EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE TEJIDOS VEGETALES

CARLOS CARPIO ZABALETA1 OSNAIDER CASTILLO CONTRERAS1 DAVID

ESTRADA REYES1
RESUMEN
El objetivo de esta experiencia es la extraccin de ADN a partir de tejidos
vegetales, por lo que es necesario realizar primero la destruccin de la pared
celular a travs de la exposicin de los tejidos a bajas temperaturas y adicin de
bfer de lisis para su posterior maceracin. Se utilizo cloroformo y alcohol
isoamilico para la separacin del ADN de los dems contenidos citoplasmticos y
nucleares; de igual manera se realizaron lavados con etanol frio a distintas
concentraciones para eliminar cualquier impureza. En conclusin, esta extraccin
es de mayor eficacia ya que es la combinacin de dos mtodos de extraccin.
Palabras claves: tejidos vegetales, pared celular, ADN, lisis, bfer de lisis.

INTRODUCCION
El ADN se encuentra en el interior del
ncleo de todas las clulas, disperso
y muy replegado, unido a protenas
para formar la cromatina. Por lo tanto,
podremos extraerlo a partir de
prcticamente cualquier material de
origen biolgico. Para ello es
necesario homogeneizar el tejido
disgregndolo y separando sus
clulas y dems componentes, luego
romper las clulas para separar el
ncleo y romper ste para liberar el
ADN, separarlo de las protenas y
precipitarlo para separarlo de la
solucin acuosa.
La extraccin de ADN requiere una
serie de etapas bsicas: En primer
lugar tiene que romperse la pared
celular y la membrana plasmtica
para poder acceder al ncleo de la

clula. A continuacin debe romperse

tambin la membrana nuclear para
dejar libre el ADN. Los jabones
utilizados
como
lavavajillas
emulsionan
los lpidos de las
membranas celulares y las rompen.
La sal evita la unin de las protenas
al ADN. Para aislar el ADN hay que
hacer que precipite en alcohol. El
ADN es soluble en agua, pero cuando
se encuentra en alcohol se desenrolla
y precipita en la interfase entre el
alcohol y el agua. Adems de
permitirnos ver el ADN, el alcohol
separa el ADN de otros componentes
celulares, los cuales son dejados en
la solucin acuosa.

METODOLOGIA
En esta practica se necesito 50 mg
de tejido vegetal el cual se trituro y

deposito en un tubo eppendorf de 1.5

ml que se refrigero posteriormente
por 15 minutos a 80, luego se
macero en seco usando un
micropistilo, agregamos 200 L de
bfer de lisis (NaCl 0.88 M, EDTA
0.06 M, SDS 0.5% v/v, Tris-HCl 0.1 M
a pH 7.5) y se macero nuevamente.
Despus de este proceso se incubo
la muestra en bloque seco (labnet
accublokle) a 80C por 10 minutos;
pasado este tiempo se le adiciono 48
L de acetato de potasio 8 M y se
deposito en hielo por 30 minutos,
luego se centrifugo la muestra a
12000 rpm por 10 minutos; se
recupero
luego
200
L
del
sobrenadante y se transfiri a un
nuevo tubo. A este se le agrego 200
L de cloroformo alcohol isoamilico
(24:1) que fueron agitados en el
vortex (maxi maxi, thermolyne) por 1
minuto, se dejo reposar por 5 minutos
a temperatura ambiente y se
centrifugo a 1200 rpm, despus se
transfiri 150 L del sobrenadante a
un tubo nuevo y se le agrego 300 L
de etanol absoluto y se guardo a
20C. al da siguiente se centrifugo
1200 rpm a 4c por 10 minutos, se
verti el alcohol y se enjuago el
precipitado usando 200 L de alcohol
al 70% frio, se centrifugo a 12000 rpm
por 10 ml. Se descarto el
sobrenadante y se repiti el proceso
de lavado usando esta vez 200 L de
alcohol absoluto frio bajo las mismas
condiciones del paso anterior. Por
ultimo se dejo evaporar el alcohol y
se resuspendido en 100 L de agua
ultrapura.

RESULTADOS Y ANALISIS
Para la extraccin de cidos
nucleicos en tejidos vegetales se
requiere
una
maceracin
mas
prolongada que la de las clulas
animales, esto debido a que los
tejidos de plantas son robustos y
requieren por lo tanto tratamientos
intensivos
tales
como
largas
incubaciones enzimticas. Algunos de
estos problemas pueden superarse
en parte usando tejidos jvenes. Al
enfriarse la muestra, se endurece el
tejido
volvindose
mas solido,
adems se cristaliza el agua presente
en las paredes y membranas de las
clulas, estos cristales filosos, el
material un poco solido mas la
maceracin ocasionan una mejor
destruccin de los materiales que son
contaminantes para extraer DNA
puro.
El
proceso fue
complementado con la adicin de un
buffer de lisis que contena EDTA
(etilendiaminotetracetico) con el cual
se eliminaron cationes divalentes y
desestabilizaron
los
otros
componentes de la membrana y
pared celular; y un detergente como
SDS
(sodio
dodecil
sulfato),
encargado de solubilizar los lpidos
de la membrana celular, adems de
esto contena NaCl (cloruro de sodio)
que tambin contribuye a la lisis de
material contaminante. La muestra
fue sometida a una temperatura
elevada para desnaturalizacin de
enzimas y protenas. Todo esto es
necesario para limpiar la muestra
de:
polisacridos,
compuestos

fenlicos (producto de la fotosntesis),

polipptidos
y
metabolitos
secundarios que dificulta e interfieren
en el proceso de extraccin y se coprecipitan junto al DNA, tornando
estas
precipitaciones
altamente
viscosas y refractarias a muchas de
las
reacciones
mediadas
por
catalizadores.
Cloroformo:alcohol isoamilico nos
permite seguir con la extraccin, esta
solucin alcalina es inmiscibles en
agua por lo que forma dos capas
cuando se adiciona al extracto celular
(en este caso, material vegetal),
cuando esta mezcla es agitada
fuertemente
las
protenas
son
desnaturalizadas y precipitadas a la
interfase, mientras que el ADN
deseado se muestra en la fase
liquida. Adems de esto, se continu
centrifugando para remover restos
celulares
y
recuperar
cidos
nucleicos precipitados.

Imagen 1: maceracin del tejido

vegetal luego de ser expuesto a bajas
temperaturas.

Imagen 2: tejido vegetal luego de la

maceracin.

El etanol utilizado en esta extraccin

permite eliminar trazas de cloroformo
y/o alcohol isoamilico, adems por
centrifugacin nuestro ADN de la
muestra se precipita y se concentrara
en el fondo del tubo. El enjuague con
etanol absoluto asegura un ADN sin
contaminantes. Al final se somete la
muestra en agua UP (ultrapura), para
conservacin e hidratacin del DNA
para anlisis electrofortico.
Imagen 3: mezclado en vortex para
una mejor extraccin.

BIBLIOGARFIA

Imagen 4: extracto luego de

adicionado el coloroformo:alcohol
isoamilico.
CONCLUSIN
De
esta
experiencia
podemos
concluir que este mtodo de
extraccin es el que mejor resultados
debe arrojar ya que de cierta manera
es la combinacin de dos mtodos de
extraccin (extraccin de cidos
nucleicos en fases inmiscibles y
extraccin por altas concentraciones
de sales).

Extraccin
de
ADN.
En
http://www.educa.madrid.org/w
eb/ies.antoniogala.mostoles/de
p_bio_archivos/EXTRACCION
_DE_ADN.pdf. Consultado el
da 8 de febrero del 2012.

Puerta,C y Urea, C. Prcticas

de biologa molecular. Editorial
pontificia
universidad
javeriana.
En
P.http://books.google.com.co/b
ooks?
id=pTrKpnFClZQC&pg=PA16&l
pg=PA16&dq=cloroformo+alco
hol+isoamilico&source=bl&ots=
1SsjnL9W7j&sig=YJ2GfjR9tPA
V2UQHyXW95ImpF0&hl=es&sa=X&ei=49YzT
8PUL8OtgwenzMDsAQ&ved=0
CD4Q6AEwAw#v=onepage&q
&f=false. Consultado el da 9
de febrero del 2012.