidado.

BIBLIOGRAFIA

CONCLUSION
La electroforesis es un mtodo de
laboratorio en el que se utiliza una
corriente elctrica controlada con la
finalidad de separar biomolculas
(como DNA, en este caso) segn su
tamao y carga elctrica a travs de
una matriz gelatinosa (en este caso
gel de agarosa). Adems si se quiere
saber cual de los mtodos de
extraccin de DNA es el mejor, la
electroforesis es muy til para estos

Posso
Duque,
Duina.
Protocolos de laboratorio UEG.
Electroforesis del ADN en
geles de agarosa. 2009.
Consultada
en
http://www.ivic.ve/ecologia/ueg/
formatos/Electroforesis%20de
%20ADN%20en%20geles
%20de%20agarosa.pdf el da
20 de enero del 2012.
Universidad
javeriana
de
Colombia: facultad de ciencias.
Electroforesis. Consultada en
http://javeriana.edu.co/Faculta
des/Ciencias/neurobioquimica/l
ibros/celular/electroforesis.html
el da 20 de enero del 2012.