Aplicaciones de La Ingeniería Genética

UNIVERSIDAD DE CALDAS
FACULTAD DE INGENIERA
INGENIERA
GENTICA
Asignatura: Biotecnologa
Programa: Ingeniera de Alimentos
Docente : scar Julin Snchez Toro, Ing.
Qum., M.Sc., Ph.D.
Universidad de Caldas
Facultad de Ingeniera
Principio de la Ingeniera Gentica
Estructura del ADN:
Nuclotidos
Docente: scar Julin Snchez Toro, Ph.D.
Estructura del ADN:
Nuclotidos
Estructura del ADN:
Nuclotidos
Estructura del ADN: Doble Hlice
Replicacin del ADN
ADN y ARN
ADN:
Adenina, Guanina, Citosina, Timina
Azcar Desoxirribosa
ARN:
Adenina, Guanina, Citosina, Uracilo
Azcar Ribosa
ADN de una clula procaritica
El ADN flota libremente en el

citoplasma junto con los ribosomas
y el resto del material celular
ADN de un organismo eucaritico
Cromosoma
Telmero
Ncleo
Centrmero
Telmero
Clula
Histonas
Pares de
Bases
Doble Hlice
de ADN
Un gen
Un gen es una secuencia de nucletidos (fragmento de ADN)
que codifica la formacin de una protena
Biosntesis de Protenas I
1. El ADN se encuentra
en el ncleo, mientras en
el citoplasma se
encuentran los
aminocidos
2. La ARN-polimerasa se
desliza por el ADN hasta
que encuentra un gen y
se inicia la formacin de
ARNm (transcripcin)
Biosntesis de Protenas II
3. El ARNm sale al
citoplasma a travs de los
poros nucleares. En el
citoplasma cada
aminocido est ligado a
una molcula de ARNt
4. El ARNm empieza a
deslizarse por el ribosoma, el
cual va uniendo los
aminocidos de acuerdo a la
secuencia codificada en el gen
original (traduccin)
Bionsntesis de Protenas III

El Cdigo Gentico
El Dogma
Central de la
Biologa
Molecular
Esquema General de la Biosntesis de Protenas
Organizacin de un Gen
Promotor: Secuencia de ADN que le indica a la ARN polimerasa

dnde se inicia la transcripcin
Regin Codificante: Secuencia que porta la informacin que
codifica la sucesin de aminocidos en la protena
Secuencia de Terminacin: Fragmento de ADN que le indica a la
ARN polimerasa dnde termina la protena, lo cual evita que se
lea el cromosoma entero cuando slo se necesita producir una
protena
Enzimas utilizadas en Biologa Molecular

Endonucleasas de Restriccin (Restrictasas)
Las endonucleasas de restriccin son enzimas que
cortan el esqueleto de azcar-fosfato del ADN
En la mayora de los casos, cortan el ADN en ambas
cadenas de la doble hlice
Los sustratos de estas enzimas son secuencias
especficas de ADN. Estas secuencias son
palindrmicas:
dbale arroz a la zorra el abad
Endonucleasas de Restriccin
Secuencias palindrmicas
de algunas restrictasas
(sitios de restriccin)
Tipos de corte de las

restrictasas
1. Extremos cohesivos (Sticky ends)
2. Extremos lisos (Blunt ends)

Ligasas
Las ligasas son enzimas que unen fragmentos
alineados de ADN
Las ligasas catalizan la formacin de enlaces
covalentes entre los fragmentos de ADN

Transcriptasa Inversa
Las transcriptasas inversas permiten la sntesis de de
ADN a partir de una cadena de ARNm
Estas enzimas son usadas por los retrovirus para
infectar el genoma de las bacterias

ADN Polimerasas
Las ADN polimerasas forman una cadena de ADN
complementaria a otra cadena de ADN matriz, que le
sirve de molde
Para el trabajo de la ADN polimerasa son necesarios
fragmentos pequeos de ADN que inicien la reaccin,
llamados primers (cebos), adems de que en el sistema
existan los nucletidos correspondientes
Plsmidos
Los plsmidos son cadenas de ADN circulares
con las siguientes propiedades:
n
Son replicables
Poseen una secuencia que marca el inicio
de la replicacin (ori )
Contienen varios genes
Pueden transferirse de una bacteria a otra
Plsmidos
Los plsmidos codifican
informacin que no es vital
para el funcionamiento de
las bacterias, pero que les
confiere ciertas
propiedades como la
resistencia a determinados
antibiticos
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Regin de ADN de inters
1.
El ADN se desnaturaliza. L os prim ers atacan
cada hilo. Se sintetiza un nuevo hilo de ADN
detrs de los prim ers sobre cada cadena matriz
2.
Otra fase: el ADN se
desnaturaliza, los prim ers se
adhieren, y el nmero de hilos
de ADN se duplica
3.
de ADN se duplica
4.
de ADN se duplica
5.
L as continuas fases de amplificacin producen velozmente
un gran nmero de fragmentos idnticos. Cada fragmento
contiene el ADN de la regin de inters
Anlisis de ADN
ELECTROFORESIS
La Electroforesis en Gel es una tcnica que separa las molculas de
ADN con base en su tamao.
El gel est generalmente elaborado de agarosa y es conectado a
electrodos, los cuales generan un campo elctrico.
La carga del ADN es negativa, por lo que los fragmentos se ubican en
unos orificios y viajan del polo (-) al polo (+)
HIBRIDIZACIN
Se sintetizan secuencias pequeas de
ADN y se mezclan con fragmentos
desnaturalizados de ADN que les sean
complementarios
SECUENCIACIN
Por mtodos qumicos se identifican
cada uno de los nucletidos que
componen la secuencia de un fragmento
de ADN
Tecnologa del ADN Recombinante I

La Tecnologa del ADN Recombinante (Ingeniera Gentica) depende de
la habilidad de los investigadores para:
Obtener gran cantidad de molculas polimricas de ADN
Las molculas de ADN se pueden propagar mediante
plsmidos o bacterifagos
Se han desarrollado una gran variedad de vectores
Manipular el ADN in vitro, generalmente mediante enzimas
Cortar secuencias de ADN en sitios especficos para
obtener fragmentos determinados usando restrictasas
Unir de nuevo estos fragmentos para obtener nuevos
arreglos de ADN usando ligasas
Sintetizar qumicamente nuevas secuencias de ADN
Replicar secuencias especficas in vitro usando la PCR
Analizar secuencias de ADN por tamao y por secuencia
Tecnologa del ADN Recombinante II

La Tecnologa del ADN Recombinante (Ingeniera Gentica) depende de
la habilidad de los investigadores para:
Identificar clones que:
Contengan un gen funcional en particular
Contengan una secuencia de ADN en particular
Produzcan una protena en particular
Expresar macromolculas para estudios in vitro
Crear nuevos organismos modificados genticamente
Etapas en la Tecnologa del ADN Recombinante

Etapa 1: Seleccin del Hospedero
E l hospedero debe tener en lo posible un genoma simple
El hospedero no debe ser patgeno
El hospedero debe ser fcilmente transformable
Debe tener un nivel bajo de enzimas de restriccin
Microorganismos ms comnmente utilizados como
hospederos:
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae
10

Etapa 2: Aislamiento del Gen
Aislamiento directo a partir del ADN total
Se usa para el caso de genes bacterianos o fngicos
Implica el fraccionamiento del ADN total del
microorganismo y su posterior identificacin
Genotecas (bibliotecas de genes)
Genes de microorganismos, clulas vegetales y
animales
Obtencin de genes a partir del ARNm
Obtencin de genes de organismos eucariticos
Se utiliza la transcriptasa inversa
Sntesis qumica
Unin qumica de los nuclotidos hasta formar
fragmentos de ADN que codifique la protena de inters
Se debe conocer previamente la secuencia de ADN del
gen o de aminocidos de la protena que el gen codifica

Etapa 3: Obtencin del Vector Recombinante in vitro
Un vector es una molcula de ADN que se utiliza para la
introduccin de un gen extrao de una protena en las
clulas del hospedero.
Los vectores deben cumplir los siguientes requisitos:
Deben poderse replicar (deben ser replicones)
Deben tener uno o ms marcadores selectivos que permitan
identificar las clulas que los contienen
Deben poderse separar fcilmente de los cromosomas
Deben tener porciones de ADN que no sean esenciales para
su replicacin
Deben tener como mnimo un site de restriccin nico
En el caso de los vectores de expresin, deben tener
promotores regulables
El plsmido pBR 322
Este plsmido ha sido extrado de Escherichia coli y tiene

alrededor de 4000 pares de bases nitrogenadas
11
Obtencin del Vector Recombinante
Etapa 4. Transformacin de las Clulas del

Hospedero
Las clulas del hospedero se tratan para obtener clulas

competentes:
- Se adicionan sales como MgCl2 y KCl
- Se mantienen las clulas a temperaturas de 4C
- Despus de este tratamiento se agregan los plsmidos
- Se utiliza tambin enzimas como la lisozima
- El rendimiento de este mtodo es del 2-3%
Etapa 5. Identificacin de los Microorganismos

Recombinantes
12
Etapa 5. Expresin del Gen
Las clulas recombinantes se transfieren a cultivos lquidos hasta

llegar al nivel de los fermentadores industriales
Se cultivan las clulas hasta la fase exponencial
Se induce el gen mediante tratamiento trmico o con ayuda de
sustancias qumicas
Se lleva a cabo la separacin y purificacin del producto
recombinante
El primer producto recombinante

autorizado: la Insulina
Algunos Productos Tradicionales

de la Ingeniera Gentica
n
n
n
n
n
n
n
Insulina
Interfern
Vacuna hepatitis B
Hormona de crecimiento humano
Renina recombinante
Amilasas y proteasas industriales
Somatotropina bovina
13
Ingeniera Gentica de Plantas

El objetivo de la IG de plantas es el mejoramiento de cultivos de
importancia econmica y la obtencin de nuevas variedades de
plantas con caractersticas totalmente nuevas como:
n Aumento en la productividad y la fertilidad
n Resistencia a insectos
n Resistencia al uso de herbicidas
n Adaptacin de las plantas a otras condiciones de cultivo
n Obtencin de alimentos con mejores propiedades nutricionales
n Obtencin de alimentos con mayor vida de anaquel
n Obtencin de metabolitos secundarios
Tcnicas Tradicionales de
Mejoramiento de Cultivos
n
Seleccin de los mejores individuos y

almacenamiento de sus semillas para utilizarlas en
la siguiente cosecha
Seleccin y cruce de los mejores individuos para la

obtencin de combinaciones genotpicas
superiores
n
n
n
Slo se puede hacer entre la misma especie o especies

muy similares con organismos de diferente sexo
Las nuevas cualidades se limitan a las que ya existen en
la especie que se cruza
Algunas caractersticas no deseadas se incorporan a los
individuos obtenidos por cruce
Ventajas de la Ingeniera Gentica de

Plantas para el Mejoramiento de Cultivos
n Se incorporan genes a las
plantas con informacin
especfica
n Slo se confiere la
cualidad o caracterstica
deseada
Cualidades, como el color de los
granos, son controladas por el
n No es necesario el cruce
ADN
entre plantas, por lo que
la barrera sexual entre
especies se supera
14
Etapas de la Ingeniera Gentica de Plantas

Etapa 1. Extraccin del ADN
Se toman los tejidos vegetales y se
maceran para romper las clulas
Se disuelve el ADN en soluciones acuosas
bufferadas
Se purifica el ADN mediante la extraccin
con solventes orgnicos en los que otras
molculas como grasas y protenas se
disuelven
Se separa la solucin acuosa de ADN y se
precipita agregando alcohol. El ADN
adquiere una consistencia semislida de
hilo
El ADN se deposita en tubos de ensayo
con una solucin buffer dbil que se puede
almacenar por largos perodos de tiempo
Maceracin del tejido

vegetal para liberar el ADN
ADN extrado de
soya despus de su
precipitacin

Etapa 2. Clonacin de los Genes
Se conforma una genoteca con el
ADN del organismo del cual se va a
extraer el gen de inters
Etapa 3. Diseo del Gen
Utilizando enzimas de restriccin se puede
cambiar la secuencia de los genes con el fin
de obtener una caracterstica en especial
Se pueden utilizar diferentes promotores
para regular la expresin de los genes
Al reemplazar el promotor
35S por PEP Carboxilasa,
la protena se expresa slo
en los tejidos verdes
El promotor 35S hace que el gen se exprese en

todos los tejidos todo el tiempo
El promotor PEP Carboxilasa hace que el gen se
exprese slo en los tejidos verdes de la planta y
cuando fotosintetiza con mayor actividad

Etapa 4. Transformacin de las Plantas
Es imposible transformar cada una de las clulas de una planta
Se usan cultivos de tejidos vegetales que consisten en la
propagacin masiva de clulas no diferenciadas (callo)
El ADN con el gen de inters se integra en los cromosomas de las
plantas
Tcnicas usadas:
Pistola Gentica
Agrobacterium
Microfibras
Electroporacin
15
Pistola Gentica
Partculas microscpicas de
oro o de tungsteno se
recubren con cientos de
copias de ADN
Las clulas del cultivo de
tejidos se ubican en una
cmara al vaco
Las partculas de metal son
impulsadas por gas a alta
presin que es liberado con
una explosin sbita parecida
a una pistola de aire
Las partculas se disparan
sobre cajas de petri con las
clulas vegetales
Las clulas del callo son

bombardeadas con partculas
metlicas recubiertas con
ADN
Empleo de Agrobacterium
La bacteria Agrobacterium
tumefaciens se introduce en un
cultivo de callo para que
modifique las clulas
vegetales
Agrobacterium tumefaciens es un
ingeniero gentico natural
Esta bacteria del suelo logra
insertar sus genes en los
cromosomas de las plantas y las
obliga a producir metabolitos
necesarios para el desarrollo de
la bacteria
Si se introducen plsmidos
recombinantes en Agrobacterium,
se pueden insertar genes de
inters en las plantas
Transformacin de Plantas con ayuda de

Agrobacterium tumefaciens
16
Microfibras
Se usan fibras microscpicas en forma de finsimas agujas
Se mezclan en un tubo las clulas del callo, cientos de copias
del gen de inters y las microfibras y se agita vigorosamente el
sistema
Las agujas pinchan las clulas vegetales y potencialmente
envan el gen de inters al ncleo de las clulas sin matarlas
Electroporacin
Se emplean impulsos cortos de electricidad para abrir los
pequeos poros de la pared celular de las clulas vegetales
Al mezclarse el gen con estas clulas, las molculas de ADN
pueden ser lo suficientemente pequeas para atravesar la pared
celular por los orificios formados

Etapa 5. Cultivo Cruzado
El callo se desarrolla y se
transforma en una planta
transgnica
Las plantas transgnicas se cruzan
con una lnea de plantas lite que
hayan demostrado alta
productividad y se obtiene una nica
lnea de plantas con buenas
caractersticas y con el gen de inters
Los descendientes de esta lnea se
cruzan de nuevo con la lnea lite
para obtener una lnea transgnica
de alto rendimiento
Cultivo
Cruzado
Tiempo requerido para completar las cinco etapas: 6-15 aos
Ejemplos de Modificacin Gentica de Plantas

n
n
n
n
n
n
Gen de resistencia a los herbicidas en soya, maz,

trigo y remolacha
Genes Bt de resistencia a insectos (codifican las
toxinas de Bacillus thuringiensis) en maz, papa y
algodn
Tomates de larga vida
Papas con contenido de almidn modificado
lamos con contenido alterado de lignina
Genes Bt de resistencia a insectos en tomates
Gen anticongelante en fresas
17
ALIMENTOS TRANSGNICOS
Cultivo
Tomate
Algodn
Calabacn
Soya
Colza
Tomate
Papa
Maz
Tomate
Algodn
Algodn
Maz
Tomate
Maz
Maz
Algodn
Caracterstica
Madurez retardada
Tolerancia a herbicidas
Resistencia a dos virus
Modifica composicin aceite
Madurez retardada
Resistencia a colepteros
Resistencia a Lepidpteros
Madurez retardada
Resistencia a lepidpteros
Resistencia a lepidpteros
Madurez retardada
Resistencia a insectos
Fecha
10/93
02/94
21/94
05/94
11/94
01/95
03/95
05/95
06/95
06/95
07/95
08/95
09/95
12/95
01/96
01/96
ALIMENTOS TRANSGNICOS
BENEFICIOS
Mayor productividad
Aumento de vida til
Resistencia a insectos
Aumento de la calidad
nutricional
Obtencin de nuevos
productos
Beneficios ecolgicos por
menor uso de pesticidas
Utilizacin de terrenos
improductivos
RIESGOS
Riesgos para la salud pblica
(alergias, resit. a antibiticos,
efectos desconocidos)
Falta de informacin y
transparencia
Disminucin de la biodiversidad
Uso indiscriminado de herbicidas
Creacin de supermalezas
Uso del gen terminator
Control econmico
Consideraciones ticas y religiosas
Modificacin Gentica de Animales

n
Los genes se introducen directamente en el ncleo de las

clulas animales (inyeccin pronuclear)
Se usa ADN que contenga el gen de inters y secuencias que
permitan la insercin del gen en los cromosomas, as como
su regulacin y control
n
Estas secuencias pueden ser promotores de genes del mismo animal,

p. ej:
promotor de protenas de la leche + gen que
codifica la protena de inters protena recombinante en la leche de
un mamfero
La introduccin de los genes en clulas animales se hace

generalmente a nivel de embriones durante procedimientos
normales de inseminacin artificial
18
Obtencin de un ratn transgnico
Los ratones transgnicos se usan en

estudios mdicos
Clonacin de vertebrados
Aplicacin de la IG en la Produccin
de Enzimas Industriales
Empresas como Novozymes han implementado
tcnicas de Ingeniera Gentica para la identificacin
y clonacin de genes que codifican enzimas de uso
industrial. Igualmente estn en capacidad de utilizar
la Ingeniera Gentica para la produccin industrial
de estas enzimas.
Las empresas productoras de enzimas cuentan con
grandes genotecas donde se guarda la informacin
correspondiente a miles de enzimas con potencial
aplicacin industrial.
19
Ingeniera Gentica de Enzimas

Screening (rastreo) molecular
Esta tcnica usa la informacin sobre genes de
enzimas conocidas para clonar genes similares de otros
organismos
Comparando la estructura de los genes, se puede
construir un primer que se una a las secuencias de ADN
comunes a ambos genes
Con los primers se pueden amplificar y secuenciar
nuevas cadenas de ADN de un gen homlogo
procedente de otros microorganismos
Con esta tcnica Novozymes logr clonar 32 genes de
celulasas de los cuatro ms grandes tipos de hongos a
partir de slo 4 secuencias de genes homlogos
Ingeniera Gentica de Enzimas

Expresin Recombinante
Una vez que se ha identificado una
enzima especfica, se transfiere el
gen responsable de esa enzima del
organismo en donde se encontr a
microorganismos conocidos y que
tengan un alto rendimiento en la
produccin de enzimas
A estos microorganismos se les ha
removido la capacidad de producir
otras enzimas que pueden
representar impurezas en el proceso
de aislamiento de la enzima
Microorganismos
utilizados:
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae
Aspergillus oryzae
Algunas enzimas producidas por

Microorganismos Modificados Genticamente
Fuente: Novozymes
Nombre comercial
Tipo de enzima
Aplicacin
Lipozyme
Lipasa
Grasas y aceites
Novamyl
Cervecera
Termamyl
Amilasa
maltognica
amilasa
Pectinex
Pectinesterasa
Carezyme
Celulasa
Industria del
almidn
Elaboracin de
jugos
Industria de
detergentes
20
Aplicaciones de la ingeniera Gentica en

Medicina: Terapia Gnica
La terapia gnica consiste en la modificacin gentica in vivo
de clulas enfermas en el ser humano. En general estos
procedimientos se encuentran en etapa de experimentacin.
Las mayores aplicaciones se orientan al tratamiento del
cncer:
Se utilizan arreglos genticos (gen + secuencias de
regulacin) para marcar las clulas cancerosas para que
posteriormente puedan ser tratadas con drogas y eliminadas
Aplicaciones de la ingeniera Gentica en

Medicina: Terapia Gnica
Otra aplicacin es el diagnstico y tratamiento de la
fibrosis qustica
Los pacientes son incapaces de sintetizar una
protena importante para el normal funcionamiento
de la pleura y de otros tejidos conectivos del cuerpo
Se administra el gen mediante aspersin nasal con
el gen de la protena incorporado en adenovirus
atenuados
Los adenovirus infectan las vas respiratorias y la
pleura, insertando el gen en las clulas
Otra manera menos riesgosa es utilizando
liposomas como vector
Mediante screening de las clulas de los padres, se
puede determinar si los hijos pueden desarrollar la
enfermedad
21

Aplicaciones de La Ingeniería Genética

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Qum., M.Sc., Ph.D.

Principio de la Ingeniera Gentica

Estructura del ADN:

Estructura del ADN:

Estructura del ADN:

Estructura del ADN: Doble Hlice

Replicacin del ADN

ADN de una clula procaritica

El ADN flota libremente en el

ADN de un organismo eucaritico

Bionsntesis de Protenas III

Esquema General de la Biosntesis de Protenas

Promotor: Secuencia de ADN que le indica a la ARN polimerasa

Enzimas utilizadas en Biologa Molecular

Tipos de corte de las

2. Extremos lisos (Blunt ends)

Enzimas utilizadas en Biologa Molecular

Enzimas utilizadas en Biologa Molecular

Enzimas utilizadas en Biologa Molecular

Contienen varios genes

Pueden transferirse de una bacteria a otra

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Tecnologa del ADN Recombinante I

Tecnologa del ADN Recombinante II

Etapas en la Tecnologa del ADN Recombinante

Etapas en la Tecnologa del ADN Recombinante

Etapas en la Tecnologa del ADN Recombinante

El plsmido pBR 322

Este plsmido ha sido extrado de Escherichia coli y tiene

Obtencin del Vector Recombinante

Etapa 4. Transformacin de las Clulas del

Las clulas del hospedero se tratan para obtener clulas

Etapa 5. Identificacin de los Microorganismos

Etapa 5. Expresin del Gen

Las clulas recombinantes se transfieren a cultivos lquidos hasta

El primer producto recombinante

Algunos Productos Tradicionales

Ingeniera Gentica de Plantas

Seleccin de los mejores individuos y

Seleccin y cruce de los mejores individuos para la

Slo se puede hacer entre la misma especie o especies

Ventajas de la Ingeniera Gentica de

Etapas de la Ingeniera Gentica de Plantas

Maceracin del tejido

Etapas de la Ingeniera Gentica de Plantas

El promotor 35S hace que el gen se exprese en

Etapas de la Ingeniera Gentica de Plantas

Las clulas del callo son

Transformacin de Plantas con ayuda de

Etapas de la Ingeniera Gentica de Plantas

Tiempo requerido para completar las cinco etapas: 6-15 aos

Ejemplos de Modificacin Gentica de Plantas

Gen de resistencia a los herbicidas en soya, maz,

Modificacin Gentica de Animales

Los genes se introducen directamente en el ncleo de las

Estas secuencias pueden ser promotores de genes del mismo animal,

La introduccin de los genes en clulas animales se hace

Obtencin de un ratn transgnico

Los ratones transgnicos se usan en

Ingeniera Gentica de Enzimas

Ingeniera Gentica de Enzimas

Algunas enzimas producidas por