PRCTICA VI

ESTUDIO DE Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis y Streptococcus ALFA, BETA Y GAMMA
HEMOLITICOS.
Elabor: CD. Fernando Snchez Hernndez.
OBJETIVOS.
Durante el desarrollo de esta prctica, el alumno:

Observar las caractersticas microscpicas de Staphylococcus sp. a partir de cultivos

puros.
Identificar por medio de cultivos y pruebas bioqumicas diferentes especies de
Staphylococcus.
Identificar las caractersticas microscpicas de los Streptococcus a partir de cultivos
puros.
Identificar por medio de cultivos y pruebas bioqumicas las diferentes especies de
Streptococcus.

INTRODUCCIN.
El gnero Staphylococcus es de bacterias comensales, cuya presencia es tan comn que es
necesario contar con mtodos de laboratorio que permitan aislarlo de tal manera que se pueda
establecer su posible relacin con ciertas infecciones, o bien con problemas de contaminacin de
materiales de uso mdico como son catteres. En diferentes productos obtenidos de pacientes, se
pueden aislar a los Staphylococcus, ya sea como bacterias directamente responsables del proceso
patolgico, o bien como oportunistas. Se les puede cultivar a partir de pus, exudados, orina, sangre,
materias fecales, materiales de biopsia, lquido cefalorraqudeo, etc.
Por lo que se refiere a mtodos de aislamiento, hay que sealar que en ocasiones basta con detectar
la presencia de estas bacterias como en el caso de los materiales clnicos, en tanto que en los
materiales de curacin, alimentos y ambiente, por lo general es necesario aplicar procedimientos
cuantitativos para determinar el nmero de bacterias viables, es decir, capaces de formar colonias
en los medios de cultivo para determinar el grado de contaminacin. Se estima que un nmero muy
reducido de Staphylococcus en alimentos es solamente un indicio de contaminacin por esta
bacteria. Si el nmero aumenta a niveles inferiores a 10,000 indica no solamente contaminacin sino
adems descuido en el manejo del alimento, lo cual ha permitido su proliferacin, en tanto que cifras
superiores a sta, representan grave riesgo de intoxicacin alimentaria.
En general las especies Staphylococcus son poco exigentes y de fcil desarrollo. En los medios no
selectivos sus colonias son grandes y de consistencia cremosa, por lo general opacas, lisas,
circulares y enteras. A veces pueden presentar bordes ligeramente ondulados, coloracin amarilla o
blanca. En agar sangre las colonias son ms grandes y pueden ser adems hemolticas o no
hemolticas. La mayor parte de las cepas virulentas son hemolticas, fermentan el manitol, resisten
altas concentraciones de cloruro de sodio y generalmente producen pigmento dorado
(Staphylococcus aureus), aunque otras cepas virulentas son blancas o carecen de pigmento. La
mejor prueba de virulencia es la facultad que tienen de coagular el plasma (coagulasa positivos).
Especies de Streptococcus pueden estar presente en grandes nmeros como componente de la
flora normal, pero bajo ciertas circunstancias puede estar asociado con infecciones o ser el
responsable principal de las mismas. El aislamiento de estas bacterias presenta problemas para los
laboratorios bacteriolgicos en vista de que ese microorganismo puede encontrarse en diferentes

partes del organismo y por lo tanto mezclado a otras bacterias que entorpecen su desarrollo en los
medios de cultivo, o bien enmascarar su presencia. Los estreptococos ms importantes
generalmente pueden demostrarse por la produccin de hemlisis en los medios que contienen
sangre, la cual facilita su deteccin. Otro problema importante lo constituye la identificacin que se
lleva a cabo por examen de sus factores antignicos.
En general, se puede decir que interesan dos grupos de Streptococcus en la prctica de aislamiento
e identificacin:
1. Los Streptococcus del grupo A, son beta hemolticos, se aslan generalmente de exudados
farngeos. Sin embargo, entre la flora existen diversos tipos de Streptococcus, los cuales
pueden ser alfa o beta hemolticos, por lo que adems de la hemlisis es necesario efectuar
otras pruebas para identificarlos, tales como la composicin antignica y la prueba de
sensibilidad a la bacitracina.
2. Los Streptococcus, tanto alfa, beta-hemolticos, o gama hemolticos, pueden estar presentes
en diferentes partes del organismo, especialmente la nasofaringe, la regin crvico-vaginal,
el intestino, y cuando salen de su hbitat normal pueden ser responsables de procesos
patolgicos. Generalmente se obtienen a partir de muestras de sangre, lquido
cefalorraqudeo, pus, orina, etc. En estos casos es importante decidir el valor de la presencia
de stas bacterias en la integracin del diagnstico.
En agar sangre las colonias de esta bacteria son pequeas, elevadas, de color blanco a gris, opacas,
duras y secas con un halo claro bien definido de hemlisis completa (hemlisis beta) como de 2 mm
de dimetro. Tienen la caracterstica de que al tratar de levantarlas con el asa recta resbalan sobre
el medio. Las placas de agar sangre pueden sembrarse tanto por estra como por vaciado. En este
ltimo caso no es necesario incubar en CO. Una prctica muy comn es la inoculacin superficial
por estra y en seguida, puncionar con el asa bacteriolgica diversas reas de la placa de agar sangre
e incubar aerbicamente.

MATERIALES PARA LA PRCTICA.

Cepas

Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis.
Streptococcus beta, alfa y gamma hemolticos.

Medios de cultivo
1 cajas de petri de agar 110
1 cajas de petri de agar sangre.
1 caja de petri con agar manitol salado.
1 tubo de solucin salina estril.
Batera de tincin para Gram
Colorante de cristal violeta
Colorante de safranina
Mordiente lugol
Decolorante alcohol-acetona
Equipo

Mechero de Bunsen.
Asa bacteriolgica.
Microscopio.

Pipeta Pasteur

H2O2 Perxido de Hidrgeno al 30% (agua oxigenada).

Cristalera
Soluciones
Consumibles
Portaobjetos.

Cerillos o encendedor.
Aceite de inmersin
Cinta adhesiva
Lpiz graso.

TCNICA Y PROCEDIMIENTO.
1. A partir del cultivo de S. aureus y Streptococcus sp. (elegir uno) hacer un frotis y teirlo
con la tcnica de Gram y observar al microscopio.
2. Sembrar los cultivos de S. aureus y S. epidermidis en agar sangre y agar 110 e incubar
a 37C + 2durante 24 horas y observar la hemlisis producida y viraje de color. Media
placa por cepa.
3. Sembrar en agar manitol salado las mismas cepas, incubar a 27C durante 24 horas y
observar si hay un viraje de color en el medio de cultivo hacia el amarillo, la reaccin
ser manitol positiva, la cual es producida por el Staphylococcus aureus.
4. Prueba de la Catalasa. Con el asa de siembra recoger el centro del cultivo y colocar la
muestra sobre un portaobjetos limpio de vidrio, agregar con una pipeta Pasteur una
gota de H2O2 (agua oxigenada) al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el
cultivo, observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).

5. A partir del cultivo de Streptococcus alfa, beta y gamma hemolticos hacer un frotis y
teirlo con la tcnica de Gram y observar al microscopio.

6. Sembrar los cultivos de Streptococcus alfa, beta y gamma hemolticos en agar gelosa
sangre, incubar a 37 C + 2 durante 24 horas y observar la hemlisis producida (elegir
dos cepas y sembrarlas en la mitad de una caja de petri cada una).

Observacin en microscopio Primostar

El proofesor a cargo, transportar el microscopio al laboratorio, y lo conectar con dispositivos
electrnicos (iPad) de los alumnos. O si no se cuenta con dichos dispositivos, con la pantalla de
computadora de microbiologa para poder observar las laminillas trabajadas en el grupo y tomar
fotografas para sus resultados, y guardarlas en un USB por equipo.
Preparativos:
1. Encender el microscopio y colocar la luz en el nivel ms bajo.
2. Verificar que el microscopio se encuentre conectado al mdem del laboratorio de
microbiologa.
3. Conectar algn dispositivo electrnico que tenga descargado el programa Labscope
(Zeiss).
Ajuste de cmara interna HD (Primostar). Ver instructivo adjunto.
4. El profesor realizar ajuste de blancos, sistema y ajuste de iluminacin del microscopio
Primostar y su calibracin para tomar fotografas de laminillas previamente proporcionadas.
5. Con los distintos objetivos del Microscopio, el profesor realizar la captura, ajuste y claridad
de imgenes.
6. Como resultado, cada alumno tomar una imagen proporcionadas de los dispositivos
electrnicos, o de lo contrario guardar en un USB por equipo las imgenes obtenidas del
microscopio.