Algas Marinas

Revista Real Academia Galega de Ciencias. Vol. XXVII. Pgs.
5-40 (2008)
DETERMINACIN DE METALES EN ALGAS MARINAS

DESTINADAS A LA ALIMENTACIN HUMANA
PRODUCIDAS Y PROCESADAS EN GALICIA: DESARROLLO
DE METODOLOGA ANALTICA AUTOMTICA
M. CARMEN YEBRA BIURRUN1
Departamento de Qumica Analtica, Nutricin y Bromatologa.
Facultad de Qumica. Universidad de Santiago de Compostela.
15782-Santiago de Compostela
mcarmen.yebra@usc.es
RESUMEN
Se ha propuesto un mtodo nuevo, simple, rpido y automtico basado en
la extraccin cida asistida con energa de ultrasonidos para la determinacin
de metales en algas. Los metales se determinaron en lnea por espectrometra
de absorcin atmica con llama utilizando un sistema de anlisis por
inyeccin en flujo. Se estudi la influencia de varias variables en la eficacia
del proceso de extraccin utilizando diseos experimentales. Adems, las
metodologas propuestas fueron evaluadas calculando el lmite de deteccin,
lmite de cuantificacin y precisin. La validacin se efectu analizando un
material de referencia certificado (NIES-9, Sargasso, National Institute
for Environmental Studies, Japan) y mediante estudios de recuperacin.
Finalmente, la metodologa propuesta se ha utilizado para la determinacin
de Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y Mg en algas marinas destinadas a la alimentacin
humana producidas y procesadas en Galicia.
Palabras clave: metales, extraccin cida continua, ultrasonidos, anlisis
por inyeccin en flujo, algas.
1
Premio de Investigacin Real Academia Galega de Ciencias-Fundacin Caixa Galicia,
convocatoria 2007.
Revista Real Academia Galega de Ciencias. Vol. XXVII
ABSTRACT
A new, simple, fast and automated method based on continuous
ultrasound-assisted acid extraction has been developed for the determination
of metals (Zn, Cu, Fe, Mn, Ca and Mg). The target metals have been on-line
monitoring by flame atomic absorption spectrometry by using a flow injection
analysis manifold. The influence of several extraction parameters on the
efficiency of metal leaching has been evaluated by using experimental designs.
Limits of detection and quantification and precision of the over all procedure
have been assessed. Method validation was performed analysing a seaweed
reference material (NIES-9, Sargasso, National Institute for Environmental
Studies, Japan) and by recovery studies. Finally, the developed continuous
extraction methodology has been applied to the determination of Zn, Cu, Fe,
Mn, Ca and Mg in edible seaweeds produced and processed in Galicia.
Key words: metals, continuous acid extraction, ultrasounds, flow injection
analysis, edible seaweeds.
INTRODUCCIN
Las algas se definen como plantas talofitas, unicelulares o pluricelulares
que viven de preferencia en el agua, tanto dulce como marina, y que, en
general, estn provistas de clorofila acompaada a veces de otros pigmentos
de colores variados que la enmascaran. El talo de las pluricelulares tiene
forma de filamento, de cinta o de lmina y puede ser ramificado. Aunque hay
muchas algas de agua dulce, la mayora vive en el mar. Dentro de stas, se
encuentran las algas unicelulares, microalgas o fitoplancton, las cuales son
microscpicas y representan el primer eslabn de la cadena alimenticia de
los animales acuticos. Adems, existen algas pluricelulares o macroalgas,
visibles al ojo humano y que normalmente se conocen como algas marinas
(Prez-Cirera Lpez-Nio, 2005). Entre las algas marinas macroscpicas se
pueden diferenciar cuatro grupos principales: Cyanophyta o algas azules,
Chlorophyta o algas verdes, Rhodophyta o algas rojas y Phaeophyceae o algas
pardas. Estos grupos se caracterizan no slo por los pigmentos que poseen,
sino tambin por la complejidad de su talo y sus mecanismos reproductivos
(Otero Schmitt et al., 2002). Sin embargo, tienen la caracterstica comn
de vivir sin raiz, y extraen su alimento y los nutrientes esenciales para su
crecimiento del agua del mar que les rodea. Desde hace mucho tiempo, el
hombre ha usado las algas con distintos fines para el medio ambiente y el ser
humano. Estas aplicaciones son:
- agropecuarias. Mejoran la produccin vegetal utilizadas como abono y
fertilizante, como corrector del pH de la tierra, e incluso como alimento para
el ganado.
- alimenticias. Las algas se han incorporado desde hace muchos siglos en
la dieta alimenticia, sobre todo en las culturas orientales y especialmente en
Japn, Corea y China, y en la poliacuicultura ecolgica, las algas sirven de
complemento diettico para peces o moluscos de granjas de cultivo.
- cosmticas. Los extractos de algas se emplean en productos para el
tratamiento de uas rotas, acn, arrugas, seborrea, e incluso para la cada del
cabello, el rejuvenecimiento de la piel, la obesidad o la celulitis. Asimismo,
su capacidad fotoprotectora se est utilizando para el desarrollo de cremas
solares.
- farmacolgicas. Las algas son muy utilizadas en la medicina tradicional
oriental.
- industriales. Para la optencin de ficocoloides: agarfitos (E-406),
alginatos (E-401 al E-405), y fundamentalmente carrageninas (E-407). El
agar se emplea en la elaboracin de medio de cultivo en laboratorio por
tener un gran poder gelificante. El agar tambin se aade como aditivo
gelificante y espesante (E-406) en gran cantidad de alimentos. Asimismo se
emplea en la industria fotogrfica y en la industria biotecnolgica (agarosa
para separaciones cromatogrficas y electroforticas). Las carrageninas son
polisacridos sulfatados muy apreciados por diversos tipos de industrias por
sus numerosas aplicaciones, normalmente alimentarias.
- medioambientales y energticas. Como restauradoras de zonas
contaminadas, depuradoras de efluentes o como bioindicadores para conocer
el estado de un determinado medio (Chaudhuri et al., 2007; Morrison et al.,
2007; Kamala-Kannan et al., 2008). Asimismo, su uso como combustible,
para generar biogs (metano), hidrgeno o biodiesel es otra lnea fructfera de
investigacin (Castell Orvay, 1993).
El consumo directo de algas en la alimentacin humana est muy
extendido en los pases orientales (China, Corea, Japn). Sin embargo, en las
ltimas dcadas, la demanda de algas para la alimentacin humana esta en

alza en pases occidentales (Gonzlez et al., 1998; Fernndez Saa, 2002). Las
algas ms apreciadas para la cocina son:
- wakame (Undaria pinnatifida): pertenece a las algas pardas y es
apreciada en la cultura oriental y muy abundante en las costas de Galicia.
Rica en calcio, yodo, protenas y fibra.
- Espagueti de Mar (Himanthalia elongata): es una alga parda, muy
sabrosa y frecuente en litorales profundos y aguas agitadas. Rica en fibra y
en hierro.
- Kombu (Laminaria ochroleuca, Laminaria hyperborea, Laminaria
saccharina): alga de gran tamao, color pardo y consistencia carnosa. Su
principal caracterstica es que es rica en cido glutmico que potencia el
sabor de los dems alimentos y es rica en minerales, especialmente calcio
y magnesio. La Laminaria saccharina tiene un sabor ligeramente dulce y es
llamada por ello Kombu de azcar.
- Dulse (Palmaria palmata): es un alga de color rojo rica en vitamina C,
protenas y potasio.
- Nori (Porphyra umbilicalis): es un alga de pequeo tamao y muchos
pliegues. En Galicia se encuentra silvestre en la bajamar. Tiene un sabor
intenso y destaca en protenas, vitamina A y vitamina B12.
- Osmundea (Osmundea pinnatifida): es un alga muy pequea, pero con
un intenso olor a mar. Muy difcil de coger ya que se encuentra bajo las rocas
en las que se cran los percebes.
- Codium (Codium tomentosum).
- Lechuga de mar (Ulva rigida): es un alga verde que recuerda mucho en
su apariencia a la lechuga.
- Agar-agar Atlntica, Gelatina de algas (Gelidium sesquipedale). Es
la fibra soluble extrada del alga Gelidium sesquipedale. Se suele emplear
como espesante y gelificante (E-406) y tambin muy usada en investigacin
(microbiologa).
- Musgo de Irlanda (Chondrus crispus): Se utiliza en su gran mayora
para la produccin industrial de carrageninas, pero tambin puede utilizarse
en cocina como espesante (E-407).
- Verdello (Enteromorpha Intestinalis): Es una alga verde del orden de

las Ulvales.
El anlisis composicional de las algas desvela que concentran del agua
del mar una amplia variedad de nutrientes esenciales: contenido elevado
en minerales esenciales (Ca, Na, K, Mg, Mn, P, Cl, Fe, Cu, Zn, I, etc.)
(Robledo y Freile Pelegrin, 1997; Rao et al., 2007). Algunas especies son
ricas en protenas. Presentan mayor cantidad en aminocidos esenciales
que las verduras. Contienen antioxidantes y son extremadamente ricas en
polifenoles, carotenoides, vitaminas E y C, clorofila, cidos grasos esenciales,
enzimas y fosfolpidos, que neutralizan los radicales libres y ayudan a retrasar
el envejecimiento. Adems, contienen vitamina A, vitamina B1, vitamina
B2, vitamina B9, vitamina B12 y vitamina K. Presentan un bajo contenido
calrico en relacin con otros alimentos, y como poseen cidos grasos
poliinsaturados de cadena larga (Omega-3 y Omega-6) ayudan a disminuir y
a regular el exceso de colesterol. Los glcidos que contienen se encuentran casi
exclusivamente en forma no asimilable (fibra). Por tanto, aportan poco valor
energtico. Contienen cido algnico que es un desintoxicante abundante en
las algas pardas laminarias (kombu) que ayuda a prevenir la contaminacin
de elementos radiactivos en el cuerpo.
El agua de mar contiene, de forma natural, pequeas concentraciones
de metales que no slo no resultan perjudiciales para el ecosistema sino
que son necesarios para el desarrollo de los organismos vivos. El problema
surge cuando se produce un aumento de concentracin y se convierten en
sustancias txicas para los organismos marinos o se acumulan en la cadena
trfica de forma que pueden convertirse en txicos para el hombre. Las
macroalgas bioconcentran los iones metlicos libres mediante dos procesos
fsico-qumicos. El primer proceso es rpido y reversible e involucra la
adsorcin del in metlico sobre la superficie externa de la pared celular. Este
proceso puede ser inico o por formacin de complejos con los ligandos de la
pared celular. Los polmeros que componen la pared celular son ricos en grupos
carboxlicos, fosforlicos, hidroxilos y aromticos que pueden ligar cationes o
producir complejos orgnicos que pueden influir la absorcin de metales. El
segundo mecanismo de incorporacin de metales es ms lento, esta regulado
por el metabolismo celular y los metales se almacenan en el citoplasma en
vacuolas ricas en polifenoles (Granan et al., 1992). Como producto de esta
acumulacin las algas pueden alcanzar contenidos de elementos traza varios
10
ordenes de magnitud ms elevados respecto a las aguas. Adems, hay que

tener en cuenta que las distintas especies de algas tienen diferentes afinidades
por los metales, por lo que su contenido metlico depende de la clase de
alga. La concentracin de metales puede variar en las diferentes partes del
alga, siendo normalmente mayor en las partes ms viejas, ya que han estado
ms tiempo expuestas al medio. Muchas especies muestran variaciones en la
concentracin de metales dependiendo de sus periodos de inmersin. Para
especies que vivan en el mismo hbitat, el contenido metlico depende de la
edad del alga. Otros factores que influyen en la concentracin metlica de
las algas son el rea geogrfica, temperatura del agua, pH, etc. (Villares et
al., 2002; Yamada et al., 2007).
En los procedimientos analticos en los que se tiene que eliminar la materia
orgnica y/o disolver la muestra, la etapa de pretratamiento de la muestra
constituye normalmente el taln de Aquiles del proceso analtico debido,
sobre todo, al tiempo que consume su realizacin. Por eso, la automatizacin
de las operaciones previas del proceso analtico es en la actualidad uno de los
objetivos principales de la Qumica Analtica. De esta manera, la preparacin
de la muestra es una etapa muy importante en la estrategia del anlisis. Por lo
que en todo procedimiento analtico es deseable que tenga lugar una mnima
manipulacin de la muestra, utilizando un pretratamiento lo ms sencillo
posible, lo cual adems, evita problemas de prdida y contaminacin de
analito(s). La seleccin del tipo de pretratamiento de la muestra depende de
la tcnica analitica que se va a utilizar para la determinacin de los metales.
Como la espectroscopa de absorcin atmica con llama es usualmente la
tcnica de determinacin elegida, sta requiere normalmente que las muestras
slidas estn disueltas para que la muestra pueda ser introducida en la fuente de
atomizacin. Los mtodos clsicos utilizados para la preparacin de muestras
vegetales implican la digestin por va seca (calcinacin) o la digestin por
va hmeda de las muestras (Knapp et al., 1975; Somenath, 2003; Munilla
et al., 1995). Los mtodos clsicos haciendo uso de una digestin por va
hmeda en recipientes abiertos son procedimientos laboriosos y tediosos,
y adems, estn sujetos a posibles errores por prdida de analito(s) y/o
contaminacin de la muestra. Otro inconveniente de este procedimiento es el
manejo de cidos concentrados y la generacin en el proceso de gases txicos
(xidos de nitrgeno). De la misma manera, los procesos que implican una
calcinacin de la muestra tambin presentan inconvenientes, ya que adems
de la prdida de analitos voltiles y la posibilidad de contaminacin de la
11
muestra, se pueden producir reacciones en las paredes del crisol. Tampoco

se deben olvidar las dificultades que se pueden producir al disolver el
residuo obtenido en la combustin (Meeravali y Sunil, 2000). Debido a estos
problemas, se han propuesto otros procedimientos para la preparacin de
muestras vegetales (Curdova et al., 1998; Zezzi Arruda, 2006). As, se han
utilizado procedimientos de digestin en va hmeda realizados en recipientes
cerrados y bajo la accin de la energa de microondas. Sin embargo, aunque
estos procesos son una buena alternativa para llevar a cabo la preparacin
de la muestra, ya que reducen el tiempo de pretratamiento en comparacin
con las metodologas clsicas, siguen presentando el inconveniente del uso de
cidos concentrados. Adems, como la muestra se disuelve completamente,
aumenta la probabilidad de que existan interferencias de matriz. Debido a estos
inconvenientes se han propuesto otras estrategias para realizar la preparacin
de muestras de origen vegetal. stas se basan en la calcinacin mediante lser,
en extraccin con lquidos a presin y en procesos de extraccin cida bajo la
accin de la energa de ultrasonidos. Sin embargo, las dos primeras propuestas
presentan los siguientes inconvenientes: elevado costo del equipo y dificultad
para realizar los procesos de manera automtica y miniaturizada (Ahlgren
et al., 1988; Saeed et al., 1999; Morales-Muoz, et al, 2007; Moreda-Pieiro
et al., 2007). Como la extraccin cida de metales asistida por la energa de
ultrasonidos no presenta estos inconvenientes, es hoy da una de las alternativas
ms vlidas para realizar el pretratamiento de las muestras slidas, includas
las de origen vegetal como las algas marinas (Luque Garcia y Luque de Castro,
2002; Luque de Castro y Priego Capote, 2007).
La energa de ultrasonidos facilita y acelera procesos como la disolucin
y la extraccin. Las muestras sometidas a energa de ultrasonidos se dispersan
de tal forma que originan una fina suspensin que se ataca fcilmente por
los reactivos (cidos o bases diludos). Los procesos de extraccin en un
bao de ultrasonidos proporcionan una mayor eficacia en la disolucin de
numerosos analitos de muestras complejas y reducen la duracin del proceso
en comparacin con los mtodos clsicos de extraccin. Esta metodologa
proporciona recuperaciones entre el 94-100%, con una buena reproducibilidad
para la mayora de los metales. Los metales son extrados generalmente con
cidos diluidos, lo que hace que no se disuelva la matriz de la muestra, evitndose
de esta forma las interferencias que puede producir en la determinacin de el
(los) analito(s) (Priego Capote y Luque de Castro, 2004; Luque de Castro y
Priego Capote, 2007).
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En lo que se refiere a la determinacin de metales en muestras de vegetales

y plantas, se han propuesto varias metodologas basadas en la extraccin cida
asistida por energa de ultrasonidos. As, se han determinado Ba, Ca, Cd, Cu,
Mg, Ni, Pb, Sr y Zn en diversos tejidos vegetales y plantas (Lavilla et al., 1998;
Filgueiras et al., 2002; Nascentes et al., 2001; Borkowska-Burnecka et al., 2003)
y As, Ba, Ca, Na, Mg, Cd, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Ni, Pb, V y Zn en algas
(Dominguez-Gonzalez et al., 2005; Ladra-Ramos et al., 2005).
La extraccin continua de metales en muestras slidas usando energa
de ultrasonidos llevada a cabo en un dispositivo automtico basado en
el anlisis por inyeccin en flujo (FIA) ha resultado ser una metodologa
rpida, sencilla y cuantitativa para el pre-tratamiento de muestras slidas
(Ruiz-Jimnez et al., 2003; Moreno-Cid et al., 2004; Yebra et al., 2005). Otras
ventajas que presenta esta metodologa en comparacin con la alternativa no
automtica comentada en el apartado anterior son las siguientes: reduccin
de la contaminacin de la muestra y de las prdidas de analito debido a una
mnima manipulacin de la muestra, bajo consumo de reactivos y de muestra
(el sistema es miniaturizado), disminucin considerable del tiempo de
tratamiento de la muestra, se evitan las etapas de centrifugacin y filtracin
para la separacin de la fase lquida del residuo slido (matriz de la muestra)
e incremento de la calidad de la metodolga analtica.
Este procedimiento combina los beneficios de la extraccin asistida con
energa de ultrasonidos con los obtenidos por los sistemas FIA (Valcrcel y
Luque de Castro, 1987). Estos mtodos automticos todava no se han propuesto
para la extraccin cida asistida por energa de ultrasonidos de metales y su
posterior determinacin en muestras de algas, siendo por primera vez objeto
de estudio y aplicacin en este trabajo de investigacin.
JUSTIFICACIN DEL TRABAJO
El mar es muchas veces el destino final de los contaminantes generados
por los seres humanos. Los metales pesados son uno de estos contaminantes.
El problema surge cuando se produce un aumento de concentracin y se
convierten en sustancias txicas para los organismos marinos o acumularse en
la cadena trfica de forma que pueden convertirse en txicos para el hombre.
Los productos marinos, entre los que se encuentran las algas, forman parte hoy
da de la dieta humana. Por lo que sera interesante conocer su composicin en
13
lo que se refiere a metales para establecer su valor nutricional y para determinar

su seguridad alimentaria. Las algas se utilizan como bioindicadores de la
contaminacin ambiental, con lo cual tambin es importante conocer su
contenido metlico para establecer el grado de contaminacin por metales
del medio ambiente marino de donde proceden. Hasta la fecha no se han
propuesto mtodos analticos automticos para la determinacin de metales
en muestras de algas.
Todo ello justifica la necesidad de proponer metodologas analticas
automticas para utilizar de manera rutinaria en laboratorios de control de
calidad de alimentos y en laboratorios de control de calidad del medio marino.
Estos mtodos permitirn realizar de manera rpida y fiable un control riguroso
del contenido metlico en organismos marinos como son las algas.
PARTE EXPERIMENTAL
En este trabajo de investigacin se ha realizado la determinacin de
metales en algas marinas destinadas a la alimentacin humana producidas
y procesadas en Galicia. Para llevar a cabo este estudio se han optimizado
dispositivos basados en el anlisis por inyeccin en flujo (FIA) que permiten
realizar en lnea la extraccin cida asistida por energa de ultrasonidos de los
metales de las muestras de algas y la determinacin continua de los mismos
por FAAS.
Reactivos, aparatos e instrumentacin analtica
cido ntrico (Merck): 65%, d=1,39 g/mL, Pm= 63,01 g/mol, cido
clorhdrico (Merck): 30%, d=1,15 g/mL, Pm=36,46 g/mol, agua ultrapura
de 18,2 M cm de resistividad especfica, obtenida por el sistema Milli-Q
(Millipore Corp.), disolucin patrn de cinc (Merck): 1000 mg/L (Zn (NO3)2 en
HNO3 0,5 mol/L), disolucin patrn de cobre (Merck): 1000 mg/L (Cu(NO3)2
en HNO3 0,5 mol/L), disolucin patrn de hierro (Merck): 1000 mg/L
(Fe(NO3)3 en HNO3 0,5 mol/L), disolucin patrn de manganeso (Merck): 1000
mg/L (Mn(NO3)2 en HNO3 0,5 mol/L), disolucin patrn de calcio (Merck):
1000 mg/L (Ca (NO3)2 en HNO3 0,5 mol/L), disolucin patrn de magnesio
(Merck): 1000 mg/L (Mg (NO3)2 en HNO3 0,5 mol/L). Cloruro de lantano (III)
heptahidratado (LaCl37 H2O) (Merck). Agua ultrapura de 18,2 M cm de
resistividad especfica, obtenida por el sistema Milli-Q (Millipore Corp.).
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Bombas peristlticas GILSON MINIPULS 3, con ocho canales y

selector de velocidad. Minicolumna de vidrio borosilicatado qumicamente
inerte (Omnifit) de 3 mm de dimetro interno y 100 mm de longitud con
dos terminales fijos y 0,70 mL de volumen de lecho. En esta minicolumna se
introduce la muestra, colocando, en cada uno de sus extremos, un papel de
filtro (Whatman 541) para evitar cualquier obturacin de sistema por prdida
de muestra durante el proceso (Figura 1).
Figura 1. Minicolumna conteniendo la muestra.
Ultrasonidos Selecta de 550 watios de potencia con selector de temperatura

y tiempo programable. Frecuencia de ultrasonidos 40 kHz. Vlvulas de
seleccin y de inyeccin de tipo hexagonal (Rheodyne). Espectrofotmetro
de Absorcin Atmica Perkin Elmer, modelo 5000, con llama aire-acetileno y
sistema nebulizador de bola de impacto y mechero de 10 cm.
Todo el material de vidrio y plstico fue lavado y almacenado en cido
ntrico al 10% (V/V) al menos durante 48 h. Antes de ser utilizado se enjuag
tres veces con agua ultrapura (Milli-Q).
Preparacin de las muestras de algas
Para poder llevar a cabo los anlisis de las muestras, stas han sido
trituradas y homogeneizadas. Una vez homogeneizadas, se secaron en una
estufa a 80 5 C hasta tener las muestras a peso constante. Despus se
tamizaron para conseguir fracciones de partculas menores de 30 m y
partculas entre 30-200 m.
Procedimiento para la determinacin de cinc, cobre, hierro y
manganeso
El esquema de trabajo del mtodo optimizado para la determinacin
de Zn, Cu, Fe y Mn en algas marinas utilizando el dispositivo FIA
15
propuesto (Figura 2) es el siguiente: En una primera etapa se realiza la

extraccin de Zn, Cu, Fe y Mn. Para ello se inserta con cuidado y se pesa
Figura 2. Dispositivo FIA usado para la determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn en muestras

de algas mostrando los valores ptimos. AU, agua ultrapura (portador); B, blanco; BU, bao
de ultrasonidos; B1 y B2, bombas peristlticas; D, desecho; DE, disolucin extractante; DP,
disolucin patrn; FAAS, espectrofotmetro de absorcin atmica con llama; M, columna
conteniendo la muestra; RM, reactor de mezcla; VI, vlvula de inyeccin; VS1, VS2 y VS3,
vlvulas de seleccin.
directamente en la minicolumna la muestra de alga marina seca, triturada y

homogeneizada (10, 80, 10 y 25 mg, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente).
Posteriormente, se colocan dos papeles de filtro en los extremos de la columna
para evitar prdidas de muestra a travs del sistema. Una vez preparada la
minicolumna, se conecta en el sistema de flujo continuo, se llena el sistema
de disolucin extractante por medio de la VS1 (1 mL de cido ntrico 0,1M;
3 M; 3M y 0,5 M para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente), manteniendo la
temperatura del bao a 20 C (temperatura ambiente). Despus, se somete
a la minicolumna a la accin de la energa de ultrasonidos durante 0,5 min
para el Zn y el Mn, y 1 min para el Cu y el Fe, a la vez que circula a su
travs la disolucin extractante. El sentido del movimiento de la disolucin
extractante que circula a travs de la columna a 6 mL/min se cambia cada
10-15 s para que no se produzcan compactaciones de la muestra en el interior
de la columna. Una vez realizada la extraccin de los metales de la muestra,
se gira la vlvula de seleccin (VS2) pasando el extracto cido a la segunda
parte del sistema, mientras que la disolucin blanco va al desecho. En esta
parte, el extracto cido se homogeneiza en un reactor de mezcla (RM). Tras
ser homogeneizado, se inyectan 250 L de extracto cido en una corriente
portadora (agua ultrapura) a travs de una vlvula de inyeccin (VI). Esta
16
disolucin portadora que circula a un caudal de 3,5 mL/min, transporta el

bolo de muestra hasta el nebulizador de un espectrofotmetro de absorcin
atmica con llama (FAAS), donde se detectan los metales de forma continua.
Para realizar las rectas de calibrado se introducen secuencialmente en el
sistema FIA disoluciones patrn de distintas concentraciones de cada metal
(preparadas en cido ntrico 0,1 M para el Zn, 3 M para el Cu y el Fe, y 0,5
M para el Mn). El volumen inyectado de cada disolucin patrn a travs de la
vlvula de inyeccin (VI) en la disolucin portadora es de 250 mL (igual que
el de la muestra). La disolucin blanco es cido ntrico 0,1 M para el Zn, 3 M
para el Cu y el Fe, y 0,5 M para el Mn.
Procedimiento para la determinacin de calcio y magnesio
El esquema de trabajo del mtodo optimizado para la determinacin
de Ca y Mg en algas marinas utilizando un dispositivo FIA (Figura 3) es el
siguiente: Primero se
Figura 3. Dispositivo FIA usado para la determinacin de Ca y Mg en muestras de

algas mostrando los valores ptimos. AU, agua ultrapura (portador); B, blanco; BU, bao
de ultrasonidos; B1 y B2, bombas peristlticas; D,desecho; DE, disolucin extractante; DIL,
canal de dilucin (disolucin de lantano); DP, disolucin patrn; FAAS, espectrofotmetro
de absorcin atmica con llama; M, columna conteniendo la muestra; RM, reactor de mezcla;
VI, vlvula de inyeccin; VS1, VS2 y VS3, vlvulas de seleccin.
realiza la extraccin de Ca y Mg. Para ello se inserta con cuidado y se pesa

directamente en la minicolumna la muestra de alga marina seca, triturada
y homogeneizada (30 mg para la determinacin de Ca y 5 mg para la
determinacin de Mg). Despus, se colocan dos papeles de filtro en los
extremos de la columna para evitar prdidas de muestra a travs del sistema.
17
Una vez preparada la minicolumna, se conecta en el sistema de flujo continuo,

se llena el sistema de disolucin extractante por medio de la VS1 (5 mL de
cido ntrico 3 M para Ca y 0,5 M para Mg), manteniendo la temperatura del
bao a 20 C (temperatura ambiente). Despus, se somete a la minicolumna a
la accin de la energa de ultrasonidos durante 0,5 min, a la vez que circula a
su travs la disolucin extractante. El sentido del movimiento de la disolucin
extractante que circula a travs de la columna a 6 mL/min se cambia cada
10-15 s para que no se produzcan compactaciones de la muestra en el interior
de la columna. Una vez realizada la extraccin de los metales de la muestra,
se gira la vlvula de seleccin (VS2) pasando el extracto cido a la segunda
parte del sistema, mientras que la disolucin blanco va al desecho. En esta
parte, el extracto cido se homogeneiza en un reactor de mezcla (RM). Tras
ser homogeneizado, se inyectan 250 L de extracto cido en una corriente
portadora (agua ultrapura) a travs de una vlvula de inyeccin (VI). Esta
disolucin portadora que circula a un caudal de 0,2 mL/min converge con un
canal de dilucin (lantano 2%) que circula a 5,8 mL/min. El canal resultante
que contiene el extracto cido diluido llega directamente hasta el nebulizador
de un espectrofotmetro de absorcin atmica con llama (FAAS), donde se
detectan los metales de forma continua. Para realizar las rectas de calibrado se
introducen secuencialmente en el sistema FIA 2 disoluciones patrn de distintas
concentraciones de cada metal (preparadas en cido ntrico 3 M para Ca y 0,5
M para Mg) a travs de la vlvula de inyeccin (VI). El volumen inyectado de
cada disolucin patrn en la disolucin portadora es de 250 mL (igual que el
de la muestra). Las distintas disoluciones patrn sufren la misma dilucin en
Tabla 1. Determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn. Variables y nivelesconsiderados para el
diseo factorial de screening.
lnea que las muestras. La disolucin blanco es cido ntrico 3 M para el Ca,
y 0,5 M para el Mg.
18
RESULTADOS Y DISCUSIN
Determinacin de cinc, cobre, hierro y manganeso
Para realizar la optimizacin de los parmetros que afectan a la extraccin
de Zn, Cu, Fe y Mn de las muestras de algas, se ha utilizado un diseo factorial
debido a que el nmero de variables implicadas es elevado (6 variables). As,
es necesario aplicar un diseo factorial de screening, para reducir de modo
significativo el nmero de experimentos a realizar en la optimizacin. Uno de
los diseos de screening ms utilizados es el diseo de Plackett-Burman. ste
permite fraccionar un diseo factorial completo proporcionando nmeros de
combinaciones de factores que son un mltiplo de cuatro. Por ejemplo, si se
aplicara un diseo factorial completo a 2 niveles para 6 variables implicara
la realizacin de 64 experimentos. Sin embargo, aplicando el diseo de
Plackett-Burman con un punto central, el nmero de experimentos a realizar
es de trece. As, las variables a optimizar para el dispositivo FIA 1 son las
siguientes: concentracin de HNO3 (disolucin extractante), concentracin de
HCl (disolucin extractante), tiempo de extraccin,
Tabla 2. Determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn. Concentracin certificada y cantidad
de muestra analizada del material de referencia Sargasso, NIES-9, National Institute for
Environmental Studies, Japan.
temperatura de extraccin, caudal de extraccin y volumen de disolucin

extractante. Para poder realizar este diseo factorial es necesario considerar
para cada variable dos niveles (valor mximo y mnimo). Estos valores
fueron seleccionados en funcin de experimentos realizados en estudios
previos (Tabla 1).
El diseo factorial aplicado es el de Plackett-Burman 2^6*3/16 que
implica realizar 13 experimentos (Statgraphics Plus v.5.1). En este diseo se ha
19
considerado un punto central en el que las variables toman un valor medio entre
el lmite superior e inferior. Una vez obtenida la matriz del diseo, se realizaron
los experimentos fijados por la misma. Para realizar estos experimentos se
utiliz un material de referencia certificado (NIES-9,Sargasso, National
Institute for Environmental Studies, Japan). La concentracin certificada para
Zn, Cu, Fe y Mn, y la cantidad de material de referencia utilizada (fijada
en funcin de la concentracin) para optimizar el proceso se muestran
en la Tabla 2.
La variable respuesta considerada ha sido el % eficacia en la extraccin
(% EF), calculado segn la siguiente ecuacin:
La matriz del diseo de Plackett-Burman con los valores que toma cada
variable en cada experimento y el % eficacia en la extraccin
Tabla 3. Matriz del diseo de Plackett-Burman con los valores de % EF para cada
variable en cada experimento para la determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn. A, [HNO3]; B,
[HCl]; C, Tiempo de extraccin; D, Temperatura de extraccin; E, Caudal de extraccin; F,
Volumen de disolucin extractante.
20
obtenido para el Zn, Cu, Fe y Mn, se recogen en la Tabla 3. Los experimentos

se han realizado por duplicado, por lo que el % eficacia en la extraccin
indicada es la media de estos dos experimentos.
Una vez realizados los experimentos, se procede al anlisis de los datos.
Para conocer que variables son significativas se recurre a las Cartas Pareto
estandarizadas (Figura 4).
Figura 4. Cartas Pareto estandarizadas para la determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn. A,

[HNO3]; B, [HCl]; C, Tiempo de extraccin; D, Temperatura de extraccin; E, Caudal de
extraccin; F, Volumen de disolucin extractante.
A partir de la observacin de las cartas Pareto (Figura 4) se pueden

establecer las siguientes conclusiones en funcin de cada variable:
Concentracin de cido ntrico (A): En todos los casos la concentracin
de HNO3 es una variable estadsticamente significativa con efecto estimado
positivo. Esto se debe a su efecto oxidante, el cual facilita el proceso de
extraccin.
21
Concentracin de cido clorhdrico (B): No es una variable

estadsticamente significativa. Aunque presenta un efecto estimado positivo
para la extraccin de Zn, Cu, Fe y Mn.
Tiempo de extraccin (C): No es una variable estadsticamente
significativa. Aunque presenta un efecto estimado positivo para la extraccin
de Zn, Cu, Fe y Mn, ya que cuanto ms tiempo permanezca la muestra bajo
la accin de la energa de ultrasonidos mayor contacto se produce entre la
muestra y la disolucin extractante, y por tanto se logra una mayor eficacia
en la extraccin. Sin embargo, tiempos de sonicacin elevados suponen
elevados tiempos de anlisis y por lo tanto una reduccin de la frecuencia de
muestreo.
Temperatura de extraccin (D): No es una variable estadsticamente
significativa, y presenta efectos estimados muy pequeos en todos los casos.
Esto indica que esta variable prcticamente no influye en el proceso de
extraccin.
Caudal de extraccin (E): Para ninguno de los cuatro metales es una
variable estadsticamente significativa. Aunque presenta un efecto estimado
positivo.
Volumen de disolucin extractante (F): En ninguno de los casos es una
variable estadsticamente significativa y siempre presenta un efecto estimado
positivo, aunque ste no es muy elevado.
Como el diseo de Plackett-Burman proporciona las tendencias de cada
una de las variables hacia el ptimo, y no el valor optimo en s mismo, se
realizaron una serie de experimentos fuera del marco del diseo, de acuerdo
con los resultados obtenidos por el mismo, para determinar los valores ptimos
de cada una de las variables que afectan a la extraccin de Zn, Cu, Fe y Mn.
Comenzando por aquellas variables no significativas se comprueba que un
volumen de disolucin extractante de 1 mL y una temperatura de extraccin
de 20C pueden ser los valores ptimos para estas variables, ya que con ellos
se obtienen eficacias en la extraccin cuantitativas (experimentos 1 y 3 de la
matriz de Plackett-Burman, Tabla 3).
En el estudio de las variables tiempo de extraccin y caudal de extraccin
(Figura 5) se observa que, a pesar de que el tiempo de extraccin tiene un
efecto estimado bastante positivo, son suficientes 0,5, 1, 1 y 0,5 min a un
22
caudal de 6 mL/min para extraer cuantitativamente el Zn, Cu, Fe y Mn en este

tipo de muestras. As, stos valores sern elegidos como ptimos para estas
variables, ya que con ellos se alcanza la frecuencia de muestreo ms elevada
Figura 5. Optimizacin del tiempo de extraccin para Zn, Cu, Fe y Mn para caudales
de extraccin de 3,5 y 6 mL/min. [HNO3]=3 M; [HCl]=3 M; Temperatura de extraccin= 20
C; Volumen de disolucin extractante= 1 mL.
Con respecto a las concentraciones de los cidos, se estudi la posibilidad

de eliminar el cido clorhdrico, ya que su concentracin result ser una
variable no estadsticamente significativa en el diseo de screening. As, los
estudios realizados deteminaron que si se elimina de la disolucin extractante
este cido (utilizando nicamente HNO3 3M como disolucin extractante)
se obtienen eficacias en la extraccin cuantitativas (95,3-100,5%), lo cual
tambin se puede corroborar con los experimentos 1 y 4 de la matriz de
Plackett-Burman, Tabla 3). Una vez comprobado que se poda eliminar el cido
clorhdrico de la disolucin extractante, se estudi la posibilidad de disminuir
la concentracin de HNO3 al mximo. Como se observa en la Figura 6, fue
posible disminuir la concentracin de este cido hasta un valor de 0,1 M para
la extraccin del Zn y 0,5 M para la extraccin del Mn, mientras que para la
extraccin de Cu y Fe la mnima concentracin de cido ntrico necesaria
para extraer cuantitativamente estos metales deba ser de 3M.
23
Figura 6. Optimizacin de la concentracin de cido ntrico utilizado como disolucin

extractante para Zn, Cu, Fe y Mn. [HCl]=0 M; Tiempo de extraccin= 0,5 min para Zn, y Mn
y 1 min para Cu y Fe; Temperatura de extraccin= 20 C; Caudal de extraccin= 6 mL/min;
Volumen de disolucin extractante= 1 mL.
Al realizar la optimizacin de las distintas variables que afectan al proceso

de extraccin cida se han utilizado las cantidades de muestra indicadas en
la Tabla 2. No obstante, tambin se ha investigado la posibilidad de analizar
cantidades de muestra mayores con el objetivo de incrementar la sensibilidad
de la metodologa analtica desarrollada. Para realizar este estudio se ha tenido
en cuenta la sensibilidad de cada uno de los metales en el espectrofotmetro
de absorcin atmica con llama y la concentracin normalmente existente en
las muestras de algas. As, los resultados obtenidos en este estudio para Zn,
Cu, Fe y Mn demostraron que con las condiciones ptimas es posible utilizar
cantidades de muestra hasta 60, 100, 25 y 90 mg, para Zn, Cu, Fe y Mn,
respectivamente. Cantidades mayores no se probaron porque esto requerira
incorporar un canal de dilucin en el dispositivo para no sobrepasar el lmite
de linealidad del detector.
Los estudios anteriores se realizaron con el material de referencia
certificado NIES-9, el cual presenta un dimetro de partcula de 80 mesh
(177 m). Por tanto, con el objetivo de estudiar si esta variable influye en
el proceso de extraccin de Zn, Cu, Fe y Mn de las muestras de algas se
analizaron diferentes porciones de la misma muestra con diferentes tamaos
de partcula. Los dimetros de partcula estudiados fueron dos: 1) partculas
de muestra con dimetros menores de 30 m y 2) partculas de muestra con
dimetros entre 30-200 m. Para realizar el estudio de la influencia del tamao
de partcula, se tom una muestra real de alga, de la que se seleccionaron
24
los dos tamaos de partcula anteriormente citados. En consecuencia, para

poder comparar los resultados obtenidos por el mtodo propuesto para cada
tamao de partcula fue necesario establecer la concentracin de los metales
en cada fraccin de muestra. Para ello, se realiz la determinacin de los
metales utilizando como pretratamiento de la muestra una digestin cida,
ya que sta es una metodologa contrastada y convencional para este tipo
de muestras (Chan et al., 2006). De este modo, fue posible correlacionar los
valores obtenidos con cada metodologa (la propuesta y la convencional) para
cada tamao de partcula estudiado. En la Tabla 4 se muestran los resultados
obtenidos, demostrndose que en el intervalo estudiado el tamao de partcula
no influye en la determinacin de estos metales con la metodologa propuesta,
ya que en todos los casos se obtienen %EF cuantitativos (mayores de 95%).
Esto simplifica el anlisis, ya que no hay que realizar un tamizado exhaustivo
para seleccionar un tamao de partcula concreto y muy pequeo de la
muestra antes de insertarla en el dispositivo automtico de determinacin de
los metales.
Determinacin de calcio y magnesio
Para realizar la optimizacin de los parmetros que afectan a la
extraccin de Ca y Mg de las muestras de algas, tambin se ha utilizado
un diseo factorial. Al igual que en el estudio de la optimizacin de las
Tabla 4. Determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn. Experimentos realizados en porciones de
muestra con diferente tamao de partcula.
*DA: Digestin cida de la muestra

**MP: Mtodo propuesto
25
variables implicadas en la extraccin de Zn, Cu, Fe y Mn, se ha elegido

como diseo de screening el diseo de Plackett-Burman. En este caso, las
variables a optimizar para el dispositivo FIA (Figura 3) son las siguientes:
concentracin de HNO3 (disolucin extractante), concentracin de HCl
(disolucin extractante), tiempo de extraccin, temperatura de extraccin,
caudal de extraccin, volumen de disolucin extractante y concentracin
de la disolucin de lantano. Como se puede observar, se ha incluido como
variable la concentracin de lantano, a pesar de no ser una variable implicada
directamente en el proceso de extraccin. Esto se explica porque para poder
realizar la determinacin tanto del calcio como del magnesio, es necesario
eliminar las posibles interferencias qumicas que sufren estos dos metales
en la celda de atomizacin. Adems, el extracto cido debe diluirse, ya que
las concentraciones de estos dos metales presentes en las muestras objeto de
estudio son muy elevadas. De hecho, segn el lmite de linealidad de estos
metales, 5 y 0,5 g/mL, para Ca y Mg, respectivamente, y teniendo en cuenta
las concentraciones a las que se pueden encontrar estos metales en las algas
marinas, se escogieron respectivamente, como caudal de portador y caudal de
dilucin 0,2 y 5,8 mL/min, lo que supone realizar en lnea una dilucin 1:30. Para
realizar el diseo de screening es necesario considerar para cada variable un
valor mximo y uno mnimo. Estos valores fueron seleccionados en funcin
de experimentos realizados en estudios previos (Tabla 5).
Tabla 5. Determinacin de Ca y Mg. Variables y niveles considerados para el diseo
factorial de screening.
26
El diseo factorial aplicado es el de Plackett-Burman 2^7*3/32 que implica

realizar 13 experimentos (considerando un punto central) (Statgraphics Plus
v.5.1). Para realizar los experimentos establecidos por la matriz del diseo
se utiliz el material de referencia certificado (NIES-9,Sargasso, National
Institute for Environmental Studies, Japan). La concentracin certificada es
de 1,34 0,05 y 0,65 0,03 %, para Ca y Mg, respectivamente. La cantidad de
material de referencia utilizada para optimizar el proceso (fijada en funcin de
la concentracin) fue de 30 y 5 mg, para Ca y Mg, respectivamente. La variable
respuesta considerada ha sido el % EF. La matriz del diseo de Plackett-Burman
con los valores que toma cada variable en cada experimento y el % EF obtenido
para el Ca y el Mg, se muestran en la Tabla 6. Los experimentos se han realizado
Tabla 6. Matriz del diseo de Plackett-Burman con los valores de % EF para cada
variable en cada experimento para la determinacin de Ca y Mg. A, [HNO3]; B, [HCl]; C,
Tiempo de extraccin; D, Temperatura de extraccin; E, Caudal de extraccin; F, Volumen
de disolucin extractante; G, concentracin de la disolucin de lantano.
por duplicado, por lo que el % EF indicada es la media de estos dos

experimentos.
Una vez realizados los experimentos, se analizaron los datos mediante las
Cartas Pareto estandarizadas (Figura 7).
27
Figura 7. Cartas Pareto estandarizadas para la determinacin de Ca y Mg. A, [HNO3];

B, [HCl]; C, Tiempo de extraccin; D, Temperatura de extraccin; E, Caudal de extraccin;
F, Volumen de disolucin extractante; G, Concentracin de la disolucin de lantano.
A partir del estudio de las cartas Pareto (Figura 7) se pueden establecer

las siguientes conclusiones en funcin de cada variable:
Concentracin de cido ntrico (A): Para Ca y Mg la concentracin de
HNO3 es una variable estadsticamente significativa con efecto estimado
positivo.
Concentracin de cido clorhdrico (B): No es una variable estadsticamente
significativa, aunque presenta un efecto estimado positivo para la extraccin
de Ca y Mg.
Tiempo de extraccin (C): No es una variable estadsticamente significativa.
Aunque presenta un efecto estimado positivo para la extraccin de Ca y Mg.
Temperatura de extraccin (D): No es una variable estadsticamente
significativa, y presenta efectos estimados muy pequeos para la extraccin
de Ca y Mg. Esto indica que esta variable prcticamente no influye en el
proceso de extraccin.
Caudal de extraccin (E): No es una variable estadsticamente significativa
para la extraccin de estos dos metales. Aunque presenta un efecto estimado
positivo.
Volumen de disolucin extractante (F): En ninguno de los casos es una
variable estadsticamente significativa y siempre presenta un efecto estimado
positivo, aunque ste no es muy elevado.
28
Concentracin de la disolucin de lantano (G): Para Ca y Mg la

concentracin de la disolucin de lantano es una variable estadsticamente
significativa con efecto estimado positivo. Esto demuestra que es necesaria
esta disolucin para eliminar las interferencias producidas por la formacin
de compuestos estables a la temperatura de llama.
Se realizaron una serie de experimentos fuera del marco del diseo,
de acuerdo con los resultados obtenidos por el mismo, para determinar los
valores ptimos de cada una de las variables que afectan a la extraccin de
Ca y Mg. Se comenz por aquellas variables no significativas y se comprob
que un volumen de disolucin extractante de 5 mL y una temperatura de
extraccin de 20C pueden ser los valores ptimos para estas variables, ya que
con ellos se obtienen eficacias en la extraccin cuantitativas (experimento 1
de la matriz de Plackett-Burman, Tabla 6). Si se tiene en cuenta que el caudal
de extraccin presenta un efecto estimado positivo y que en los experimentos
5 y 11 de la matriz de Plackett-Burman (Tabla 6) se consiguen eficacias en
la extraccin cuantitativas, un caudal de extraccin de 6 mL/min poda ser
considerado como ptimo para la extraccin de Ca y Mg.
Al estudiar el tiempo de extraccin (Figura 8) se puede ver que aunque
esta variable presenta un efecto estimado bastante importante y positivo, son
suficientes 0,5 min para extraer cuantitativamente el Ca y el Mg en este tipo
de muestras.
Figura 8. Optimizacin del tiempo de extraccin para Ca y Mg. [HNO3]=3 M; [HCl]=3

M; Temperatura de extraccin= 20 C; Caudal de extraccin= 6 mL/min; Volumen de
disolucin extractante= 1 mL; Concentracin de la disolucin de lantano= 2%.
29
Adems, se estudi la posibilidad de eliminar el cido clorhdrico de la

disolucin extractante, ya que su concentracin result ser una variable no
estadsticamente significativa en el diseo de screening. As, los estudios
realizados deteminaron que si se elimina se obtienen eficacias en la
extraccin cuantitativas (98,7-101,7%), lo cual tambin se puede corroborar
con los experimentos 1 y 11 de la matriz de Plackett-Burman, Tabla 6). Una
vez comprobado que se poda eliminar el cido clorhdrico de la disolucin
extractante, se estudi la posibilidad de disminuir la concentracin de cido
ntrico al mximo. Como se observa en la Figura 9, fue posible disminuir la
concentracin de este cido hasta un valor de 0,5 M para la extraccin del
Mg, mientras que para la extraccin de Ca la mnima concentracin de cido
ntrico necesaria para extraer cuantitativamente este metal deba ser de 3M.
Figura 9. Optimizacin de la concentracin de cido ntrico utilizado como disolucin

extractante para Ca y Mg. [HCl]=0 M; Tiempo de extraccin= 0,5 min; Temperatura de
extraccin= 20 C; Caudal de extraccin= 6 mL/min; Volumen de disolucin extractante= 5 mL;
Concentracin de la disolucin de lantano= 2%.
Por ltimo, se estudi la variable concentracin de la disolucin de

lantano. As, se comprob que para ambos metales, la concentracin de la
disolucin de lantano, necesaria para eliminar las interferencias, no poda ser
menor del 2%.
Al realizar la optimizacin de las distintas variables que afectan al proceso
de extraccin cida se han utilizado las cantidades de muestra antes indicadas.
30
En este caso, tambin se ha investigado la posibilidad de analizar cantidades

de muestra mayores con el objetivo de incrementar la sensibilidad de la
metodologa analtica desarrollada. Para realizar este estudio se ha tenido en
cuenta la sensibilidad de ambos metales en el espectrofotmetro de absorcin
atmica con llama y la concentracin normalmente existente en las muestras
de algas. Los resultados obtenidos en este estudio demostraron que con las
condiciones ptimas establecidas es posible utilizar cantidades de muestra
hasta 50 y 10 mg, para Ca y Mg, respectivamente. Cantidades mayores no se
probaron porque esto requerira aumentar el caudal del canal de dilucin del
dispositivo FIA para no sobrepasar el lmite de linealidad del detector.
Se analizaron diferentes porciones de la misma muestra de alga con
diferentes tamaos de partcula (menor de 30 y entre 30 - 200 m) con el
objetivo de estudiar si la variable tamao de partcula influa en el proceso de
extraccin de Ca y Mg de las muestras de algas. En la Tabla 7 se muestran los
resultados obtenidos, demostrndose que en el intervalo estudiado el tamao
de partcula no influye en la determinacin de estos metales con la metodologa
propuesta, ya que en todos los casos se obtienen %EF cuantitativos.
Tabla 7. Determinacin de Ca y Mg. Experimentos realizados en porciones de muestra
con diferente tamao de partcula.
*DA: Digestin cida de la muestra

**MP: Mtodo propuesto
Caractersticas analticas de los mtodos propuestos para la determinacin

de Zn, Cu, Fe y Mn en muestras de algas
Con el objetivo de estudiar las posibles interferencias que puede provocar
la matriz de la muestra, es decir la influencia de los dems componentes de
31
las algas, se compar para cada uno de los casos la pendiente de la recta de
calibrado con la obtenida para la recta de adicin. Los resultados obtenidos
aparecen en la Figura 10. Como se puede observar en esta Figura, en todos
los casos la recta de calibrado y la recta de adicin son paralelas. Dicho
paralelismo se corrobor mediante la aplicacin de un test estadstico t para
un nivel de significacin del 95%. Por todo ello, se puede decir que no existe
efecto matriz para la determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn en las muestras de
algas por el mtodo propuesto. Lo que se traduce en que se puede utilizar
nicamente la recta de calibrado correspondiente para relacionar la seal de
la muestra con la concentracin existente de cada metal.
Figura 10. Rectas de calibrado y adicin para Zn, Cu, Fe y Mn.
Se calcul el lmite de deteccin (LOD), el lmite de cuantificacin (LOQ)

y el intervalo lineal teniendo en cuenta distintas cantidades de muestra para
la determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn en muestras de algas por el mtodo
propuesto. Los resultados obtenidos para cada uno de estos parmetros se
muestran en la Tabla 8.
La comprobacin de la exactitud de la metodologa analtica propuesta se
realiz de tres maneras: realizando el test de pares de valores (comparacin con
32
un mtodo convencional de pretratamiento de la muestra realizando la digestin

de la misma con cidos concentrados), estudio de la recuperacin analtica y
mediante la utilizacin de un material de referencia. Los valores obtenidos en
el test de pares de valores sobre diferentes muestras resultaron comparables
estadsticamente al 95% de probabilidad, es decir, no hay diferencias entre los
resultados obtenidos por los dos mtodos. El estudio de la recuperacin del
mtodo se realiz analizando una muestra real de alga. En el anlisis de esta
muestra se utilizaron disoluciones extractantes (HNO3 0,1M para Zn, HNO3 3 M
para Cu y Fe, y HNO3 0,5 M para Mn) a las que se le haban adicionado distintas
concentraciones de cada metal (0,1; 1,0; 1,0 y 0,5, g/mL, para Zn, Cu, Fe y Mn,
respectivamente). Los resultados obtenidos fueron 98,7, 96,8, 101,3 y 99,3%,
para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Se analiz un material de referencia
(NIES-9,Sargasso, National Institute for Environmental Studies, Japan), de
Tabla 8. LOD, LOQ e intervalo lineal para la determinacin de Zn, Cu, Fe y Zn en algas
para distintas cantidades de muestra.
composicin elemental tpica de un alga marina parda. El contenido certificado,

para los metales en este material de referencia es: 15,6 1,2; 4,9 0,2; 187
33
6 y 21,2 1,0 g/g, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Los resultados
obtenidos para el anlisis de estos metales por el mtodo propuesto fueron
los siguientes (media desviacin estndar, n=3): 15,0 0,2; 5,1 0,1; 183,7
1,1 y 20,9 0,2 g/g, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Con todos
estos datos se puede decir que el procedimiento utilizado para realizar la
determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn en algas marinas mediante la metodologa
automtica propuesta es exacto.
La precisin se estudi en base al clculo de la repetibilidad de la
metodologa propuesta. Para ello, se aplic el mtodo propuesto a once
muestras de una misma alga. Los resultados obtenidos expresados como
coeficiente de variacin fueron los siguientes: 1,3; 2,0; 0,6 y 1,0%, para Zn,
Cu, Fe y Mn, respectivamente.
Se calcul la frecuencia de muestreo del mtodo propuesto considerando
la duracin de la etapa de extraccin y la duracin de la etapa de medida (20
s). De esta manera, las frecuencias de muestreo para los distintos metales
fueron las siguientes: 60, 36, 36 y 60 muestras/h, para Zn, Cu, Fe y Mn,
respectivamente.
Caractersticas analticas de los mtodos propuestos para la determinacin
de Ca y Mg en muestras de algas
Como se puede observar en la Figura 11, la recta de calibrado y la recta
de adicin son paralelas. Este paralelismo se comprob mediante la aplicacin
de un test estadstico t para un nivel de significacin del 95%. Por todo ello,
es posible concluir que no existe efecto matriz para la determinacin de Ca y
Mg en las muestras de algas por el mtodo propuesto.
Figura 11. Rectas de calibrado y adicin para Ca y Mg.
34
Se calcul el lmite de deteccin (LOD), el lmite de cuantificacin (LOQ)

y el intervalo lineal teniendo en cuenta distintas cantidades de muestra para
la determinacin de Ca y Mg en muestras de algas por el mtodo propuesto.
Los resultados obtenidos para cada uno de estos parmetros se muestran en
la Tabla 9.
La comprobacin de la exactitud de la metodologa analtica propuesta se
realiz mediante el estudio de la recuperacin analtica y analizando un material
de referencia certificado. El estudio de la recuperacin del mtodo se realiz
analizando una muestra real de alga. En el anlisis de esta muestra se utilizaron
disoluciones extractantes (HNO3 3 M para Ca y HNO3 0,5 M para Mg) a las que
se le haban adicionado distintas concentraciones de cada metal (20 y 1 g/mL,
para Ca y Mg, respectivamente). Los resultados obtenidos para la recuperacin
analtica fueron 98,7 y 101,0%, para Ca y Mg, respectivamente). Lo que significa
Tabla 9. LOD, LOQ e intervalo lineal para la determinacin de Ca y Mg en algas para

distintas cantidades de muestra.
que se obtiene una recuperacin cuantitativa en ambos casos. Adems, se

analiz un material de referencia (NIES-9,Sargasso, National Institute
for Environmental Studies, Japan). El contenido certificado, para Ca y
Mg en este material de referencia es 1,34 0,05 y 0,65 0,03%, para Ca
y Mg, respectivamente. Los resultados obtenidos para la determinacin
de estos metales en el material de referencia por la metodologa propuesta
35
(media desviacin estndar, n=3) fueron 1,33 0,02 y 0,66 0,01%, para Ca
y Mg, respectivamente.
La precisin se estudi en base al clculo de la repetibilidad de la
metodologa propuesta. Para ello, se aplic el mtodo propuesto a once
muestras de una misma alga. Los resultados obtenidos para el estudio de la
precisin expresados como coeficiente de variacin estaban en el intervalo
0,9-1,4%, demostrndose la precisin de la metodologa analtica propuesta.
Se calcul la frecuencia de muestreo del mtodo propuesto considerando
la duracin de la etapa de extraccin (0,5 min) y la duracin de la etapa de
medida (25 s). As, la frecuencia de muestreo para Ca y Mg result ser de 55
muestras/h.
APLICACIN
DE
LAS
METODOLOGAS
ANALTICAS
DESARROLLADAS. DETERMINACIN DE Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y
Mg EN ALGAS MARINAS DESTINADAS A LA ALIMENTACIN
HUMANA PRODUCIDAS Y PROCESADAS EN GALICIA
Los mtodos propuestos fueron aplicados para la determinacin de de Zn,
Cu, Fe, Mn, Ca y Mg en algas marinas destinadas a la alimentacin humana
producidas y procesadas en Galicia. Las muestras analizadas se adquirieron
en supermercados y tiendas de alimentacin. Estas algas son las siguientes:
Algas rojas: Agar-agar Atlntica (Gelidium sesquipedale), Dulse
(Palmaria palmata), Musgo de Irlanda (Chondrus crispus) y Nori (Porphyra
umbilicalis).
Algas pardas: Wakame (Undaria pinnatifida), Espagueti de Mar
(Himanthalia elongata), Kombu (Laminaria ochroleuca) y Kombu de azcar
(Laminaria saccharina).
Algas verdes: Lechuga de mar (Ulva rigida).
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 10.
CONCLUSIONES
Las ventajas que presenta la metodologa automtica propuesta frente a los
mtodos analticos utilizados hasta el momento para realizar la determinacin
de metales en muestras de algas son las siguientes:
36
Tabla 10. Resultados obtenidos para las muestras de algas analizadas: concentraciones
de Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y Mg. Media desviacin estndar (n= 3 determinaciones).
* Concentraciones expresadas en % (g metal /g muestra) x 100
- Se utiliza una cantidad de muestra menor: 5-160 mg frente a 0,2-0,5 g.

- El modo dinmico del los sistemas y la reduccin del tamao de muestra
hacen que se pueda reducir el tiempo necesario para realizar cuantitativamente
la extraccin de los metales: 0,5-2 min frente a 30-35 min.
- La extraccin tiene lugar con cidos diluidos (0,1-3 M HNO3) y a
temperatura ambiente.
- Debido a la miniaturizacin, se reduce el volumen de reactivos, lo cual
adems, en el caso del volumen de la disolucin extractante, incrementa la
sensibilidad del sistema.
- Se evita la contaminacin de la muestra y las prdidas de analito debido
a una mnima manipulacin de la muestra.
- Se evitan las etapas de centrifugacin y filtracin para la separacin
de la fase lquida del residuo slido (matriz de la muestra). Este punto con el
punto n 2 hacen que se produzca una disminucin considerable del tiempo de
tratamiento de la muestra.
- Se produce un incremento en la calidad de la metodolga analtica
inherente a la metodologa FIA utilizada.
37
Los metales esenciales, tambin denominados biometales, son los que

estn presentes en los organismos vivientes y ejercen una funcin biolgica
insustituible. Un dficit en el organismo de un metal esencial conduce a serias
alteraciones biolgicas. Actualmente la Organizacin Mundial de la Salud
considera entre otros metales esenciales para la salud humana a Zn, Cu, Fe,
Mn, Ca y Mg. En las algas estudiadas se encuentra un contenido importante
de metales, lo que representa un alto valor nutritivo para este alimento. Segn
los datos obtenidos, las algas ms ricas en Zn son Nori y Espagueti de mar,
el alga ms rica en cobre es la Dulse, las algas ms ricas en hierro son Dulse
y Lechuga de mar, las algas ms ricas en manganeso son Dulse y Lechuga
de mar, las algas ms ricas en calcio son Espagueti de Mar y Wakame, y
el alga ms rica en magnesio es la Lechuga de mar. Estas concentraciones
suponen una concentracin de metales esenciales mayor que la que presentan
los vegetales terrestres (Mataix Verd, 1998).
38

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Revista Real Academia Galega de Ciencias. Vol. XXVII. Pgs.

DETERMINACIN DE METALES EN ALGAS MARINAS

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ltimas dcadas, la demanda de algas para la alimentacin humana esta en

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- Verdello (Enteromorpha Intestinalis): Es una alga verde del orden de

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ordenes de magnitud ms elevados respecto a las aguas. Adems, hay que

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muestra, se pueden producir reacciones en las paredes del crisol. Tampoco

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En lo que se refiere a la determinacin de metales en muestras de vegetales

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lo que se refiere a metales para establecer su valor nutricional y para determinar

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Bombas peristlticas GILSON MINIPULS 3, con ocho canales y

Figura 1. Minicolumna conteniendo la muestra.

Ultrasonidos Selecta de 550 watios de potencia con selector de temperatura

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propuesto (Figura 2) es el siguiente: En una primera etapa se realiza la

Figura 2. Dispositivo FIA usado para la determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn en muestras

directamente en la minicolumna la muestra de alga marina seca, triturada y

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disolucin portadora que circula a un caudal de 3,5 mL/min, transporta el

Figura 3. Dispositivo FIA usado para la determinacin de Ca y Mg en muestras de

realiza la extraccin de Ca y Mg. Para ello se inserta con cuidado y se pesa

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Una vez preparada la minicolumna, se conecta en el sistema de flujo continuo,

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temperatura de extraccin, caudal de extraccin y volumen de disolucin

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obtenido para el Zn, Cu, Fe y Mn, se recogen en la Tabla 3. Los experimentos

Figura 4. Cartas Pareto estandarizadas para la determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn. A,

A partir de la observacin de las cartas Pareto (Figura 4) se pueden

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Concentracin de cido clorhdrico (B): No es una variable

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caudal de 6 mL/min para extraer cuantitativamente el Zn, Cu, Fe y Mn en este

Con respecto a las concentraciones de los cidos, se estudi la posibilidad

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Figura 6. Optimizacin de la concentracin de cido ntrico utilizado como disolucin

Al realizar la optimizacin de las distintas variables que afectan al proceso

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los dos tamaos de partcula anteriormente citados. En consecuencia, para

*DA: Digestin cida de la muestra

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variables implicadas en la extraccin de Zn, Cu, Fe y Mn, se ha elegido

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El diseo factorial aplicado es el de Plackett-Burman 2^7*3/32 que implica

por duplicado, por lo que el % EF indicada es la media de estos dos

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Figura 7. Cartas Pareto estandarizadas para la determinacin de Ca y Mg. A, [HNO3];

A partir del estudio de las cartas Pareto (Figura 7) se pueden establecer

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Concentracin de la disolucin de lantano (G): Para Ca y Mg la

Figura 8. Optimizacin del tiempo de extraccin para Ca y Mg. [HNO3]=3 M; [HCl]=3

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Adems, se estudi la posibilidad de eliminar el cido clorhdrico de la

Figura 9. Optimizacin de la concentracin de cido ntrico utilizado como disolucin

Por ltimo, se estudi la variable concentracin de la disolucin de

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