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Diagnstico de algunas enfermedades de origen gentico

El diagnstico de las enfermedades hereditarias consiste en la deteccin de las alteraciones o variaciones de la constitucin gentica
de un individuo que estn directa o indirectamente relacionadas con estados patolgicos.
Las estrategias para el diagnstico gentico las podemos clasificar como directas o indirectas en funcin de si se detecta o no el gen
implicado. En el primer caso podremos realizar el diagnstico identificando en los pacientes las diferentes mutaciones del gen en
cuestin. La segunda estrategia es independiente del conocimiento del gen implicado, pues se fundamenta en el estudio de la
herencia conjunta de marcadores annimos y el locus de la enfermedad estudiada. Para este fin, es preciso que el marcador utilizado
presente un fuerte ligamento con el locus de inters, adems de otras caractersticas que lo harn ms o menos adecuado para el
diagnstico.

El diagnstico molecular
La aplicacin en gentica humana de la tecnologa del ADN recombinante y de los mtodos de amplificacin enzimtica de cidos
nuclicos han supuesto una autntica revolucin metodolgica. El diagnstico molecular pretende la caracterizacin, con la mayor
precisin posible, del genotipo de un individuo. Dicha caracterizacin la podemos realizar mediante dos aproximaciones bsicas:

el diagnstico directo, mediante la deteccin del cambio producido a nivel del ADN,

el diagnstico indirecto, mediante el estudio de la cosegregacin del carcter estudiado y marcadores polimrficos
ntimamente ligados a ste.

El diagnstico molecular directo


El mximo nivel de precisin del diagnstico directo se obtiene con la secuenciacin de los nucletidos correspondientes al locus
mutado, sin embargo la aplicacin de esta estrategia diagnstica de forma generalizada es por el momento inviable. Por lo general el
diagnstico directo de una mutacin se realiza mediante el estudio de los cambios que sta produce en la estructura primaria
(secuencia), en las propiedades fsico-qumicas de la molcula de ADN o bien en los cambios que se presentan en el producto gnico
(sea este ARN mensajero o protena). Bsicamente podemos distinguir cuatro tipos de cambios o mutaciones del ADN:
a. cambios de nucletido: transversiones y transiciones
b. pequeas deleciones o inserciones
c. grandes reorganizaciones
d. mutaciones dinmica: Repeticin inestable de trinucletidos en distintas regiones de un gen.
Los cambios de nucletidos y las pequeas deleciones o inserciones alteran la estructura primaria del ADN y pueden dar lugar a
variaciones del tamao de la molcula o bien, como veremos ms adelante, prdidas o ganancias de dianas de restriccin. As mismo
la molcula mutada puede presentar variaciones en sus propiedades fsico-qumicas que alteren su movilidad electrofortica o sus
propiedades de apareamiento complementario. Las grandes reorganizaciones y las mutaciones dinmicas provocan generalmente
variaciones en el tamao de la molcula de ADN. Finalmente, las mutaciones pueden ser detectadas en el producto gnico cuando
estas dan lugar a mensajeros inestables o de tamao distinto o bien a protenas truncadas.

Herramientas y metodologas para la deteccin de mutaciones


Las tcnicas y protocolos utilizados en el diagnstico molecular se circunscriben en el mbito de la biologa molecular bsica. No
estamos hablando de una tecnologa excesivamente compleja y de hecho cualquier laboratorio de biologa molecular est capacitado
tcnicamente para llevar a cabo este tipo de anlisis.
Bsicamente las tcnicas comunes a todos los laboratorios de diagnstico molecular son:
a. los enzimas de restriccin,
b. las tcnicas de separacin electrofortica de cidos nucleicos,
c. la hibridacin de cidos nucleicos y
d. la amplificacin enzimtica del ADN (PCR)

Mtodos de deteccin directa de mutaciones


Veremos a continuacin mediante algunos ejemplos como se aplican estas tcnicas bsicas en el diagnstico gentico:
Deteccin directa de una mutacin que altera una diana de restriccin.
La anemia falciforme es una enfermedad autosmica recesiva. Los pacientes afectados por esta patologa presentan en homozigosis
la substitucin de una glutamina por una valina en el tercer aminocido de la -globina (S). Dicha mutacin se corresponde con el
cambio de una adenina por una timina en el codn 6 de dicho gen que al mismo tiempo altera la diana de restriccin para el enzima
MstII.
Aprovechando esta circunstancia se ha diseado un mtodo muy sencillo para detectar la mutacin. Como se indica en la Figura, la
secuencia normal del gen de la -globina en los codones 5, 6 y 7 (cct gag gag) incluye la diana para el enzima Mst II (cctgagg). Dicha
diana se pierde con la mutacin que causa anemia falciforme al pasar a ser (cctgtgg). Flanqueando a esta diana existen dos dianas
para el mismo enzima: una a 1,2 kb y otra a 0,2 kb de distancia. La digestin del ADN genmico de un individuo con el enzima Mst II,
dar lugar a miles de fragmentos entre los cuales estarn los correspondientes al locus de la -globina. Podemos ahora separar todos
los fragmentos segn su tamao en una electroforesis con gel de agarosa y transferir el resultado a un filtro de nitrocelulosa.
Utilizando una sonda complementaria al fragmento de 1,2 kb, podremos detectar aquellos fragmentos de ADN que contengan la
secuencia complementaria a la sonda (vase parte inferior de la Figura). Si un individuo es homozigoto para el alelo normal de la globina, el nico fragmento que ser detectado por la sonda ser el de 1,2 kb. Si el individuo es portador del alelo de anemia falciforme
detectaremos dos fragmentos: el de 1,2 kb y el de 1,4 kb, uno proveniente del cromosoma que tiene la secuencia normal (con diana) y
el otro proveniente del cromosoma con la secuencia de la anemia falciforme (sin diana). Finalmente, en un individuo homozigoto para
la anemia falciforme solo detectaremos el fragmento de 1,4 kb.

Una variacin del mtodo anterior se presenta en la Figura siguiente. La aplicacin de la tcnica de PCR facilita enormemente la
deteccin de mutaciones en las que varia una diana de restriccin. El mtodo consiste en obtener oligonucletidos que flanquean la
mutacin y mediante PCR obtener millones de copias de dicha regin. Seguidamente los fragmentos amplificados se ponen en
presencia del enzima en cuestin, en nuestro caso Mst II. Si el ADN proviene de un individuo normal todos los fragmentos amplificados
presentarn la diana para el enzima y por lo tanto despus de la digestin obtendremos dos subfragmentos (en el ejemplo, del
fragmento amplificado de 300 pb se obtendrn dos subfragmentos: uno de 200 y otro de 100 pb). Si el ADN proviene de un individuo
afectado todos los fragmentos amplificados tendrn la secuencia que no es reconocida por el enzima y por lo tanto la digestin no
alterar su tamao (todos continuarn siendo de 300 pb). Finalmente, si el ADN proviene de un individuo heterozigoto los fragmentos
amplificados sern de dos clases, con la secuencia diana o sin dicha secuencia. La digestin de los primeros dar lugar a dos
fragmentos de 200 y 100 pb, mientras que los segundos mantendrn el tamao de 300 pb despus de la digestin. La resolucin en
una electroforesis con gel de agarosa de cada una de estas muestras se presenta en la parte inferior de la Figura.

Deteccin directa de la secuencia mutada.


Cuando la mutacin ha sido caracterizada y se conoce su base molecular es posible disear estrategias diagnsticas basadas en la
deteccin de la secuencia mutada. Se han descrito distintos mtodos de deteccin directa, de entre los cuales comentaremos la
deteccin mediante oligonucletidos especficos de alelo (ASO). Un ejemplo de este mtodo lo tenemos en la Figura donde se
presenta la deteccin de mutaciones en el gen de la fibrosis qustica. La fibrosis qustica (CF) es una grave enfermedad hereditaria. En
esta enfermedad las funciones de pulmones y pncreas estn alteradas por un aumento en las secreciones de dichos rganos. Los
pacientes afectados manifiestan los sntomas propios de la CF, alteraciones en las vas respiratorias e infecciones recurrentes, durante
el primer ao de vida vindose muy afectada su calidad y esperanza de vida. Se han descrito numerosas mutaciones del locus CF,

siendo la ms frecuente la delecin de tres nucletidos (CTT) que supone la prdida del aminocido 508 de la protena CFTR
(mutacin 508). La problemtica derivada de la existencia de un gran nmero de mutaciones para un determinado locus
(heterogeneidad allica) es comn a muchas enfermedades hereditarias.
El mtodo consiste en el diseo de oligonucletidos con la secuencia correspondiente a cada uno de los alelos descritos para CF,
incluyendo como control a la secuencia normal. Cada mutacin puede estar localizada en una regin distinta del gen. En la Figura se
presentan 4 mutaciones situadas en cuatro exones distintos. De cada mutacin se dispone de la secuencia y de cebadores que
permiten amplificar el exn correspondiente. Despus de obtener ADN de cada uno de los pacientes, mediante los cebadores
apropiados se realiza una PCR para cada exn. Esta reaccin se realiza en un solo tubo de forma que se obtiene una mezcla de todos
los exones amplificados. La muestra as obtenida se aplica por duplicado a un filtro de nylon y el ADN se fija mediante luz UV.
Seguidamente el filtro se hibrida con el ASO correspondiente a cada mutacin y a su control normal, marcados previamente de forma
enzimtica, con fluorescencia o radioactividad. Despus del revelado apropiado obtendremos una seal positiva que nos revelar los
alelos presentes en cada paciente. En el ejemplo de la Figura, el paciente 1 es heterozigoto para la mutacin 508, pues da positivo
para el ASO del alelo normal de todas las mutaciones y tambin para el ASO del alelo 508. El paciente 2 es homozigoto para la
mutacin 508, pues en el filtro de dicha mutacin solo obtenemos seal positiva para el ASO del alelo 508. Los pacientes 3, 4 y 5
son heterozigotos compuestos para las mutaciones 508 - W1282X, 508 - R177H y 508 - R553X respectivamente. Finalmente el
paciente 6 da positivo para todos los ASO normales y negativo para las cuatro mutaciones. Ello nos indica que debe presentar una
mutacin distinta a las estudiadas. El inters del diagnstico especfico del alelo o alelos mutados reside en la relacin existente entre
dicho alelo y la manifestacin clnica de la enfermedad. No son muchas las enfermedades en las cuales se ha podido establecer este
tipo de correlacin, pero en el caso de la CF se ha podido demostrar que los pacientes homozigotos para la mutacin 508 presentan
insuficiencia pancretica mientras que los heterocigotos compuestos R117H / 508 tienen una funcin pancretica normal.

Deteccin de mutaciones por delecin.


Las mutaciones que suponen una prdida de nucletidos en la secuencia de ADN son fcilmente detectadas mediante PCR. Un
ejemplo de aplicacin lo tenemos en la deteccin de mutaciones en el gen de la distrofia muscular de Duchenne (DMD). Esta
enfermedad presenta una herencia ligada al cromosoma X. Se caracteriza por la prdida progresiva del tono muscular que se
manifiesta desde el primer ao de vida. Los nios afectados de DMD tienen problemas para mantenerse derechos y correr. A edades
ms avanzadas la musculatura se debilita presentndose paradas cardacas y parlisis. La esperanza de vida no supera los 25 aos.
Existe una manifestacin ms benigna conocida como distrofia muscular de Becker. Cuando se pretende un diagnstico prenatal debe
realizarse mediante el anlisis del genotipo.
El gen DMD es el gen humano de mayor tamao hasta ahora caracterizado. El locus DMD ocupa ms de 2 megabases de ADN que
dan lugar a un trnscrito de 13kb. La protena denominada distrofina tiene un total de 3.685 aminocidos y presenta una estructura
repetitiva. El anlisis molecular del gen DMD ha revelado que un nmero importante de mutaciones se producen por deleciones
distribuidas a lo largo del locus, presentndose tanto pequeas como grandes prdidas de ADN (2/3 de los varones afectados
presentan delecin). Las deleciones que causan una prdida total de producto gnico presentan una manifestacin clnica mucho ms
grave (Duchenne) que aquellas que respetando la pauta de lectura, dan lugar a la sntesis de una protena anmala (Becker). La
deteccin de distrofina en biopsia muscular, mediante la utilizacin de anticuerpos especficos, es una buena metodologa diagnstica.
Sin embargo, su carcter invasivo y elevado coste econmico hacen que sea substituida por el diagnstico gentico.
En la Figura se presenta un esquema de la estrategia de multiplex PCR desarrollada para la deteccin simultnea de distintas
deleciones en el gen DMD en varones afectados. Mediante la utilizacin de parejas de cebadores, previamente optimizados, se
amplifican de forma simultnea distintos exones del gen DMD. El resultado de cada PCR mltiple se analiza en una electroforesis con
gel de agarosa obtenindose un patrn de bandas del cual es posible inferir las regiones delecionadas. Una vez se han determinado
cuales son los exones delecionados es posible definir en cada paciente los extremos de la delecin y estimar as el comportamiento
clnico esperado de dicho paciente.

El mtodo de PCR mltiple tiene una proporcin muy baja de errores de diagnstico, es muy verstil, rpido (en tan solo un da es
posible analizar varios individuos) y barato. As mismo, las cantidades de ADN necesarias para el anlisis son muy reducidas por lo
que su aplicacin es posible tanto en el diagnstico postnatal como en el prenatal.

Multiplex PCR. Deteccin de mutaciones por delecin en el locus


DMD. Utilizando los oligonucletidos indicados en la parte superior de la figura
(puntas de flecha) se amplifican, en una sola reaccin, distintos exones del gen
DMD. Los primeros carriles corresponden a controles, un estandar de
fragmentos amplificados, un control negativo de la PCR en el cual no se aade
ADN y un control positivo de un individuo con el alelo normal. De 1 a 5 son
varones afectados de DMD. El paciente 1 presenta una delecin de los exones
b y c. El paciente 2 presenta una delecin desde el exn b al exn f. El
paciente 3 presenta una delecin de toda la regin analizada. El paciente 4
tiene delecionado el exn a y finalmente el paciente 5 ha perdido los exones d y e.
Deteccin de mutaciones inestables.
Este tipo de mutacin conocida como mutacin inestable es producida por la expansin de unidades de repeticin de tres
nucletidos. En la actualidad, se han identificado ms de 50 genes eucariotas que presentan este tipo de repeticiones, entre los cuales
se encuentran genes humanos responsables de un nmero importante de patologas neurolgicas. Este tipo de mutacin presenta
diversas caractersticas:
a. la repeticin es polimrfica y se presenta tanto en individuos sanos como en afectados, siendo el nmero de repeticiones como
mnimo de entre 2 y 5 veces superior en los afectados que en los sanos.
b. el nmero de repeticiones puede variar, expandirse o, en algunos casos contraerse de generacin en generacin. En algunas de las
patologas implicadas se observa una progresin partiendo de un nmero de rango normal, pasando por una pre-mutacin de rango
intermedio y finalmente una mutacin completa.
c. en varias de las patologas se encuentra una fuerte correlacin entre el nmero de repeticiones y distintos parmetros clnicos como
la edad de manifestacin (fenmeno conocido como anticipacin) o el tipo de presentacin clnica (gravedad, rganos o tejidos
afectados, etc.).
d. todas las mutaciones inestables con carcter patolgico identificadas hasta el momento, afectan de forma directa o indirecta al
sistema nervioso o neuromuscular.
La mayora comparten el patrn de herencia dominante. La repeticin puede localizarse tanto en regin codificante (exones) o no
codificante (regin 5, regin 3 o intrones), por lo que sus efectos pueden ir desde alteraciones en la expresin del gen hasta la
abolicin del producto gnico.
El diagnstico molecular de este tipo de mutaciones tiene un alto inters dado que el tamao de la repeticin permite extrapolar una
parte importante del comportamiento clnico del paciente. Durante los ltimos aos se han estandarizado diversos mtodos de
deteccin basados en las tcnicas de Southern (hibridacin y deteccin mediante una sonda) o PCR. En la aplicacin del mtodo
Southern (Figura, izquierda) la deteccin se realiza mediante una sonda de ADN homloga a una secuencia adyacente a la regin
repetida. Se obtiene ADN genmico del paciente y se digiere con un enzima de restriccin con dianas que flanquean al locus inestable.
Una vez digerido se fracciona en una electroforesis con un gel de agarosa y ste se transfiere a un filtro de nitrocelulosa. El filtro se
hibrida con la sonda para detectar los fragmentos que contienen la regin inestable. El tamao de los fragmentos detectados es del
orden de kilobases.

Para la aplicacin de la tcnica de PCR en el diagnstico de las mutaciones inestables se utilizan cebadores que flanquean la regin
amplificada (figura, derecha). El producto de la amplificacin, cuyo tamao puede estar en el rango de unos cientos de pares de bases,
se aplica a un gel de agarosa o acrilamida con el objeto de determinar el tamao de cada fragmento. Tal y como se presenta en la
figura es posible detectar los fragmentos amplificados de individuos normales o en aquellos que presentan pre-mutacin, sin embargo
puede suceder que no se detecte el fragmento procedente de un individuo con la mutacin completa. Esto es as debido a que la DNA
polimerasa puede tener problemas al intentar amplificar los tamaos del orden de kilobases (Kb) que se presentan en el cromosoma
con la mutacin completa. En el esquema tambin puede observarse que las bandas amplificadas mediante PCR tienen una cierta
heterogeneidad en su definicin. Esto es as debido por una parte al polimorfismo en el nmero de repeticiones y por otra a los errores
de la DNA polimerasa.
Deteccin de nuevas mutaciones.
Hasta el momento hemos presentado diversas estrategias diagnsticas para la deteccin de mutaciones previamente caracterizadas,
sin embargo en la rutina diaria del laboratorio de diagnstico gentico se plantea con frecuencia la identificacin de mutaciones que
bien por ser desconocidas o bien por ser poco prevalentes, precisan de una aproximacin diagnstica diferente. Las distintas
estrategias de deteccin de nuevas mutaciones pueden ser agrupadas en tres grandes apartados:
a. deteccin de variaciones en el apareamiento entre las cadenas normal y mutada.
b. deteccin de cambios de conformacin y
c. deteccin de productos gnicos alterados
En el primer grupo se incluyen dos mtodos ampliamente utilizados como son el anlisis de heteroduplex y la digestin qumica de
cadenas con apareamientos errneos (CCM). En ambos mtodos el cambio o mutacin se detecta mediante la hibridacin en solucin
de la cadena normal (N) y la cadena mutada (m) obtenidas previamente mediante PCR. Molculas de ADN que corresponden a la
secuencia de la cadena mutada (mm) se mezclan con molculas de ADN que corresponden a la secuencia de la cadena normal (NN).
Despus de la desnaturalizacin por calor de ambas cadenas se permite su renaturalizacin. Si existe alguna diferencia en la
secuencia de nucletidos entre ambos tipos de cadenas, adems de los hbridos NN y mm (homoduplex), tambin se formarn
hdridos del tipo Nm (heteroduplex) que presentarn errores de apareamiento. En el mtodo de heteroduplex los hbridos se analizan
en un gel de acrilamida y las diferencias entre ellos se visualizan por la aparicin de un patrn de bandas anmalo. En el mtodo CCM
los hbridos son tratados con un reactivo qumico (por ejemplo tetrxido de osmio) que cortan a la doble cadena de ADN en regiones
de apareamiento errneo. La aparicin de fragmentos de degradacin ser indicacin de la existencia de una variacin entre la cadena
normal y la mutada.
De los mtodos de anlisis de cambios de conformacin, destaca por su versatilidad, economa y aceptacin generalizada el anlisis
de conformacin de cadena sencilla (SSCP). El mtodo SSCP se fundamenta en los cambios de conformacin que presentan dos
cadenas sencillas de ADN que difieren entre s en un nico nucletido. Dichos cambios de conformacin se pueden poner de
manifiesto en un gel de acrilamida por la aparicin de un patrn de bandas diferencial. El mtodo es muy resolutivo y su aplicacin es
tcnicamente simple. Algunas de las limitaciones de la tcnica son:
a. las condiciones de la electroforesis (temperatura y concentracin de aditivos como glicerol o sacarosa) deben ser determinadas
empricamente,
b. el tamao de la molcula a analizar no puede exceder los 300-350 pares de bases (pb) y
c. presenta una sensibilidad inferior al 100%

A pesar de estas limitaciones es una tcnica ampliamente utilizada como primera aproximacin al estudio y caracterizacin de nuevas
mutaciones. Su aplicacin en la deteccin rutinaria de nuevas mutaciones consiste bsicamente en amplificar mediante PCR
fragmentos de 200 pb del locus a estudiar. Los productos de amplificacin se desnaturalizan por calor y se analizan en un gel de
acrilamida juntamente con un control de secuencia normal. La aparicin de un patrn de bandas anmalo es indicativo de un posible
cambio nucleotdico. Dicho cambio ser posteriormente confirmado mediante la secuenciacin del fragmento cuyo patrn se ha visto
alterado.

En la Figura se presenta un ejemplo de la aplicacin de la tcnica de SSCP en la deteccin de una variacin polimrfica del extremo 3
del locus del receptor de la vitamina D. Dicho polimorfismo altera la diana de restriccin del enzima BsmI, al cambiar la secuencia
ACATTC (alelo B) por GCATTC (alelo b). Mediante oligonucletidos sintticos que flanquean el locus polimrfico se obtienen
fragmentos de ADN de 192 pb. Los productos de amplificacin se desnaturalizan para obtener cadenas sencillas de ADN y estas se
resuelven a temperatura ambiente en un gel de acrilamida. El patrn de bandas obtenido ser distinto en funcin del genotipo del
paciente. Si ste es homozigoto para la secuencia correspondiente a la diana (BB), se obtienen tres bandas: dos de cadena sencilla
correspondientes a cada una de las cadenas complementarias y una banda, localizada en la parte inferior del gel en la Figura, que
corresponde a la cadena doble no desnaturalizada. El mismo nmero de bandas aparecern en un paciente homozigoto para el alelo b
(ausencia de diana en homozigosis), pero en este caso y dado que cada cadena complementaria difiere de las anteriores en un
nucletido, la posicin en el gel es distinta. Finalmente el heterozigoto presentar, como en los casos anteriores, una banda
procedente de la cadena doble no desnaturalizada y cuatro bandas correspondientes a las cuatro cadenas sencillas.
Para finalizar comentaremos el test de protena truncada (PTT), como modelo de los mtodos basados en el estudio de modificaciones
en el producto gnico. El test PTT es un mtodo de reciente aplicacin diseado de forma especfica para detectar mutaciones que
causan la aparicin de un codn de paro prematuro en la molcula de ADN. Es un mtodo tcnicamente complejo, muy sensible para
este tipo de mutaciones pero inaplicable para la deteccin de otro tipo de variaciones del ADN. El mtodo consiste en la amplificacin
mediante PCR de distintas regiones del locus a analizar, utilizando cebadores que adems de contener la secuencia homloga del
fragmento a amplificar contienen en pauta de lectura, la secuencia del lugar de iniciacin de la transcripcin para la RNA polimerasa
de T7 y un codn ATG de iniciacin. Los fragmentos amplificados se utilizan como moldes en una reaccin de transcripcin in vitro
utilizando la RNA polimerasa de T7. As se obtienen molculas de RNA que son simultneamente traducidas a protena en presencia
de un aminocido marcado. Las protenas obtenidas son analizadas en un gel de acrilamida-SDS que permite detectar su tamao. La
aparicin de protenas con un tamao inferior al esperado respecto a un control de secuencia normal, ser indicativo de la existencia
de una mutacin de codn de paro prematuro en la molcula analizada.
Adems de los mtodos descritos, existen innumerables estrategias diseadas para la deteccin de nuevas mutaciones que son el
fruto, en muchas ocasiones, de la capacidad imaginativa del investigador.

El diagnstico indirecto
El diagnstico indirecto es independiente del conocimiento previo de la naturaleza molecular de la mutacin a diagnosticar y para
llevarlo a cabo solo es preciso conocer la localizacin cromosmica del locus implicado. Dicha estrategia consiste en estudiar, en la
familia del paciente, la segregacin conjunta de la enfermedad y secuencias polimrficas fsicamente prximas (ligadas) al locus de la
misma.
El ADN es una molcula lineal en la que las secuencias de nucletidos se hallan contiguas y distribuidas a lo largo de la doble hlice
en un mundo de una dimensin. Existe pues una relacin fsica de proximidad entre secuencias de ADN. Dicha relacin de continuidad

puede alterarse durante el proceso de la divisin meitica que se presenta durante la formacin de las clulas germinales. En la
profase de la primera divisin meitica, los cromosomas homlogos (uno proveniente de la lnea paterna y el otro de la lnea materna)
intercambian material por el proceso de entrecruzamiento. El resultado final es tal que los cromosomas de la clula germinal madura
(espermatozoide u vulo) presentan nuevas combinaciones de las secuencias existentes en la clula original (nuevos recombinantes).
Dada la relacin fsica existente entre secuencias adyacentes en un mismo cromosoma, la frecuencia en que dos de estas secuencias
se transmiten (segregan) juntas de una generacin a la siguiente es inversamente proporcional a la distancia que las separa. Es decir,
cuanto menor es la distancia que separa a dos secuencias de ADN, menos probable es el entrecruzamiento entre ellas y por lo tanto
segregan juntas con una mayor frecuencia. Cuando se da esta situacin decimos que ambas secuencias estn ligadas.

Polimorfismos del tamao de fragmentos de


restriccin (RFLP). La prdida o ganancia de una diana de
restriccin por efecto de la substitucin de un nucletido (A), o la
insercin o delecin de un fragmento de ADN (B), pueden ser
detectados por las variaciones en los tamaos de los fragmentos
de restriccin. En la figura se presenta el resultado esperado de
este tipo de polimorfismos en individuos homozigotos para la
presencia de la diana o la delecin (+ +), los homozigotos para la
ausencia de diana o la insercin (- -) y los heterozigotos (+ -). El
mtodo de deteccin puede ser tanto hibridacin y southern
(esquematizado en la figura) como mediante PCR.
El ligamiento entre secuencias de ADN se establece mediante el estudio de la segregacin de los alelos de dichas secuencias en
genealogas. Este tipo de estudios permiten la obtencin del mapa gentico de una determinada regin cromosmica. Dicho mapa
contendr puntos de referencia al estilo de un mapa de carreteras.
As, mientras que el mapa de carreteras nos informa de la posicin de pueblos y ciudades, el mapa gentico contendr informacin
sobre la posicin de los genes. Adems de pueblos y ciudades el mapa de carreteras contiene otros puntos de referencia orientativos
como pueden ser un cruce de carreteras, un puerto de montaa o una vista panormica. Dichos puntos de referencia son
fundamentales para orientarse a lo largo de la carretera. Su equivalente en el mapa gentico sern por ejemplo los puntos de rotura de
una determinada translocacin o las secuencias polimrficas repartidas a lo largo de la molcula de ADN.